KR101244025B1 - 벼 형질전환용 재조합 벡터 및 이를 이용한 소 트립신의 대량생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼 형질전환용 재조합 벡터 및 이를 이용한 소 트립신의 대량생산방법에 관한 것이다.
본 발명의 벼 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된 벼에서 매우 간단한 공정을 통해 트립신을 대량으로 생산할 수 있으며 생산효율 역시 배지 1L 당 15㎎ 이상으로 매우 높다.

Description

벼 형질전환용 재조합 벡터 및 이를 이용한 소 트립신의 대량생산방법{Recombinant expression vector for rice transformation and Mass manufacturing method for bovine trypsin}

본 발명은 벼 형질전환용 재조합 벡터 및 이를 이용한 소 트립신의 대량생산방법에 관한 것이다.

효소는 이미 오래전부터 특정기질에 선택적으로 반응하는 특징으로 인해 음료수제조, 육가공, 유가공, 양조, 제빵, 유지 산업과 효소센서 등 다양한 산업현장에서 유용하게 이용되고 있다.

현재, 산업적으로 활용되는 효소 중에서도 단백질분해효소는 청국장, 새우젓, 제빵, 치즈 등의 식품산업, 소화제, 소염제 등의 의약품과 세제를 만드는 등 여러 분야에서 상업적으로 중요한 역할을 하고 있다.

특히, 단백질분해효소 중에서도 다양한 기질에 대하여 효소반응성을 나타내는 트립신은 산업적으로 유용하게 활용되고 있다.

그러나, 세포외부로 분비되어 단백질성 기질을 분해하는 특성으로 인하여, 트립신은 세포내에서는 매우 낮은 농도로 존재하고, 일단 세포외부로 분비되어 효소반응을 수행한 후에는 신속하게 분해되기 때문에, 트립신 유전자를 이용한 유전자 재조합 방법을 이용하여도, 다른 효소에 비하여 상대적으로 생산수율이 낮다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위하여, 생산된 트립신의 활성을 향상시키거나 또는 트립신의 활성을 장시간 동안 유지시키기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.

트립신은 주로 소(bovine)의 췌장에서 추출하여 생산하고 있다. 그러나, 최근 빈번하게 발생하는 광우병 등 치명적인 질병으로 인하여 소의 췌장에서 직접 트립신을 추출하는 것 보다 다른 생명체에서 소 트립신을 생산하기 위한 여러 연구가 시도되고 있다.

그러나 이러한 연구를 통한 일부 형질전환 생명체의 경우, 세포독성이 발생하기도 하였고, 수율이 낮거나 생산공정이 지나치게 복잡하여 상용화하기 어려운 문제가 있었다.

이에, 지금까지도 대부분의 트립신은 여전히 소(bovine)의 췌장에서 직접 추출하여 소비하고 있는 실정이다.

상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 소 유래의 트립신을 벼에서 대량으로 생산할 수 있는 벼 형질전환용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 상기 벼 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된 벼를 통하여 소 유래의 트립신을 대량으로 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 벼 형질전환용 재조합 벡터는 벼 유래의 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터 및 소 유래의 트립신 코딩 유전자가 전사방향으로 작동가능하게 연결되도록 구성된다.

상기 벼 유래의 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터 및 소 유래의 트립신 코딩 유전자는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있다.

그리고, 상기 벡터는 도 2에 개시된 구조의 pMYT111일 수 있다.

또한, 본 발명은 벼 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된 벼를 제공하며, 이 때 상기 벼는 바람직하게는 벼 캘러스일 수 있다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 소 유래 트립신 대량 생산 방법은 상술한 벼 형질전환용 재조합 벡터를 벼에 도입한 후, 소 유래의 트립신 코딩 유전자를 과발현하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징에 따른 소 유래 트립신 대량 생산 방법은 벼 유래의 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터 및 상기 합성된 소 유래의 트립신 코딩 유전자가 전사방향으로 작동가능하게 연결되어 있는 벼 형질전환용 재조합 벡터를 구성하는 단계, 상기 구성된 벼 형질전환용 재조합 벡터를 벼의 캘러스에 형질전환하는 단계 및 상기 형질전환된 벼의 캘러스를 배양하여 소 트립신을 수득하는 단계를 포함한다.

여기서, 벼 유래의 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터 및 소 유래의 트립신 코딩 유전자는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어질 수 있다.

그리고, 상기 벡터는 도 2에 개시된 구조의 pMYT111일 수 있다.

그리고, 벼 캘러스의 형질전환은 아그로박테리움 튜머페이션스를 이용하여 수행될 수 있다.

형질 전환된 벼 캘러스의 배양은 당 결핍 상태에서 현탁배양할 수 있다. 이때, 수득되는 트립신은 배지 1L 당 15㎎ 이상일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열 목록 2의 유전자로 코딩되는 소 유래 트립신을 제공한다.

또한, 본 발명은 식물 형질 전환용 서열목록 2의 소 유래 트립신 유전자를 제공한다.

본 발명은 소 트립신 코딩 유전자를 포함하는 특정한 벼 형질전환용 재조합 벡터를 구성하고 이를 벼에 형질전환시켜 소 트립신을 대량생산하는 방법을 제공한다. 그에 따라, 본 발명의 벼 형질전환용 재조합 벡터는 벼에 형질전환되어 소 트립신을 대량생산하는데 대단히 유용하다.

본 발명의 벼 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된 벼에서 매우 간단한 공정을 통해 트립신을 대량으로 생산할 수 있으며 생산효율 역시 배지 1L 당 15㎎ 이상으로 매우 높다.

이와 같은 본 발명의 소 트립신 생산 방법은 소 트립신을 대량생산할 수 있으므로 바이오 산업에 대단히 유용하다.

도 1a는 본 발명에서 사용된 소 트립신 코딩 유전자인 sbTrysinogen을 오버랩 PCR 방법을 통해 합성하는 방법을 나타내는 개략도이고 도 1b은 도 1a의 올리고머들의 구체적인 서열들이다.
도 2는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 벼 형질전환용 재조합 벡터 pMYT111의 구조를 나타내는 모식도이다.
도 3에서 (A)는 PCR을 통해 수득된 재조합 벼 캘러스의 소 트립신 유전자를 탐지하기 위한 전기 영동 분석 결과이고, (B)는 서던블롯의 분석 결과이다.
도 4는 형질전환 벼 캘러스 현탁배지에서 발현된 소 트립신 유전자에 대한 노던 블롯 분석결과이다.
도 5는 형질전환 벼 캘러스 현탁배지에서 발현된 소 트립신의 웨스턴 블롯 분석 결과이다.
도 6은 재조합 벼 캘러스 배지의 트립신의 자이모그램(zymogram) 분석결과이다.
도 7은 시간에 따른 소 트립신의 분석 결과이다.
도 8은 소 트립신 유전자(bTrysinogen)와 서열목록 2의 트립신 유전자(sbTrysinogen)의 대비 결과이다.

본 발명자는 벼 유래의 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터를 이용하여, 소 유래의 트립신 코딩 유전자를 발현하는 벡터를 구성하여, 소 유래의 트립신을 대량을 생산할 수 있음을 확인하여 본 발명에 이르렀다.

즉, 본 발명은 벼 유래의 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터와 소 유래의 트립신 코딩 유전자가 전사방향으로 작동 가능하게 연결되어 있는 벼 형질전환용 재조합 벡터를 제공한다

본 발명에서, 용어 "재조합"은 세포가 이종의 유전자를 복제하거나, 상기 유전자를 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 유전자에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 DNA 단편(들), 유전자 분자를 세포 내로 전달할 수 있는 수단을 지칭할 때 사용된다. 벡터는 숙주세포에서 독립적으로 DNA를 복제시키고, 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다.

용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한, 이와 같은 발현 유전자 서열인 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

"프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다.

본 발명에서, 소 유래의 트립신 코딩 DNA를 벼 캘러스에 도입시키는데 이용될 수 있는 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터일 수 있다.

본 발명에서 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 유전자 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자 서열이 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 벼 형질전환용 제조합 벡터에서, 프로모터로는 벼에서 소 트립신의 대량생산에 적합하며, 당 결핍배지에서 상기 트립신을 생산할 수 있는 벼 유래의 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터(서열번호 1) 가 사용될 수 있으며 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함하는 프로모터가 사용될 수 있다. 여기서 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 유전자 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서 사용되는 프로모터인 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터는 외래 단백질의 발현량이 높아, 소 트립신의 대량생산의 목적 달성에 적합하다. 또한, 당이 고갈된 상태에서 단백질 분해 효소 활성이 현저히 낮으므로, 당 고갈 상태에서 강력하게 발현되는 프로모터가 발현된 소 트립신의 분해 가능성을 낮출 수 있어 바람직한데, 본 발명의 일 구현예에서 사용되는 프로모터인 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터는 당이 고갈된 상태에서 강력하게 발현되므로, 본 발명의 목적 달성에 바람직하다. 만일, 통상의 식물체 형질전환에 사용되는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터를 사용하는 경우 발현되는 소 트립신의 분해 속도가 높아, 목적하는 소 트립신의 축적을 기대할 수 없게 된다.

따라서, 본 발명의 벼 형질전환용 재조합 벡터는 상기 벼 유래의 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터에 소 유래의 트립신 코딩 유전자가 전사방향으로 작동가능하게 연결되도록 구성된다.

여기서 '작동가능하게 연결된(operatively linked to)'은 유전자 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 유전자 서열(예컨대, 소 유래의 트립신 코딩 유전자)사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 유전자 서열의 전사 및/또는 해독 과정을 조절하게 된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 소 유래의 트립신 코딩 유전자는 통상의 소에서 발현되는 트립신을 코딩하는 서열로서 벼 캘러스와 같은 식물에서 발현될 수 있는 것이면 제한 없이 사용될 수 있으나, 서열번호 2로 표시되는 소 유래의 트립신 코딩 유전자를 사용할 수 있다. 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 벼 형질전환용 재조합 벡터는 터미네이터를 포함할 수 있다. 상기 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 바람직할 수 있다.

본 발명의 벼 형질전환용 재조합 벡터는 소 유래 트립신 유전자와 프로모터 유전자를 벼 캘러스 세포에 도입할 수 있는 것이면 특별한 제한이 없으나, 도 2에 개시된 구조의 pMYT111일 수 있다.

본 발명은 또한 상술한 벼 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된 벼를 제공하며, 이 때 상기 벼는 바람직하게는 벼 캘러스일 수 있다.

식물의 형질전환은 유전자(DNA)를 식물에 전이시켜 이루어진다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 유전자(DNA)를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법 (Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 유전자 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한 소 트립신의 대량생산 방법을 제공한다. 구체적으로 (1) 소 유래의 트립신 코딩 유전자를 합성하는 단계, (2) 벼 유래의 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터 및 상기 합성된 소 유래의 트립신 코딩 유전자가 전사방향으로 작동가능하게 연결되어 있는 벼 형질전환용 재조합 벡터를 구성하는 단계, (3) 상기 구성된 벼 형질전환용 재조합 벡터로 벼의 캘러스를 형질전환하는 단계 및 (4) 상기 형질전환된 벼의 캘러스를 배양하여 소 트립신을 수득하는 단계를 포함한다.

먼저 (1) 단계로서 공지의 소 유래의 트립신 코딩 유전자를 합성하는 단계를 수행하며, 본 발명에서는 오버랩 PCR 방법을 이용하였지만 이에 제한되는 것은 아니며 다양한 공지의 방법을 통해 소 유래의 트립신 코딩 유전자를 합성할 수 있다.

다음 (2) 단계로서 상술한 본 발명의 벼 형질전환용 재조합 벡터를 구성한다. 그 뒤 (3) 단계로서 상기 구성된 벼 형질전환용 재조합 벡터로 벼의 캘러스를 형질전환한다. 마지막으로 (4) 단계로서 형질전환된 벼의 캘러스를 배양하여 소 트립신을 수득하게 되며, 이 경우 여러가지 배양방법을 사용할 수 있으나 바람직하게는 분비되는 외래 단백질을 용이하게 정제할 수 있는 현탁배양 방법을 사용한다.

한편, 본 발명의 대량생산 방법을 통해 생산된 트립신의 생산효율은 배지 1L 당 15㎎ 이상으로 매우 수치를 나타내었다(도 5, 7 참조)

이하, 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 소 트립신 코딩 유전자의 합성

GeneBank (assession number D38507)의 소 트립신 유전자의 염기서열을 바탕으로 하고, 컴퓨터 분석을 통하여 트립신 유전자 mRNA의 안정성에 영향을 주는 염기서열을 분석하였다.

트립신 유전자 유전자의 코돈(codon)을 벼의 고빈도 사용 코돈(codon)으로 치환하기 위하여 Kazusa DNA Research Institute (KDRI)의 코돈 사용 데이터(codon usage data)(http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html)를 이용하여 트립신 유전자에 나타난 벼의 코돈 사용 빈도를 확인하였다.

그리고, 이를 바탕으로 트립신 유전자의 코돈 사용을 최적화 하였다. 유전자 분석프로그램인 DNASIS 프로그램을 이용하여 소 트립신 유전자 유전자의 코돈 사용을 분석하고 벼의 코돈 사용과 비교하였다.

소 트립신 유전자의 247개의 코돈 중에서 벼에서 낮은 빈도로 사용되고 있는 코돈은 94개로서 약 38%의 코돈이 벼의 코돈으로서는 부적절한 것으로 확인되었으며, 이러한 컴퓨터 분석 결과를 바탕으로 최적의 소 트립신 유전자 유전자의 염기서열(이하, 소 유래 트립신 유전자: 서열 번호 2)을 설계하였다.

이와 같이 수득된 본 발명의 소 유래 트립신 유전자와 소 유전자의 유전자 서열 비교한 결과는 도 8에 도시된 바와 같다. 도 8에서, 서열번호 2의 소 유래 트립신 유전자에서 소 유전자와 상이한 부분은 붉은색으로 표기하였다.

그리고, 이 결과를 바탕으로 작성된 염기서열을 Oligo 4.0 프로그램을 이용하여 최적의 프라이머를 설계하고 합성하였다.

그리고, 도 1에서 도시된 바와 같은 오버랩 PCR을 사용하여 소 트립신 유전자 유전자를 합성하였다.

소 트립신 유전자 유전자를 합성하기 위하여 합성된 프라이머들은 각각 길이가 80 bp 이며 합성에 사용되는 두 개의 프라이머 간에 반복 염기 서열을 20 bp를 포함한다.

도 1에 도시된 바와 같이, 두 개의 절편(fragment)을 각각 합성한 후 두 절편을 주형으로 목표 소 트립신 유전자를 합성한다.

먼저 절편 1을 합성하기 위하여 정방향(forward) 프라이머 TrypF2와 역방향(reverse) 프라이머 TrypR6, R7, R8, R9 및 R11(각각 서열 번호 9~14) 을 pfu 폴리머라아제를 이용하여 380 bp의 단편을 합성하였다.

절편 2를 합성하기 위하여 정방향 프라이머 TrypF1과 역방향 프라이머 TrypR1, R2, R3, R4 및 R5(각각 서열 번호 3~8)을 pfu 폴리머라아제를 이용하여 400 bp의 단편을 합성하였다. 합성된 절편 1과 2를 주형으로 정방향 프라이머 F51 (31 bp)과 역방향 프라이머 Tryp F54 (27 bp)(각각 서열번호 15, 16)를 넣고 Ex - Taq 폴리머라이제를 사용하여 전체 741 bp에 해당하는 합성 소 트립신 유전자를 합성하였다.

이러한 PCR 조건은 94 ℃에서 변성 3분 55 ℃에서 어닐링 30초, 그리고 70 ℃에서 신장 40초를 30 cycle 반복하였다. 이를 pGEM-T easy vector에 클로닝(cloning) 하여 합성된 소 트립신 유전자 유전자의 염기서열을 확인한 결과 서열번호 2와 같이 정확하게 합성되었음을 확인하였다.

실시예 2: 벼 형질전환용 재조합 벡터

실시예 1에서 합성한 소 트립신 코딩 유전자를, 하이그로마이신에 내성을 나타내는 선발 마커인 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제를 포함하며, 벼 유래 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터와 3' UTR 터미네이터가 삽입되어 있는 식물발현 벡터 pMYN44 (Shin et al., 2003)에 SacI과 XbaI 제한효소 자리를 이용하여 도입하여 도 2에 도시된 pMYT111를 수득하였다. (참고로 pMYN44 벡터는 본 발명의 발명자의 한국 특허 제640193호에 상세히 개시됨)

도 2에서, RAmy3D-p 는 벼 유래의 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터를, sbTrysinogen는 소 트립신 유전자를, 3'UTR 는 벼 유래의 α-아밀라제의 3'비전사 구역을, RB 는 T-DNA 우측 보더(right border)를 35S-p 는 CaMV35S 프로모터를, HPT 는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제를, 35S polyA 는 35S 유전자의 터미네이터를, LB 는 T-DNA 좌측 보더(left border)를, 그리고 화살표는 엔테로키나제 절단부위를 각각 나타낸다.

실시예 3: 벼 캘러스 형질전환

벼의 종자를 1 % 클로락스 및 0.01 % 트리톤X-100 용액에 넣어 5분간 살균한 다음 멸균된 증류수로 세 번 씻은 후, 2 mg/l의 2,4-D, 0,02 mg/L의 카이네틴 및 3 %의 수크로스를 포함하는 캘러스 유도용 N6 (Chu et al., (1975) Sci. Sin. vol.18, pp.659-668)배지에 치상하여 28 ℃의 생장상에서 캘러스를 유도하였다.

그리고, 캘러스 유도 후 3주에서 4주 째의 배반유래 캘러스를 형질전환에 이용하였다.

실시예 2의 소 트립신 유전자 및 프로모터 유전자를 포함하는 재조합 백터pMYT111이 포함된 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens LBA4404) 균주가 OD600이 0.8-1.2 정도로 배양된 아세토시링원(acetosyringone)이 포함된 AA 액체배지 (AA 염 및 아미노산, B5 비타민, 20 g/L 수크로스, 2 mg/L 2,4-D, 0.2 mg/L 키네틴, 100 mM 아세토시링원, pH 5.8) (Toriyama K, Hirata K, 1985, Plant Sci 41: 179-183)에 상기 캘러스를 15분간 침적시켜 혼합배양시켰다.

이와 같이, 접종된 캘러스는 멸균된 여과지로 여분의 아그로박테리움 현탁액을 제거한 후, 2N6-Co (2N6, 10 g/L 글루코스, 100 mM 아세토시링원) 고체배지 1개당 25개의 캘러스를 치상한 다음, 3일간 24℃의 암조건에서 아그로박테리움과 공동배양하였다.

공동배양된 캘러스로부터 아그로박테리움을 제거하기 위하여 250 ug/mL의 카베니실린(carbenicillin)이 포함된 멸균 증류수에 캘러스를 3회 세척하였다. 세척된 캘러스를 멸균된 여과지로 여분의 물기를 제거한 후, 2N6-SE (2N6, 250 mg/L 카베니실린, 50 mg/L 하이그로마이신) 선발배지에 치상하였고 27℃에서 2주 동안 암배양하였다. 이후 왕성하게 분열한 캘러스만 선발하여 다시 2N6-SE 배지에 옮겨준 후 2주 가량의 암배양을 통해 증식된 캘러스만을 선발하였다.

실시예 4: 형질전환된 벼 캘러스의 배양

실시예 3에서 형질전환된 벼 캘러스를 로터리 교반기에서 110rpm으로 교반하면서 28℃에서 암배양하였다. 이때, 벼 캘러스 세포 현탁액은 2 ㎎/l 2,4-디클로로페녹시아세트산(2, 4-dichlorophenoxyacetic acid) (2,4-D), 0.02 ㎎/l 키네틴, 및 3% 수크로즈를 포함하는 N6 배지(Thompson et al., 1986)를 통해 300㎖ 플라스크에서 배양되었다.

서브배양을 위하여 9일에 걸쳐 10㎖ 씩 접종원이 옮겨졌다.

그 후, 흡입을 통해 세포 현탁액으로부터 N6 배지를 제거하였고, 10%(젖은 세포 중량/배지 부피)의 새로운 당 고갈 N6 배지(슈크로즈가 제외된)에 벼 캘러스 세포를 옮겨, α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터의 통제하에서 소 트립신 유전자의 발현을 유도하였다.

Myracloth(Calbiochem, La Jolla, CA, USA)의 2 ~ 3개 층을 통해 형질전환된 세포 현탁액을 부으면서 유도된 벼 캘러스 세포가 포함된 배지의 상등액을 수득하였다.

그리고, 전체 배지의 단백질은 찌꺼기를 제거하기 위하여 4℃에서 10분간 18,000*g 의 원심분리를 통해 수득되었다.

실험예 1 : 소 트립신 유전자의 도입 확인

소 트립신 유전자의 도입여부를 genomic DNA PCR및 서던 블럿을 통해 분석하였다.

유전체(Genomic DNA)는 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 실시예 4의 캘러스로부터 동정되었다. PCR 분석은 소 트립신 유전자에 특정한 5'-TCT AGA GAT TAT GAA GAC CTT CAT CTT CCT C-3'을 전방 프라이머로 하고, 5'-GAG CTC TCA GTT GGA GGC GAT GGT G-3' 를 후방 프라이머로 하여 수행되었다.

PCR은 30 사이클 수행되었으며 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 40초로 구성되었다. 상기 PCR 산물은 1.0% (w/v) 아가로즈 겔에서 전기영동되었고, 육안으로 관찰하기 위하여 에티움 브로마이드로 염색되고 UV 광선하에서 관찰되었다.

도 3에서 도시된 바와 같이, 전기 영동 결과로부터, 재조합 벼 캘러스를 포함하는 형질전환 벼 캘러스 현탁배지로부터 동정된 유전자에서 트립신에 해당하는 약 741bp의 DNA 밴드인 소 트립신 유전자를 확인하였다(도 3(A)). 그리고, 서던 블럿 결과로부터, 양성 대조구와 동일한 결과를 재조합 벼 캘러스를 포함하는 형질전환 벼 캘러스 현탁배지로부터 동정된 유전자로부터 확인하여 소 트립신 유전자를 확인하였다(도 3(B)).

도 3에서, 레인 M은 λEcoRI+HindIII DNA 크기 마커 (Promega)이며, PC는 pMYT111 플라스미드(양성 대조구), NC는 재조합 DNA로 형질전환되지 않은 벼 캘러스(음성 대조구), 레인 1 ~ 7은 각각 재조합 벼 캘러스를 포함하는 형질전환 벼 캘러스 현탁배지로부터 동정된 유전자를 나타낸다.

실험예 2 : 소 트립신 유전자의 발현 확인( 노던블럿 분석)

실시예 4의 5 g의 벼 캘러스 세포를 RNeasy plant total RNA extraction kit (Qiagen)를 사용하여 각각 50 mL의 N6 및 당 고갈(또는 결핍) N6 배지에서 7일간 배양하였다. 그 후 현탁액에서 전체 RNA를 분리하였다. 상기 RNA는 포름알데히드가 포함된 아가로즈 겔(Sambrook and Russell, 2001)에서 전기영동하여 분리되었다.

상기 분리된 RNA는 Hybond N⁺ 막(Amersham Pharmacia Biotech RPN82B, Piscataway, NJ, USA)로 옮겨졌다. 상기 막은 65℃ 혼성화 인큐베이터(FINEPCR Combi-H, Seoul, Korea)에서 Prime-a Gene labeling system (Promega U1100, Madison, WI, USA)을 이용하여 ³²P 표지된 트립신 유전자 프로브를 통해 혼성화되었다. 상기 막은 2ⅹSSC and 0.1% SDS에 의해 2회 세척되었고 65℃에서 15분간 2ⅹSSC and 1% SDS에 의해 다시 2회 세척되었다. 상기 혼성화된 밴드는 X-ray film (Fuji Photo Film Co. HR-G30, Tokyo, Japan)상에서 자기방사법을 통해 탐지되었다.

이와 같은 노던 블랏 분석을 수행한 결과, 도 4에서 도시된 바와 같이, 7계통의 각각의 캘러스 세포에서 트립신의 mRNA가 다양한 수준으로 발현되었으나, 음성 대조구(야생형 벼 캘러스 현탁세포)에서는 트립신이 발현되지 않음을 확인하였다.

도 4의 (A)에서, 레인 NC 는 재조합 벼 캘러스를 포함하지 않은 배지의 전체 RNA 추출물(음성 대조구)을, 레인 1 ~ 7은 각각 재조합 벼 캘러스를 포함하는 형질전환 벼 캘러스 현탁배지의 전체 RNA 추출물이며, (B)는 에티디움브로마이드 (EtBr)에 염색된 RNA로 실험에 사용한 RNA 량이 동일함을 보여준다.

실험예 3: 소 트립신 유전자의 발현 확인( 웨스턴 블롯 분석 및 ELISA )

실험예 2의 벼 캘러스 세포 배양액을 4℃에서 12,000rpm 으로 5분간 원심분리한 후 상층액을 사용하여 12% (w/v) SDS-PAGE 로 분리하고, 니트로셀룰로오스 막으로 전기적 블롯팅(electroblotting)을 수행하였다.

상기 니트로셀룰로오스 막은 토끼 항-트립신 다클론성 항체(Abcam, UK)에서 배양되고 알칼린 포스페이트와 컨쥬게이트된 항-토끼 IgG(Calbiochem, San Diego, CA, USA)를 두번째 항체로서 첨가하였다.

이때, 소의 췌장에서 추출한 상업적인 소 트립신(Sigma, St. Louis, MO, USA)은 양성 대조군으로 사용되었다. 상기 젤은 45%의 메탄올 및 10%의 빙초산과 함께 0.25% Comassie brilliant blue R-250에서 염색되었다. 단백질의 농도는 BSA를 표준으로 사용하여 브레드포드 분석법(Bradford)에 기초하여 단백질 분석시약(Sigma)를 통해 정량되었다.

도 5(A)에 도시된 바와 같이, SDS-PAGE로 아크릴아마이드 젤에서 단백질이 분리되었으며, 도 5(B)에 도시된 바와 같이, 표준품으로 사용한 소의 췌장으로부터 분리 정제한 소 트립신의 24kDa에서의 단백질 밴드와 유사한 24-26 kDa에 해당하는 크기에서 단백질 밴드들이, 음성 대조구(야생형의 현탁세포 배양액)를 제외한, 재조합 벼 캘러스의 단백질들(라인 1 내지 7)에서 확인되었다.

이로부터, 소 트립신이 벼 캘러스 세포 배양액에서 발현되었음이 확인되었다.

도 5(B)에서, 표준품의 소 트립신과 벼 캘러스 세포 배양액의 소 트립신의 단백질의 크기가 다소 상이한 것은 동물세포와 식물세포에서 당화 양상이 다른 것에 기인하는 것으로 사료된다.

도 5에서, 레인 M은 마커((PageRuler ^TM Protein Ladder Fermentas, MD, USA)를, PC는 소로부터 정제된 소 트립신(양성 대조구)를, NC 는 재조합 벼 캘러스를 포함하지 않은 배지(음성 대조구)를, 레인 1 ~ 7은 각각 재조합 벼 캘러스를 포함하는 형질전환 벼 캘러스 현탁배지를 나타낸다.

그리고, 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 통해, 재조합 벼 캘러스를 포함하는 형질전환 벼 캘러스 세포 현탁액에서의 소 트립신 분비량을 확인하였다.

도 5의 (C)로부터, 벼 캘러스 세포 배지내로 분비된 트립신의 량이 매우 높음을, 특히 4번 세포주의 경우 15 mg/L 이상임을 확인할 수 있다.

실험예 4: 소 트립신 활성 분석(젤라틴 아크릴아미드 겔 전기영동법)

실험예3의 벼 캘러스 세포 배양액 상층액의 소 트립신의 단백질 분해 활성을 젤라틴 분해 정도로 평가하였다.

비환원 상태에서(2-머캅토에탄올 부재 등) 10% 겔이 0.1%의 젤라틴을 포함하는 공중합된 기질에서 벼 캘러스 세포 배양액 상층액으로 SDS-PAGE를 수행하였다. 이때, 표준품으로 10 ng의 소 트립신(bovine trypsin)을 사용하였다.

전기영동 이후 겔은 2.5%의 트리톤 X-100 용액에서 상온에서 1시간 동안 약하게 흔들어주었고 of 50 mM Tris (pH 7.5), 200 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, and 0.02% (w/v) Tween 20 (pH 7.5) 용액에서 37℃ 18시간 동안 배양되었다.

젤라틴화는 쿠마시에 블루 염색(0.02% in methanol, acetic acid, and water, 3:1:6)에 의해 드러났고 프로테아제의 활성은 흰색밴드나 파란색 배경영역에 위치하였다.

도 6에 도시된 바와 같이, 표준품의 소 트립신의 경우 단백질 밴드24 kDa의 트립신에 의해 젤라틴 기질이 분해되어 화이트존으로 나타났다. 그리고, 음성 대조구인 야생형의 현탁세포 배양액을 제외하고, 벼 캘러스 세포 배양액의 경우, 재조합 벼 캘러스의 트립신에 해당하는 단백질 밴드24-26 kDa 부분에서 젤라틴 기질이 분해되어 화이트 존을 형성함을 확인하였다. 이로부터, 재조합 벼 캘러스에서 발현된 트립신이 소에서 유래된 트립신(표준품)과 같이 정상적인 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있다.

도 6에서, 레인 M은 마커((PageRuler ^TM Protein Ladder)를, PC는 소로부터 정제된 소 트립신(양성 대조구)을, NC는 재조합 벼 캘러스를 포함하지 않은 배지(음성 대조구)를, 레인 1 ~ 7은 각각 재조합 벼 캘러스를 포함하는 형질전환 벼 캘러스 현탁배지를 나타낸다.

실험예 5: 세포주 4의 소 트립신 정량 분석

실험예 3의 4번 세포주의5g의 현탁세포를 수크로스가 첨가되지 않은 N6 액체배지에 접종한 후, 1일, 3일, 5일, 7일, 및 9일의 배양액을 수거하여 SDS-PAGE, 웨스턴 블랏 및 직접 ELISA(Abcam's 방법)를 수행하였다.

이때, SDS-PAGE, 웨스턴 블랏은 앞서 실험예와 동일한 방법으로 수행하였으므로, 여기서는 구체적인 방법은 생략하고, 아래에 직접 ELISA 방법을 기술한다.

미세역가 플레이트(NUNC, Netherland)의 웰에 100㎕ 당 1 ㎍/ml의 표준 소 트립신(Sigma)을 코팅하고, 실험예 3의 4번 세포주의 1일, 3일, 5일, 7일, 및 9일의 배양액의 형질전환 벼 캘러스에서 수득한 소 트립신을 넣고, 100mM 나트륨비카보네이트 버퍼(pH 9.6) 용액 4℃에서 하룻밤 동안 정치시켰다.

PBST(0.05% 트윈 20을 포함하는 PBS 버퍼)를 통해 상기 코팅물질 및 플레이트를 세척하였다. 플레이트는 0.1%의 탈지분유를 포함하는 200㎕의 블로킹 버퍼를 첨가하고 실온에서 2시간 동안 정치시킨 후 상술한 PBST로 세척하였다.

이후, 웰 100㎕ 당 5㎍/ml의 비오틴화된 토끼 항-트립신 다클론성 항체(Abcam)가 첨가되었다.

상온에서 2시간 동안 배양된 후 PBST로 세척하였다. 100㎕의 Avidin-HRP(BD PharMingen, U.S.A.)를 각 웰에 첨가하였다. 각각의 샘플들은 상온에서 30분간 배양되고 PBST로 세척된 후 각각의 웰들은 100㎕의 TMB 기질시약(substrate reagent, BD PharMingen)을 첨가하였다. 마이크로 플레이트 리더(Microplate Reader)로 430nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 7에서, (A)는 SDS-PAGE로 아크릴아마이드 젤에서 분리된 단백질을 보여주며, (B)는 웨스턴 블랏 분석으로서, 실험예 3과 같이 트립신에 특이적인 항체를 이용하여 배양시간에 따른 트립신 발현 양상을 확인하였다. 이때, 트립신을 발현하는 세포배양액에서는 당이 고갈된 상태의 배양 1일째부터 26 kDa에서 트립신이 확인 되었으며, 배양 5일째에는 24-26 kDa의 벼유래 트립신의 발현이 최대로 확인되었으며 배양 7일째부터는 점점 발현이 감소하는 것으로 나타났다.

도 7의 (C)는 직접 ELISA로 트립신에 특이적인 항체(비오틴화된 토끼 항-트립신 다클론성 항체(Abcam))를 사용하여 배지내 축적된 트립신을 정량한 결과이며, 소의 췌장에서 정제한 트립신 표준품과 같이, 형질전환 벼 캘러스 현탁배지의 트립신이 토끼 항-트립신 다클론성 항체(Abcam)와 결합함을 보여준다. 이로부터, 트립신이 점차적으로 축적됨을 알 수 있다.

그리고, 도 7의 (D)로부터 시간 경과에 따른 소 트립신 분비량을 확인할 수 있는데, 배양 5일 까지 트립신의 생산량이 증가하는데, 배양 후 5일에 약 15 mg/L의 트립신의 생산량을 보여준다. 그러나, 배양 5일 이후부터는 트립신의 생산량이 급격히 감소하였다. 이는 배지내로 분비되어진 단백질 분해효소 억제제의 발현과 함께 트립신이 불활성화 되고 트립신 자체의 자가 분해 프로세스에 기인하는 것으로 사료된다.

도 7에서, 레인 M은 마커((PageRuler ^TM Protein Ladder)를, PC는 소로부터 정제된 sbTrysin(양성 대조구)를, NC는 재조합 벼 캘러스를 포함하지 않은 배지(음성 대조구, +S, -S는 각각 수크로즈를 포함하거나 포함하지 않는 배지)를, 레인 1, 3, 5, 7 및 9 는 각각 재조합 벼 캘러스를 포함하는 배지로서 각각 1일, 3일, 5일, 7일 및 9일이 경과한 배지를 나타낸다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니고 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.

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Claims (14)

1. 삭제
2. 벼 유래의 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터 및 소 유래의 트립신 코딩 유전자가 전사방향으로 작동가능하게 연결되어 있고,
   상기 벼 유래의 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터 및 소 유래의 트립신 코딩 유전자는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 벼 형질전환용 재조합 벡터.
3. 제2항에 있어서,
   상기 벡터는 도 2에 개시된 구조의 pMYT111인 것을 특징으로 하는 벼 형질전환용 재조합 벡터.
4. 제2항 또는 제3항의 벼 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된 벼.
5. 제4항에 있어서,
   상기 벼는 벼 캘러스인 것을 특징으로 하는 벼 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된 벼.
6. 제2항 또는 제3항의 벼 형질전환용 재조합 벡터를 벼에 도입하여 소 유래의 트립신 코딩 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 소 트립신의 대량생산방법.
7. 삭제
8. 벼 유래의 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터 및 소 유래의 트립신 코딩 유전자가 전사방향으로 작동가능하게 연결되어 있는 벼 형질전환용 재조합 벡터를 구성하는 단계;
   상기 구성된 벼 형질전환용 재조합 벡터를 벼 캘러스에 형질전환하는 단계; 및
   형질전환된 벼의 캘러스를 배양하여 소 트립신을 수득하는 단계;를 포함하며,
   벼 유래의 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터 및 소 유래의 트립신 코딩 유전자는 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 소 트립신의 대량생산방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 벡터는 도 2에 개시된 구조의 pMYT111인 것을 특징으로 하는 소 트립신의 대량생산방법.
10. 제8항에 있어서,
    상기 벼 캘러스 형질전환은 아그로박테리움 튜머페이션스를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 소 트립신의 대량생산방법.
11. 제8항에 있어서,
    상기 벼 캘러스의 배양은 당 결핍 상태에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 소 트립신의 대량생산방법.
12. 제8항에 있어서.
    상기 벼 캘러스 배양에서 수득되는 트립신은 배지 1L 당 15㎎ 이상인 것을 특징으로 하는 소 트립신의 대량생산방법.
13. 서열 목록 2의 유전자로 코딩되는 소 유래 트립신.
14. 식물 형질 전환용 서열목록 2의 소 유래 트립신 유전자.
    

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