KR102632726B1 - 식물체의 비생물적 스트레스 저항성을 조절하는 OsWRKY5 유전자 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 식물체의 비생물적 스트레스 저항성을 조절하는 OsWRKY5 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, CRISPR/Cas9 시스템을 통해 OsWRKY5 유전자 기능이 상실된 돌연변이체는 비생물적 스트레스에 대한 저항성이 증가되고, OsWRKY5 유전자가 과발현된 형질전환체는 비생물적 스트레스에 대한 민감성이 증가되므로, OsWRKY5 유전자를 대상으로 유전자 편집 기술을 적용하면 다중 스트레스 저항성 작물의 개발을 기대할 수 있다.
Description
본 발명은 식물체의 비생물적 스트레스 저항성을 조절하는 OsWRKY5 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.
식물은 고착생활을 하면서 다양한 환경 스트레스에 노출되고 있으며, 환경 스트레스는 다른 생물체에 의해 일어나는 생물적(병·충해, 바이러스 등) 스트레스와 물리적 또는 화학적 환경의 변화에 의해 일어나는 비생물적(건조, 염해, 냉해, 고온, 공해물질 등) 스트레스로 구분된다. 이러한 환경 스트레스는 식물의 생육과 발달에 큰 영향을 미치고 있다.
환경 스트레스는 식물의 성장을 저해하고 농업 분야에서 수확물의 생산성을 제한하는 요소로서 수분(건조) 스트레스, 삼투 스트레스, 저온 스트레스 등이 있다. 환경 스트레스에 대한 식물의 적응 능력은 농업 생산성과 직결되기 때문에, 이에 대한 연구는 인간이 농경 생활을 시작하면서부터 꾸준히 관심을 가져온 중요한 연구 주제이다. 식물이 생산할 수 있는 총 생산량을 100%로 보았을 때 실제 생산량은 21%에 불과하고, 그 중 대부분은 가뭄, 냉해, 염해 등을 비롯한 환경 스트레스에 의하여 손실되게 되며 이는 작물 총 생산량의 약 69%에 달한다. 이 중 고염 스트레스에 영향을 받는 지역은 전 세계 농경지 면적 중 20%에 달하며, 물을 필요로 하는 관계농업 면적의 약 40% 이상이 염류에 영향을 받고 있다. 따라서 식물 환경 스트레스 저항성 및 염류 저항성 관련 핵심물질 확보를 통하여 이러한 손실을 단 1%만 줄일 수 있다고 하더라도 미래 인류가 당면할 식량문제를 획기적으로 개선할 수 있을 것으로 기대된다.
한편, 한국공개특허 제2017-0057564호에 '단기 수분 스트레스에 반응하는 WRKY 전사조절 유전자 및 그 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2015-0010299호에는 'ARR22 유전자를 이용한 식물체의 환경 스트레스 내성을 조절하는 방법 및 그에 따른 식물체'가 개시되어 있으나, 본 발명의 식물체의 비생물적 스트레스 저항성을 조절하는 OsWRKY5 유전자 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, OsWRKY5(Os05g04640) 유전자의 CDS(coding sequence)를 표적으로 하는 sgRNA(single guide RNA)를 디자인하여 pOs-sgRNA 벡터에 클로닝하고 pH-Ubi-Cas9-7 벡터에 최종 클로닝한 후, 상기 재조합 플라스미드로 동진벼를 형질전환시켜 OsWRKY5 유전자의 2번째 엑손에 4개의 염기가 결실된 oswrky5-2 돌연변이체를 제작하였다. 상기 OsWRKY5 유전자 발현이 억제된 oswrky5-2 돌연변이체의 가뭄 스트레스에 대한 저항성을 분석한 결과, 야생형 대조구와 oswrky5-D 과발현 형질전환체에 비해 oswrky5-2 돌연변이체에서 수분 손실률, 이온 누출율 및 MDA(malondialdehyde) 양이 유의적으로 감소하고, 작물 생산량이 증가한 것을 확인하였다. 또한, 상기 oswrky5-2 돌연변이체의 삼투 스트레스에 대한 저항성을 분석한 결과, 야생형 대조구와 OsWRKY5 과발현 형질전환체에 비해 oswrky5-2 돌연변이체의 생존율과 지상부 생장이 증가한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 조절하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 벼 유래 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 (b) 상기 유전체가 교정된 식물세포로부터 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 비생물적 스트레스에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 비생물적 스트레스에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 벼 유래 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환된 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는 비생물적 스트레스에 대한 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 비생물적 스트레스에 대한 저항성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 벼 유래 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물체의 비생물적 스트레스에 대한 저항성 조절용 조성물을 제공한다.
본 발명은 다중 스트레스 저항성 작물 개발 타겟으로서 OsWRKY5 유전자의 가능성을 시사하였다. 다중 스트레스 저항성 작물의 확보는 농업 분야에서 매우 중요한 특성이므로, 본 발명의 벼 유래 OsWRKY5 유전자는 활용도가 높을 것으로 예상된다. 또한, OsWRKY5 유전자는 다양한 비생물적 스트레스(abiotic stress) 연관 유전자와 관련되어 있음이 확인되어, 유전자가위 기반 유전자교정 정밀육종의 매우 중요한 소재로 활용가능할 것이다.
도 1은 OsWRKY5 유전자 서열에서 Cas9/sgRNA 표적 위치를 나타낸 그림이다.
도 2는 자연의 장일 조건(>14시간 명조건/1일)에서 10일간 키운 야생형 벼와 120일간 키운 야생형 벼의 다양한 조직에서 OsWRKY5 유전자의 발현량을 확인한 결과이다. FL: 지엽(flag leaf), LB: 엽신(leaf blade), LS: 잎집(leaf sheath), LJ: 엽절(lamina joint), S: 줄기(stem), N: 마디(node), IN: 절간(internode), R: 뿌리(root), TB: 분얼조직(tiller base), P: 이삭(panicle).
도 3은 야생형 동진벼(대조군, WT), OsWRKY5 유전자 기능이 상실된 돌연변이체(oswrky5-2) 및 OsWRKY5 유전자가 과발현된 형질전환체(oswrky5-D)에 가뭄 스트레스를 처리한 후 벼의 생장 상태(A), 생존율(B), 이온 누출률(C) 및 MDA(malondialdehyde) 함량(D)을 측정한 결과이다.
도 4는 야생형 동진벼(대조군, WT), OsWRKY5 유전자 기능이 상실된 돌연변이체(oswrky5-2) 및 OsWRKY5 유전자가 과발현된 형질전환체(oswrky5-D)에 가뭄 스트레스를 처리한 후 벼 잎의 상태(A), 수분 손실률(B), 기공 형태(C), 기공전도도(D) 및 기공 밀도(E)를 측정한 결과이다.
도 5는 야생형 동진벼(대조군, WT), OsWRKY5 유전자 기능이 상실된 돌연변이체(oswrky5-2; A) 및 OsWRKY5 유전자가 과발현된 형질전환체(oswrky5-D; B)에 가뭄 스트레스를 처리한 후 벼의 생장 상태를 확인한 사진이다.
도 6은 야생형 동진벼(대조군, WT), OsWRKY5 유전자 기능이 상실된 돌연변이체(oswrky5-2; A) 및 OsWRKY5 유전자가 과발현된 형질전환체(oswrky5-D; B)에 가뭄 스트레스를 처리한 후 벼의 생산성과 관련된 요소들을 확인한 결과이다. 수율, Yield; 500 GW, 500 grain weight; TGW, Total grain weight; FR, Filling rate; NFG, Number of filled grains; NSP, Number of spikelets per panicle; NTS, Number of total spikelets; PL, Panicle length; NP, Number of panicles; CL, Culm length.
도 7은 야생형 동진벼(대조군, WT), OsWRKY5 유전자 기능이 상실된 돌연변이체(oswrky5-2) 및 OsWRKY5 유전자가 과발현된 형질전환체(oswrky5-D)에 삼투 스트레스를 처리한 후 벼의 생존 상태(A) 및 지상부 길이(B)를 측정한 결과이다.
도 2는 자연의 장일 조건(>14시간 명조건/1일)에서 10일간 키운 야생형 벼와 120일간 키운 야생형 벼의 다양한 조직에서 OsWRKY5 유전자의 발현량을 확인한 결과이다. FL: 지엽(flag leaf), LB: 엽신(leaf blade), LS: 잎집(leaf sheath), LJ: 엽절(lamina joint), S: 줄기(stem), N: 마디(node), IN: 절간(internode), R: 뿌리(root), TB: 분얼조직(tiller base), P: 이삭(panicle).
도 3은 야생형 동진벼(대조군, WT), OsWRKY5 유전자 기능이 상실된 돌연변이체(oswrky5-2) 및 OsWRKY5 유전자가 과발현된 형질전환체(oswrky5-D)에 가뭄 스트레스를 처리한 후 벼의 생장 상태(A), 생존율(B), 이온 누출률(C) 및 MDA(malondialdehyde) 함량(D)을 측정한 결과이다.
도 4는 야생형 동진벼(대조군, WT), OsWRKY5 유전자 기능이 상실된 돌연변이체(oswrky5-2) 및 OsWRKY5 유전자가 과발현된 형질전환체(oswrky5-D)에 가뭄 스트레스를 처리한 후 벼 잎의 상태(A), 수분 손실률(B), 기공 형태(C), 기공전도도(D) 및 기공 밀도(E)를 측정한 결과이다.
도 5는 야생형 동진벼(대조군, WT), OsWRKY5 유전자 기능이 상실된 돌연변이체(oswrky5-2; A) 및 OsWRKY5 유전자가 과발현된 형질전환체(oswrky5-D; B)에 가뭄 스트레스를 처리한 후 벼의 생장 상태를 확인한 사진이다.
도 6은 야생형 동진벼(대조군, WT), OsWRKY5 유전자 기능이 상실된 돌연변이체(oswrky5-2; A) 및 OsWRKY5 유전자가 과발현된 형질전환체(oswrky5-D; B)에 가뭄 스트레스를 처리한 후 벼의 생산성과 관련된 요소들을 확인한 결과이다. 수율, Yield; 500 GW, 500 grain weight; TGW, Total grain weight; FR, Filling rate; NFG, Number of filled grains; NSP, Number of spikelets per panicle; NTS, Number of total spikelets; PL, Panicle length; NP, Number of panicles; CL, Culm length.
도 7은 야생형 동진벼(대조군, WT), OsWRKY5 유전자 기능이 상실된 돌연변이체(oswrky5-2) 및 OsWRKY5 유전자가 과발현된 형질전환체(oswrky5-D)에 삼투 스트레스를 처리한 후 벼의 생존 상태(A) 및 지상부 길이(B)를 측정한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼 유래 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 조절 방법에 있어서, 상기 OsWRKY5 단백질은 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsWRKY5 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 벼 유래 OsWRKY5 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 본 발명에 있어서, 용어 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 비생물적 스트레스 저항성을 조절하는 활성을 의미한다.
본 발명에 따른 식물체의 비생물적 스트레스 저항성을 조절하는 방법은, 상기 벼 유래 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시켜 야생형에 비해 비생물적 스트레스에 대한 식물체의 저항성을 증가시키는 것일 수 있고, 또는 상기 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자의 발현을 식물세포에서 과발현시켜 야생형에 비해 비생물적 스트레스에 대한 민감성을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 OsWRKY5 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제는 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자에 CRISPR/Cas9 유전자 교정 시스템, 내생 트랜스포존(transposon), X-레이 또는 γ-레이 조사를 통한 돌연변이 유발, RNAi 또는 안티센스 RNA를 이용하여 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해(억제)하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 유전자의 발현을 저해하는 당업계의 통상의 방법이면 모두 가능할 수 있다.
본 발명에 따른 식물체의 비생물적 스트레스 저항성 조절 방법에 있어서, 상기 비생물적 스트레스는 가뭄 또는 삼투 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 벼 유래 OsWRKY5 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 유전자의 범위는 OsWRKY5 단백질을 코딩하는 게놈 DNA, cDNA 및 합성 DNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 OsWRKY5 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 벼 유래 OsWRKY5 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)을 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 명세서에서, 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다.
본 발명의 상기 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, Trp 프로모터, Lac 프로모터, T7 프로모터, Tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터일 수 있으며, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 상기 마커 유전자는 항생제 저항성 유전자(dominant drug resistance gene)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 미세조류, 미생물 등을 포함한 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(B. thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모 (예컨대, Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 식물세포이다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.
본 발명은 또한,
(a) 벼 유래 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및
(b) 상기 유전체가 교정된 식물세포로부터 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 비생물적 스트레스에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "유전체/유전자 교정(genome/gene editing)"은, 인간 세포를 비롯한 동·식물 세포의 유전체 염기서열에 표적지향형 변이를 도입할 수 있는 기술로서, DNA 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자의 결실(deletion), 삽입(insertion), 치환(substitutions) 등에 의하여 특정 유전자를 녹-아웃(knock-out) 또는 녹-인(knock-in)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩(non-coding) DNA 서열에도 변이를 도입할 수 있는 기술을 말한다. 본 발명의 목적상 상기 유전체 교정은 특히 엔도뉴클레아제(endonuclease) 예컨대, Cas9(CRISPR associated protein 9) 단백질 및 가이드 RNA를 이용하여 식물체에 변이를 도입하는 것일 수 있다. 또한, '유전자 교정'은 '유전자 편집'과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "표적 유전자"는 본 발명을 통해 교정하고자 하는 식물체의 유전체 내에 있는 일부 DNA를 의미하며, 그 유전자의 종류에 제한되지 않으며, 코딩 영역 및 비-코딩 영역을 모두 포함할 수 있다. 당업자는 그 목적에 따라, 제조하고자 하는 유전체 교정 식물체에 대하여 원하는 변이에 따라 상기 표적 유전자를 선별할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "가이드 RNA(guide RNA)"는 표적 유전자의 염기서열을 암호화하는 DNA에 특이적인 RNA를 의미하며, 표적 DNA 염기서열과 전부 또는 일부가 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 염기서열로 엔도뉴클레아제 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미한다. 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA(dual RNA); 또는 표적 유전자 내 염기서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 RNA-가이드 뉴클레아제와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA(sgRNA) 형태를 말하나, RNA-가이드 뉴클레아제가 표적 염기서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있으며, 함께 사용된 엔도뉴클레아제의 종류 또는 엔도뉴클레아제의 유래 미생물 등을 고려하여 당업계의 공지된 기술에 따라서 적절히 선택할 수 있다.
또한, 상기 가이드 RNA는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것, 생체 외(in vitro)에서 전사된(transcribed) 것(예컨대, 올리고뉴클레오티드 이중가닥) 또는 합성한 가이드 RNA 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에 따른 유전체 교정 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 단백질은 Cas9, Cpf1(CRISPR from Prevotella and Francisella 1), TALEN(Transcription activator-like effector nuclease), ZFN(Zinc Finger Nuclease) 또는 이의 기능적 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 Cas9 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(S. thermophilus) 또는 스트렙토코커스 아우레우스(S. aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질, 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 유래의 Cas9 단백질, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) 유래의 Cas9 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Cas9 단백질 또는 이의 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다.
Cas9 단백질은 RNA-guided DNA 엔도뉴클레아제 효소로, 이중 가닥 DNA 절단(double stranded DNA break)을 유도한다. Cas9 단백질이 정확하게 표적 염기서열에 결합하여 DNA 가닥을 잘라내기 위해서는 PAM(Protospacer Adjacent Motif)이라 알려진 3개의 염기로 이루어진 짧은 염기서열이 표적 염기서열 옆에 존재해야 하며, Cas9 단백질은 PAM 서열(NGG)로부터 3번째와 4번째 염기쌍 사이를 추정하여 절단한다.
본 발명에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질은 리보핵산-단백질(ribonucleoprotein) 복합체를 형성하여 RNA 유전자 가위(RNA-Guided Engineered Nuclease, RGEN)로 작동할 수 있다.
본 발명에서 사용된 CRISPR/Cas9 시스템은 교정하고자 하는 특정 유전자의 특정위치에 이중나선 절단을 도입하여 DNA 수선 과정에서 유도되는 불완전 수선에 의한 삽입-결실(insertion-deletion, InDel) 돌연변이를 유도시키는 NHEJ(non-homologous end joining) 기작에 의한 유전자 교정 방법이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 식물세포에 도입하는 것은, 식물 유래 OsWRKY5 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein); 또는 OsWRKY5 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터;를 이용하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 OsWRKY5 유전자의 표적 염기서열은 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 유전체 교정 식물체는 CRISPR/Cas9 유전자 교정 시스템을 통해 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 OsWRKY5 유전자의 염기서열 중 139~142번째에 해당하는 4 bp 염기가 결실되어 OsWRKY5 유전자의 발현이 억제된 유전체 교정 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 식물체는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 당근, 미나리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있고, 바람직하게는 단자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 벼 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 비생물적 스트레스에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
본 발명은 또한,
벼 유래 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환된 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는 비생물적 스트레스에 대한 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 벼 유래 OsWRKY5 단백질은 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsWRKY5 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함할 수 있고, 구체적인 내용은 전술한 것과 같다.
또한, 본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같으며, 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 비생물적 스트레스는 가뭄 또는 삼투 스트레스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 OsWRKY5 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시키면 비형질전환 식물체 즉, 야생형에 비해 식물체의 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 증가시킬 수 있고, 또는 OsWRKY5 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 과발현시키면 비형질전환 식물체에 비해 식물체의 비생물적 스트레스에 대한 민감성을 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자의 발현 저해는 OsWRKY5 유전자에 대한 센스(sense) 또는 안티센스(antisense) DNA, 또는 microRNA를 포함하는 재조합벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해하거나 또는 CRISPR/Cas9 등의 유전자 교정 시스템을 이용하여 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 유전자 발현 저해 기술을 이용할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 비생물적 스트레스에 대한 저항성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
본 발명에 따른 형질전환 식물체는 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해시킨 경우에는 비생물적 스트레스에 대한 저항성이 증가된 것을 특징으로 하며, OsWRKY5 단백질 코딩 유전자의 발현을 증가시킨 경우에는 비생물적 스트레스에 대한 민감성의 증가를 특징으로 한다.
상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 당근, 미나리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있고, 바람직하게는 단자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 벼 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 벼 유래 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물체의 비생물적 스트레스에 대한 저항성 조절용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 유효성분으로 벼 유래 OsWRKY5 단백질을 코딩하는 유전자 또는 OsWRKY5 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이를 포함하며, 상기 OsWRKY5 단백질을 코딩하는 유전자 또는 OsWRKY5 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환함으로써 식물체의 비생물적 스트레스에 대한 저항성을 조절할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 벼 유래 OsWRKY5 단백질은 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 식물 재료
자포니카 품종인 야생형 동진벼를 대조구로 사용하였고, OsWRKY5 과발현 형질전환체(oswrky5-D; PFG_3A-15928)의 종자는 경희대학교 안진흥 교수 실험실에서 제공받았다. 상기 OsWRKY5 과발현 형질전환체는 T-DNA 활성화 태깅(tagging) 방법(Plant Physiol, 2002, 130(4), 1636-1644)에 의해 OsWRKY5 유전자의 발현이 증가된 식물체이다.
또한, CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 OsWRKY5 유전자 발현이 억제된 oswrky5-2 돌연변이체를 제작하기 위해, OsWRKY5 유전자의 코딩 시퀀스 부위(5'-CGACGACGACGTCCTCCGTG-3'; 서열번호 3)를 타겟으로 하는 sgRNA를 디자인한 후 이를 pOs-sgRNA 벡터에 도입하였으며, 이후 최종 벡터인 pH-Ubi-Cas9-7에 클로닝하여 도입하였다. 최종적으로 클로닝된 재조합 플라스미드는 아그로박테리움 튜머파시엔스 균주 LBA4404에 얼리고 녹이는 방법을 통해 형질전환하였다. 아그로박테리움 튜머파시엔스를 매개로한 캘러스 형질전환은 동진벼를 사용하여 수행하였고, OsWRKY5 유전자의 CDS(coding sequence)가 편집되었는지 확인하기 위해서 재분화된 식물체의 DNA를 추출하여 PCR로 증폭시킨 후 마크로젠에 시퀀싱 서비스를 의뢰하였다. 상기 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 제작된 oswrky5-2 돌연변이체는 OsWRKY5 유전자의 두번째 엑손에서 4 bp 염기가 결실되어 OsWRKY5 유전자의 기능이 상실된 돌연변이체이다(도 1).
2. 비생물적 스트레스 처리
2-1. 가뭄 스트레스 처리 및 저항성 검증
유리온실 내 동일한 포트에서 장일 조건(16시간 빛 조건 30℃/8 h 어둠 조건 25℃)으로 3주간 재배된 야생형, 돌연변이체 및 과발현체에 5일간 관수를 중단하여 가뭄 스트레스를 처리하였다. 가뭄 스트레스 처리 후 8일간 재관수하였으며, 벼의 생존율, 이온 누출률(ion leakage rate), MDA 양, 수분 손실률 및 생산량을 분석하여 가뭄 스트레스에 대한 저항성을 평가하였다.
2-2. 삼투 스트레스 처리 및 저항성 검증
유리온실 내 동일한 포트에서 장일 조건(16시간 빛 조건 30℃/8 h 어둠 조건 25℃)으로 3주간 재배된 야생형, 돌연변이체 및 과발현체에 200 mM의 만니톨(mannitol)을 10일간 처리하여 삼투 스트레스를 유도한 후 수돗물을 10일간 관수하였으며, 벼의 생존율 및 지상부 길이를 측정하여 삼투 스트레스에 대한 저항성을 평가하였다.
3. 수분 손실률, 이온 누출율 및 MDA 양 측정
수분 손실률을 측정하기 위해 야생형, 돌연변이체 및 과발현체의 잎을 실험실 벤치(온도 23±1℃, 습도 30~40%)의 3M 필터 페이터에 올려 놓고, 100분 동안 20분 간격으로 무게를 측정하였다. 수분 손실률은 초기 무게 대비 측정된 무게를 백분위로 환산하여 계산하였다. 이온누출률은 벼의 잎 조각(1 cm2)으로부터 누출된 전해질 양을 구하여 측정하였다. 각 식물체의 잎 조각을 상온에서 0.4 M 만니톨 6 ㎖에 침수시켜 약하게 교반하면서 반응시켰고, 반응시킨 각각의 용액은 전도율 측정기(CON6 METER, LaMOTTE, 미국)를 이용하여 전도율을 측정하였다. 전체 전도율은 각각의 샘플을 85℃에서 20분간 처리한 후 측정하였다.
비생물적 스트레스 받은 식물체의 경우 세포막이 손상되어 이온 누출률이 증가하고, ROS의 과축적으로 인한 지질 과산화가 MDA(malondialdehyde)의 양을 증가시킬 수 있으므로, 이온 누출률과 MDA 양은 비생물적 스트레스 저항성을 평가하는 중요 척도로 여겨진다. 이온 누출률은 각 샘플에서 전체 전도율과 처리 후 전도율을 백분율로 표시하여 서로 비교하여 분석하였다. MDA 양을 측정하기 위해 각 식물체의 잎 분말 100 mg을 0.1% TCA(trichloroacetic acid)에 반응시키고 15,000 g, 4℃에서 10분간 원심분리한 후, TCA 20%에 0.5% TBA(Thiobarbituric acid)를 첨가한 용액을 상층액에 4배가 되도록 넣어주고 95℃에서 25분간 반응시켰다. 이후 15분간 얼음에 보관하여 반응을 종결시켰고, 반응액을 분광 광도기를 사용하여 532 nm 및 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. MDA 양은 155 mM-1cm-1의 흡광계수를 사용하여 계산하였다.
4. 기공세포 관찰
기공의 상태를 측정하기 위해 3주간 재배된 야생형, 돌연변이체 및 과발현체의 잎 조각을 pH 7.2의 0.1 M 인산완충액에 2.5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)를 혼합시킨 용액에 고정시켰으며, 이후 증류수로 3번 세척한 후 에탄올(30%, 50%, 70%, 80%, 95%)로 탈수 과정을 거친 다음 100% 에탄올로 3번 탈수 과정을 수행하였다. 이후 샘플을 임계점건조기(EM CPD300, Leica, 독일)를 사용하여 최종적으로 건조시켰다. 기공 면적 사진은 Carl Zeiss의 SUPRA 55VP 주사전자현미경을 이용하여 촬영하였다. 기공 전도율 측정을 위해 휴대용 측정기(AP4, Delta-T Devices, 영국)를 사용하여 가뭄 스트레스를 24시간 준 후 약 30초간 자동 모드로 측정하였다. 기공의 밀도(단위 면적 당 기공 수)는 광학현미경(Olympus BX-50, 일본)을 이용하여 잎의 무작위 지점 세 군데에서 측정하였고, 기공 자국은 잎 뒷면을 순간접착제로 코팅하여 만들었다.
5. 역전사와 정량 실시간 PCR
총 RNA는 식물체 각 조직에서 MG total RNA extraction kit(MGmed, 한국)를 사용하여 제조회사의 프로토콜에 따라 추출하였다. 첫번째 가닥(First-strand) cDNA는 총 RNA의 2 μg, M-MLV 역전사효소 및 oligo(dT)15 프라이머(promega, 미국)를 혼합하여 최종적으로 25 ㎕의 첫번째 가닥(first-strand) cDNA를 제작하였고, 상기 cDNA에 물 75 ㎕를 넣고 희석하여 사용하였다.
qPCR 반응물은 첫 번째 가닥(first-strand) cDNA 혼합액 2 ㎕, 2X GoTaq PCR Mix (Roche) 10 ㎕, 뉴클리에이즈 프리워터 7 ㎕ 및 10 pM qRT 프라이머 세트 1 ㎕를 혼합하여 총 20 ㎕로 제조하였고, LightCycler 2.0 기기(Roche Diagnostics)를 이용하여 qPCR 수행하였다. qPCR 과정은 전변성 95℃ 2분; 변성(denaturation) 95℃ 5초, 59℃ 15초, 신장(extension) 72℃ 10초의 과정을 총 50회 반복의 조건으로 수행하였다. OsUBQ5(Os01g0328400)는 내부 컨트롤로 사용되었고, qPCR 분석에 사용된 프라이머 정보는 하기 표 1에 나타내었다.
| 프라이머 명칭 | 염기서열(5'→3') (서열번호) |
| OsWRKY5 (Os05g04640) |
F: GGCTCCAATGATCAGTGATGGA (4) |
| R: AGCCATTGTGCATCGGTAGT (5) | |
| OsUBQ5 (Os01g0328400) |
F: ACCACTTCGACCGCCACTACT (6) |
| R: ACGCCTAAGCCTGCTGGTT (7) |
실시예 1. 벼 식물체 내
OsWRKY5
유전자 발현 확인
OsWRKY5 유전자의 발현 패턴을 확인하기 위해, 자연의 장일 조건에서 10일간 키운 야생형 동진벼와 120일간 키운 야생형 동진벼의 잎새, 잎집, 지엽, 뿌리, 엽절, 줄기, 마디, 절간, 분얼경 또는 이삭에서 전사양을 측정하였다.
그 결과, OsWRKY5 유전자는 잎새, 잎집 및 지엽과 같은 잎 조직에서 발현된 것을 확인하였다(도 2). 이를 통해, OsWRKY5 유전자는 주로 벼의 잎에서 기능할 것으로 예상되었다.
실시예 2. 가뭄 스트레스에 대한
OsWRKY5
유전자의 기능 상실 돌연변이체 및 과발현체의 저항성 검증
2-1. 생존율, 이온 누출률 및 MDA 양 측정 결과
3주된 야생형 동진벼(대조군), OsWRKY5 유전자 기능이 상실된 돌연변이체(oswrky5-2) 및 OsWRKY5 유전자가 과발현된 형질전환체(oswrky5-D)를 동일한 조건의 포트에서 키운 후 5일간 관수를 중단하여 가뭄 스트레스를 처리하고, 8일간 재관수한 후 각 식물체의 생존율, 이온 누출률, MDA 양, 수분 손실률 및 생산성을 분석하여 가뭄 스트레스에 대한 저항성을 평가하였다.
먼저, 생존율을 측정한 결과, oswrky5-2의 생존율은 야생형에 비해 증가하고, oswrky5-D의 생존율은 야생형에 비해 감소한 것을 확인하였다(도 3A 및 3B).
또한, 이온 누출률과 MDA 양은 가뭄 스트레스를 처리한지 5일이 지나면 모든 식물체에서 증가하였으나, 야생형과 oswrky5-D에 비해 oswrky5-2의 이온 누출률과 MDA 양은 상대적으로 낮은 것을 확인하였다(도 3C 및 3D). 이를 통해, 식물체에서 OsWRKY5 유전자의 기능이 상실되면 가뭄 스트레스에 대한 저항성이 부여될 수 있음을 알 수 있었다.
2-2. 수분 손실률 측정 결과
2주된 야생형 동진벼(대조군), OsWRKY5 유전자 기능이 상실된 돌연변이체(oswrky5-2) 및 OsWRKY5 유전자가 과발현된 형질전환체(oswrky5-D)의 잎을 떼어내고 1시간 동알 탈수시킨 후 각 식물체의 생장 상태와 기공을 관찰하고, 수분 손실률을 분석하여 가뭄 스트레스에 대한 저항성을 평가하였다.
먼저, 생장 상태를 관찰한 결과, oswrky5-D는 심각한 잎 말림 표현형이 관찰된 반면, oswrky5-2는 탈수 후에 야생형과 oswrky5-D에 비해 동안 잎이 덜 말리는 것을 확인하였다(도 4A). 또한, 수분 손실률은 잎 말림 표현형과 동일하게 oswrky5-D 잎은 야생형에 비해 더 빠르게 수분을 잃는 반면, oswrky5-2 잎은 야생형과 oswrky5-D에 비해 상당히 적은 수분 손실율을 나타내었다(도 4B).
또한, 기공의 형태를 측정한 결과, 가뭄 스트레스 처리 전에는 야생형, oswrky5-2 및 oswrky5-D의 잎 기공 중에서 닫힌 기공이 약 20% 정도였으나, 가뭄 스트레스 처리 후 oswrky5-2의 닫힌 기공은 약 87%, 야생형의 닫힌 기공은 약 45%, oswrky5-D의 닫힌 기공은 약 33.7%로, 야생형과 oswrky5-D 보다 oswrky5-2에서 닫힌 기공의 비율이 현저히 높음을 확인하였다(도 4C).
또한, 잎의 기공전도도와 기공 밀도를 측정한 결과, oswrky5-D의 기공전도도는 야생형과 oswrky5-D에 비해 유의적으로 낮고(도 4D), 야생형, oswrky5-2 및 oswrky5-D의 잎에는 비슷한 수준으로 기공이 존재함을 확인하였다(도 4E). 이를 통해, 식물체에서 OsWRKY5 유전자의 기능이 상실되었을 때 기공이 빠르게 닫힘으로써 기공을 통한 수분 및 가스 교환이 감수하여 수분 손실을 최소화시켜 가뭄 스트레스에 대한 저항성을 향상시킬 수 있을 것으로 예상되었다.
2-3. 작물 생산성 측정 결과
야생형 동진벼(대조군), OsWRKY5 유전자 기능이 상실된 돌연변이체(oswrky5-2) 및 OsWRKY5 유전자가 과발현된 형질전환체(oswrky5-D)를 100일간 논에서 자연 장일 조건(>14시간 명조건/1일)에서 키운 뒤 플라스틱 박스로 옮기고, 2번의 가뭄 스트레스를 처리한 후 벼 식물체의 생장 상태를 관찰한 결과, oswrky5-2는 야생형에 비해 생장 상태가 우수한 반면(도 5A), oswrky5-D는 야생형이 비해 생장 상태가 좋지 못함을 확인하였다(도 5B).
또한, 작물 생산성과 밀접하게 연관되어 있는 요소인 수율(Yield), 500 GW(grain weight), TGW(Total grain weight), FR(Filling rate), NFG(Number of filled grains), NSP(Number of spikelets per panicle), NTS(Number of total spikelets), PL(Panicle length), NP(Number of panicles) 및 CL(Culm length)을 측정한 결과, oswrky5-2에서는 CL, PL 및 NSP를 제외한 나머지 7개 요소에서 모두 증가한 것을 확인한(도 6A 및 표 2) 반면, oswrky5-D에서는 총 10개의 요소가 야생형이 비해 모두 감소한 것을 확인하였다(도 6B 및 표 3).
즉, 야생형 동진벼와 비교하여 oswrky5-2 돌연변이체는 가뭄 스트레스에 대한 저항성이 우수하여 작물의 총 생산성이 증가하는 반면, oswrky5-D 형질전환체는 가뭄 스트레스에 대한 민감성이 증가하여 작물의 총 생산성이 오히려 감소하는 것을 알 수 있었다. 따라서, OsWRKY5의 기능 상실은 식물체의 영양생장 단계에서 가뭄 스트레스에 대한 저항성을 증진시킴으로써 작물의 생산성을 증가시킬 수 있을 것으로 예상되었다.
실시예 3. 삼투 스트레스에 대한
OsWRKY5
유전자의 기능 상실 돌연변이체 및 과발현체의 저항성 검증
3주된 야생형 동진벼(대조군), OsWRKY5 유전자 기능이 상실된 돌연변이체(oswrky5-2) 및 OsWRKY5 유전자가 과발현된 형질전환체(oswrky5-D)를 동일한 조건의 포트에서 키운 후 10일간 200 mM의 만니톨(mannitol)을 처리하고, 10일간 회복시킨 다음 각 벼의 생존율(도 7A) 및 지상부 길이(도 7B)를 측정한 결과, oswrky5-2는 야생형에 비해 유의적으로 증가하고, oswrky5-D는 야생형에 비해 유의적으로 감소한 것으로 확인하였다. 이를 통해, OsWRKY5의 유전체/유전자 교정에 의한 식물체 내 OsWRKY5 유전자 기능 상실은 삼투 스트레스에 대한 저항성을 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.
<110> Seoul National University R&DB Foundation
<120> OsWRKY5 gene controlling resistance to abiotic stress in plant
and uses thereof
<130> PN21056
<160> 7
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1509
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 1
atggagatga tggtgcagaa gcaacgacac gaggaggggg aagaggagcg aggaggcttg 60
tgcgcccgcg agatcaagga gctcgacttc ttctccgccg ccggtgccgg tgccggccgg 120
agagacgacg acgacgtcct ccgtgcggat gggatcagca gcagccacgc cggatttatg 180
gtcagcactg cgctggactt gctgacagcg gtcaacgacg gtgatcatca tgaggagaag 240
aaagggcagt caaatattca ccaaagcaag cagatggatg cggcggcgac gacggtggag 300
ggggagctcc ggcaagccgg cgaagagaac cggcggctgc ggcggaggct ggaggagctc 360
accagcagct atggcgccct ctaccaccag ctcgtccagg cgcagcagct gcacaccaag 420
catcagcagc aggctccgat cgccggcgtg cagttgctgg acgcgctcgc ggcggcgtct 480
ccggcgagcc accggcgacg agcggcggcg gcggtggacg gcgatagaac agctgactct 540
gatggtggcg agggcgacga gaacgtgtcg ccttctcttg gtagcaagag gccggcggcg 600
gcagcgacgt taacgcggct gacgccggag agcggcagcg gcggggagaa taatggcggc 660
ggcgagcagg cgccggcggc ggagatggcg ccgtgccgga aggccagggt gtcggtgcga 720
gcacgatccg aggctccaat gatcagtgat ggatgccaat ggaggaagta cgggcagaag 780
atggccaagg gtaacccttg ccctagagcc tactaccgat gcacaatggc ttcgcaatgc 840
cccgtcagaa aacaggtgca acgatgcgcg gaggacaaga gcatcctcat caccacctac 900
gagggcaccc acagccaccc gctgccgccg gccgccgccg ccatggccaa gaccacctcc 960
gccgccgccg ccatgctcct ctccggcccc gccgtcagcc gcgacgcgct gttcgccgcc 1020
caccaccacg tcgtcgcgcc gccgcccttc ttccaccacc cctacgccgg gtccaccatg 1080
gccacgctct ccgcctccgc cccgttcccg accatcacgc tcgacctcac ccagccgccg 1140
ccgacgacga cgaccaccgc cgccgccgcc atgctccagc tccaccgccc ttatgccttc 1200
tcctcattgc cgttctcgat gtacggcgcc ggcggcggct cgcaccggcc gcccgtcgtc 1260
ctgcccccgc cgtcgtcggt ggtggagacg atgaccgccg cgatcaccag ggaccccaac 1320
ttcaccacgg cggtggcggc cgcgctctcc tcgatcatgg cgggaggcgg cgcccaagct 1380
cgaacacctc cacgcggcgg gagtgacgcc gccggagaca tcaacggagg cggcggcgcc 1440
gaccacgcca ctgccggagc acgcgccgcg gcggcggcga cgcagccttg cggcacgtct 1500
cccacctga 1509
<210> 2
<211> 502
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 2
Met Glu Met Met Val Gln Lys Gln Arg His Glu Glu Gly Glu Glu Glu
1 5 10 15
Arg Gly Gly Leu Cys Ala Arg Glu Ile Lys Glu Leu Asp Phe Phe Ser
20 25 30
Ala Ala Gly Ala Gly Ala Gly Arg Arg Asp Asp Asp Asp Val Leu Arg
35 40 45
Ala Asp Gly Ile Ser Ser Ser His Ala Gly Phe Met Val Ser Thr Ala
50 55 60
Leu Asp Leu Leu Thr Ala Val Asn Asp Gly Asp His His Glu Glu Lys
65 70 75 80
Lys Gly Gln Ser Asn Ile His Gln Ser Lys Gln Met Asp Ala Ala Ala
85 90 95
Thr Thr Val Glu Gly Glu Leu Arg Gln Ala Gly Glu Glu Asn Arg Arg
100 105 110
Leu Arg Arg Arg Leu Glu Glu Leu Thr Ser Ser Tyr Gly Ala Leu Tyr
115 120 125
His Gln Leu Val Gln Ala Gln Gln Leu His Thr Lys His Gln Gln Gln
130 135 140
Ala Pro Ile Ala Gly Val Gln Leu Leu Asp Ala Leu Ala Ala Ala Ser
145 150 155 160
Pro Ala Ser His Arg Arg Arg Ala Ala Ala Ala Val Asp Gly Asp Arg
165 170 175
Thr Ala Asp Ser Asp Gly Gly Glu Gly Asp Glu Asn Val Ser Pro Ser
180 185 190
Leu Gly Ser Lys Arg Pro Ala Ala Ala Ala Thr Leu Thr Arg Leu Thr
195 200 205
Pro Glu Ser Gly Ser Gly Gly Glu Asn Asn Gly Gly Gly Glu Gln Ala
210 215 220
Pro Ala Ala Glu Met Ala Pro Cys Arg Lys Ala Arg Val Ser Val Arg
225 230 235 240
Ala Arg Ser Glu Ala Pro Met Ile Ser Asp Gly Cys Gln Trp Arg Lys
245 250 255
Tyr Gly Gln Lys Met Ala Lys Gly Asn Pro Cys Pro Arg Ala Tyr Tyr
260 265 270
Arg Cys Thr Met Ala Ser Gln Cys Pro Val Arg Lys Gln Val Gln Arg
275 280 285
Cys Ala Glu Asp Lys Ser Ile Leu Ile Thr Thr Tyr Glu Gly Thr His
290 295 300
Ser His Pro Leu Pro Pro Ala Ala Ala Ala Met Ala Lys Thr Thr Ser
305 310 315 320
Ala Ala Ala Ala Met Leu Leu Ser Gly Pro Ala Val Ser Arg Asp Ala
325 330 335
Leu Phe Ala Ala His His His Val Val Ala Pro Pro Pro Phe Phe His
340 345 350
His Pro Tyr Ala Gly Ser Thr Met Ala Thr Leu Ser Ala Ser Ala Pro
355 360 365
Phe Pro Thr Ile Thr Leu Asp Leu Thr Gln Pro Pro Pro Thr Thr Thr
370 375 380
Thr Thr Ala Ala Ala Ala Met Leu Gln Leu His Arg Pro Tyr Ala Phe
385 390 395 400
Ser Ser Leu Pro Phe Ser Met Tyr Gly Ala Gly Gly Gly Ser His Arg
405 410 415
Pro Pro Val Val Leu Pro Pro Pro Ser Ser Val Val Glu Thr Met Thr
420 425 430
Ala Ala Ile Thr Arg Asp Pro Asn Phe Thr Thr Ala Val Ala Ala Ala
435 440 445
Leu Ser Ser Ile Met Ala Gly Gly Gly Ala Gln Ala Arg Thr Pro Pro
450 455 460
Arg Gly Gly Ser Asp Ala Ala Gly Asp Ile Asn Gly Gly Gly Gly Ala
465 470 475 480
Asp His Ala Thr Ala Gly Ala Arg Ala Ala Ala Ala Ala Thr Gln Pro
485 490 495
Cys Gly Thr Ser Pro Thr
500
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OsWRKY5 target sequence
<400> 3
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<211> 22
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 6
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
acgcctaagc ctgctggtt 19
Claims (14)
- 벼 유래 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해시키는 단계를 포함하는, 식물체의 가뭄 또는 삼투 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 벼 유래 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자를 유전자교정 시스템을 이용하여 녹아웃(knock-out)시켜 가뭄 또는 삼투 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- (a) 벼 유래 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA) 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 식물세포에 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및
(b) 상기 유전체가 교정된 식물세포로부터 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 가뭄 또는 삼투 스트레스에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 식물체의 제조방법. - 제5항에 있어서, 상기 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자의 표적 염기서열은 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 가뭄 또는 삼투 스트레스에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 식물체의 제조방법.
- 제5항에 있어서, 상기 (a) 단계의 가이드 RNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 식물세포에 도입하는 것은, 식물 유래 OsWRKY5 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체(ribonucleoprotein); 또는 OsWRKY5 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터;를 이용하는 것을 특징으로 하는 가뭄 또는 삼투 스트레스에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 식물체의 제조방법.
- 제5항의 방법에 의해 제조된 가뭄 또는 삼투 스트레스에 대한 저항성이 증가된 유전체 교정 식물체.
- 벼 유래 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하여 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해시키는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환된 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는, 비형질전환 식물체에 비해 가뭄 또는 삼투 스트레스에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법. - 삭제
- 삭제
- 제9항의 제조방법에 의해 제조된 가뭄 또는 삼투 스트레스에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체.
- 제12항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
- 벼 유래 OsWRKY5 단백질 코딩 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물체의 가뭄 또는 삼투 스트레스에 대한 저항성 증가용 조성물.
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| International Journal of Molecular Sciences. Vol. 20, No. 18, p.1-18 (2019. 9. 9.)* |
| Saudi Journal of Biological Sciences. Vol. 28, p.2323-2341(2021. 1. 20.)* |
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