KR102646071B1 - 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체 또는 RsTT8 전사체 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체 또는 RsTT8 전사체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체 또는 RsTT8 전사체는 식물체 내 안토시아닌 함량을 증가시킬 수 있으므로, 본 발명의 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체 또는 RsTT8 전사체를 활용하여 안토시아닌 함량이 증진된 고품질의 식물체를 개발하여 기능성 식품, 화장품, 사료 등의 소재로 다양하게 활용할 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체 또는 RsTT8 전사체 및 이의 용도에 관한 것이다.
식물의 색소(pigment)는 광합성에 관여하는 엽록소를 제외하고 3가지 계통(안토시아닌, 카로테노이드, 베타라인)이 존재하며 이 색소들이 수분을 위한 동물유인 및 종자 분산 등을 담당하며, 자외선이나 강한 가시광선에 의한 식물의 손상을 막아준다. 안토시아닌(anthocyanin)은 플라보노이드(flavonoid) 계통의 수용성 색소로 식물의 잎, 꽃 및 과실의 푸른색, 자주색 및 붉은색을 결정하며, 식물의 생장과 발달에도 중요한 역할을 한다. 안토시아닌은 꽃잎에서 곤충 등 화분매개자를 유혹하고, 열매 및 씨앗에서 종자의 분산을 도와 생태적 분포를 마련한다. 안토시아닌을 포함한 플라보노이드 화합물은 곤충 및 외부 스트레스에 대한 식물의 손상을 보호하는 기능을 하고(즉 생물학적 및 비생물학적 스트레스 저항성 부여), 특히 활성산소 등에 의한 손상을 막기 위해 항산화제로서의 기능을 한다. 안토시아닌은 사람에게도 항산화제로 작용하여 세포사멸을 감소시키고, 심혈관 질병, 암, 당뇨, 신경퇴화, 염증, 바이러스 감염 및 비만을 예방할 수 있어, 건강식품으로 각광을 받고 있다. 대사체공학을 통한 과실과 야채의 안토시아닌 함량의 질적 양적 증가는 중요하고 산업적 가치가 있는 연구방향이다.
Pre-mRNA의 선택적 슬라이싱(alternative splicing, AS)은 비생물학적 스트레스, 발달 과정 및 다양성과 관련된 유전자의 발현을 조절하는 방법의 하나로 대두되고 있다. 그 중에서 인트론 유지(intron retention, IR) 현상은 프레임시프트(frameshift)를 초래하여 조기 정지코돈(stop codon)의 도입을 야기, 절단된(truncated) 단백질 합성을 이끌어 정상적인 단백질의 양을 조절하고, 간혹 단백질의 구조를 바꾸어 기능이 다른 단백질을 만들기도 한다.
유전자 도입을 통한 산물 생산이나 작물의 형질전환에서 가장 문제가 되는 것은 도입한 유전자의 발현양이 낮다는 것이다. 이를 해결하기 위해서 인트론을 도입 유전자에 삽입하여 발현을 증가시키는 인트론 매개 발현증진(Intron-Mediated Enhancement, IME)이 식물을 비롯한 다양한 생물체에서 이루어져 왔다. IME는 인트론 도입으로 형질전환 유전자를 내생유전자(endogene)처럼 인식되게 하여 유전자의 안정성과 sRNA(small RNA)에 의한 분해를 방지하는 것으로 알려져 있다. 대개 도입되는 인트론은 해당 유전자가 지닌 인트론이나 보편적 인트론(CGATT 및 TTNGATYTG)이다. 따라서 전사체에 인트론이 유지되고 그들을 도입하였을 경우 발현이 증가한다면 더욱 좋은 도입유전자 소재가 될 것이다.
한편, 한국공개특허 제2019-0052559호에 인트론이 완전히 제거된 무 유래의 RsTT8 및 RsMYB1 유전자를 포함하는 '안토시아닌 생합성을 증진시키기 위한 재조합 벡터 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1351265호에 고구마 유래의 IbMYB1a 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용한 '안토시아닌 함량이 증가된 형질전환 알팔파 식물체의 제조 방법 및 그에 따른 알팔파 식물체'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체 또는 RsTT8 전사체 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 인트론이 유지된 무(Raphanus sativus) 유래 RsMYB1-IR1, RsMYB1-IR2, RsTT8-IR1 및 RsTT8-IR2 전사체가 존재함을 확인하였고, 상기 인트론이 유지된 'RsMYB1-IR1 또는 RsMYB1-IR2'와 'RsTT8-IR1 또는 RsTT8-IR2' 전사체를 식물체에서 동시에 발현시킬 경우 인트론이 제거된 'RsMYB1 및 RsTT8' 전사체가 동시 발현된 식물체에 비해 안토시아닌 함량이 현저히 증가한 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체 또는 RsTT8 전사체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 RsTT8 전사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터와 RsTT8 전사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜, 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체와 RsTT8 전사체를 동시에 과발현시키는 단계를 포함하는, 식물체의 안토시아닌 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터와 RsTT8 전사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물 세포로부터 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체와 RsTT8 전사체를 동시에 과발현시키는 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 안토시아닌 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 안토시아닌 함량이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;와 RsTT8 전사체 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 유효성분으로 포함하는 식물체의 안토시아닌 함량 증가용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체 및 RsTT8 전사체는 식물체 내 안토시아닌 함량을 증가시킬 수 있으므로, 본 발명의 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체 및 RsTT8 전사체를 활용하여 안토시아닌 함량이 증진된 고품질의 식물체를 개발하여 기능성 식품, 화장품, 사료 등의 소재로 다양하게 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 무 유래 RsMYB1 또는 RsTT8 전사체의 구조를 나타낸 모식도로, 박스는 엑손을, 실선은 인트론을 나타낸다.
도 2A는 적피적심(Red skin/Red flesh, RsRf; HKR-275) 무에서 RsMYB1 또는 RsTT8 전사체의 발현 수준을 확인한 PCR 결과이고, 도 2B는 상기 PCR 증폭 산물의 염기서열 분석을 통해 인트론이 완전히 제거된 RsMYB1 및 RsTT8 전사체와 일부 인트론이 유지된 RsMYB1-IR1, RsMYB1-IR2, RsTT8-IR1 및 RsTT8-IR2 전사체의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 3은 인트론이 모두 제거된 RsMYB1 및 RsTT8 전사체와 인트론이 유지된 RsMYB1-IR1, RsMYB1-IR2, RsTT8-IR1 및 RsTT8-IR2 전사체가 각각 암호화하는 단백질의 아미노산 서열을 비교한 결과이다.
도 4는 녹피적심(GsRf, Green skin/Red flesh), 적피적심(RsRf, Red skin/Red flesh), 적피백심(RsWf, Red skin/White flesh) 및 백피백심(WsWf, White skin/White flesh)의 특징을 가진 무를 45일간 배양한 후 무의 표피(skin)와 과육(flesh)에서 인트론이 모두 제거된 RsMYB1 또는 RsTT8 전사체와 인트론이 유지된 RsMYB1-IR1, RsMYB1-IR1 또는 RsTT8-IR2 전사체의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 5는 담배 잎에서 RsMYB1 전사체(RsMYB1, RsMYB1-IR1 및 RsMYB1-IR2) 및 RsTT8 전사체(RsTT8, RsTT8-IR1, RsTT8-IR2)를 동시에 발현시킨 후 안토시아닌 함량을 측정한 결과이다. ■: RsMYB1, ■(Ⅰ): RsMYB1-IR1, ■(Ⅱ): RsMYB1-IR2, ●: RsTT8, ●(Ⅰ): RsTT8-IR1, ●(Ⅱ): RsTT8-IR2.
도 2A는 적피적심(Red skin/Red flesh, RsRf; HKR-275) 무에서 RsMYB1 또는 RsTT8 전사체의 발현 수준을 확인한 PCR 결과이고, 도 2B는 상기 PCR 증폭 산물의 염기서열 분석을 통해 인트론이 완전히 제거된 RsMYB1 및 RsTT8 전사체와 일부 인트론이 유지된 RsMYB1-IR1, RsMYB1-IR2, RsTT8-IR1 및 RsTT8-IR2 전사체의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 3은 인트론이 모두 제거된 RsMYB1 및 RsTT8 전사체와 인트론이 유지된 RsMYB1-IR1, RsMYB1-IR2, RsTT8-IR1 및 RsTT8-IR2 전사체가 각각 암호화하는 단백질의 아미노산 서열을 비교한 결과이다.
도 4는 녹피적심(GsRf, Green skin/Red flesh), 적피적심(RsRf, Red skin/Red flesh), 적피백심(RsWf, Red skin/White flesh) 및 백피백심(WsWf, White skin/White flesh)의 특징을 가진 무를 45일간 배양한 후 무의 표피(skin)와 과육(flesh)에서 인트론이 모두 제거된 RsMYB1 또는 RsTT8 전사체와 인트론이 유지된 RsMYB1-IR1, RsMYB1-IR1 또는 RsTT8-IR2 전사체의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 5는 담배 잎에서 RsMYB1 전사체(RsMYB1, RsMYB1-IR1 및 RsMYB1-IR2) 및 RsTT8 전사체(RsTT8, RsTT8-IR1, RsTT8-IR2)를 동시에 발현시킨 후 안토시아닌 함량을 측정한 결과이다. ■: RsMYB1, ■(Ⅰ): RsMYB1-IR1, ■(Ⅱ): RsMYB1-IR2, ●: RsTT8, ●(Ⅰ): RsTT8-IR1, ●(Ⅱ): RsTT8-IR2.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체 또는 RsTT8 전사체를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 RsMYB1 전사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 2의 염기서열을 포함할 수 있고, 상기 RsTT8 전사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 또는 4의 염기서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 RsTT8 전사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 4의 염기서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 RsTT8 전사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 명세서에서, 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다.
본 발명의 상기 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, Trp 프로모터, Lac 프로모터, T7 프로모터, Tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터일 수 있으며, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 상기 마커 유전자는 항생제 저항성 유전자(dominant antibiotics drug resistance gene)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 미세조류, 미생물 등을 포함한 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(B. thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모 (예컨대, Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 식물세포이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명은 또한, 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터와 RsTT8 전사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜, 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체와 RsTT8 전사체를 동시에 과발현시키는 단계를 포함하는, 식물체의 안토시아닌 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물체의 안토시아닌 함량을 증가시키는 방법에 있어서, 상기 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체 또는 RsTT8 전사체, 상기 전사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 방법은 상기 전술한 것과 같다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 식물체의 안토시아닌 함량을 증가시키는 방법은 상기 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체와 인트론이 유지된 무 유래의 RsTT8 전사체를 동시에 과발현시켜 식물체의 안토시아닌 함량을 증가시킬 수 있다. 구체적으로 서열번호 1의 인트론이 유지된 RsMYB1 전사체 및 서열번호 3의 인트론이 유지된 RsTT8 전사체; 서열번호 1의 인트론이 유지된 RsMYB1 전사체 및 서열번호 4의 인트론이 유지된 RsTT8 전사체; 서열번호 2의 인트론이 유지된 RsMYB1 전사체 및 서열번호 3의 인트론이 유지된 RsTT8 전사체; 또는 서열번호 2의 인트론이 유지된 RsMYB1 전사체 및 서열번호 4의 인트론이 유지된 RsTT8 전사체;를 식물체에서 동시에 과발현시키면, 인트론이 완전히 제거된 RsMYB1 전사체(서열번호 5) 및 RsTT8 전사체(서열번호 6)가 동시 발현된 식물체에 비해 안토시아닌 함량을 현저하게 증진시킬 수 있다.
본 발명은 또한,
인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터와 RsTT8 전사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물 세포로부터 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체와 RsTT8 전사체를 동시에 과발현시키는 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 안토시아닌 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 안토시아닌 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체 또는 RsTT8 전사체와, 상기 전사체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터는 상기 전술한 것과 같다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985, Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
또한, 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 안토시아닌 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법에 의해 제조된 안토시아닌 함량이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.
본 발명의 상기 식물체는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 당근, 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 미나리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽일 수 있다.
본 발명은 또한, 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;와 RsTT8 전사체 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 유효성분으로 포함하는 식물체의 안토시아닌 함량 증가용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 유효성분으로 식물체의 안토시아닌 함량을 증가시킬 수 있는 인트론이 유지된 무 유래의 RsMYB1 전사체 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 RsTT8 전사체 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;를 포함하며, 상기 전사체를 동시에 과발현시키면 식물체의 안토시아닌 함량을 증가시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명은 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 식물재료
본 발명의 전사체 분리 및 유전자 발현 분석에 사용한 무는 한국종묘(주)로부터 분양받은 근교계로, 적피적심(Red skin/Red flesh, RsRf; HKR-275), 녹피적심(Green skin/Red flesh, GsRf; HKR-397), 적피백심(Red skin/White flesh, RsWf; HKR-513) 및 백피백심(White skin/White flesh, WsWf; KR-519)을 사용하였다.
다중-홀 포트에 종자를 심어 발아시키고 성장시켜 유묘를 만든 후 적당한 포트로 옮겨 심고 성장챔버(environmental growth chamber) 또는 유리온실에서 생장시켰다. 식물체는 각 샘플링 단계(유묘, 배축 표면(hypocotyl skin) 탈착 전, 배축 표면 탈착 후 및 수확 단계)에서 사진을 찍은 후 샘플링하였고, 사용전까지 얼려서 보관하였다.
일과성검정(transient assay)을 위해 사용한 담배는 니코티아나 타바쿰 L(Nicotiana tabacum L.)이다. 담배 종자는 상토가 채워진 다공포트(15.5 x 22 x 7 cm)에 심어 키운 후 직경이 9 cm인 개개의 화분으로 옮겨 장일조건(16h 빛/8h 암), 빛 세기 110 mmol m-2s-1, 온도 22±0.5℃로 세팅된 생장기에서 키웠다.
2.
RsMYB1
및
RsTT8
전사체 클로닝
NCBI 홈페이지와 이미 알려진 두 개의 무 게놈 데이터 베이스(http://radish-genome.org/, 및 http://www.nodai-genome-d.org/)에 존재하는 서열을 근거로 프라이머를 제작하여, 4종류의 무(RsRf, GsRf, RsWf 및 WsWf)로부터 게놈 유전자를 클로닝한 후 상기 서열에 기반하여 전사체 클로닝을 위한 프라이머를 제작하였다. 이때 클로닝 편의를 위하여 두 개의 제한효소(SmaI 및 XbaI) 자리를 정방향 프라이머와 역방향 프라이머에 넣었다(표 1). 총 RNA는 TRIzol용액(Invitrogen, 미국)을 이용하여 분리하였고, 전체 RNA 1 μg에 RQ1 RNase-free DNase(Promaga, 미국)를 65℃에서 10분 처리하여 RNA를 제거하였다. 첫 번째 cDNA가닥은 올리고 dT 프라이머와 Revertra Ace Kit(TOYOBO, 일본)를 이용하여 합성하였다. Semi-quantitative RT-PCR은 94℃에서 5분간 가열한 후 94℃ 30초→60℃ 30초→72℃ 60초를 27회 반복하고 마지막으로 72℃에서 7분간 반응시켰다. PCR 산물인 DNA 절편은 1.2% 아가로오스 겔에 전개하고 EtBr로 염색한 후 UV하에서 사진을 찍고 밴드를 오려내었다. 오려낸 밴드로부터 DNA를 용출한 후 All In One Vector (BIOFACT, 한국)에 서브클로닝하여 확인한 후 염기서열 분석을 Mcrogen Co.(한국)에 의뢰하였다. 에러를 줄이기 위해서 적어도 하나의 시료 또는 클론 당 5개 이상의 염기서열 분석 결과를 비교하여 최종 서열을 확정하였다.
| 프라이머 명칭 | 서열정보(5'→3') (서열번호) |
| RsMYB1_SmaIxXbaI | F: CCCGGGATGGAGGGTTCGTCC (7) |
| R: TCTAGATTACACAGTCTCTCCATCTAACAGG (8) | |
| RsTT8_SmaIxXbaI | F: GACCCCGGGATGGATGAATCAAG (9) |
| R: CGGCTCTAGACTAGAGTTTATTTTG (10) |
밑줄 : 제한효소 위치
3. 담배에서
RsMYB1
및
RsTT8
의 일과성 검정(transient assay)
염기서열을 분석하여 선발된 각 클론은 pCAMBIA3300 바이너리 벡터(binary vector)의 CaMV(cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터 다음에 삽입하였다. 이때 선별유전자로 bar 유전자를 도입하였다. 재조합 플라스미드는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) strain GV3101에 도입하여 세포를 배양한 후 담배의 일과성 검정 또는 애기장대 형질전환에 사용하였다.
담배의 일과성 검정에는 아그로박테리움에 도입한 모든 벡터와 대조군으로 공벡터를 이용하였다: pCAMBIA3300-RsMYB1, pCAMBIA3300-RsMYB1-IR1, pCAMBIA3300-RsMYB1-IR2, pCAMBIA3300-RsTT8, pCAMBIA3300-RsTT8-IR1, pCAMBIA3300-RsTT8-IR2 및 pCAMBIA3300. 아그로박테리움은 항생제(50 mg/L rifampicin, 50 mg/L kanamycin)가 첨가된 LB배지를 이용하여 28℃에서 190 rpm으로 진탕하며 밤새 배양한 후 OD600=0.6이 될 때까지 배양하였다. 10분간 3,800 rpm으로 원심분리하여 세포를 모은 후 아그로-인필트레이션(agro-infiltration) 배지(MS salts 4.32 mg/L, 10 mM MES, 20 g/L sucrose, 0.1mM acetosyringone)으로 재부유시키고 실온에서 2~4시간 동안 둔 다음 담배 잎에 주입(300∼500 ㎕)하였다. 아그로박테리움은 5~6주 배양된 담배의 잎 수가 7~8개일 때 생장점에서 3~4번째 어린잎의 배축면(abaxial side)에 주입하였다. 주입하고 5일 후 잎의 변색 과정을 추적 관찰하면서 사진을 찍었고, 잎은 안토시아닌 함량과 유전자 발현을 알아보기 위해 채취하여 -80℃에 보관하였다.
4. 유전자 발현 분석
총 RNA는 RNeasy Mini Kit(Qiagen, 독일)를 사용하여 추출하였고, 게노믹 DNA의 오염을 제거하기 위해 RNase-free DNase(Promega, 미국)를 처리하였다. 이 후, Avian Myeloblastosis Virus One-step RT-PCR Kit(Takara, 일본) 및 유전자 특이적 프라이머(표 1)를 사용하여 RT-PCR(reverse transcription PCR)을 수행하였다.
Semi-quantitative RT-PCR은 94℃에서 5분간 초기 변성 후, 94℃에서 30초 변성→60℃에서 30초 결합→72℃에서 30초 신장으로 이루어진 증폭 과정을 27회 반복한 후, 72℃에서 7분간 최종 신장하였다. 증폭된 DNA 단편은 1.5% 아가로스 겔에 로딩하여 분리하고 EtBr(ethidium bromide)로 염색하였다.
또한, qRT-PCR(quantitative real-time PCR)은 SYBR Green Realtime Master Mix(TOYOBO, 일본)와 MiniOpticon system(Bio-Rad, 미국)을 통해 수행하였고, 94℃에서 10분간 초기변성 후 94℃에서 30초 변성→58℃에서 30초 결합→72℃에서 30초 신장으로 이루어진 증폭 과정을 40회 반복하였으며, 형광값은 각 회차의 마지막 단계에서 측정하였다. 모든 분석은 3번의 생물학적 반복 실험으로 수행되었다. 표적 유전자의 전사체 수준은 대조군으로 사용한 유전자(RsACT2)와 비교하여 정규화화였으며, 2-△△CT 방법을 사용하여 분석하였다. 모든 qRT-PCR 결과는 3번의 기술적 반복과 3번의 생물학적 반복의 결과를 평균 및 표준오차로 표기하였다.
6. 안토시아닌 함량 측정
총 안토시아닌 함량은 Lee 등(Journal of Food Science, 1991, 56(2), 466-468)과 Giusti 등(In Current Protocols in Food Analytical Chemistry, 2001, 00(1), F1.2.1-F1.2.13)의 방법을 사용하여 측정하였다. 구체적으로 식물체의 잎을 곱게 간 분말 0.3 g을 추출버퍼(1% HCl을 함유한 메틸알콜) 1 ㎖에 넣고 중간 세기로 진탕하면서 4℃에서 24시간 동안 암조건에서 배양한 후 13,000 g로 5분간 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 침전물이 제거된 상층액의 흡광도 값을 흡광도 측정기로 530 nm(A530), 620 nm(A620), 650 nm(A650)에서 측정하였다. 상대적 안토시아닌 함량은 '(A530-A620)-0.1×(A650-A620)'의 계산식을 이용하여 계산하였고, 총 안토시아닌 함량은 '상대적 안토시아닌 함량×MW(시아니딘-3-글루코시드 분자량, 449.2 g/mol)×DF(희석인자)×1000×ε(큐벳의 길이, 1cm)'의 계산식을 이용하여 계산하였으며, 3반복의 결과를 데이터로 사용하였다.
실시예 1. 인트론이 유지된 무 유래의
RsMYB1
또는
RsTT8
전사체 확인
무 유래 RsMYB1 게놈 DNA는 3개의 엑손과 2개의 인트론으로 구성되어 있고, RsTT8 게놈 DNA는 7개의 엑손과 6개의 인트론으로 구성되어 있다(도 1). 적피적심(RsRf)에서 RsMYB1 또는 RsTT8 전사체의 발현 수준을 확인한 결과, RsMYB1 전사체의 경우 747 bp, 1,127 bp 및 896 bp 크기의 밴드가 검출되었고, RsTT8 전사체의 경우 1,560 bp, 1,673 bp 및 1,801 bp 크기의 밴드가 검출되었다(도 2A).
상기 PCR 증폭 산물로부터 DNA를 추출하여 염기서열을 분석한 결과, 747bp 또는 1,560 bp의 크기를 가진 밴드는 각각 인트론이 모두 제거된 RsMYB1 및 RsTT8 전사체이고, 이보다 큰 크기를 가진 나머지 밴드는 인트론이 유지된 RsMYB1 및 RsTT8 전사체이며, 유지된 인트론에 정지코돈(stop codon)이 존재함을 확인하였다(도 2B).
인트론이 유지된 RsMYB1 전사체는 각각 RsMYB1-IR1 및 RsMYB1-IR2로 명명하였고, RsMYB1-IR1은 첫번째 인트론(380 nt)을 지닌 무 유래 MYB1 전사체, RsMYB1-IR2는 두번째 인트론(149 nt)을 지닌 무 유래 MYB1 전사체이다. 또한, 상기 인트론이 유지된 RsTT8 전사체는 각각 RsTT8-IR1 및 RsTT8-IR2로 명명하였다. 인트론이 유지된 RsTT8-IR1은 4번째 인트론(113 nt)이 유지된 무 유래 TT8 전사체이고, RsTT8-IR2는 3번째 인트론(128 nt)과 4번째 인트론(113 nt)이 모두 유지된 무 유래 TT8 전사체이다.
상기 전사체들의 서열로 암호화되는 단백질의 아미노산 서열을 비교한 결과, 인트론이 유지된 RsMYB1-IR1, RsMYB1-IR2, RsTT8-IR1 또는 RsTT8-IR2 전사체는 인트론에 존재하는 정지코돈으로 인해 기능성 도메인이 결여된 아주 짧은 단백질을 암호화하여, 온전한 단백질을 암호화하지 못함을 확인하였다(도 3). 특히, RsTT8-IR1 및 RsTT8-IR2 전사체 모두 MYB와 결합하는 MIR 영역을 완전히 암호화하지 못하였고, 나머지 중요한 기능성 영역(WD 결합 영역, bHLH(basic Helix 1 Loop Helix 2) 영역 및 ACT-like 영역)가 결여된 단백질을 암호화하였으므로, 식물체 내 안토시아닌 합성을 촉진할 수 없을 것으로 예상되었다.
실시예 2. 무에서
RsMYB1
또는
RsTT8
전사체의 발현 수준 분석
발아한 무는 30~40일 정도 지나면 표피가 벗겨지고 진정한 표피 조직이 형성되기 때문에 녹피적심(GsRf, Green skin/Red flesh), 적피적심(RsRf, Red skin/Red flesh), 적피백심(RsWf, Red skin/White flesh) 및 백피백심(WsWf, White skin/White flesh)의 특징을 가진 무를 45일간 배양한 후 무의 표피(skin)와 과육(flesh)에서 인트론이 모두 제거된 RsMYB1 전사체와 인트론이 유지된 RsMYB1-IR1 및 RsMYB1-IR2 전사체의 발현 수준을 분석하였다.
그 결과, 적색을 띤 GsRf 및 RsRf 무에서 RsMYB1, RsMYB1-IR1 또는 RsMYB1-IR2의 발현 수준이 높았고, RsMYB1의 발현양은 RsMYB1-IR1 또는 RsMYB1-IR2에 비해 현저히 높음을 확인하였다(도 4A).
또한, 45일간 배양된 녹피적심, 적피적심, 적피백심 및 백피백심의 특징을 가진 무의 표피와 과육에서 인트론이 모두 제거된 RsTT8 전사체와 인트론이 유지된 RsTT8-IR2 전사체의 발현 수준을 확인하였다.
그 결과, GsRf 및 RsRf 무에서 RsTT8 또는 RsTT8-IR2의 발현 수준이 높았고, 특히 RsRf 무에서는 상기 RsMYB1 결과와 다르게 인트론이 유지된 RsTT8-IR2의 발현량이 RsTT8에 비해 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다(도 4B). RsTT8-IR1의 발현 수준은 RsTT8-IR1 특이적 프라이머 작성이 어려워 분석하지 못하였다.
실시예 3. 담배 잎에서
RsMYB1
및
RsTT8
전사체의 동시 발현을 통한 일과성 검정(transient assay)
안토시아닌 합성에는 MYB1과 TT9 전사인자가 모두 관여하므로, 담배 잎에서 인트론이 모두 제거되거나 일부 인트론이 유지된 RsMYB1 및 RsTT9 전사체를 동시에 발현시켜 안토시아닌 합성 수준을 분석하였다.
먼저, RsMYB1 전사체의 기능을 검정하기 위해 RsTT8 전사체(RsTT8, RsTT8-IR1, RsTT8-IR2)를 배경으로 RsMYB1, RsMYB1-IR1 또는 RsMYB1-IR2 전사체를 발현시킨 후 안토시아닌 함량을 측정한 결과, RsTT8 전사체 발현 조건 하에 RsMYB1을 발현시킨 것보다 RsMYB1-IR1 또는 RsMYB1-IR2를 발현시킬 경우 안토시아닌 함량이 증가하였고, 특히 RsMYB1-IR1 보다 RsMYB1-IR2가 안토시아닌 함량을 더 증가시킬 수 있음을 확인하였다(도 5B).
또한, RsTT8 전사체의 기능을 검정하기 위해 RsMYB1 전사체(RsMYB1, RsMYB1-IR1 및 RsMYB1-IR2)를 배경으로 RsTT8, RsTT8-IR1 또는 RsTT8-IR2 전사체를 발현시킨 후 안토시아닌 함량을 측정한 결과, RsMYB1 전사체 발현 조건 하에 RsTT8을 발현시킨 것보다 RsTT8-IR1 또는 RsTT8-IR2 를 발현시킬 경우 안토시아닌 함량이 증가한 것을 확인하였다(도 5A).
상기 결과를 통해, 인트론이 완전히 제거된 RsMYB1 또는 RsTT8 전사체 보다 일부 인트론이 유지된 RsMYB1-IR1, RsMYB1-IR2, RsTT8-IR1 또는 RsTT8-IR2 전사체를 식물체에서 발현시킬 경우 안토시아닌 함량을 증가시킬 수 있고, 특히 인트론이 유지된 'RsMYB1-IR1 또는 RsMYB1-IR2'와 'RsTT8-IR1 또는 RsTT8-IR2'를 동시에 발현시킬 경우 안토시아닌 함량 증진 효과가 더욱 우수함을 알 수 있었다.
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uses thereof
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<210> 1
<211> 1127
<212> DNA
<213> Raphanus sativus
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ggtatgttct ttttcaataa aataaaagct ggtatgttat tttttattat tttgcacaca 180
catacatata ctacgtatat tctctttctc tgtttactat atagaaatta attaacaccg 240
gggtgcacaa tcattttttc gtttttgttc atgaaaaaag tacatttata ctgttcatat 300
ttaagtttgc ctactctctt tgttggtttg tcgttcagta aatgaactca gtgaaatttc 360
cttgcacgaa cccgtgtgtt tctgttgaat acattatttc tattggtgta cttaaattct 420
tcatgataaa attttaggag acacggaagc agtccttttt catcctttta ataatattta 480
tgtcaattat tggttttgca gggctgaatc ggtgcaggaa gagttgtaga ctaagatggt 540
tgaactattt gaagccaagt atcaagagag ggaaacttaa ctctgatgaa gttgatcttc 600
ttgttcgcct tcataaactt ttgggaaaca ggtggtcttt aattgctggt agattacccg 660
gtcggactgc caatgatgtc aaaaattact ggaacaccca tttgagtaag aaacatgaac 720
caggttgcaa gacccagatg aaaaaagaaa agagaaacat tccttgctct cctactacac 780
tagcccaaaa aatcgacgtt ttcaaacctc gacctcgatc cttcaccgtt aacaacggct 840
gcagccatat tattggcatg ccaaaacctg acgttgttcc tctatgcctt cgatccaaca 900
acaccaaaaa tgtttgtgaa agtattgcta catgtaacaa agatgacgat aaatctgagc 960
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Claims (11)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 무 유래의 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 이루어진 RsMYB1 전사체를 포함하는 재조합 벡터와 무 유래의 서열번호 3 또는 4의 염기서열로 이루어진 RsTT8 전사체를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜, 무 유래의 RsMYB1 전사체와 RsTT8 전사체를 동시에 과발현시키는 단계를 포함하는, 식물체의 안토시아닌 함량을 증가시키는 방법.
- 삭제
- 무 유래의 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 이루어진 RsMYB1 전사체를 포함하는 재조합 벡터와 무 유래의 서열번호 3 또는 4의 염기서열로 이루어진 RsTT8 전사체를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물 세포로부터 무 유래의 RsMYB1 전사체와 RsTT8 전사체를 동시에 과발현시키는 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 안토시아닌 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법. - 제7항의 방법에 의해 제조된 안토시아닌 함량이 증가된 형질전환 식물체.
- 제8항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
- 무 유래의 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 이루어진 RsMYB1 전사체;와 무 유래의 서열번호 3 또는 4의 염기서열로 이루어진 RsTT8 전사체;를 유효성분으로 포함하는 식물체의 안토시아닌 함량 증가용 조성물.
- 삭제
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| KR101459584B1 (ko) * | 2013-04-23 | 2014-11-12 | 대한민국 | 신규한 안토시아닌 생합성 증진 유전자 및 이의 이용 |
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2021
- 2021-04-02 KR KR1020210043117A patent/KR102646071B1/ko active IP Right Grant
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|---|---|---|---|---|
| KR102026764B1 (ko) * | 2017-11-08 | 2019-09-30 | 대한민국 | 안토시아닌 생합성을 증진시키기 위한 재조합 벡터 및 이의 용도 |
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