KR100974302B1 - 페투인이 발현된 감자 식물체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 페투인(fetuin) 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 식물체 및 그의 종자, 상기 벡터로 식물체를 형질전환하여 페투인 단백질을 생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 생산된 페투인 단백질에 관한 것이다. 본 발명에 따른 페투인 단백질이 발현되는 형질전환감자 식물체는 인간의 치료에 쓰이는 당단백질인 페투인을 다량으로 생산 및 분리하는데 활용이 가능할 것으로 기대된다.

페투인, 식물 발현 벡터, 감자, 당단백질

Description

페투인이 발현된 감자 식물체{Fetuin producing potato plant}

본 발명은 인간 페투인(fetuin) 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 벡터로 형질전환된 식물체 및 그의 종자, 상기 벡터로 식물체를 형질전환하여 페투인 단백질을 생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 생산된 페투인 단백질에 관한 것이다.

인간 페투인 (2-Heremans-Schmid-glycoprotein or Alpha2-HS- glycoprotein; AHSG)은 혈청에 존재하는 주요한 당단백질로 간에서 합성된다. 페투인은 두 개의 펩타이드 사슬로 이루어져 있는데 단일 mRNA로부터 전단백질이 만들어지고 두 개로 쪼개진다. 그것은 각각의 기능을 수행하는데 세포내 분열이나 뇌의 발달 그리고 골 조직의 형성에 관여한다. 페투인 프로테인은 일반적으로 미성숙한 대뇌피질이나 골수 조혈 모체의 피질에 존재한다. 페투인 단백질은 지방분해 저해와 지방생성을 자극하는데 관여하는 인슐린에 관련이 있고(Dahlman et al., diabetologia, 47, 1974-9, 2004), 석회화 대동맥협착증에서 석회침착의 유력한 저해물질로 확인되었고(Kaden et al., Int. J. Mol. Med., 2007, 20(2), 193-7), 염증을 저해하여 심근염 빈혈에 대해 억제하는 효과(Lim et al., Clin. Chem., 53(10):1835-40, 2007)등 그 생물학적 역할과 기능들이 알려지고 있다.

대부분의 의료용 단백질은 분비 경로 중에 소포체(Endoplasmic reticulum)와 골지체(Golgi apparatus)를 거치면서 단백질의 아스파라진(asparagine)에 당쇄(oligosaccharide)가 공유결합으로 부착되는 당단백질(glycoprotein)이다(Jenkinset al., Nat. Biotechnol., 14, 975-9, 1996). 당단백질에 부착된 당쇄 구조와 종류가 그 단백질의 폴딩(folding), 생물학적 활성, 혈장내 안정성 등에 큰 영향을 미치므로 원형의 당쇄 형태와 의약적 활성을 지닌 의료용 재조합 당단백질 생산을 위한 접근방법 중 현재까지 동물세포 발현 시스템이 많이 이용되어져 왔다. 하지만 낮은 생산성, 비싼 배지 비용, 레트로바이러스(retrovirus) 감염 위험을 비롯하여 안정된 세포주를 만들기 위해서 소요되는 긴 시간 등은 동물세포 배양을 이용한 재조합 당단백질 생산의 큰 제한점이 되고 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 인간의 당단백질인 페투인을 식물 형질전환 벡터를 이용해 식물체에서 발현시켜, 대상 단백질이 생산되는 감자 식물체를 개발하고 이 식물체를 통해 인간의 당단백질이 식물체에서 인간의 치료용으로 사용가능한 단백질로 사용할 수 있는지의 여부를 확인함과 동시에 페투인이 발현된 감자 식물체를 인간 치료용 당단백질을 대량 생산할 수 있는 원료로 활용하고자 하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 인간 페투인(fetuin) 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 식물체 및 그의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 식물체를 형질전환하여 페투인 단백질을 생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 생산된 페투인 단백질을 제공한다.

본 발명에 따른 인간 페투인 형질전환감자 식물체는 식물체내에서 생산되는 인간의 당단백질과 인간의 페투인 단백질간의 당쇄구조를 비교하여 그 차이점을 알아보고 식물체에서 인간 당단백질의 발현과 생산 분리 및 정제 방법을 연구하는데 활용이 가능할 것으로 기대된다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 페투인(fetuin) 유전자를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 일 구현예에 따른 재조합 식물 발현 벡터에서, 본 발명에 따른 페투인 유전자는 인간의 당단백질인 페투인을 암호화하는 임의의 페투인 유전자일 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 페투인 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.

폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다. 상기 %는 동일한 핵산 염기가 두 서열 모두에 존재하는 위치의 수를 확인하여 정합 위치의 수를 산출하고, 그 정합 위치의 수를 비교 영역 내의 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 상동성 %를 산출함으로써 계산된다. 비교를 위한 서열의 최적 배열은 공지된 연산방식의 컴퓨터에 의한 임플러먼테이션에 의해(예를 들면, GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFAST in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI, or BlastN and BlastX available from the National Center for Biotechnology Information), 또는 검사에 의해 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 상기 페투인 형질전환용 벡터는 pMBP-1 벡터이며, 이는 도 1에 기재되어 있다. 그러나, 본 발명의 페투인 형질전환용 벡터는 도 1에 기재된 벡터에 한정되지 않고, 식물 형질 전환에 유용한 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 또한, 도 1의 pMBP-1 벡터에 페투인 유전자가 삽입된 재조합 식물 발현 벡터는 바람직하게는 도 2에 기재된 벡터이다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 페투인 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(포스피노트리신)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(카나마이신), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액 틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

상기 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다. 본 발명에 따른 상기 식물체는 인간 페투인 단백질을 발현한다.

본 발명에 따른 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있다. 바람직하게는, 상기 식물체는 감자이다.

본 발명은 또한, 상기 식물체의 종자를 제공한다. 바람직하게는, 상기 종자는 감자의 종자이다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 재조합 식물 발현 벡터로 식물체를 형질전환하여 페투인 단백질을 발현시키는 단계; 및

상기 발현된 페투인 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 페투인 단백질의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 페투인 단백질의 생산 방법은 본 발명에 따른 재조합 식물 발현 벡터로 식물체를 형질전환하여 페투인 단백질을 발현시키는 단계를 포함한다. 페투인 단백질을 발현시키기 위한 형질전환 식물체의 배양은 페투인 당단백질을 암호화하는 유전자를 도입한 식물 발현용 재조합 벡터가 최적으로 발현되는 배양조건을 의미한다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식 물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다. 바람직하게는, 상기 식물체는 감자이다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태 의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

본 발명의 페투인 단백질의 생산 방법은 상기 발현된 페투인 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함한다. 인간 치료용 당단백질인 페투인의 분리는 및 정제는 본 발명의 기술적 사상 범주 내에서 당업자가 용이하게 사용하는 방법으로 다양한 과정이 적용된다. 재조합 분자가 발현된 단백질은 발현 숙주의 배양물을 정제하여 생성물을 수득함으로써 얻는다. 세정, 원심분리, 여과, 한외여과, 황산암모늄 침전, 실리카 비드의 사용, 연속적인 원심분리, 레이트 구역 구배 원심분리(rate zonal gradient centrifugation), 겔 투과, 크기 배제, 친화성 및 이온 교환과 같은 다양한 크로마토그래피 방법 등과 같은 몇 단계의 정제가 일반적으로 적용된다.

상기 형질전환감자 식물체에서 발현 가능한 재조합 인간 치료용 당단백질로는 페투인 외에도 에리트로포이에틴(erythropoietin, EPO), B형 간염 백신(hepatitis B vaccine), 인간 성장 호르몬(Human Growth Hormone, hGH), 콜로니 촉진 인자(colony-Stimulatin Factors, CSFs)가 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 의해 생산된 페투인 단백질을 제공한다. 상기 생산된 페투인 단백질은 뿌리에서 가장 많이 발현되었으며, 그 크기는 약 55 kDa이었다 (도 6 참고).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발 명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험방법

1. 식물체와 성장조건

감자 (Solanum tuberosum L. cv. Desiree)는 MS 염, 30g/L 수크로스, 스타바 비타민(Staba vitamin), 100mg/L 이노시톨과 8g/L 아가가 포함된 고체 MS(Murashige and Skoogmedium) (pH 5.8) 배지에서 16/8시간, 명/암 주기로 24±2℃에서 300 ~ 400 μmol photons m^-2 sec^-1인 빛 조건으로 배양하였다.

2. 페투인 유전자의 발현을 위한 페투인 형질전환 벡터 제작

식물체에 형질전환하기 위한 벡터에 인간 페투인 유전자(Accession #: BC052590, 유전자: Homo sapiens alpha-2-HS-glycoprotein (AHSG); fetuin)를 삽입하기 위한 주형으로 인간 페투인 유전자의 cDNA를 사용하였다. 주형으로부터 서브클로닝을 하기 위해 프라이머 말단이 각각 제한효소인 BamHI과 SacI의 서열이 들어간 정방향 프라이며 5'-GGA TCC TCT CTG GGG CAG CCA TGA AGT-3'(서열번호 2), 역방향 프라이머 5'-GAG CTC TGC CAT GTC TAG CCT AGA CC-3'(서열번호 3)으로 PCR 증폭하여 그 산물을 얻었다 (서열번호 1). 증폭된 DNA 절편(1143 nts)은 BamHI과 SacI을 사용하여 절단하고, 동일한 방법으로 절단한 pMBP-1 벡터에 서브클론하였 다. 재조합 pMBP-1 벡터는 제한효소 BamHI과 SacI으로 잘라 확인하였다. 확인된 벡터는 열충격을 가하여 아그로박테리움 균주인 LBA4404에 넣었다.

3. 감자 식물체의 형질전환과 형질전환된 감자 식물체의 선별

감자 식물체의 형질전환은 배양용기에서 3~4주 정도 지난 감자의 잎을 사용하였다. 벡터가 들어간 아그로박테리움을 100 mg/L의 카나마이신이 포함된 20ml의 YEP 액체 배양액에 넣고 28℃에서 180 rpm으로 OD₆₀₀에서의 값이 0.6이 될 때까지 배양하였다. 감자의 잎을 아그로박테리움 현탁액에 넣고 10분 동안 공동배양한 후 멸균된 여과지에 옮겨 물기를 제거하고 MS 배지에 2mg/L의 2,4-D가 포함된 CC (co-culture) 배지에서 2일 동안 배양하였다. 2일 후 MS 배지에 0.01 mg/L NAA, 0.1 mg/L GA3, 2mg/L 제아틴, 100mg/L 카나마이신, 500 mg/L 카베니실린 (carbenicillin)이 포함된 PR (plant regeneration) 배지로 옮기고 2주마다 배지를 교체하였다. 4~5주 후 재생된 식물체는 MS 배지에 100mg/L 카나마이신과 500mg/L 카베니실린이 포함된 KC 배지에서 2주 동안 배양하여 항생제 저항 여부를 확인하고 MS 배지에 옮겨주었다. 저항성 여부가 확인된 식물체에 페투인 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위하여 페투인 유전자 특이적 프라이머인 5'-CAG CGT GAG GCA GCT GAA GGA G-3'(서열번호 4)와 5'-TGG TGT CCT GGA GGA GCT GCC A-3'(서열번호 5)를 이용하여 PCR 증폭으로 일차 확인하였고, 이차확인은 제한효소 서열이 들어간 프라이머 5'-GGA TCC TCT CTG GGG CAG CCA TGA AGT-3'(서열번호 2)와 5'-GAG CTC TGC CAT GTC TAG CCT AGA CC-3'(서열번호 3)를 사용하여 PCR 증폭하여 형질전환 여부를 확인하였다.

4. 노던 블럿과 서던 블럿 분석

노던 블럿 분석은 야생형 감자 (Solanum tuberosum L. cv. Desiree)와 각각의 페투인 형질전환 감자들의 잎으로부터 페놀/SDS 방법을 이용하여 추출한 전체 RNA를 이용하여 수행하였다. 추출한 전체 RNA 25μg을 0.8% 아가로스 겔로 전기영동을 실시하고 나일론 막으로 옮겼다. 나일론 막은 PCR DIG 프로브 합성 키트(Roche Molecular Biochemicals)를 이용하여 페투인 유전자로부터 설계된 페투인 유전자 특이적 프라이머인 5'-CAG CGT GAG GCA GCT GAA GGA G-3'(서열번호 4)와 5'-TGG TGT CCT GGA GGA GCT GCC A-3'(서열번호 5)를 이용하여 증폭된 딕옥시제닌 (DIG)이 라벨링된 프로브로 혼성화하였다. 혼성화 완충액에서 42℃ 조건으로 16시간동안 혼성화를 실시하고, 막을 실온에서 5분 동안 2X SSC, 0.1% (w/v) SDS로 2회, 68℃에서 0.1X SSC, 0.1% SDS로 10분 동안 세척하고 타깃 DNA를 제조처(Roche Molecular Biochemicals)에서 제시한 방법으로 DIG 발광 감지 키트를 이용하여 확인하였다.

서던 블럿 분석은 식물체로부터 Doyle 과 Doyle(Doyle and Doyle, 1990, Focus, 12, 13-15)이 제시한 방법에 따라 2%[w/v] CTAB, 1.4M NaCl, 20mM EDTA (pH 8.0), 100mM Tris-HCl, 1% 폴리비닐피롤리돈, 10mM DTT이 포함된 추출 완충용액을 사용하여 추출한 지노믹 DNA를 사용하여 수행하였다. 10μg의 지노믹 DNA를 0.8% 아가로스 겔로 전기영동하고 나일론 막에 옮겼다. 혼성화를 위한 프로브, 혼성화 방법 및 감지는 노던 블럿 분석과 동일한 종류와 방법으로 실시하였다.

5. 웨스턴 블롯 분석

야생형과 페투인 형질전환 감자 레인의 뿌리의 모든 수용성 단백질은 각각의 뿌리를 액체질소를 사용하여 분쇄한 후 50mM Tri-Cl (pH 8.0), 100mM NaCl, 1mM EDTA (pH8.0), 0.05% Triton-100, 1X complete EDTA-free (Roche, Germany), 50mM sodium ascorbate가 포함된 완충용액을 사용하여 추출하였다. 각 시료의 단백질 20μg을 Sambrook and Russell (2001)이 제시한 방법에 따라 10% (w/v) SDS-PAGE 젤에서 분리하였다. 단백질의 분자량을 확인하기 위해 분리시 PageRulerTM Prestained Protein Ladder (Fermentas)를 함께 사용하였다. 분리된 단백질을 PVDF 막에 전사하였고, 5% (w/v) 스킴 밀크가 포함된 PBST 완충용액(1X PBS, 0.1% [v/v] Tween-20)에서 1시간 동안 블로킹하였다. PBST 완충용액으로 5분씩 세 번 세척하고 인간 페투인 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 항-인간 페투인의 IgG 분획 (Rockland)를 넣어 반응시켰다. 다시 PBST 완충용액으로 10분씩 세 번 세척하고 IgG와 결합하는 Donkey anti-Goat IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology)를 넣어 반응시킨고 PBST 완충용액으로 15분씩 세 번 세척한 후 제조처에서 제시한 방법에 따라 ECL Plus Western blotting Detection System(GE healthcare) 키트를 사용하여 반응시켰다.

실시예 1. 감자 식물체에서 인간 페투인 유전자를 발현시키가 위한 페투인 발현 벡터의 제작과 감자로의 형질전환

인간 페투인 유전자의 cDNA를 인간 페투인 유전자에 특이적인 프라이머(서열번호 2와 서열번호 3)를 사용하여 PCR 증폭하고 그 산물을 클로닝 벡터에 삽입하고, 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3' (서열번호 6)과 5'-CAGGA AACAGCTATGAC-3' (서열번호 7)로 유전자의 서열을 확인하였다. 확인된 염기 서열은 서열번호 1로 표시된다. 페투인 형질전환 벡터를 만들기 위해 식물체에서 발현되는 pMBP-1 벡터의 CaMV 35S 프로모터 뒷부분을 BamHI과 SacI 제한효소를 사용하여 자른 후 인간 페투인 유전자를 삽입하였다. 이렇게 하여 CaMV 35S 프로모터에 의해 발현되는 인간 페투인 발현 벡터가 제작되었다. 재조합 페투인 발현 벡터는 BamHI과 SacI 제한효소로 절단하여 확인하였다.

인간 페투인 발현 벡터는 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법으로 감자(cv. Desiree)에 형질전환시켰다. 총 41개의 인간 페투인 형질전환감자 식물체를 카나마이신으로 선별하였다. 인간 페투인 형질전환감자 식물체는 페투인 특이적인 프라이머 (서열번호 4 및 서열번호 5)를 사용하여 일차적으로 형질전환감자 식물체를 선별하였고, 마찬가지로 인간 페투인 특이적이 프라이머 (서열번호 2 및 서열번호 3)를 이용하여 PCR 방법으로 형질전환감자 식물체를 확인하였다 (도 3). 도 3에서 보여주는 것과 같이, 레인 PC(페투인 발현 벡터 DNA를 주형으로 한 PCR) 또는 레인 NC(야생형 식물체 DNA를 주형으로 한 PCR)는 양성 대조구와 음성대조구로 각각 사용하였다. 그 결과, 전체 형질전환추정 감자 식물체에서 화살표로 표시한 레 인 #2, #9, #12, #13, #15, #16, #21, #22, #24, #25, #26, #27, #31, #32, #34, #36, #37의 인간 페투인 형질전환감자 식물체를 선별하였다 (도 3). 이들 18개의 형질전환감자 식물체는 카나마이신에 저항성이 있고, 인간 페투인 유전자를 가지고 있다.

실시예 2. 노던 블럿 분석을 이용한 페투인 형질전환감자 식물체에서 페투인 전사체의 분석

PCR 반응을 통해 선별한 17개 레인의 페투인 형질전환감자 식물체 각각에 대하여 인간 페투인 유전자의 전사 여부 및 전사 정도를 확인하기 위하여 모든 RNA를 각각의 페투인 형질전환감자 식물체의 잎으로부터 추출하였다. 인간 페투인 유전자 특이적 프라이머를 사용한 노던 블럿 분석 결과, 야생형 감자에서는 인간 페투인 전사체가 전혀 발현되지 않음을 확인하였고, PCR을 통한 선별에서 레인 #36을 제외한 다른 모든 레인들이 삽인된 유전자로부터 전사체가 발현되고 있음을 확인하였다. 전사체의 발현이 확인된 모든 페투인 형질전환감자 식물체 중에서 다른 레인들 보다 상대적으로 페투인 전사체의 발현이 두드러지게 나타나는 페투인 형질전환감자 식물체 #16, #18, #26, #27, #32, #34을 선별하였다.

실시예 3. 서던 블럿 분석을 이용한 페투인 형질전환 감자 식물체에서 DNA에 삽입된 페투인 유전자 분석

식물체 형질전환에 의해 삽입된 페투인 유전자 복사본(copy)의 수를 확인하 기 위하여, 선별된 6개의 형질전환감자 식물체의 지노믹 DNA를 추출하고 제한효소인 BamH I으로 자른 후 노던 블럿 분석에 사용한 프로브와 동일한 프로브를 사용하여 서던 블럿 분석을 수행하였다 (도 5). 그 결과, 야생형 감자의 지노믹 DNA에서는 인간 페투인 유전자가 존재하지 않음을 확인하였고, 페투인 형질전환감자 식물체 레인 #16, #18, #26, #27, #32, #34에서 각각 1, 2, 5, 5, 2, 2개의 복사본이 식물체 형질전환에 의해 삽입되어 있음을 확인하였다.

실시예 4. 웨스턴 블럿 분석을 통한 페투인 형질전환감자 식물체에서 발현되는 인간 페투인 단백질의 분석

PCR 증폭과 노던 블롯을 통해 페투인 유전자의 식물체 내 삽입과 전사체의 발현이 확인된 형질전환감자 식물체 #16, #18, #26, #27, #32, #34의 모든 수용성 단백질을 잎, 줄기, 뿌리, 덩이줄기로부터 분리하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 그 결과, 약 55 kDa 크기의 위치에서 페투인 단백질의 밴드가 위치하고, 잎의 경우 루비스코 단백질의 양이 많아서 페투인 단백질의 밴드와 겹쳐서 나타나 페투인 단백질을 구분할 수 없었다. 뿌리, 줄기, 덩이줄기에서 페투인 단백질의 발현을 비교했을 때, 뿌리에서 가장 많이 발현됨을 확인하였다. 또한 각 라인에서 뿌리에서 추출한 모든 수용성 단백질에서 페투인 단백질의 발현을 비교하였다 (도 6). 그 결과 선별된 페투인 형질전환감자 식물체 중에서 레인 #34에서 가장 많은 페투인 단백질이 발현됨을 알 수 있었다.

레인 #34에서 발현되는 인간 페투인 단백질의 양을 알아보기 위하여 정제된 인간 페투인 단백질을 각각 5μg, 10μg, 30μg, 50μg, 80μg으로 희석해서 #34와 함께 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다 (도 7). 약 1g의 뿌리에서 모두 수용성 단백질을 추출하였을 때 약 500μg의 단백질이 추출되었고, SDS-PAGE 겔에 25μg의 단백질을 넣고 전기영동하여 웨스턴 블럿 분석을 수행한 후 희석된 페투인 단백질과 비교했을 때 약 50ng의 페투인 단백질이 발현되고 있음을 알 수 있었다. 그 결과 1μg의 모든 수용성 단백질에서 약 2ng, 다시 말해 1g의 식물체에서 약 1μg의 페투인 단백질이 포함되어 있음을 알 수 있었다.

도 1은 pMBP-1 벡터를 나타내는 그림이며,

도 2는 pMBP-1에 페투인이 삽입된 벡터의 구조를 나타내는 그림이며,

도 3은 페투인 형질전환감자 식물체를 PCR 증폭을 사용하여 선별하는 그림으로, A는 #2, #9, #11~#25를 서열번호 4번과 5번으로 PCR 증폭한 결과이고, B는 #2, #26~#41을 서열번호 4번과 5번으로 PCR 증폭한 결과이다. (레인 M; 분자의 크기 마커, 레인 PC; 페투인 형질전환 벡터 양성 대조구, 레인 NC; 야생형 음성 대조구)

도 4는 PCR 증폭으로 선별된 페투인 형질전환감자 식물체에서 페투인 유전자에 대한 프로브를 이용하여 페투인 전사체의 발현정도를 확인한 노던 블롯 분석 그림이고(레인 WT; 야생형 음성 대조구),

도 5는 선별한 인간 페투인 형질전환감자 식물체의 게놈에 들어간 페투인 유전자의 수를 확인한 서던 블롯 분석 그림이고(레인 WT; 야생형 음성 대조구),

도 6은 선별한 인간 페투인 형질전환감자 식물체에서 해독된 페투인 단백질의 양을 확인한 웨스턴 블롯 분석 그림이고 (레인 PC; 인간 페투인 양성 대조구, 레인 M; 분자의 크기마커, 레인 WT; 야생형 음성 대조구),

도 7은 야생형 감자와 선별한 페투인 형질전환감자 중 레인 #34의 뿌리에서 추출한 모든 단백질에 포함되어 있는 페투인 단백질의 양을 확인한 웨스턴 블롯 분석 그림이다 (레인 WT; 야생형 음성 대조구).

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Fetuin producing potato plant <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1143 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggatcctctc tggggcagcc atgaagtccc tcgtcctgct cctttgtctt gctcagctgt 60 ggggctgcca ctcagcccca catggcccag ggctgattta tagacaaccg aactgcgatg 120 atccagaaac tgaggaagca gctctggtgg ctatagacta catcaatcaa aaccttcctt 180 ggggatacaa acacaccttg aaccagattg atgaagtaaa ggtgtggcct cagcagccct 240 ccggagagct gtttgagatt gaaatagaca ccctggaaac cacctgccat gtgctggacc 300 ccacccctgt ggcaagatgc agcgtgaggc agctgaagga gcatgctgtc gaaggagact 360 gtgatttcca gctgttgaaa ctagatggca agttttccgt ggtatacgca aaatgtgatt 420 ccagtccaga ctcagccgag gacgtgcgca aggtgtgcca agactgcccc ctgctggccc 480 cgctgaacga caccagggtg gtgcacgccg cgaaagctgc cctggccgcc ttcaacgctc 540 agaacaacgg ctccaatttt cagctggagg aaatttcccg ggctcagctt gtgcccctcc 600 caccttctac ctatgtggag tttacagtgt ctggcactga ctgtgttgct aaagaggcca 660 cagaggcagc caagtgtaac ctgctggcag aaaagcaata tggcttttgt aaggcaacac 720 tcagtgagaa gcttggtggg gcagaggttg cagtgacctg cacggtgttc caaacacagc 780 ccgtgacctc acagccccaa ccagaaggtg ccaatgaagc agtccccacc cccgtggtgg 840 acccagatgc acctccgtcc cctccacttg gcgcacctgg actccctcca gctggctcac 900 ccccagactc ccatgtgtta ctggcagctc ctccaggaca ccagttgcac cgggcgcact 960 acgacctgcg ccacaccttc atgggtgtgg tctcattggg gtcaccctca ggagaagtgt 1020 cgcacccccg gaaaacacgc acagtggtgc agcctagtgt tggtgctgct gctgggccag 1080 tggttcctcc atgtccgggg aggatcagac acttcaaggt ctaggctaga catggcagag 1140 ctc 1143 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 ggatcctctc tggggcagcc atgaagt 27 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 gagctctgcc atgtctagcc tagacc 26 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 4 cagcgtgagg cagctgaagg ag 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 tggtgtcctg gaggagctgc ca 22 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 gtaaaacgac ggccag 16 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 caggaaacag ctatgac 17

Claims (10)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. 인간 페투인(fetuin) 유전자를 포함하는 도 2에 도시된 재조합 식물 발현 벡터로 형질전환되어 인간 페투인 단백질이 발현되는 식물체.
5. 삭제
6. 제4항에 있어서, 상기 식물체는 감자인 것을 특징으로 하는 식물체.
7. 제4항에 따른 식물체의 종자.
8. 인간 페투인(fetuin) 유전자를 포함하는 도 2에 도시된 재조합 식물 발현 벡터로 식물체를 형질전환하여 페투인 단백질을 발현시키는 단계; 및

   상기 발현된 페투인 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 페투인 단백질의 생산 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 식물체는 감자인 것을 특징으로 하는 방법.
10. 삭제

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