KR20160025829A

KR20160025829A - 특정 아미노산 함량을 증가시키는 산왕거미 유래의 AvMaSp 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20160025829A
Application number: KR1020140113190A
Authority: KR
Inventors: 김도훈; 양원태; 진병래; 이광식
Original assignee: 동아대학교 산학협력단
Priority date: 2014-08-28
Filing date: 2014-08-28
Publication date: 2016-03-09

Abstract

본 발명은 산왕거미 유래의 AvMaSp(Araneus ventricosus major ampullate spidroin) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AvMaSp 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물의 특정 아미노산 함량을 증가시키는 방법, 산왕거미 유래의 AvMaSp 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AvMaSp 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 특정 아미노산 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 특정 아미노산 함량이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 산왕거미 유래의 AvMaSp 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물체의 특정 아미노산 함량 증가용 조성물에 관한 것이다.

Description

특정 아미노산 함량을 증가시키는 산왕거미 유래의 AvMaSp 유전자 및 이의 용도{AvMaSp gene increasing specific amino acid content from Araneus ventricosus and uses thereof}

본 발명은 특정 아미노산 함량을 증가시키는 산왕거미 유래의 AvMaSp 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 산왕거미 유래의 AvMaSp(Araneus ventricosus major ampullate spidroin) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AvMaSp 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물의 특정 아미노산 함량을 증가시키는 방법, 산왕거미 유래의 AvMaSp 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AvMaSp 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 특정 아미노산 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 특정 아미노산 함량이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 산왕거미 유래의 AvMaSp 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물체의 특정 아미노산 함량 증가용 조성물을 제공한다.

거미에서 생산되는 실크는 화학적 조성이 밝혀지면서 화장품, 의약품 등 기능성 식품의 소재로 개발이 활발히 진행되고 있다. 실크 피브로인 단백질은 18종의 아미노산으로 구성되어 있는데 주성분은 글리신, 알라닌과 세린으로 이들은 항산화 작용, 간 기능 개선 작용, 인슐린 분비 촉진 작용, 혈중 콜레스테롤 상승억제 작용, 신경계 질환 예방 및 개선 작용 등의 임상적 효과가 입증되었고, 숙취제거제, 기능성 음료, 화장품, 비누, 치약, 염모제 및 창상피복제 등의 제품생산도 이루어지고 있다. 실크 아미노산의 소화 흡수율은 90% 이상으로 매우 높다. 실크 단백질은 상기 효능뿐만 아니라 변비가 해소되고 노인들의 피부에 나타나는 갈색 반점도 적어진다. 특히 일본에서는 실크 분말을 케이크, 우동, 음료, 과자 등에 넣어 상품화하고 있다. 그러나 이러한 거미 메이저 엠플레이트 피브로인 실크 단백질이 가진 구조적 특징에도 불구하고 아직까지 거미 실크 단백질을 이용한 벼 형질전환 식물체 개발은 이루어지지 않았다. 벼에 존재하는 유전자가 아닌 외래의 유전자를 도입함으로서 유전자의 침묵 현상을 회피할 수 있고, 또한 몇 가지 유용 아미노산의 생합성을 위해서는 각각의 아미노산 생합성 유전자를 클로닝하여 도입해야 하지만 실크 피브로인 유전자는 단일 유전자의 도입에 의해 특정 유용 아미노산들의 생합성을 유도할 수 있는 장점이 있다. 아울러 본 발명은 실크 단백질을 이용한 새로운 접근과 시도이다. 그리고 본 발명은 벼뿐만 아니라 타 작물에도 응용 가능하다는 점에서 중요하고 산업적으로도 유용하게 이용될 수 있다.

한편, 한국공개특허 제2013-0049409호에서는 '산왕거미 유래 메이저 엠풀레이트 스피드로인 단백질의 반복적인 Ｃ-말단 영역의 폴리펩티드 서열 및 이를 코딩하는 염기서열'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1220455호에서는 '산왕거미 추출물을 포함하는 면역세포증가용 약학적 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, 특정 아미노산 함량을 증가시키는 산왕거미 유래의 AvMaSp 유전자 및 이의 용도에 관해서는 밝혀진 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 산왕거미 유래의 메이저 엠플레이트 스피로인(major ampullate spidroin) 단백질을 코딩하는 AvMaSp 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 형질전환시킨 벼 식물체를 제조하였고, 상기 형질전환된 벼 식물체가 야생형 식물체보다 글리신, 알라닌 및 세린의 특정 아미노산 함량이 증가하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 산왕거미 유래의 AvMaSp(Araneus ventricosus major ampullate spidroin) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AvMaSp 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물의 특정 아미노산 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 산왕거미 유래의 AvMaSp 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AvMaSp 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 특정 아미노산 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 특정 아미노산 함량이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 산왕거미 유래의 AvMaSp(Araneus ventricosus major ampullate spidroin) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물체의 특정 아미노산 함량 증가용 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 산왕거미 유래의 메이저 엠플레이트 스피로인 단백질을 코딩하는 AvMaSp 유전자가 과발현된 형질전환 벼의 종자 내 글리신, 알라닌과 세린 아미노산 함량이 증가된다는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 아미노산 조성 및 구조가 유사한 거미 피브로인 유전자를 식물에 도입함으로써 생리 기능 향상을 위한 기능성 물질의 대량생산이 가능할 것으로 기대된다.

도 1은 산왕거미 유래의 메이저 엠플레이트 스피로인 단백질을 코딩하는 AvMaSp 유전자와 배유 특이 발현 프로모터가 포함된 pPZP200 벡터 구조체를 나타낸다.
도 2는 동진벼 캘러스를 이용하여 산왕거미 유래의 AvMaSp 유전자가 도입된 과발현 형질전환 벼 제작과정을 나타낸다.
도 3은 T₀ 형질전환 벼를 대상으로 AvMaSp 유전자의 도입 여부를 PCR로 조사한 결과(A), 게놈 DNA를 분리하여 서던 블롯 분석 방법으로 1 카피 형질전환 벼를 선발한 결과(B)를 나타낸다.
도 4는 선발된 형질전환 벼를 대상으로 AvMaSp 유전자의 발현 양상을 조사하였다. 서던 블롯 분석을 이용하여 1 카피 형질전환체를 검정하였고(A), 형질전환 벼의 종자로부터 RNA를 추출하여 유전자 발현양상을 확인하였다(B). 또한, 형질전환 벼의 종자로부터 단백질을 추출하여 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 단백질 발현 양상을 검정하였다(C).
도 5는 형질전환 벼의 종자를 수확하여 종자 내 아미노산 함량을 분석한 결과, 글리신, 알라닌 및 세린 아미노산 함량이 증가하는 것을 확인한 결과이다. WT: 야생형 벼 식물체, OsAvMaSp: AvMaSp 유전자를 과발현하는 벼 형질전환 식물체.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산왕거미 유래의 AvMaSp(Araneus ventricosus major ampullate spidroin) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AvMaSp 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물의 특정 아미노산 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 AvMaSp 유전자 서열은 재조합 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 재조합 벡터는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 벡터, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다.

AvMaSp 유전자 각각의 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 (binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터 또는 Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 상부의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성 (constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이며, 본 발명에서는 항시성 프로모터의 사용이 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제 (NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacteriumtumefaciens)의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터, 파세올린 (phaseoline) 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 유전자 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트 (glyphosate) 또는 포스피노트리신 (phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신 (kanamycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol), G418, 블레오마이신 (Bleomycin)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 유전자총-매개 형질전환 방법 (bombardment), 아그로박테리움-매개 형질전환법, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 DEAE-덱스트란 처리법 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 AvMaSp 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, AvMaSp 유전자는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열 (추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 특정 아미노산은 글리신(glycine), 알라닌(alanine) 또는 세린(serine)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은

산왕거미 유래의 AvMaSp(Araneus ventricosus major ampullate spidroin) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 특정 아미노산 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같다.

또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 AvMaSp 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 식물체는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 단자엽 식물이며, 더욱 바람직하게는 벼 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 산왕거미 유래의 AvMaSp(Araneus ventricosus major ampullate spidroin) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물체의 특정 아미노산 함량 증가용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 AvMaSp 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 AvMaSp 유전자 또는 상기 AvMaSp 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환함으로써 식물체의 특정 아미노산 함량을 증가시킬 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. AvMaSp 유전자를 과발현하는 형질전환 벼 식물체의 제조 및 상기 형질전환 벼 식물체에서 특정 아미노산 함량의 변화 분석

본 실험은 우리나라 재배 품종인 동진벼를 사용하였다. 산왕거미 유래의 메이저 엠플레이트 스피로인 단백질을 코딩하는 유전자(AvMaSp , 진뱅크 등록번호 JN857964.1)에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머(정방향 프라이머 5'-GGATCCATGGCCGCCGCAGCCGCA-3'(서열번호 3) 및 역방향 프라이머 5'-GTCGACTAACGCTGCGGCAGAGGC-3'(서열번호 4))를 제작하였고, PCR 방법을 이용하여 유전자의 코딩(coding) 영역을 증폭하였다. 증폭된 산물을 pGemT 벡터에 클로닝하여 시퀀싱을 통해 유전자의 염기서열을 확인하였다.

산왕거미 유래의 AvMaSp 유전자를 동진벼에 형질전환하여 AvMaSp 유전자가 과발현하는 형질전환체를 만들었다. 벼의 형질전환체 생산과정을 간략히 살펴보면 다음과 같다. AvMaSp 유전자의 코딩(coding) 영역을 종자 배유 특이발현 프로모터(GluC promoter), 제초제 저항성 유전자(Bar)와 Nos 터미네이터를 포함하는 pPZP200 벡터에 클로닝하여 유전자가 항상 강하게 발현하는 CaMV 35S 프로모터에 의해서 조절되는 pAvMaSp-바 구조체를 만들었고, 트리페렌탈 메이팅(triparental mating) 방법으로 아그로박테리움 튜메파시엔스 EHA105(Agrobacterium tumefaciens EHA105)으로 옮겼다. 동진벼 캘러스에 구조체가 포함된 아그로박테리움 튜메파시엔스 EHA105를 형질전환하여 과발현 형질전환체 식물체를 제작하였다(도 1 및 도 2).

T₀ 형질전환 식물체에서 AvMaSp 유전자의 도입 여부를 PCR 분석(도 3A)으로 확인한 후에 형질전환체를 선발하였다. 선발된 형질전환체를 대상으로 서던 블롯 분석 방법을 이용하여 1 카피 유전자가 도입된 계통을 선발하기 위하여 형질전환체 잎 10g을 채취하여 DNA 추출 버퍼(2% 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드, 1.4M 소듐 클로라이드, 2% 폴리비닐피롤리돈, 0.1% 아스코르브산, 0.1M 소듐 디에틸디티오카보네이트)에 65℃에서 60분간 반응시킨 후 페놀:클로로포름:이소아밀알코올(25:24:1)(Sigma, America)를 첨가하여 원심분리 하였다. 상등액을 회수하여 3M 소듐 아세테이트와 100% 에탄올을 첨가하여 -20℃에서 20분간 반응시킨 후 원심분리 하였다. 상등액을 버리고 남은 펠렛을 70% 에탄올을 이용하여 세척하여 멸균수를 이용하여 게놈 DNA을 추출하였다. 게놈 DNA를 KpnⅠ(Takara, Japan) 제한효소를 이용하여 37℃에서 24시간 반응시킨 후 0.7% 아가로스 겔에 영동하여 Hybond-N⁺나일론 막(Amersham Biosciences, UK)에 게놈 DNA를 부착시켰다. 게놈 DNA가 부착된 나일론 막은 [³²P] dCTP로 표지된 프로브(바스타 유전자)를 20%(w/v) SDS, 20X SSPE, 100 g/L PEG(8,000 mwt), 250 mg/L 헤파린, 그리고 10ml/L Hearing sperm DNA(10 mg/ml)가 포함된 용액과 함께 65℃에서 하루 밤 동안 반응시켰다. 서던 블랏 분석 결과 1 카피 형질전환체 다수의 계통을 선발하였다(도 3B).

선발된 계통을 대상으로 벼 종자로부터 게놈 DNA를 추출하여 서던 블롯 분석을 통하여 개체별로 1 카피 여부를 확인하였고(도 4A), Trizol REAGENT(Invitrogen)을 이용하여 RNA를 분리하였다. 10㎍의 RNA를 1.2%(w/v) 변성 포름알데히드 아가로스 겔(denaturing formaldehyde agarose gel)에서 전기영동하여 나일론 막(Amersham)에 RNA를 부착시켰다. RNA가 부착된 나일론 막은 [³²P] dCTP로 표지된 프로브를 20%(W/V) SDS, 20X SSPE, 100 g/L PEG(8,000 mwt), 250 mg/L 헤파린, 그리고 10ml/L Hearing sperm DNA(10 mg/ml)가 포함된 용액과 함께 65℃에서 하루 밤 동안 반응시켰다. 개체별로 유전자 발현 양상을 확인한 결과 과발현 형질전환 벼에서 유전자가 강하게 발현하는 것을 확인하였다(도 4B). 종자로부터 PBS 버퍼(phosphate buffered saline, pH7.4)를 이용하여 단백질을 추출하여 10% 아크릴아미드 겔에서 영동하여 나일론 막-ECL(Amersham)에 부착시켰다. 단백질이 부착된 나일론 막-ECL은 AvMaSp 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 실시하여 단백질 발현양을 확인하였다(도 4C). 선발된 계통의 종자 내 아미노산 함량을 의뢰 분석한 결과 선발된 계통의 글리신, 알라닌과 세린 아미노산 함량이 증대된 것을 확인하였다(도 5).

<110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> AvMaSp gene increasing specific amino acid content from Araneus ventricosus and uses thereof <130> PN14222 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 726 <212> DNA <213> Araneus ventricosus <400> 1 atggccgccg cagccgcagc agcagctggt ggacaaggag gtcaaggtgg atatggagga 60 ttaggttccc aaggagctgg acaaggagga tatggagcag gacaaggtgc cgcggcagct 120 gcagcagcag ccgggggtgc aggaggcgca ggacgaggag gcttaggtgc tggaggtgca 180 ggacaaggat atggagctgg attaggtgga caaggaggag caggacaagc agcagctgca 240 gcagcagccg gaggagcagg aggcgcacga caaggaggct taggcgctgg tggtgcagga 300 caaggatatg gagctggatt aggtggacaa ggaggggcag gacaaggagg tgccgcggca 360 gccgcagcag cagctggtgg acaaggaggt caaggtggat atggaggatt aggttcccaa 420 ggagctggac aaggaggata tggagcagga caaggtggtg ccgctgcagc cgcagcagca 480 gctggaggac aaggaggtca aggtggatat ggtggattag gttcccaagg agctggacaa 540 ggtggatatg gaggtagaca aggtggtgca ggagccgcag cagctgcagc agcagccgga 600 ggtgcaggag gcgcaggaca aggaggatta ggtgctggtg gtgccggaca aggaggatat 660 ggaggtggtg catatggtgg acaaggtgca gcatcatctg ctgctgcagc ctctgccgca 720 gcgtaa 726 <210> 2 <211> 241 <212> PRT <213> Araneus ventricosus <400> 2 Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly 1 5 10 15 Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly 20 25 30 Ala Gly Gln Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly 35 40 45 Gly Ala Gly Arg Gly Gly Leu Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Tyr 50 55 60 Gly Ala Gly Leu Gly Gly Gln Gly Gly Ala Gly Gln Ala Ala Ala Ala 65 70 75 80 Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Arg Gln Gly Gly Leu Gly Ala 85 90 95 Gly Gly Ala Gly Gln Gly Tyr Gly Ala Gly Leu Gly Gly Gln Gly Gly 100 105 110 Ala Gly Gln Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gln 115 120 125 Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln Gly Ala Gly Gln 130 135 140 Gly Gly Tyr Gly Ala Gly Gln Gly Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 145 150 155 160 Ala Gly Gly Gln Gly Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Leu Gly Ser Gln 165 170 175 Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Arg Gln Gly Gly Ala Gly Ala 180 185 190 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly 195 200 205 Gly Leu Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gln Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Ala 210 215 220 Tyr Gly Gly Gln Gly Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ser Ala Ala 225 230 235 240 Ala <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggatccatgg ccgccgcagc cgca 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gtcgactaac gctgcggcag aggc 24

Claims

산왕거미 유래의 AvMaSp(Araneus ventricosus major ampullate spidroin) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 AvMaSp 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 식물의 특정 아미노산 함량을 증가시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 AvMaSp 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 특정 아미노산은 글리신(glycine), 알라닌(alanine) 또는 세린(serine)인 것을 특징으로 하는 방법.
산왕거미 유래의 AvMaSp(Araneus ventricosus major ampullate spidroin) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 비형질전환체에 비해 특정 아미노산 함량이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
제4항에 있어서, 상기 AvMaSp 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 특정 아미노산은 글리신(glycine), 알라닌(alanine) 또는 세린(serine)인 것을 특징으로 하는 방법.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 비형질전환체에 비해 특정 아미노산 함량이 증가된 형질전환 식물체.
제7항에 있어서, 상기 식물체는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
제7항에 있어서, 상기 특정 아미노산은 글리신(glycine), 알라닌(alanine) 또는 세린(serine)인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
제7항에 따른 식물체의 종자.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 산왕거미 유래의 AvMaSp(Araneus ventricosus major ampullate spidroin) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 식물체의 특정 아미노산 함량 증가용 조성물.