KR102424617B1 - 식물의 내염성을 조절하는 벼 유래의 OsCZMT1 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물의 내염성을 조절하는 벼 유래의 OsCZMT1 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 OsCZMT1 유전자의 발현을 조절하여 식물체의 내염성을 조절할 수 있으므로, 환경 스트레스에 내성을 갖는 새로운 형질전환 식물체를 개발하는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

식물의 내염성을 조절하는 벼 유래의 OsCZMT1 유전자 및 이의 용도{OsCZMT1 gene from Oryza sativa for controlling salt stress tolerance of plant and uses thereof}

본 발명은 식물의 내염성을 조절하는 벼 유래의 OsCZMT1 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

식물은 병원균 감염 및 곤충의 공격과 같은 생물학적 스트레스와 고염, 가뭄, 더위, 추위와 같은 비생물학적 스트레스에 직면하여 살아가고 있다. 특히, 토양 중에 염 농도가 증가되는 염 스트레스의 경우, 식물의 성장 및 개화시기 등에 큰 영향을 주게 되며 고염에 노출된 식물은 세포 내 이온농도의 불균형과 삼투압의 불균형이 일어나게 되어, 이와 함께 영양 장해, 대사 장해 및 광합성 장해 등을 유발시켜 식물의 생산량을 감소시킬 수 있다.

마그네슘(Mg²⁺)은 식물의 필수 미량영양소로서, 자연상태에서는 단일원소로 존재하지 않고 주로 규산, 황산 또는 탄산과 결합한 염의 형태로 존재한다. 마그네슘은 식물의 뿌리에서 물과 함께 흡수되어 물관을 통해 이동하며 다른 이온과 결합한 상태로 식물 조직내에 존재한다. 마그네슘 수송체(Magnesium transporter) 단백질은 마그네슘을 세포막을 통해 이동시키는 역할을 한다. 애기장대에서 세포막에 존재하는 마그네슘 수송체 MGT6 단백질은 마그네슘 결핍 조건에서 마그네슘을 흡수하는 역할을 한다고 알려져있다.

한편, 최근 많은 연구자들이 환경 스트레스에 대한 유전자의 기능에 관심을 가지고 활발히 연구하고 있으며, 육종가들은 교배를 통해 품종을 개량하여 내염성 작물을 개발하고자 시도를 하고 있다. 기존의 품종개량 기술은 각각 원하는 특성을 지닌 유사한 종들을 교배하여 생성된 잡종 중 목적하는 품종만을 선별하는 것으로, 한 품종을 개발하기 위해서는 많은 시행착오와 시간이 소요된다. 이에 비해 유전자 재조합 기술은 원하는 특성을 가진 유전자를 다른 생물체에 직접 삽입함으로써 목적하는 품종을 얻을 수 있다. 또한 삽입하고자 하는 유전자는 같은 생물종뿐만 아니라 서로 다른 생물종에서도 얻을 수 있으므로, 품종개량의 폭이 넓고 종래의 품종개량에 비해 소요 시간이 짧은 장점이 있다.

한편, 한국등록특허 제1376522호에는 '내염성을 증가시키는 벼 유래의 OsMLD 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1829737호에는 '페놀계 중합체를 유효성분으로 함유하는 식물의 염 스트레스 내성 증진용 조성물 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '식물의 내염성을 조절하는 벼 유래의 OsCZMT1 유전자 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 동안벼에 감마선을 조사하여 유도된 내염성 돌연변이체와 야생형의 전사체를 분석하여 돌연변이체에서 OsCZMT1 유전자의 발현이 저해되어 있음을 확인하였다. 그 후, 염 스트레스 조건에서 야생형의 OsCZMT1 유전자가 유묘기의 뿌리에서 강하게 발현되는 것을 확인하였고, OsCZMT1 유전자를 과발현시키면 효모의 내염성이 감소하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsCZMT1(Oryza sativa CorA-like ZnB Magnesium Transporter1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsCZMT1 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 내염성을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsCZMT1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 내염성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 내염성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsCZMT1 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 내염성 조절용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsCZMT1 단백질을 코딩하는 유전자를 돌연변이시켜 야생형 식물체에 비해 내염성이 증가된 돌연변이 식물체를 제공한다.

본 발명의 OsCZMT1 유전자는 식물의 내염성을 조절할 수 있으므로, 환경 스트레스에 대해 내성을 가지는 식물체를 개발하여 농작물의 생산성을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 돌연변이체 sitl1의 내염성을 분석한 결과로, (a)는 영양배지(NS) 또는 탈이온수(DW) 조건에서 야생형(WT)과 sitl1에 0, 50 및 100 mM NaCl을 처리한 후, 7일 째의 식물체 표현형을 확인한 사진이고, (b) 및 (c)는 0, 50 및 100 mM NaCl을 처리했을 때 지하부(root)와 지상부(leaf sheath, leaf blade)의 생체중 분석 결과이며, (d) 및 (e)는 0, 50 및 100 mM NaCl을 처리했을 때 엽록소(chlorophyll)의 함량을 보여주는 결과이다.
도 2는 염 처리에 따른 마그네슘(Mg²⁺)과 나트륨(Na⁺) 이온의 함량을 분석한 결과로, 야생형(WT)과 sitl1에 50 mM NaCl을 처리했을 때 뿌리와 잎에서의 마그네슘과 나트륨 이온의 함량(a, b)과 물관 수액에서의 마그네슘과 나트륨 이온의 함량(c, d)을 보여주는 결과이다.
도 3은 내염성 돌연변이체 sitl1의 OsCZMT1 유전자에 삽입된 염기의 위치(빨간색 화살표)를 보여주는 그림이다.
도 4는 야생형 식물체에서의 염처리에 따른 OsCZMT1 유전자 발현양상을 분석한 결과로, (a)는 각 발달 단계별 식물 조직에서의 OsCZMT1 유전자의 발현양상을 보여주는 결과이고, (b) 및 (c)는 50 mM NaCl을 처리했을 때 뿌리와 잎에서의 OsCZMT1 유전자의 발현양상을 보여주는 결과이다.
도 5는 OsCZMT1 단백질의 나트륨 수송 활성을 확인한 결과로, OsCZMT1 유전자가 과발현된 야생형(WT)과 sitl1의 원형질체에 50 mM NaCl을 처리하지 않았을 때와 처리했을 때의 원형질체내 흡수된 나트륨 함량을 보여주는 결과이다. EV(empty 벡터); OsCZMT1(OsCZMT1 유전자 발현 벡터)
도 6은 OsCZMT1 유전자가 과발현된 효모 형질전환체의 내염성을 확인한 결과로, (a) 및 (b)는 0, 0.1 및 1 mM MgCl₂를 처리했을 때 형질전환체의 성장을 보여주는 결과이고, (c) 및 (d)는 0, 0.5 및 1 M NaCl을 처리했을 때 형질전환체의 성장을 보여주는 결과이다. CM52(정상 효모); CM66(Mg²⁺ 수송 유전자 결실 효모); EV(empty 벡터); OE-mOsCZMT1(mutated OsCZMT1 유전자 과발현 벡터); OE-OsCZMT1(OsCZMT1 유전자 과발현 벡터).

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsCZMT1(Oryza sativa CorA-like ZnB Magnesium Transporter1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsCZMT1 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 내염성을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 식물체의 내염성을 조절하는 방법에 있어서, 상기 OsCZMT1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80%이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 내염성을 조절하는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명에 따른 OsCZMT1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물체의 내염성을 조절하는 방법은, 벼 유래의 OsCZMT1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시켜 야생형 식물체에 비해 내염성을 증가시키는 것일 수 있고, 또는 벼 유래의 OsCZMT1 단백질을 코딩하는 유전자를 식물세포에서 과발현시켜 야생형 식물체에 비해 내염성을 감소시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 벼 유래의 OsCZMT1 단백질을 코딩하는 유전자 서열은 재조합 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 재조합 벡터는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동무루 세포 바이러스 벡터 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될수 있다. 상기 발현 벡터의중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

OsCZMT1 단백질을 코딩하는 유전자의 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터 또는 Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 발현 또는 클로닝을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들면, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보솜 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ 프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseolin) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 신타아제(Octopine synthase) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

재조합 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), G418(Geneticin), 블레오마이신(Bleomycin)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA(aminoglycoside-3'-adenyl transferase) 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 유전자총-매개 형질전환 방법(bombardment), 아그로박테리움-매개 형질전환법, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 DEAE-덱스트란 처리법 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsCZMT1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는, 내염성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 벼 유래의 OsCZMT1 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함하며, 구체적인 내용은 전술한 것과 같다.

또한, 본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 것과 같다.

또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 내염성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법에 있어서, 벼 유래의 OsCZMT1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 저해시켜 내염성이 증가된 형질전환 식물체를 제조할 수 있고, 또한, 벼 유래의 OsCZMT1 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시켜 내염성이 감소된 형질전환 식물체의 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 OsCZMT1 단백질 코딩 유전자의 발현 저해는 이에 한정되는 것은 아니나, OsCZMT1 유전자에 T-DNA를 삽입시켜 돌연변이를 유도하거나, OsCZMT1 유전자를 발현 저해 벡터인 VIGS(virus-induced gene silencing) 벡터 또는 RNAi(RNA interference) 벡터에 삽입하여 수행할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 내염성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

상기 식물체는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 당근, 미나리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽일 수 있고, 바람직하게는 단자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 벼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsCZMT1 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 내염성 조절용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCZMT1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 유전자의 발현이 저해되면 식물체의 내염성을 증가시킬 수 있고, 상기 유전자가 과발현되면 식물체의 내염성을 감소시킬 수 있다.

용어 '유전자의 과발현' 및 '유전장 발현 저해/감소'는 각각 야생형 식물에서 발현되는 수준 이상 및 이하로 OsCZMT1 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsCZMT1(Oryza sativa CorA-like ZnB Magnesium Transporter1) 단백질을 코딩하는 유전자를 돌연변이시켜 야생형 식물체에 비해 내염성이 증가된 돌연변이 식물체를 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 내염성 돌연변이체( sitl1 )의 선발

"동안벼"에 감마선을 조사하여 돌연변이를 유발시키고 28℃에서 2일 동안 배양하면서 발아를 유도하였다. 발아된 개체는 생장 챔버로 옮겨 16시간 명/8시간 암 조건의 광주기로 배양하고 7일 후, 100 mM NaCl이 포함된 영양배지를 처리하여 1 주일 이상 배양시키면서 내염성 돌연변이체 sitl1(salt insensitive TILLING line 1)을 선발하였다.

선발된 돌연변이체 sitl1의 내염성을 분석한 결과, 50 mM 이상의 NaCl이 포함된 영양배지(NS)에서 야생형에 비해 약 1.2배 이상 우수한 뿌리 및 잎의 성장을 보이는 것을 확인하였다(도 1b). 이러한 결과는 50 mM 이상의 NaCl이 포함된 탈이온수(DW)에서도 동일하게 나타났다(도 1c). 또한, 돌연변이체 sitl1는 50 mM 이상의 NaCl이 포함된 영양배지 또는 탈이온수에서 엽록소의 함량이 야생형보다 높은 것을 확인하였다(도 1d, e).

실시예 2. 염 처리에 따른 마그네슘 및 나트륨 함량 분석

수경재배한 7일령의 돌연변이체 및 야생형 벼를 16시간 명/8시간 암조건의 광주기로 배양하며 50 mM NaCl을 7일 동안 처리하였다. 이 후, 뿌리와 잎을 수거하여 80℃에서 16시간 동안 건조시키고, 물관의 수액 또한 수거하여 유도결합플라즈마 분광광도계(ICP-OES, Optima 700dv, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)로 Mg²⁺과 Na⁺ 이온의 농도를 측정하였다.

그 결과, 염을 처리했을 때 내염성 돌연변이체 sitl1의 뿌리 및 잎에서의 Mg²⁺과 Na⁺ 이온의 함량이 야생형에 비해 낮은 것을 확인하였다(도 2a, b). 이러한 결과는 물관의 수액에서도 동일하게 나타나는 것을 확인함으로써, 돌연변이체 sitl1의 마그네슘과 나트륨 수송 기능이 결실되었음을 알 수 있었다(도 2c, d).

실시예 3. 염 처리에 따른 OsCZMT1 유전자의 발현 양상 분석

전사체 분석을 통해, 돌연변이체 sitl1과 야생형에서 다르게 발현하는 유전자 중 OsCZMT1(Oryza sativa CorA-like ZnB Magnesium Transporter1) 유전자가 돌연변이체 sitl1에서 야생형에 비해 발현이 현저하게 감소되어 있는 것을 확인하였다. 돌연변이체 sitl1의 염기서열 분석 결과, OsCZMT1 유전자(서열번호 1)의 1044번째 염기 뒤에 염기 T가 삽입되어 있는 것을 확인하였다(도 3). 이에, OsCZMT1 유전자가 내염성에 관여하는지 조사하기위해 야생형에서의 OsCZMT1 유전자 발현 양상을 분석하였다.

야생형 벼의 다양한 식물 조직에서의 OsCZMT1 유전자 발현 양상을 각 발달 단계로 나누어 분석한 결과, 유묘기 뿌리에서 강하게 발현하는 것을 확인하였다(도 4a). 또한, 7일 된 벼에 50 mM NaCl을 처리하고 뿌리에서의 OsCZMT1 유전자 발현 양상을 분석한 결과, NaCl 처리 30분 후부터 OsCZMT1 유전자의 발현이 증가하기 시작하였고, NaCl 처리 6시간 후부터 OsCZMT1 유전자의 발현이 현저하게 감소한 것을 확인하였다(도 4b). 잎에서의 OsCZMT1 유전자의 발현은 NaCl 처리 30분 후부터 6시간 까지 증가하였고, 이후부터 현저하게 감소한 것을 확인하였다(도 4c).

상기 결과를 통해, 단일염기 삽입에 의한 OsCZMT1 유전자의 발현 저해가 돌연변이체 sitl1에 내염성을 부여하는 것을 알 수 있었고, 염 스트레스 조건에서 정상 벼의 뿌리와 잎에서 OsCZMT1 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인함으로써, OsCZMT1 유전자가 내염성에 관여하는 것을 알 수 있었다.

실시예 4. OsCZMT1 유전자 과발현에 따른 세포내 나트륨 함량 확인

야생형과 돌연변이체 sitl1의 벼 원형질체에 OsCZMT1 유전자 발현벡터를 주입하였다. OsCZMT1 유전자가 과발현된 원형질체에 50 mM NaCl을 처리하지 않았을 때와 처리했을 때, 원형질체내로 흡수된 나트륨의 함량을 측정하였다. 그 결과, NaCl을 처리했을 때, 과발현 식물체(sitl1+OsCZMT1)는 sitl1 및 sitl1+EV에 비해 흡수된 나트륨의 함량이 증가한 것을 확인하였다(도 5). 따라서, OsCZMT1 단백질이 나트륨 수송에 관여하는 것을 알 수 있었다.

실시예 5. OsCZMT1 유전자가 과발현된 효모 형질전환체의 내염성 확인

OsCZMT1 유전자가 과발현된 효모 형질전환체를 개발하기위해, Mg²⁺ 수송 유전자가 결실된 CM66 효모와 정상 CM52 효모에 OsCZMT1 유전자와 mOsCZMT1(mutated OsCZMT1) 유전자를 대장균(Escherichia coli)을 통해 형질전환시켰다. 상기 효모 CM66과 CM52는 이전에 보고되었다(Yeast. 1985. 11;53-55).

OsCZMT1 유전자와 mOsCZMT1 유전자가 과발현된 효모 형질전환체에 MgCl₂와 NaCl을 처리한 후, 효모의 성장을 분석하였다. 그 결과, OsCZMT1 유전자가 과발현된 Mg²⁺ 수송 유전자가 결실된 CM66 효모는 1 mM MgCl의 처리에도 성장을 유지한 반면 mOsCZMT1 유전자가 과발현된 CM66 효모는 성장하지 못한 것을 확인하였다(도 6a, b). OsCZMT1 유전자가 과발현된 정상 CM52 효모는 처리한 염의 농도가 증가할 수록 다른 식물체에 비해 성장률이 감소한 것을 확인하였다(도 6c, d).

상기 결과를 통해, OsCZMT1 유전자가 식물체에서 과발현되면 Mg²⁺의 흡수를 복원시킴으로써 내염성이 감소되는 것을 알 수 있었고, OsCZMT1 유전자의 발현 조절을 통해 식물체의 내염성을 조절할 수 있을 것으로 사료되었다.

<110> KNU-Industry Cooperation Foundation <120> OsCZMT1 gene from Oryza sativa for controlling salt stress tolerance of plant and uses thereof <130> PN20224 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1677 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggctgatg tggagggcca acagcctcat caggtcagtg gtgtgtccag ggcacaagac 60 ggggttgcca aggtgagttt ggggaaagag catgtgccag gaagcgagct ctggaccgac 120 gggctcatct gtgcttttga gctcataaag ggtcacaaga agctggttca gcacaaatca 180 tggccgacga ttgatagcat gcaggagaaa gaggtcccta tgcatatgaa gcggcacata 240 agtaggaacg ggcatcatgt cgcaaccatg aaaccagaag agtgcgatgt ggtggagaat 300 ccccgccaga cagagtttgc taatgatcct tctctgttca aagataggcc ggtgcatgtc 360 agggcaatcc tggatcacaa atgggtgcct atcggatggt ctaggattgc tgaactggtc 420 cagagggttc agtcagatgc cagctgggat agtgagccgg cggagatgac cgacagtgag 480 gatgattaca ctgtagctga tgttgcagct ccatactggc agcgtccggt aggacctaca 540 tggtggtgcc atgtcactgc aggccatccc tcagttgacg catggctgaa tagtgctcac 600 tggatgcatc cggctataag aactgcattg agagatgaaa gccggctgat aagtgatcgg 660 atgaagtacc ttctctatga ggtcccagtt agagttgctg ggggactgct atttgaactt 720 cttggtcaat cagtcggaga tccaaaccgt gaagaggaag acatacccat tgtgcttcgg 780 tcttggcaag cacagaactt tcttgtgacc gcaatgcatg tcaaaggccc ttcatccaat 840 ataaatgttt taggagtgac tgaagtgcag gagttgctta gtgctggtgg aagtcaaaca 900 cctagatcag ctcatgaagt aattgcacat ttgatcggcc gtctttcccg atgggatgac 960 aggttattcc ggaaatatgt ctttggtgaa gcagatgaaa ttgaactgaa gtttgtgaat 1020 aggagaaatc atgaagatct aaatctagtc agcatcatat tgaatcaaga aatcagaagg 1080 ttagcaacac aggtaatcag agttaaatgg tctctgcatg caagggaaga gatcataatt 1140 gagctcctta gacatttgag gggaaatacc acaagagtta tcttagatag cattagaaag 1200 gacacaagag aaatgttgga ggagcaggaa gctgtccgtg gccgcttgtt cactattcag 1260 gatgttatgc aaagcactgt tcgagcatgg ttacaagata gaagccttcg tatcacccac 1320 aatttggcta tttttggggg tggcggcatg gttttatcca taatcactgg cctttttgga 1380 atcaatgttg atggcatacc gggagcgcag aatactccat acgcttttgg cttgtttgca 1440 ggacttctct tctttgtagg cttcgtcctt attggggtag gaatactcta tcttgggtta 1500 caaaatccag tgaccaatga gaaggtcaag gtgaggaagc tcgagctcca ggatcttgtt 1560 tcagcgttcc agcatgaagc agaacagcac ggcaaggtga gggaaggtct cagccggcac 1620 agctcgtctc ctaagtcatc atcggcctct aatgtagact acgttctaat ttcttaa 1677 <210> 2 <211> 558 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Ala Asp Val Glu Gly Gln Gln Pro His Gln Val Ser Gly Val Ser 1 5 10 15 Arg Ala Gln Asp Gly Val Ala Lys Val Ser Leu Gly Lys Glu His Val 20 25 30 Pro Gly Ser Glu Leu Trp Thr Asp Gly Leu Ile Cys Ala Phe Glu Leu 35 40 45 Ile Lys Gly His Lys Lys Leu Val Gln His Lys Ser Trp Pro Thr Ile 50 55 60 Asp Ser Met Gln Glu Lys Glu Val Pro Met His Met Lys Arg His Ile 65 70 75 80 Ser Arg Asn Gly His His Val Ala Thr Met Lys Pro Glu Glu Cys Asp 85 90 95 Val Val Glu Asn Pro Arg Gln Thr Glu Phe Ala Asn Asp Pro Ser Leu 100 105 110 Phe Lys Asp Arg Pro Val His Val Arg Ala Ile Leu Asp His Lys Trp 115 120 125 Val Pro Ile Gly Trp Ser Arg Ile Ala Glu Leu Val Gln Arg Val Gln 130 135 140 Ser Asp Ala Ser Trp Asp Ser Glu Pro Ala Glu Met Thr Asp Ser Glu 145 150 155 160 Asp Asp Tyr Thr Val Ala Asp Val Ala Ala Pro Tyr Trp Gln Arg Pro 165 170 175 Val Gly Pro Thr Trp Trp Cys His Val Thr Ala Gly His Pro Ser Val 180 185 190 Asp Ala Trp Leu Asn Ser Ala His Trp Met His Pro Ala Ile Arg Thr 195 200 205 Ala Leu Arg Asp Glu Ser Arg Leu Ile Ser Asp Arg Met Lys Tyr Leu 210 215 220 Leu Tyr Glu Val Pro Val Arg Val Ala Gly Gly Leu Leu Phe Glu Leu 225 230 235 240 Leu Gly Gln Ser Val Gly Asp Pro Asn Arg Glu Glu Glu Asp Ile Pro 245 250 255 Ile Val Leu Arg Ser Trp Gln Ala Gln Asn Phe Leu Val Thr Ala Met 260 265 270 His Val Lys Gly Pro Ser Ser Asn Ile Asn Val Leu Gly Val Thr Glu 275 280 285 Val Gln Glu Leu Leu Ser Ala Gly Gly Ser Gln Thr Pro Arg Ser Ala 290 295 300 His Glu Val Ile Ala His Leu Ile Gly Arg Leu Ser Arg Trp Asp Asp 305 310 315 320 Arg Leu Phe Arg Lys Tyr Val Phe Gly Glu Ala Asp Glu Ile Glu Leu 325 330 335 Lys Phe Val Asn Arg Arg Asn His Glu Asp Leu Asn Leu Val Ser Ile 340 345 350 Ile Leu Asn Gln Glu Ile Arg Arg Leu Ala Thr Gln Val Ile Arg Val 355 360 365 Lys Trp Ser Leu His Ala Arg Glu Glu Ile Ile Ile Glu Leu Leu Arg 370 375 380 His Leu Arg Gly Asn Thr Thr Arg Val Ile Leu Asp Ser Ile Arg Lys 385 390 395 400 Asp Thr Arg Glu Met Leu Glu Glu Gln Glu Ala Val Arg Gly Arg Leu 405 410 415 Phe Thr Ile Gln Asp Val Met Gln Ser Thr Val Arg Ala Trp Leu Gln 420 425 430 Asp Arg Ser Leu Arg Ile Thr His Asn Leu Ala Ile Phe Gly Gly Gly 435 440 445 Gly Met Val Leu Ser Ile Ile Thr Gly Leu Phe Gly Ile Asn Val Asp 450 455 460 Gly Ile Pro Gly Ala Gln Asn Thr Pro Tyr Ala Phe Gly Leu Phe Ala 465 470 475 480 Gly Leu Leu Phe Phe Val Gly Phe Val Leu Ile Gly Val Gly Ile Leu 485 490 495 Tyr Leu Gly Leu Gln Asn Pro Val Thr Asn Glu Lys Val Lys Val Arg 500 505 510 Lys Leu Glu Leu Gln Asp Leu Val Ser Ala Phe Gln His Glu Ala Glu 515 520 525 Gln His Gly Lys Val Arg Glu Gly Leu Ser Arg His Ser Ser Ser Pro 530 535 540 Lys Ser Ser Ser Ala Ser Asn Val Asp Tyr Val Leu Ile Ser 545 550 555

Claims (10)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsCZMT1(Oryza sativa CorA-like ZnB Magnesium Transporter1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsCZMT1 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는, 식물체의 내염성을 조절하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsCZMT1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 저해시켜 야생형 식물체에 비해 내염성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 식물체의 내염성을 조절하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsCZMT1 단백질을 코딩하는 유전자를 식물체에서 과발현시켜 야생형 식물체에 비해 내염성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 식물체의 내염성을 조절하는 방법.
4. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsCZMT1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
   상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는, 내염성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsCZMT1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 저해하여 식물체의 내염성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 내염성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsCZMT1 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시켜 식물체의 내염성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 내염성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법.
7. 제4항의 방법에 의해 제조된 내염성이 조절된 형질전환 식물체.
8. 제7항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
9. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsCZMT1 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 내염성 조절용 조성물.
10. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래의 OsCZMT1(Oryza sativa CorA-like ZnB Magnesium Transporter1) 단백질을 코딩하는 유전자를 돌연변이시켜 야생형 식물체에 비해 내염성이 증가된 돌연변이 식물체.

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