KR102424687B1

KR102424687B1 - 식물의 흰잎마름병 저항성을 조절하는 벼 유래 OsCP2 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102424687B1
Application number: KR1020200058631A
Authority: KR
Inventors: 니노 마존; 김미선; 조용구
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2020-05-15
Filing date: 2020-05-15
Publication date: 2022-07-25
Also published as: KR20210141232A

Abstract

본 발명은 식물의 흰잎마름병 저항성을 조절하는 벼 유래 OsCP2(Oryza sativa cysteine proteinase 2) 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 OsCP2 유전자의 발현을 조절하여 흰잎마름병에 저항성을 갖는 새로운 식물체를 개발하는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

식물의 흰잎마름병 저항성을 조절하는 벼 유래 OsCP2 유전자 및 이의 용도{OsCP2 gene from Oryza sativa for controlling bacterial leaf blight disease resistance of plant and uses thereof}

본 발명은 식물의 흰잎마름병 저항성을 조절하는 벼 유래 OsCP2 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)은 그람음성 박테리아로서 벼 흰잎마름병의 주요 병원체이며 전 세계적으로 벼의 박테리아성 질병의 주원인으로 알려져 있다. 흰잎마름병균은 기주 식물체의 상처 또는 배수조직을 통해 감염되며 피복조직을 통해 증식되고 관다발계를 통해 이동한다. 분자마커 연구를 통해 얻어진 흰잎마름병균의 다양성, 분포도, 계통 및 감염성에 대한 상관관계는 흰잎마름병균의 계통정보에 대한 보다 많은 이해를 도와주었고, 아시아에서 발생하는 흰잎마름병균들이 지역에 따라 서로 다른 양상을 나타내고 있음을 보여주었다. 한국형 흰잎마름병균의 계통은 필리핀형(64% 차이) 및 일본형(58% 차이)과 계통학적 차이를 보였고, 이러한 한국형 흰잎마름병균은 다른 나라에 비해 유전적 변이가 심화된 계통으로 감염경로가 보다 다양할 것으로 예상된다. 한국형 K1 균주는 Xa1과 Xa3 유전자를 보유하고 있는 벼 품종의 확산에 의해 감소되는 추세이이지만, K2와 K3 균주는 한국에서 계속해서 증식하고 있는 상황이다. 새로운 병원체인 K3a는 2003년에 심각한 흰잎마름병 피해를 주었던 K3와 동일한 감염 양상을 보이고 있다.

지금까지는 이러한 식물 병들을 방제하기 위해 농약을 이용한 화학적 방제법이 주로 사용되어져 왔지만 그 독성으로 인하여 병원체뿐만 아니라 주변 다른 생물에게도 해를 끼쳐 자연 생태계의 파괴를 일으키는 폐해를 가져왔다. 이러한 문제점을 해결하기 위한 방법으로 식물이 처해 있는 환경 및 생태조건을 고려하여 물리적·생물학적 방제수단을 적절히 혼용하여 농약의 사용을 줄이거나, 분자생물학적 방법 및 육종법 등을 이용하여 저항성을 가지고 있는 품종의 도입 및 개량 등을 통해 병 발생 자체를 억제하는 방법에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다.

한편, 한국등록특허 제1636154호에는 '흰잎마름병 저항성 메틸전이효소 및 이를 이용한 형질전환 식물체'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1754804호에는 '식물 병 저항성을 증가시키는 BrCP3 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 식물의 흰잎마름병 저항성을 조절하는 벼 유래 OsCP2 유전자 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 벼의 1번 염색체에 존재하는 OsCP2(Oryza sativa cysteine protease 2, LOC_01g73980) 유전자를 과발현하는 벼 형질전환체를 제조한 후 흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae strain K3a)을 접종한 결과, OsCP2 과발현 벼 형질전환체가 대조구 식물체(야생형 동진벼, 흰잎마름병 감수성)에 비해 병변 길이가 감소된 것을 알 수 있었고, 이를 통해 OsCP2 유전자가 흰잎마름병에 대한 식물체의 저항성을 증가시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCP2(Oryza sativa cysteine protease 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsCP2 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 흰잎마름병(bacterial leaf blight disease) 저항성을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCP2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 흰잎마름병 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 흰잎마름병 저항성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCP2 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 흰잎마름병 저항성 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명의 OsCP2 유전자를 과발현시킨 형질전환 식물체는 흰잎마름병에 대한 저항성이 증대되므로, OsCP2 유전자의 발현 조절을 통해 흰잎마름병에 대한 저항성이 증가된 형질전환 식물체를 개발하여 농작물의 생산성을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 벼 유래 OsCP2 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 모식도이다.
도 2A는 벼의 CP(cysteine protease) 패밀리 단백질에 보존된 도메인(Peptidase_C1 superfamily)을 나타낸 모식도이고, 도 2B는 벼 표준 유전체(Nipponbare 품종) 내 OsCP2 유전자와 본 발명의 클로닝된 OsCP2 유전자(Oryza sativa cv. Jinbaek)의 염기서열을 비교한 결과이며, 도 2C는 벼(Oryza sativa), 애기장대(Arabidopsis thaliana) 및 배추(Brassica rapa) 유래 CP 단백질들간의 유연관계를 나타낸 계통수이다.
도 3A는 다양한 OsCP2 과발현 벼 형질전환체 중에서 단일 카피(single copy) 도입 형질전환체를 선발하기 위해 서던 블롯(Southern blot)을 수행한 결과이고, 도 3B는 선발된 벼 형질전환체 내 OsCP2 유전자 도입 유무를 확인하기 위해 PCR을 수행한 결과이다. HPT(hygromycin phosphotransferase): 선발 마커 유전자.
도 4는 흰잎마름병에 대해 감수성 품종인 야생형 동진벼(Donjin), 흰잎마름병 저항성 품종인 진백벼(Jinbaek) 및 본 발명의 OsCP2 과발현 벼 형질전환체(OsCP2-15, OsCP2-25 및 OsCP2-26)에 흰잎마름병원균(X. oryzae pv. oryzae strain K3a)을 접종하고 14일 후 각 식물체의 병변 길이(lesion length)를 측정한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCP2(Oryza sativa cysteine protease 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsCP2 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 흰잎마름병(bacterial leaf blight disease) 저항성을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 식물체의 흰잎마름병 저항성을 조절하는 방법은, 상기 OsCP2 단백질 코딩 유전자를 식물세포에서 과발현시켜 식물체의 흰잎마름병에 대한 저항성을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 OsCP2 단백질의 범위는 벼로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 본 발명에 있어서, 용어 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 흰잎마름병 저항성을 조절하는 활성을 의미한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 OsCP2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 유전자의 범위는 OsCP2 단백질을 코딩하는 게놈 DNA, cDNA 및 합성 DNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 OsCP2 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)을 포함할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 명세서에서, 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 발현 또는 클로닝을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들면, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보솜 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ 프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터일 수 있으며, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서, 용어 "프로모터"란 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 제미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

재조합 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 상기 마커 유전자는 항생제 내성 유전자(antibiotics resistance gene)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 원핵세포의 예로는, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

본 발명의 벡터를 진핵세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 원핵세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCP2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 흰잎마름병 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 흰잎마름병 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 OsCP2 단백질의 범위는 전술한 것과 같다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 흰잎마름병 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법은 상기 OsCP2 단백질 코딩 유전자를 식물세포에서 과발현시켜 식물체의 흰잎마름병에 대한 저항성 또는 내성을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

또한, 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 제조방법에 의해 제조된 흰잎마름병 저항성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

본 발명의 형질전환 식물체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCP2 단백질 코딩 유전자를 식물세포에서 과발현시켜 식물체의 흰잎마름병에 대한 저항성이 비형질전환체에 비해 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 식물체는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 당근, 미나리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽일 수 있고, 바람직하게는 단자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 벼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCP2 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물체의 흰잎마름병 저항성 조절용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 식물체의 흰잎마름병에 대한 저항성을 조절할 수 있는 벼 유래 OsCP2 단백질 코딩 유전자를 포함하며, 상기 유전자의 발현이 증가되면 식물체의 흰잎마름병에 대한 저항성을 증가시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명은 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물재료

아그로박테리움 매개 형질전환 방법(Agrobacterium-mediated transformation)을 이용하여 흰잎마름병에 대한 저항성을 나타내는 벼 유래 OsCP2 유전자를 흰잎마름병 감수성 품종인 동진벼(Oryza sativa cv. Dongjin)에 도입하여 형질전환체를 육성하였으며, 흰잎마름병 저항성에 대한 OsCP2 유전자의 기능 검정을 위해 흰잎마름병 저항성 품종인 진백벼(Oryza sativa cv. Jinbaek)를 대조구로 이용하였다.

2. 벼에서 시스테인 프로테아제 2(OsCP2)의 분리

진백벼의 어린 잎을 사용하여 RNAiso Plus extraction reagent(Takara Bio Inc., 일본)로 총 RNA를 추출한 후 추출된 RNA 1㎍을 주형으로 하여 Superscript III First-Strand cDNA Synthesis 키트(Invitrogen, 미국)로 first-strand cDNA를 합성하였고, OsCP2의 PCR 증폭을 위해 표 1의 프라이머 세트를 사용하였다. PCR 과정은 전변성 95℃ 5분; 변성(denaturation) 95℃ 30초, 결합(annealing) 55℃ 30초, 신장(extension) 72℃ 2분의 과정을 총 35회 반복; 최종 신장 72℃ 10분;의 조건으로 수행하였다. PCR 산물 확인을 위해 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)가 포함된 1%(w/v) 아가로스 겔을 이용하여 전기영동하였고 Gel purification kit(Bioneer, 한국)를 사용하여 PCR 산물을 정제하였다. 정제된 PCR 산물은 pGEMT-easy 벡터(Promega, 미국)에 서브클로닝하고 Macrogen Inc.(Korea)에 의뢰하여 서열을 분석하였다.

본 발명에 사용된 프라이머 세트 정보

Gene ID	ORF (bp)	Source	Seq(5'→3') (서열번호)	Size (bp)	Tm (℃)	GC (%)
LOC_01g73980	1,098	O.sativa cv. Jinbaek	F:GGGGTACCAGCTTGCAACAATGGCGG (3)	26	68	62
LOC_01g73980	1,098	O.sativa cv. Jinbaek	R:GCTCTAGACTGATTTAATTTAAGCGTTC (4)	28	56	36

3. 재조합 벡터 구축 및 벼 형질전환체의 육성

OsCP2(LOC_01g73980.1) 유전자의 ORF cDNA를 T4 ligase 키트(Promega, 미국)를 사용하여 pCAMBIA1300 벡터(Takara, 일본)의 35S 프로모터와 Tnos 터미네이터 사이에 삽입하였고, 선발 마커 유전자로 사용된 hptII 유전자를 35S 프로모터와 CaMV 터미네이터 사이에 삽입하여 식물 형질전환용 벡터 'pCAMBIA1300::OsCP2'를 구축하였다(도 1).

그 다음, 상기 pCAMBIA1300::OsCP2 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) strain EHA105는 카나마이신(kanamycin, 50㎎/L)이 포함된 AB 배지의 28℃ 암조건에서 배양하여 선발하였다. 형질전환된 아그로박테리움 튜머파시엔스는 AAM 배지에 현탁하여 최종 농도 OD₆₀₀에서 0.01로 맞춘 후 실험에 사용하였다. 10일 동안 배양시킨 동진벼 종자 유래 캘러스를 아그로박테리움 튜머파시엔스 현탁액에서 3분간 감염시키고 건조시킨 후 0.4% 젤라이트(gelrite)가 포함된 2N6-AS 배지에서 배양하였고, 아그로박테리움 튜머파시엔스와 캘러스의 공동배양은 25℃의 암조건에서 진행하였다. 그리고 캘러스에서 아그로박테리움 튜머파시엔스를 제거하기 위해 카베니실린(carbenicillin, 500 ㎎/L)이 포함된 증류수를 이용하여 세척하였다. 세척이 끝난 캘러스는 하이그로마이신(hygromycin, 50 ㎎/L)과 카베니실린(400 ㎎/L)이 포함된 2N6-CP 배지에서 32℃의 광조건으로 2주간 배양하였다. 이후 증식된 캘러스를 MSR-CP 배지로 옮겨 뿌리와 줄기의 신장을 유도하고 지속적인 계대배양을 실시하였으며, 캘러스에서 재분화된 식물체는 토양으로 옮겨 온실에서 재배하였다. 조직배양과 형질전환에 사용한 배지의 조성은 표 2와 같다.

4. 게놈 DNA 추출 및 서던 블롯(Southern blot) 분석

액체질소로 냉각시킨 0.25 g의 벼 잎을 2 ㎖의 튜브에 담아 분쇄하고 CTAB 버퍼(pH 7.8~8.0) 900 ㎕를 첨가하여 65℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 얻은 상층액에 페놀(phenol):클로로폼(chloroform):이소아밀알코올(isoamyl alcohol)이 25:24:1 비율로 혼합된 용액 700 ㎕을 첨가하고 볼텍스 기기를 이용하여 충분히 혼합하였다. 다시 12,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 수득하고 이소프로판올(isopropanol) 300 ㎕을 첨가하여 20분 동안 -20℃ 냉동고에서 반응시켰다. 4℃, 12,000 rpm 조건에서 15분간 원심분리한 후 튜브 바닥의 침전물이 떨어지지 않도록 하여 상층액을 제거하고 70 % 에탄올 400 ㎕을 첨가하여 DNA 세척을 수행한 다음 4℃, 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하고 피펫으로 에탄올을 제거하여 건조시켰다. 건조 후 TE buffer 50 ㎕에 DNA를 녹였고, RNase(RNase stock 20 ㎕, nuclease free-water 10 ㎖) 1 ㎕를 첨가하고 37℃에 10분 동안 반응시켜 게놈 DNA를 추출하였다.

또한, 서던 블롯을 수행하기 위해 10㎍의 게놈 DNA를 제한효소 EcoRⅠ으로 밤새 37℃에서 반응시켜 절단한 후 절단된 DNA를 1% 아가로스 겔에서 전기영동하고 Hybond-N+ 멤브레인(Amersham Bioscience, 미국)으로 트랜스퍼하였다. 상기 멤브레인은 DIG Easy Hyb 버퍼를 이용하여 42℃에서 1시간 동안 반응시켜 미리 혼성화시켰고, 이후 DIG-표지된 프로브(2 ㎕ probe/ 1 ㎖ buffer; HPT 유전자)를 첨가하고 42℃에서 밤새 반응시켜 혼성화시켰다. 그 다음, 멤브레인을 세척용액(2×SSC, 0.1% SDS)을 이용하여 25℃에서 5분 동안 2번 세척하였고, 다시 세척용액(01×SSC, 0.5% SDS)을 이용하여 68℃에서 15분 동안 2번 세척하였다. DIG-표지된 DNA는 DIG Nucleic Acid Detection 키트(Roche Molecular Biochemicals, 미국)를 사용하여 검출하였다.

5. 벼 형질전환체의 흰잎마름병에 대한 저항성 분석

7주령의 OsCP2 과발현 벼 형질전환체, 야생형 동진벼(흰잎마름병 감수성) 및 진백벼(흰잎마름병 저항성)에 흰잎마름병원균(X. oryzae pv. oryzae strain K3a, 10⁸ CFU/㎖)을 접종하고 14일간 배양한 후 식물체 당 2개의 잎에서 평균 병변 길이를 측정하였다.

6. 표현형 분석

OsCP2 과발현 벼 형질전환체 및 야생형 동진벼를 50% 피트(peat)와 50% 토양(farm soil)의 혼합물로 채워진 트레이에서 3주간 배양하고 30×15 cm의 실험 농장에 이식한 후 N-P2O5-K2O 비료를 90-45-47 kg/ha로 처리하고, 충북대학교에서 수행되고 있는 쌀 재배 표준법에 따라 재배관리를 수행하였다. 그리고 초장(height), 이삭 길이(panicle length), 줄기 길이(culm length), 유효분얼(productive tillers)의 수, 낟알 길이(grain length) 및 낟알 너비(grain width)와 같은 형태적 특징을 관찰하였다.

7. 통계분석

데이터는 ANOVA(analysis of variance)를 통해 분석되었고, 표현형 관련 데이터의 경우 대조군인 야생형 동진벼와 비교하여 SAS 9.4M5(SAS Institute Inc, https://www.sas.com)를 사용하여 분석하였으며, 저항성 관련 데이터는 DMRT(Duncan's Multiple Range test)를 통해 분석하였다.

실시예 1. OsCP2 유전자의 특성 분석

벼의 1번 염색체에 존재하는 OsCP2(Oryza sativa cysteine protease 2, LOC_01g73980) 유전자는 C1A 군집에 속하는 것으로 알려진 파파인-유사 시스테인 프로테아제(papain-like cysteine protease)의 하나로서(도 2A), 1,098 bp의 CDS를 가지고 있고 365개의 아미노산을 코딩하고 있음을 확인하였다. 분자량과 등전점은 각각 40.7195 kDa, 6.6439로 예측되었다. 또한 OsCP2 유전자는 표준 유전체(Nipponbare 품종)와 비교하여 100%의 상동성을 보였고(도 2B), 클로닝된 OsCP2와 다른 작물과의 계통발생학적 유연관계를 분석한 결과 OsCP2는 XCP2(At1g20850)와 밀접한 관계가 있음을 확인하였다(도 2C).

실시예 2. 벼 형질전환체의 특성 확인

OsCP2 유전자 과발현 형질전환체로부터 단일 카피(single copy) 도입 개체를 선발고자 벼 형질전환체 T₀로부터 추출된 게놈 DNA를 사용하여 서던 블롯을 수행한 결과, 총 10개의 벼 형질전환체 중 단일 카피가 존재하는 개체가 총 8개임을 확인하였고, 이 중에서 OsCP2-15, OsCP2-25 및 OsCP2-26을 선발하여 실험에 사용하였다(도 3A). 또한, 상기 OsCP2-15, OsCP2-25 및 OsCP2-26을 대상으로 PCR을 수행한 결과, 선발마커 HPT 유전자와 OsCP2 유전자의 밴드가 증폭된 것을 통해 OsCP2 유전자가 성공적으로 도입되었음을 확인하였다(도 3B).

또한, 벼 형질전환체를 대상으로 형태적·농업적 분석을 수행한 결과, 대부분 벼 형질전환체의 초장(height), 이삭 길이(panicle length), 줄기 길이(culm length), 유효분얼(productive tillers)의 수, 낟알 길이(grain length) 또는 낟알 너비(grain width)가 야생형 동진벼과 유사하거나 더 우수한 표현형을 나타내는 것을 확인하였다(표 3).

실시예 3. 벼 형질전환체의 흰잎마름병균에 대한 저항성 평가

OsCP2 과발현 벼 형질전환체(OsCP2-15, OsCP2-25 및 OsCP2-26)에 흰잎마름병원균을 접종하고 14일간 배양한 후 야생형 동진벼와 벼 형질전환체의 병변 길이(lesion length)를 측정하여 식물체 내 OsCP2 유전자 과발현이 흰잎마름병원균 저항성에 미치는 영향을 확인하였다.

그 결과, 야생형 동진벼의 병변 길이는 약 16.1 cm이고 벼 형질전환체의 병변 길이는 약 5~9 cm로, 야생형 동진벼가 OsCP2 과발현 벼 형질전환체에 비해 흰잎마름병에 대한 손상 정도가 매우 심각한 수준임을 확인하였다. 그리고, 흰잎마름병 저항성 품종인 진백벼는 다른 실험군과 비교하여 병변 길이가 가장 짧았다(도 4).

상기 결과를 통해, OsCP2 유전자가 식물체에서 과발현되면 흰잎마름병에 대한 저항성이 증가되는 것을 알 수 있었고, OsCP2 유전자의 발현 조절을 통해 식물체의 흰잎마름병에 대한 저항성을 조절할 수 있을 것으로 사료되었다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> OsCP2 gene from Oryza sativa for controlling bacterial leaf blight disease resistance of plant and uses thereof <130> PN20103 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1098 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggcggctt caatgaattc gaagcttccc ctggctcttg tgctcctcct gctgtgcggc 60 ggcgcatgcg tagcggtagc catgcccagt gaattgtcca tagttggcta ctcggaggag 120 gatctggcgt cgcatgagag gctgatggag ctgttcgaga agttcatggc caagtaccgc 180 aaggcctact ccagcttgga ggagaagctg aggaggttcg aggtgttcaa ggacaacctc 240 aaccacatcg acgaggagaa caagaagatc accggctact ggctgggcct caacgagttc 300 gccgacctca cccacgacga gttcaaggct gcctacctcg gcctcaccct cactccggcg 360 aggaggaaca gcaacgatca gttgttcagg tacgaggagg tggaggcggc aagtttgccg 420 aaggaggtgg actggaggaa gaagggggcg gtgacggagg tgaagaacca ggggcagtgc 480 ggcagctgct gggcgttctc gacggtggcg gcggtggagg ggatcaacgc catcgtgacc 540 ggcaacctga cgcgcctgtc ggagcaggag ctcatcgact gcgacaccga cggcaacaac 600 ggctgcagcg gcggcctcat ggactacgcc ttctcctaca tcgccgccaa cggcggcctc 660 cacaccgagg agtcctaccc gtacctgatg gaggaaggca cctgccgccg cggcagcacg 720 gagggggacg acgacggcga ggcggcggcg gcggtgacca tctccgggta cgaggacgtg 780 ccgaggaaca acgagcaggc cctgctcaag gccctggccc accagcccgt cagcgtcgcc 840 atcgaggcct caggcaggaa cttccagttc tacagcgggg gtgtgtttga tggtccgtgc 900 ggcacgcggc tggatcatgg cgtgacggcc gttggatacg ggacggccag caagggacac 960 gattacatca tcgtgaagaa ctcgtgggga tcgcattggg gtgagaaggg gtacatccgg 1020 atgaggaggg gcaccggcaa gcacgacggc ctctgcggca tcaacaagat ggcctcctac 1080 ccaaccaaga acgcttaa 1098 <210> 2 <211> 365 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Ala Ala Ser Met Asn Ser Lys Leu Pro Leu Ala Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Cys Gly Gly Ala Cys Val Ala Val Ala Met Pro Ser Glu Leu 20 25 30 Ser Ile Val Gly Tyr Ser Glu Glu Asp Leu Ala Ser His Glu Arg Leu 35 40 45 Met Glu Leu Phe Glu Lys Phe Met Ala Lys Tyr Arg Lys Ala Tyr Ser 50 55 60 Ser Leu Glu Glu Lys Leu Arg Arg Phe Glu Val Phe Lys Asp Asn Leu 65 70 75 80 Asn His Ile Asp Glu Glu Asn Lys Lys Ile Thr Gly Tyr Trp Leu Gly 85 90 95 Leu Asn Glu Phe Ala Asp Leu Thr His Asp Glu Phe Lys Ala Ala Tyr 100 105 110 Leu Gly Leu Thr Leu Thr Pro Ala Arg Arg Asn Ser Asn Asp Gln Leu 115 120 125 Phe Arg Tyr Glu Glu Val Glu Ala Ala Ser Leu Pro Lys Glu Val Asp 130 135 140 Trp Arg Lys Lys Gly Ala Val Thr Glu Val Lys Asn Gln Gly Gln Cys 145 150 155 160 Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Thr Val Ala Ala Val Glu Gly Ile Asn 165 170 175 Ala Ile Val Thr Gly Asn Leu Thr Arg Leu Ser Glu Gln Glu Leu Ile 180 185 190 Asp Cys Asp Thr Asp Gly Asn Asn Gly Cys Ser Gly Gly Leu Met Asp 195 200 205 Tyr Ala Phe Ser Tyr Ile Ala Ala Asn Gly Gly Leu His Thr Glu Glu 210 215 220 Ser Tyr Pro Tyr Leu Met Glu Glu Gly Thr Cys Arg Arg Gly Ser Thr 225 230 235 240 Glu Gly Asp Asp Asp Gly Glu Ala Ala Ala Ala Val Thr Ile Ser Gly 245 250 255 Tyr Glu Asp Val Pro Arg Asn Asn Glu Gln Ala Leu Leu Lys Ala Leu 260 265 270 Ala His Gln Pro Val Ser Val Ala Ile Glu Ala Ser Gly Arg Asn Phe 275 280 285 Gln Phe Tyr Ser Gly Gly Val Phe Asp Gly Pro Cys Gly Thr Arg Leu 290 295 300 Asp His Gly Val Thr Ala Val Gly Tyr Gly Thr Ala Ser Lys Gly His 305 310 315 320 Asp Tyr Ile Ile Val Lys Asn Ser Trp Gly Ser His Trp Gly Glu Lys 325 330 335 Gly Tyr Ile Arg Met Arg Arg Gly Thr Gly Lys His Asp Gly Leu Cys 340 345 350 Gly Ile Asn Lys Met Ala Ser Tyr Pro Thr Lys Asn Ala 355 360 365 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggggtaccag cttgcaacaa tggcgg 26 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gctctagact gatttaattt aagcgttc 28

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCP2(Oryza sativa cysteine protease 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하여 형질전환된 식물세포에서 OsCP2 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물체의 흰잎마름병(bacterial leaf blight disease) 저항성을 증가시키는 방법.
삭제
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCP2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하여 형질전환된 식물세포에서 OsCP2 유전자를 과발현시키는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 야생형에 비해 흰잎마름병 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법.
제3항의 방법에 의해 제조된 야생형에 비해 흰잎마름병 저항성이 증가된 형질전환 식물체.
삭제
제4항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCP2 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 흰잎마름병 저항성 증가용 조성물.