KR102280955B1

KR102280955B1 - 토마토 열매의 아스코르브산 함량을 조절하는 토마토 유래 apx4 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102280955B1
Application number: KR1020210073635A
Authority: KR
Inventors: 정영희; 심재성; 도주희
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2021-06-07
Filing date: 2021-06-07
Publication date: 2021-07-23

Abstract

본 발명은 토마토(Solanum lycopersicum) 유래 APX4 (Ascorbate Peroxidase 4) 단백질 코딩 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는, 토마토 열매의 아스코르브산 함량 조절 방법에 관한 것이다.

Description

토마토 열매의 아스코르브산 함량을 조절하는 토마토 유래 APX4 유전자 및 이의 용도{APX4 gene from tomato regulating ascorbic acid content in tomato fruit and uses thereof}

본 발명은 토마토 열매의 아스코르브산 함량을 조절하는 토마토 유래 APX4 (Ascorbate Peroxidase 4) 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

토마토는 전 세계적으로 널리 재배되는 경제성 원예작물로 식이섬유질 및 기능성 물질을 많이 포함하고 있어 고기능성 경제성 품종 개발을 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히 항산화 물질 및 카로티노이드계의 리코펜(lycopene), 칼륨 등을 함유하고 있어 건강기능식품의 재료로도 각광받고 있다.

아스코르브산은 비타민 C로 작용하는 물질로서 활성화산소종(Reactive oxygen specis)을 조절하는 용해성 산화환원분자로, 인간의 경우 아스코르브산을 합성하는 guluno-1,4γ-lactone oxidase (GuLo)가 결핍되어 있어 외부 물질로부터 아스코르브산을 흡수해야 한다. 아스코르브산은 주로 식물과 과일에 많이 함유되어 있다. 식물 종에 따라 아스코르브산의 양은 매우 다양한데, 토마토의 경우 다른 과일에 비해 비교적 낮은 아스코르브산(10-40 mg/100g fw)을 포함하고 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 아스코르브산 함량이 증가된 토마토의 개발을 통해 토마토의 영양학적, 산업적 활용도가 크게 개선될 수 있다.

기존 토마토에서 아스코르브산의 함량을 증가시키기 위한 시도는 아스코르브산 합성 유전자의 발현 증가 또는 아스코르브산 분해에 관여하는 효소 활성을 억제를 통해 진행되고 있다. 아스코르브산이 식물세포에서 활성화 산소종을 제거하기 위해서는 주로 Ascorbate Peroxidase (APX)에 의한 촉매 작용이 필요하며, 이 과정에서 아스코르브산은 분해되게 된다. 따라서 토마토에서 APX 유전자의 발현을 낮추게 되면 토마토의 아스코르브산의 함량이 증가될 수 있다. 이때 APX의 발현 감소를 토마토 과실로 제한하게 되면 토마토의 전반적인 발달과정에 있어 아스코르브산 분해를 통한 항산화 기능은 보존되면서 최종 산물인 토마토 과실에서 아스코르브산이 증가하는 결과를 달성할 수 있다. 이를 위해서는 열매에서 특이적으로 기능하는 SlAPX 유전자를 동정하고 그 기능을 검증하는 연구가 필수적이다.

본 발명은 Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) 시스템을 통해 열매 특이적 발현 패턴을 보이는 SlAPX4 유전자가 토마토 과실에서 아스코르브산 함량 증가에 있어 가지는 역할을 다른 알려진 아스코르브산 함량 증가에 관여하는 SlAPX과 비교하여 분석하였다.

한편, 한국공개특허 제2019-0043841호에는 '식물체에서 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 LeMADS-RIN 유전자 편집에 의해 에틸렌 생산을 감소시키는 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제2090157호에는 '식물체의 초장, 종자 크기 및 출수기를 조절하는 야생벼 유래 APX9 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '토마토 열매의 아스코르브산 함량을 조절하는 토마토 유래 APX4 유전자 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 토마토에 존재하는 SlAPX (Solanum lycopersicum Ascorbate Peroxidase) 유전자 중 열매 발달 단계에 특이적으로 발현되는 SlAPX4와 잎에서 높게 발현되는 SlAPX6 유전자를 분리한 후 유전자 발현 억제 시스템을 통해 아스코르브산 함량 조절에 미치는 두 유전자의 기능을 분석하였다. 이를 위해 SlAPX4와 SlAPX6를 대상으로 각각 세 지역에 작용할 수 있는 VIGS 벡터를 제작하였고, 제작한 벡터를 immature green 단계의 토마토 열매에 아그로박테리움을 매개로 도입한 후 red-ripeing 단계에서 아스코르브산의 함량을 분석하였다. 그 결과 SlAPX4 유전자 침묵을 유도하는 독립적인 세 가지의 VIGS 벡터를 도입한 토마토 열매의 경우 대조군(야생형)에 비해 아스코르브산 함량이 유의미하게 증가한 반면, SlAPX6 유전자의 발현을 침묵하는 독립적인 세 가지의 VIGS 벡터를 도입한 경우 토마토 열매의 경우 아스코르브산 함량의 증가가 관찰되지 않았다. 이를 통해 열매 특이적 발현을 보이는 SlAPX4 유전자가 유전자 발현 억제를 통한 고 아스코르브산 함량 토마토 개발에 활용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 토마토(Solanum lycopersicum) 유래 APX4 (Ascorbate Peroxidase 4) 단백질 코딩 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는, 토마토 열매의 아스코르브산 함량 조절 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 토마토 유래 APX4 (Ascorbate Peroxidase 4) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 토마토 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 토마토 식물세포로부터 형질전환된 토마토 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는 열매의 아스코르브산 함량이 조절된 형질전환 토마토 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 열매의 아스코르브산 함량이 증가된 형질전환 토마토 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 토마토 유래 APX4 (Ascorbate Peroxidase 4) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 토마토 열매의 아스코르브산 함량 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명은 토마토의 열매에서 특이적으로 발현되는 SlAPX4 유전자의 발현 억제를 위한 표적 서열 및 이의 전달을 위한 벡터 시스템, 토마토 식물체로 VIGS 도입 방법, VIGS 도입 식물체 분석법을 제공한다. 또한, 본 발명에서 제시한 SlAPX4 유전자 발현 침묵을 통한 열매 내 아스코르브산 함량 증가 기술은 식물체 내 아스코르브산의 분해를 저해시켜 아스코르브산의 축적을 증가시키므로, 아스코르브산 함량이 증가된 식물체를 개발하는데 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 토마토에 존재하는 SlAPX4 (A)와 SlAPX6 (B)의 코딩 서열(coding sequence)을 보여주는 그림이다.
도 2는 SlAPX4와 SlAPX6의 토마토 열매 발달 단계별 발현 패턴을 보여주는 그래프이다.
도 3은 SlAPX4와 SlAPX6의 발현 억제를 위해 제작한 VIGS 벡터의 구조를 도식화한 그림이다.
도 4는 VIGS 벡터가 도입된 토마토 열매에서 아스코르브산 함량을 측정하여 비교한 그래프이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 토마토(Solanum lycopersicum) 유래 APX4 (Ascorbate Peroxidase 4) 단백질 코딩 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는, 토마토 열매의 아스코르브산 함량 조절 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 조절 방법에 있어서, 상기 APX4 단백질은 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열 중 167 내지 250번째 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 서열번호 2의 아미노산 서열 중 167 내지 250번째 아미노산 서열은 서열번호 1의 염기서열에서 499 내지 753번째 염기서열에 해당한다.

본 발명에 따른 토마토 유래 APX4 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 본 발명에 있어서, 용어 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 토마토 열매의 아스코르브산 함량을 조절하는 활성을 의미한다.

본 발명에 따른 토마토 열매의 아스코르브산 함량을 조절하는 방법은, 상기 토마토 유래 APX4 단백질 코딩 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시켜 비형질전환 식물체에 비해 열매의 아스코르브산 함량을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 APX4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제는 APX4 단백질 코딩 유전자에 VIGS (Virus-induced gene silencing) 시스템, RNAi 또는 안티센스 RNA, T-DNA 삽입, 내생 트랜스포존(transposon), X-레이 또는 γ-레이 조사를 통한 돌연변이 유발, 또는 CRISPR/Cas9 유전자 교정 시스템 등을 이용하여 APX4 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해(억제)하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 유전자의 발현을 저해하는 당업계의 통상의 방법이면 모두 가능할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 APX4 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 상기 APX4 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

본 발명의 상기 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, Trp 프로모터, Lac 프로모터, T7 프로모터, Tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터일 수 있으며, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 VIGS 벡터 또는 RNAi 벡터이다. VIGS는 바이러스 벡터에 식물 유전자를 도입한 후 식물체를 감염시키면, 그 도입된 유전자의 내인성 유전자가 발현이 억제되는 현상을 말한다. 이는 PTGS (Post-transcriptional gene silencing)의 일종으로서, 전사-후 (post-transcriptional), RNA 턴오버 (RNA turnover) 및 뉴클레오티드 서열 특이적 (nucleotide sequence-specific) 이라는 특징들을 가진다. 상기 VIGS 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적 (transient) 발현 벡터 및 외래 유전자가 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 (binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

재조합 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 상기 마커 유전자는 항생제 저항성 유전자(dominant drug resistance gene)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 미세조류, 미생물 등을 포함한 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(B. thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모 (예컨대, Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 식물세포이다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.

본 발명은 또한,

토마토 유래 APX4 (Ascorbate Peroxidase 4) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 토마토 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 토마토 식물세포로부터 형질전환된 토마토 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는 열매의 아스코르브산 함량이 조절된 형질전환 토마토 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 토마토 유래 APX4 단백질은 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함할 수 있고, 구체적인 내용은 전술한 것과 같다.

또한, 본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같으며, 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

식물의 형질전환에 이용되는 "식물세포"는 어떤 식물세포도 된다. 식물세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 토마토 유래 APX4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 토마토 식물세포에서 저해시키면 비형질전환 식물체 즉, 야생형 토마토에 비해 토마토 식물체의 열매 내 아스코르브산 함량이 증가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 토마토 유래 APX4 단백질 코딩 유전자의 발현 저해는 토마토 유래 APX4 유전자에 대한 센스(sense) 또는 안티센스(antisense) DNA, 또는 microRNA를 포함하는 재조합 벡터로 토마토 식물세포를 형질전환시켜 APX4 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 당업계에 공지된 유전자 발현 저해 기술을 이용할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 열매의 아스코르브산 함량이 증가된 형질전환 토마토 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 발명에 따른 열매의 아스코르브산 함량이 증가된 형질전환 토마토 식물체는 APX4 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해시켜 열매 내 아스코르브산의 함량이 증가된 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 토마토 유래 APX4 (Ascorbate Peroxidase 4) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 토마토 열매의 아스코르브산 함량 조절용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 토마토 열매의 아스코르브산 함량을 조절할 수 있는 토마토 유리 APX4 단백질 코딩 유전자를 포함하며, 상기 유전자의 발현이 저해되면, 토마토 열매의 아스코르브산 함량을 증가시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물재료 및 배양조건

본 발명에는 토마토 '마이크로톰' (Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom) 품종을 사용하였다. 토마토 씨는 MS salt 4.4 g/L, 수크로스 30 g/L 및 plant agar 8 g/L 조성의 배지에서 발아시켰으며, 22~24℃, 16시간의 광(光), 8시간 암(暗) 상태로 유지되는 배양실에서 키웠다.

2. SlAPX 유전자 발현 패턴 분석

토마토 SlAPX4와 SlAPX6 유전자의 발현 패턴을 비교 분석하기 위해 Sol Genomics Network의 Tomato Expression Database (TED) (http://ted.bti.cornell.edu/) 및 '마이크로톰' 토마토를 이용하였다. 마이크로톰 토마토에서 유전자의 발현 패턴을 분석하기 위해 각 발달 단계에 해당하는 식물 시료를 채취한 뒤, 액체질소를 이용하여 균질화 하였다. 이후 RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Germany)를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 300 ng의 RNA를 대상으로 AMPIGENE cDNA Synthesis Kit (ENZO, USA)를 이용하여 cDNA를 제작한 후 Realtime PCR 분석을 실시하였다. Realtime PCR 분석은 1/10로 희석된 cDNA 4 ㎕, 멸균증류수 3 ㎕, 정방향 프라이머 2 ㎕, 역방향 프라이머 2 ㎕, SYBR Green (Qiagen, Germany) 10 ㎕를 넣은 후 95℃에서 15분 후, 95℃ 20초, 55℃ 30초, 72℃ 30초로 50 주기를 수행하였으며, 매 주기마다 형광신호를 검출하였다. 유전자 발현 분석에 사용한 프라이머 정보는 표 1에 기재하였다.

본 발명에 사용된 프라이머 정보

프라이머 명칭	염기서열 (5'→3') (서열번호)	용도
qSlAPX4_F	GACGTTTGATCGGAGAAGAAATGGTG (3)	Gene expression analysis
qSlAPX4_R	CGGGTGCCTGATTGTTCCAA (4)
qSlAPX6_F	ACGACGGCGAGACTTGCCAT (5)
qSlAPX6_R	TGATCGGGATCAGAAGCAGC (6)
APX6_insert1-EcoRI-F	GTAAGGTTACCGAATTCATGACTTCCCTCACAGG (7)	SlAPX6_insert gene synthesis
APX6_insert1-BamHI-R	AGCTCGGTACCGGATCCTCCTTAATGTCCTCTC (8)
APX6_insert2-EcoRI-F	GTAAGGTTACCGAATTCGATGTTTCTGGACCTGATG (9)
APX6_insert2-BamHI-R	AGCTCGGTACCGGATCCATTTCAACCACTGC (10)
APX6_insert3-EcoRI-F	GTAAGGTTACCGAATTCTGCCAAACTGAGCAAC (11)
APX6_insert3-BamHI-R	AGCTCGGTACCGGATCCTTAGTTTCCAAGCAAATATG (12)
APX4_insert1-EcoRI-F	GTAAGGTTACCGAATTCATGGTGAAGTGTTATCCGAC (13)	SlAPX4_insert gene synthesis
APX4_insert1-BamHI-R	AGCTCGGTACCGGATCCCGTAGGATAGGATTGG (14)
APX4_insert2-EcoRI-F	GTAAGGTTACCGAATTCTTCCCAATCCTATCCTACG (15)
APX4_insert2-BamHI-R	AGCTCGGTACCGGATCCAGCGTTCTTTGTGG (16)
APX4_insert3-EcoRI-F	GTAAGGTTACCGAATTCTGCCACAAAGAACGC (17)
APX4_insert3-BamHI-R	AGCTCGGTACCGGATCCTTACTCAGCATCTGC (18)
pYL156-V-intP-F	GTTTGAGGGAAAAGTAGAGAACG (19)	target gene screening
NOT-terminator	AAGACCGGCAACAGGATTC (20)	target gene screening

3. 재조합 벡터 제작

토마토 SlAPX4와 SlAPX6 유전자의 발현 침묵을 유도하기 위해서 각 유전자마다 VIGS 시스템을 통해 침묵을 유도할 수 있는 표적 유전자 서열 세 지역을 선별한 뒤(표 2), 각 유전자를 합성하여 pUCIDT-Amp에 삽입하였다(cosmogenetech, Korea). 그 후 삽입된 유전자를 95℃에서 5분 후, 95℃ 30초, 57℃ 30초, 72℃ 20초로 25 주기를 수행하고 72℃에서 5분간 안정화시켰으며, PCR 산물을 아가로스 겔에 로딩하여 결과물을 확인하였다. 확인된 밴드를 Gel extraction kit (cosmogentech, Korea)를 사용하여 25 ㎕로 용출하여 insert 산물을 준비하였다. TRV2(pYL156)는 E.coli stock 5 ㎕을 카나마이신 50 ㎎/L이 함유된 LB 액체배지 (LB broth High Salt 25 g/L)에 접종하여 37℃에서 하루 동안 배양한 뒤, Nucleospin plasmid easypure kit (MACHEREY-NAGEL, Germany)를 통해 플라스미드를 추출하였다. 추출한 플라스미드는 EcoRI과 BamHI을 처리하여 37℃에서 하루 동안 반응시켜 절단시켰으며, 제한효소로 절단된 TRV2(pYL156) 벡터 4 ㎕, insert 4 ㎕, T4 ligase (cosmogentech), 10X 버퍼 (cosmogentech) 1 ㎕, 멸균증류수 2 ㎕를 넣고 상온에서 2분 30초, 얼음에서 10분 처리하여 라이게이션(ligation)을 진행하여 재조합 벡터 [TRV2(pYL156)::SlAPX4 insert, TRV2(pYL156)::SlAPX6 insert]를 제작하였다. 제작된 재조합 벡터를 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) GV3101에 삽입하였다. 유전자 존재 유무는 PCR과 염기서열 분석을 통해 확인하였다. insert 합성 및 PCR 분석에 사용된 프라이머 정보는 표 1에 기재하였다.

VIGS 시스템을 통한 유전자 침묵 유도를 위한 SlAPX4 및 SlAPX6 유전자 insert 정보

		표적 서열
SlAPX4	insert 1	ATGGTGAAGTGTTATCCGACGGTGAGCGAAGAGTATCAAAAAGCAGTTGAAAAATGTAAGAGGAAGCTCAGAGGACTTATCGCCGAGAAGAATTGTGCTCCGATTATGCTGAGATTAGCATGGCATTCAGCAGGGACATATGATGTCAAAACCAAAACTGGTGGTCCATTTGGAACAATCAGGCACCCGAATGAACTTAAACATGGAGCTAACAATGGTCTTGATATTGCTGTTCGACTTTTGGAGCCGATCAAGGAACAGTTCCCAATCCTATCCTACG (서열번호 21)
	insert 2	TTCCCAATCCTATCCTACGCTGACTTTTATCAGTTGGCTGGAGTAGTTGCTGTTGAAGTTACGGGAGGCCCCGATATTCCTTTTCATCCTGGGAGACAGGACAAGACAGAACCACCTCCAGAAGGCCGCTTGCCTGACGCCACCAAAGGCTCAGATCATCTGAGGGAGGTTTTTGGACACATGGGATTGAGTGATAAAGACATTGTTGCTTTATCTGGTGGTCACACTCTGGGAAGGTGCCACAAAGAACGCT (서열번호 22)
	insert 3	TGCCACAAAGAACGCTCAGGATTTGAGGGAGCATGGACCAACAACCCTCTCATATTTGACAATTCCTATTTCAAGGAGCTTTTGAGTGGAGAGAAAGAAGGTCTCCTCCAGCTACCATCAGACAAAGCACTCTTAGAAGATCCAGTCTTCCGCCCTCTAGTCGAGAAATATGCTGCAGATGAAGATGCATTCTTTGCTGATTATGCTGAAGCTCATTTGAAGCTCTCGGAGCTCGGATTTGCAGATGCTGAGTAA (서열번호 23)
SlAPX6	insert 1	ATGACTTCCCTCACAGGCGCCACCTCTCATCTCCTCCCCTCCGCCACCATCGCCGCCACATCCGCCTCCACGACGGCGAGACTTGCCATTTCATTCTCCTCCTCCTCTTCTTCTTCTCTTAAACGCATTCGATCATCTCCTCTCCTTCCCCACATATTCCGCTACCAGAAACGATCATTGATTGGAACAACTTCTAGTGGAAGATTCAGTACATTCGCTTCGCCGAAATGCGCTGCTTCTGATCCCGATCAGTTGAAAAGTGCAAGAGAGGACATTAAGGA (서열번호 24)
	insert 2	GATGTTTCTGGACCTGATGAATGTCCAGAAGAGGGAAGGCTTCCTGATGCTGGCCCCCCTAACCCTTCATCTCATTTGCGAGATGTCTTCTACAGAATGGGACTAAATGATAAGGAAATTGTTGCACTTTCTGGGGCACACACTTTGGGGAGATCCAGACCAGAGCGTAGTGGTTGGGGCAAGCCAGAAACAAGATACACGAAAGATGGACCAGGAAGCCCTGGAGGACAATCATGGACTGTGCAGTGGTTGAAAT (서열번호 25)
	insert 3	TGCCAAACTGAGCAACCTTGGTGCTAAATTTGATCCACCTGAGGGTTTCTCAATAGACAATAATCCTACACAAGTTCAACCAGAGAAGTTCGTGGCAGCAAAATACTCAACTGGAAAGAGAGAGCTCTCGGATGCTATGAAACAAAAGATTCGAGCAGAATACGAAGGCTTGGGAGGAACCCCAGATAAGCCTCTCCCGACGAACTATTTTCTCAATATCATAATTGTGATTGGTGTTTTGGCAATTTTGACATATTTGCTTGGAAACTAA (서열번호 26)

4. 토마토 식물체 VIGS 시스템 도입

재조합 벡터를 포함하고 있는 아그로박테리움 튜메파시엔스(A. tumefaciens) GV3101을 리팜피신 50 ㎎/L, 카나마이신 50 ㎎/L이 함유된 YEP 액체배지 (yeast extract 10 g/L, peptone 10 g/L, NaCI 5 g/L, pH 7.2)에서 하루 동안 배양시킨다. 배양된 균액 0.5 ㎖에 리팜피신 50 ㎎/L, 카나마이신 50 ㎎/L가 포함된 YEP 액체 배지 5 ㎖을 넣어준 뒤, O.D₆₀₀ 값이 0.8~1.0이 될 때까지 배양하고 원심분리하여 균주를 포집하였다. 그 후 상기 균주를 계대했던 배지와 1:1의 비율로 10 mM MgCl₂를 첨가하여 재부유시킨 후, MgCl₂를 첨가하며 OD₆₀₀에서 1.0을 맞춰주었다. 200 μM 아세토시린곤(acetosyringone)와 10 mM MES를 첨가 후 상온에서 4시간 동안 암배양하였다. 그 후 토마토 mature green 단계의 열매에 균액을 주입하였다.

5. 아스코르브산 분석

열매에서 아스코르브산 측정은 Abcam사의 Ascorbic Acid Assay Kit를 이용하여 측정되었다. 야생형과 VIGS 시스템을 통해 유전자 침묵을 유도시킨 식물체의 ripen red 상태 열매를 실험에 이용하였다. 열매 조직 40 mg을 PBS 용액으로 세척한 후 400 ㎕의 멸균증류수와 함께 튜브에 넣어 균질기를 이용하여 균질화시킨 후 샘플을 4℃에서 13,000 rpm으로 5분간 원심분리한 후 상등액을 취해 제조사의 분석법에 따라 분광광도계(microplate reader)를 이용하여 OD₅₉₃에서 각 샘플의 아스코르브산 함량을 측정하였다.

실시예 1. 토마토에서 SlAPX 유전자 발현양상 확인

본 발명자들은 토마토에 존재하는 SlAPX 유전자 중 토마토 열매에서 아스코르브산 함량 조절에 있어 SlAPX4 (Solyc09g007270) 유전자의 기능을 분석하기 위하여 기존에 토마토에서 아스코르브산 함량 조절에 관여하는 것으로 알려져 있는 SlAPX6 (Solyc11g01855) 유전자와의 비교 분석을 실시하였다. 유전자 서열 분석을 통해 SlAPX4와 SlAPX6는 서열 유사도가 높지 않은 유전자임을 확인하였다(도 1). 그 후, SlAPX4 및 SlAPX6의 발현 패턴을 Heinz 품종과 마이크로톰을 대상으로 분석하였다. Sol Genomics Network의 Tomato Expression Database (TED)를 통해 Heinz에서 SlAPX4는 토마토 열매에서 발현되며, 특히 열매 발달 후반부에 발현이 크게 증가하는 것으로 나타났다(도 2A). SlAPX4와 달리 SlAPX6는 잎 조직에서 가장 높은 발현 패턴을 보였으며, 토마토 열매에서는 Immature green 단계에서 가장 높은 발현을 보인 후 점차 감소하는 패턴을 보였다(도 2A). 상기와 같은 발현 패턴은 토마토 마이크로톰 품종에서도 유사하게 관찰되었다(도 2B). 또한 두 유전자의 발현 패턴을 비교 분석한 결과 SlAPX4가 SlAPX6에 비해 열매 조직에서 보다 높은 발현량을 보였음을 알 수 있었다(도 2C). 이상의 결과를 통해 SlAPX4는 열매 발달 후반부에 발현이 증가하는 유전자이고 SlAPX6는 잎에서 높게 발현되며 열매 발달 단계에서는 발현이 낮은 유전자임을 확인하였다.

실시예 2. SlAPX4 또는 SlAPX6 유전자 침묵에 의한 아스코르브산 함량 변화

토마토 열매 아스코르브산 함량 조절에 있어 SlAPX4와 SlAPX6 유전자의 기능을 비교·분석하기 위하여 각 유전자의 발현을 침묵시킬 수 있는 VIGS 시스템을 도입하였다. SlAPX4와 SlAPX6 유전자의 발현을 침묵시키기 위해 유전자의 코딩 서열(coding sequence)의 세 지역을 대상으로 VIGS 벡터 (TRV1, TRV2:insert)를 제작하였다(도 3). 각 벡터의 insert는 SlAPX4와 SlAPX6 유전자의 서열 중 250~300 bp의 서열로 상세 서열은 표 2에 제시하였다. 제작한 재조합 벡터는 아그로박테리움 GV3103을 매개로 mature green 단계의 토마토 열매에 주입하였다. 감염 후 3주 경과 후 Ripen Red 시기의 열매를 수확하여 열매 내 아스코르브산 함량을 분석한 결과 SlAPX4 유전자를 침묵시켰을 때, 대조군에 비해 아스코르브산 함량이 높게 나타난 것을 확인하였다(도 4A). 이에 비해 SlAPX6 유전자를 침묵시켰을 경우, 대조군에 비해 아스코르브산 함량이 증가하지 않고 오히려 감소하였다(도 4B). 이 결과들을 토대로 SlAPX4 유전자가 토마토 열매에서 특이적으로 아스코르브산 함량을 조절함을 규명하였고，SlAPX4 유전자 침묵을 통해 토마토 열매 내 아스코르브산 함량 증가를 유도할 수 있음을 확인하였다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> APX4 gene from tomato regulating ascorbic acid content in tomato fruit and uses thereof <130> PN21170 <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 753 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Solanum lycopersicum <400> 1 atggtgaagt gttatccgac ggtgagcgaa gagtatcaaa aagcagttga aaaatgtaag 60 aggaagctca gaggacttat cgccgagaag aattgtgctc cgattatgct gagattagca 120 tggcattcag cagggacata tgatgtcaaa accaaaactg gtggtccatt tggaacaatc 180 aggcacccga atgaacttaa acatggagct aacaatggtc ttgatattgc tgttcgactt 240 ttggagccga tcaaggaaca gttcccaatc ctatcctacg ctgactttta tcagttggct 300 ggagtagttg ctgttgaagt tacgggaggc cccgatattc cttttcatcc tgggagacag 360 gacaagacag aaccacctcc agaaggccgc ttgcctgacg ccaccaaagg ctcagatcat 420 ctgagggagg tttttggaca catgggattg agtgataaag acattgttgc tttatctggt 480 ggtcacactc tgggaaggtg ccacaaagaa cgctcaggat ttgagggagc atggaccaac 540 aaccctctca tatttgacaa ttcctatttc aaggagcttt tgagtggaga gaaagaaggt 600 ctcctccagc taccatcaga caaagcactc ttagaagatc cagtcttccg ccctctagtc 660 gagaaatatg ctgcagatga agatgcattc tttgctgatt atgctgaagc tcatttgaag 720 ctctcggagc tcggatttgc agatgctgag taa 753 <210> 2 <211> 250 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Solanum lycopersicum <400> 2 Met Val Lys Cys Tyr Pro Thr Val Ser Glu Glu Tyr Gln Lys Ala Val 1 5 10 15 Glu Lys Cys Lys Arg Lys Leu Arg Gly Leu Ile Ala Glu Lys Asn Cys 20 25 30 Ala Pro Ile Met Leu Arg Leu Ala Trp His Ser Ala Gly Thr Tyr Asp 35 40 45 Val Lys Thr Lys Thr Gly Gly Pro Phe Gly Thr Ile Arg His Pro Asn 50 55 60 Glu Leu Lys His Gly Ala Asn Asn Gly Leu Asp Ile Ala Val Arg Leu 65 70 75 80 Leu Glu Pro Ile Lys Glu Gln Phe Pro Ile Leu Ser Tyr Ala Asp Phe 85 90 95 Tyr Gln Leu Ala Gly Val Val Ala Val Glu Val Thr Gly Gly Pro Asp 100 105 110 Ile Pro Phe His Pro Gly Arg Gln Asp Lys Thr Glu Pro Pro Pro Glu 115 120 125 Gly Arg Leu Pro Asp Ala Thr Lys Gly Ser Asp His Leu Arg Glu Val 130 135 140 Phe Gly His Met Gly Leu Ser Asp Lys Asp Ile Val Ala Leu Ser Gly 145 150 155 160 Gly His Thr Leu Gly Arg Cys His Lys Glu Arg Ser Gly Phe Glu Gly 165 170 175 Ala Trp Thr Asn Asn Pro Leu Ile Phe Asp Asn Ser Tyr Phe Lys Glu 180 185 190 Leu Leu Ser Gly Glu Lys Glu Gly Leu Leu Gln Leu Pro Ser Asp Lys 195 200 205 Ala Leu Leu Glu Asp Pro Val Phe Arg Pro Leu Val Glu Lys Tyr Ala 210 215 220 Ala Asp Glu Asp Ala Phe Phe Ala Asp Tyr Ala Glu Ala His Leu Lys 225 230 235 240 Leu Ser Glu Leu Gly Phe Ala Asp Ala Glu 245 250 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gacgtttgat cggagaagaa atggtg 26 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cgggtgcctg attgttccaa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 acgacggcga gacttgccat 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tgatcgggat cagaagcagc 20 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gtaaggttac cgaattcatg acttccctca cagg 34 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 agctcggtac cggatcctcc ttaatgtcct ctc 33 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gtaaggttac cgaattcgat gtttctggac ctgatg 36 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 agctcggtac cggatccatt tcaaccactg c 31 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gtaaggttac cgaattctgc caaactgagc aac 33 <210> 12 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 agctcggtac cggatcctta gtttccaagc aaatatg 37 <210> 13 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gtaaggttac cgaattcatg gtgaagtgtt atccgac 37 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 agctcggtac cggatcccgt aggataggat tgg 33 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gtaaggttac cgaattcttc ccaatcctat cctacg 36 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 agctcggtac cggatccagc gttctttgtg g 31 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gtaaggttac cgaattctgc cacaaagaac gc 32 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 agctcggtac cggatcctta ctcagcatct gc 32 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gtttgaggga aaagtagaga acg 23 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 aagaccggca acaggattc 19 <210> 21 <211> 280 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APX4 insert1 <400> 21 atggtgaagt gttatccgac ggtgagcgaa gagtatcaaa aagcagttga aaaatgtaag 60 aggaagctca gaggacttat cgccgagaag aattgtgctc cgattatgct gagattagca 120 tggcattcag cagggacata tgatgtcaaa accaaaactg gtggtccatt tggaacaatc 180 aggcacccga atgaacttaa acatggagct aacaatggtc ttgatattgc tgttcgactt 240 ttggagccga tcaaggaaca gttcccaatc ctatcctacg 280 <210> 22 <211> 253 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APX4 insert2 <400> 22 ttcccaatcc tatcctacgc tgacttttat cagttggctg gagtagttgc tgttgaagtt 60 acgggaggcc ccgatattcc ttttcatcct gggagacagg acaagacaga accacctcca 120 gaaggccgct tgcctgacgc caccaaaggc tcagatcatc tgagggaggt ttttggacac 180 atgggattga gtgataaaga cattgttgct ttatctggtg gtcacactct gggaaggtgc 240 cacaaagaac gct 253 <210> 23 <211> 255 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APX4 insert3 <400> 23 tgccacaaag aacgctcagg atttgaggga gcatggacca acaaccctct catatttgac 60 aattcctatt tcaaggagct tttgagtgga gagaaagaag gtctcctcca gctaccatca 120 gacaaagcac tcttagaaga tccagtcttc cgccctctag tcgagaaata tgctgcagat 180 gaagatgcat tctttgctga ttatgctgaa gctcatttga agctctcgga gctcggattt 240 gcagatgctg agtaa 255 <210> 24 <211> 281 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APX6 insert1 <400> 24 atgacttccc tcacaggcgc cacctctcat ctcctcccct ccgccaccat cgccgccaca 60 tccgcctcca cgacggcgag acttgccatt tcattctcct cctcctcttc ttcttctctt 120 aaacgcattc gatcatctcc tctccttccc cacatattcc gctaccagaa acgatcattg 180 attggaacaa cttctagtgg aagattcagt acattcgctt cgccgaaatg cgctgcttct 240 gatcccgatc agttgaaaag tgcaagagag gacattaagg a 281 <210> 25 <211> 256 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APX6 insert2 <400> 25 gatgtttctg gacctgatga atgtccagaa gagggaaggc ttcctgatgc tggcccccct 60 aacccttcat ctcatttgcg agatgtcttc tacagaatgg gactaaatga taaggaaatt 120 gttgcacttt ctggggcaca cactttgggg agatccagac cagagcgtag tggttggggc 180 aagccagaaa caagatacac gaaagatgga ccaggaagcc ctggaggaca atcatggact 240 gtgcagtggt tgaaat 256 <210> 26 <211> 271 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APX6 insert3 <400> 26 tgccaaactg agcaaccttg gtgctaaatt tgatccacct gagggtttct caatagacaa 60 taatcctaca caagttcaac cagagaagtt cgtggcagca aaatactcaa ctggaaagag 120 agagctctcg gatgctatga aacaaaagat tcgagcagaa tacgaaggct tgggaggaac 180 cccagataag cctctcccga cgaactattt tctcaatatc ataattgtga ttggtgtttt 240 ggcaattttg acatatttgc ttggaaacta a 271

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 토마토(Solanum lycopersicum) 유래 APX4 (Ascorbate Peroxidase 4) 단백질 코딩 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는, 토마토 열매의 아스코르브산 함량 조절 방법.
제1항에 있어서, 상기 토마토 유래 APX4 단백질 코딩 유전자의 발현 조절은 APX4 유전자의 발현을 저해하여 아스코르브산 함량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 토마토 열매의 아스코르브산 함량 조절 방법.
제2항에 있어서, 상기 APX4 유전자의 발현 저해는 VIGS (Virus-induced gene silencing), RNAi 또는 안티센스 RNA, T-DNA 삽입, 내생 트랜스포존(transposon), 방사선 조사 또는 유전자 교정 시스템을 통한 돌연변이 유발을 이용하여 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는 토마토 열매의 아스코르브산 함량 조절 방법.
토마토 유래 APX4 (Ascorbate Peroxidase 4) 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 토마토 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 토마토 식물세포로부터 형질전환된 토마토 식물체를 재분화하는 단계;를 포함하는 열매의 아스코르브산 함량이 조절된 형질전환 토마토 식물체의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 토마토 유래 APX4 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해시켜 야생형에 비해 열매의 아스코르브산 함량이 증가된 것을 특징으로 하는 형질전환 토마토 식물체의 제조방법.
제4항 또는 제5항의 방법에 의해 제조된 열매의 아스코르브산 함량이 증가된 형질전환 토마토 식물체.
제6항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 토마토 유래 APX4 (Ascorbate Peroxidase 4) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 토마토 열매의 아스코르브산 함량 조절용 조성물.