KR101666680B1

KR101666680B1 - PNGase A를 생산하는 형질전환 벼 캘러스 및 이의 용도

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Publication number: KR101666680B1
Application number: KR1020160078792A
Authority: KR
Inventors: 김현순; 권태호; 전재흥; 김진아; 문기범; 서미성; 신윤지
Original assignee: 한국생명공학연구원; (주)엔비엠
Priority date: 2015-11-11
Filing date: 2016-06-23
Publication date: 2016-10-14

Abstract

본 발명은 벼 현탁 배양을 이용한 재조합 PNGase A의 생산방법에 관한 것으로, 본 발명의 벼 캘러스 배양시스템을 통해 배지분비 형태로 생산되는 PNGase A 단백질은 대장균 등 세균성이 배제된 환경에서 생산되므로 내독소(endotoxin)의 위험으로부터 안전할 수 있어, 보다 안전하고 친환경적인 소재로서의 강점을 가진다. 또한, 푸코오스(Fucose) 및 자일로스(Xylose)를 포함하고 있는 당단백질의 당 구조상 미생물 유래 PNGase F에 의하여 절단이 되지 않으므로, 반드시 식물유래 효소인 PNGase A를 사용하여야 절단이 되는 식물유래 당단백질 분석에 매우 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 바이오시밀러 연구와 분자농업 연구의 관심이 높아지면서 식물 유래 및 곤충세포 유래 당단백질의 구조분석 연구가 매우 활발하게 이루어지고 있는 요즘에 수요가 증가하고 있으나 고가(30만원/mIU)의 시장이 형성되어 있어 수급 불균형의 PNGase A를 형질전환 식물체의 캘러스를 이용하여 대량으로 생산할 수 있어 관련 산업에 매우 유용하다.

Description

PNGase A를 생산하는 형질전환 벼 캘러스 및 이의 용도{Transgenic rice callus producing PNGase A and uses thereof}

본 발명은 PNGase A를 생산하는 형질전환 벼 캘러스 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 α-아밀라제(RAmy3D) 프로모터 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 아몬드 유래 PNGase A(Peptide-N-glycosidase A) 단백질 코딩 유전자가 작동가능하게 연결된 벼 형질전환용 재조합 벡터, 상기 벡터로 형질전환되어 재조합 PNGase A를 생산하는 벼 캘러스, 상기 형질전환된 벼 캘러스를 현탁 배양하여 재조합 PNGase A를 생산하는 방법, 상기 방법에 의해 생산된 재조합 PNGase A 및 상기 벼 형질전환용 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 PNGase A 단백질 생산용 조성물에 관한 것이다.

동물세포 유래 당단백질의 N-결합형 당사슬은 주로 플라비박테리움 메닝고셉티쿰(Flavibacterium meningocepticum) 유래 펩티드-N-글리코시다제 F(PNGase F)에 의해 절단되는 반면, 첫번째 N-아세틸글루코사민에 α(1,3)-퓨코스가 부가되어 있는 식물 또는 곤충에서 발현된 당단백질에 부착된 N-결합형 당사슬은 아몬드 (Almond) 유래 펩티드-N-글리코시다제 A(PNGase A)에 의해 절단된다(Altman et al., 1998, Eur. J. Biochem. 252, 118-123). PNGase F는 만노스-6-인산이 부가된, 특히 인산이 2개 부가된 당사슬 구조의 당단백질에 대한 절단 활성이 떨어져 당사슬의 절단에 PNGase A 효소의 사용이 선호된다.

최근 바이오시밀러 연구와 분자농업 연구의 관심이 높아지면서 식물 유래 및 곤충세포 유래 당단백질의 구조분석 연구가 매우 활발하게 이루어지고 있으므로, 이러한 PNGase A의 수요가 급증하고 있으나 전통적인 단백질 정제방법을 통해 아몬드로부터 정제되기 때문에 매우 고가 (30만원/mIU)로 판매되고 있어 경제적이지 못한 단점이 있다.

최근, 식물을 이용하여 재조합 단백질을 생산하는 분자농업에서 벼 캘러스 현탁배양을 이용하여 목적 단백질의 고발현을 배지 내로 유도하는 발현시스템이 기존 시스템 대비 약 1,000 배의 증가를 보인 점이 보고되었다(Shin et al., Biotechnol Bioeng. 2003. 30;82(7):778-83). 따라서, 본 발명에서는 벼 캘러스/배지분비형의 식물발현벡터를 이용하여 PNGase A를 벼 캘러스에 도입하였고 이들의 분자생물학적인 분석을 통하여 매우 높은 수준의 단백질 발현을 보이는 동질 캘러스를 선발하였고, 나아가 PNGase A 단백질의 대량생산을 확인하였다.

한편, 한국공개특허 제2012-0053963호에서는 야로위아 리폴리티카 유래 펩티드-Ｎ-글리코시다제 및 이의 용도가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 벼 현탁 배양을 이용한 재조합 PNGase A의 생산방법에 대해서는 밝혀진 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 수요가 급격하게 증가하고 있는 PNGase A가 현재는 전량 아몬드에서 추출하여 사용되기 때문에 매우 고가(30만원/mIU)인 문제점을 해결하고자 본 발명에서는 배지분비 형태의 PNGase A 단백질을 형질전환 벼의 캘러스 배양 시스템을 통하여 높은 발현율로 생산하고, 용이한 수확, 정제를 가능하게 하여 우수한 경쟁력을 가지는 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 α-아밀라제(RAmy3D) 프로모터 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 아몬드 유래 PNGase A(Peptide-N-glycosidase A) 단백질 코딩 유전자가 작동가능하게 연결된 벼 형질전환용 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환되어 재조합 PNGase A를 생산하는 벼 캘러스를 제공한다.

또한, 본 발명은

(a) 상기 벼 형질전환용 재조합 벡터를 벼 캘러스에 형질전환하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 형질전환된 벼 캘러스를 현탁 배양 배지에서 배양하여 PNGase A를 생산하는 단계를 포함하는 재조합 PNGase A의 생산방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 PNGase A를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 α-아밀라제(RAmy3D) 프로모터 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 아몬드 유래 PNGase A(Peptide-N-glycosidase A) 단백질 코딩 유전자가 작동가능하게 연결된 벼 형질전환용 재조합 벡터를 유효성분으로 함유하는, 식물체의 PNGase A 단백질 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명의 벼 캘러스 배양시스템을 통해 배지분비 형태로 생산되는 PNGase A 단백질은 대장균 등 세균성이 배제된 환경에서 생산되므로 내독소(endotoxin)의 위험으로부터 안전할 수 있어, 보다 안전하고 친환경적인 소재로서의 강점을 가진다. 또한, 푸코오스(Fucose) 및 자일로스(Xylose)를 포함하고 있는 당단백질의 당 구조상 미생물 유래 PNGase F에 의하여 절단이 되지 않으므로, 반드시 식물유래 효소인 PNGase A를 사용하여야 절단이 되는 식물유래 당단백질 분석에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

따라서, 바이오시밀러 연구와 분자농업 연구의 관심이 높아지면서 식물 유래 및 곤충세포 유래 당단백질의 구조분석 연구가 매우 활발하게 이루어지고 있는 요즘에 수요가 증가하고 있으나 고가(30만원/mIU)의 시장이 형성되어 있어 수급 불균형의 PNGase A를 형질전환 식물체의 캘러스를 이용하여 대량으로 생산할 수 있어 관련 산업에 매우 유용하다.

도 1은 본 발명에서 사용된 RAmy3D 프로모터/3Dsp/PNGase A/His6 구조물인 pJKS107의 모식도이다.
도 2는 본 발명에서 사용된 RAmy3D 프로모터/5'UTR/3Dsp/PNGase A/His6 구조물인 pJKS117의 모식도이다.
도 3은 본 발명에서 제조한 식물 발현벡터(pJKS107, pJKS117)로 아그로박테리움을 형질전환한 후 형질전환체를 선별하기 위해 콜로니 PCR을 수행한 결과를 나타낸다. 왼쪽은 pJKS107 벡터 형질전환체, 오른쪽은 pJKS117 벡터 형질전환체를 각각 나타낸다.
도 4는 본 발명에서 제조한 pJKS107의 벼 형질전환 캘러스 및 pJKS117의 벼 형질전환 캘러스의 선발을 나타낸다. 왼쪽은 pJKS107 벡터로 형질전환된 벼 형질전환 캘러스, 오른쪽은 pJKS117 벡터로 형질전환된 벼 형질전환 캘러스를 각각 나타낸다.
도 5는 각각의 형질전환 캘러스로부터 추출한 총 RNA를 사용하여 RNA 수준에서 고발현 PNGase A 우수 라인을 선별하기 위해 노던 블럿 분석을 수행한 결과이다. 각 숫자는 형질전환 캘러스 라인을 나타낸다.
도 6은 각각의 형질전환 캘러스로부터 추출한 총 RNA를 사용하여 RNA 수준에서 고발현 PNGase A 우수 라인을 선별하기 위해 정량적 실시간 PCR(qrPCR) 분석을 수행한 결과이다. 각 숫자는 형질전환 캘러스 라인을 나타낸다.
도 7은 선별된 고발현 PNGase A 우수 라인으로부터 PNGase A 단백질 발현을 분석하기 위해 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타낸다. (A) 쿠마시 염색, (B) 항-PNGase를 이용한 웨스턴블럿 분석. M, 단백질 사이즈 마커; P, 양성 대조구로 시판되는 스위트아몬드 추출 PNGase A 단백질; N, 음성 대조구로 사용한 벼 캘러스 세포주 N75의 배양액 추출 총 수용성 단백질(total soluble protein, TSP); 레인 1, 2 및 3, PNGase A 발현 세포주로부터 확보한 배양액 추출 TSP.
도 8은 선별된 고발현 PNGase A 우수 라인으로부터 발현된 PNGase A 단백질의 활성을 분석한 결과를 나타낸다. (A) Activin A에 대한 PNGase A 단백질의 활성분석 결과로, 왼쪽은 쿠마시 염색, 오른쪽은 항-Activin A 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석 결과임. (B) 페투인(Fetuin)에 대한 PNGase A 단백질의 활성분석 결과로, 왼쪽은 쿠마시 염색, 오른쪽은 항-페투인(Fetuin) 항체를 이용한 웨스턴블럿 분석 결과임. (A) : P, 양성 대조구로 사용한 Activin A 단백질; N, 음성 대조구로 사용한 벼 캘러스 세포주 N75의 배양액으로부터 추출한 총 수용성 단백질(total soluble protein, TSP)을 Activin A에 전처리하고 퓨린 처리한 실험구; 레인 1, 또 다른 음성 대조구로 사용하기 위해 빈 벡터(empty vector)로 형질전환된 세포주로부터 추출한 총 수용성 단백질 ; 레인 2, Activin A 발현 우수 세포주로부터 획득한 TSP; 레인 3, Activin A 발현 우수 세포주로부터 획득한 TSP에 PNGase A 발현 세포주로부터 확보한 PNGase A로 전처리하지 않고 퓨린 처리한 실험구; 레인 4, Activin A 발현 우수 세포주로부터 획득한 TSP에 PNGase A 발현 세포주로부터 확보한 PNGase A로 전처리하고 퓨린 처리한 실험구. (B) : N, 음성 대조구로 사용한 벼 캘러스 세포주 N75의 배양액으로부터 추출한 총 수용성 단백질(total soluble protein, TSP); 레인 1, 페투인(Fetuin) 단백질 (native 상태); 레인 2, 시판용 PNGase A로 처리된 페투인 단백질; 레인 3, 고발현 PNGase A 우수 라인으로부터 발현된 PNGase A로 처리된 페투인 단백질.
도 9는 본 발명을 통해 선발된 벼 형질전환 캘러스의 현탁배양 후 배양 플라스크를 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 α-아밀라제(RAmy3D) 프로모터 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 아몬드 유래 PNGase A(Peptide-N-glycosidase A) 단백질 코딩 유전자가 작동가능하게 연결된 벼 형질전환용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 벼 형질전환용 재조합 벡터에서, 프로모터로는 벼에서 PNGase A의 대량생산에 적합하며, 당 결핍 배지에서 상기 PNGase A를 생산할 수 있는 벼 유래의 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터가 사용될 수 있으며, 본 발명에 따른 α-아밀라제 프로모터를 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함하는 프로모터가 사용될 수 있다. 여기서 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 유전자 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 아몬드 유래의 PNGase A을 암호화하는 유전자를 제공한다. 유전자은행(GeneBank)의 아몬드 유래의 PNGase A 단백질 서열(Assession number : P81898)을 바탕으로 하고, PNGase A 유전자의 코돈을 벼의 고빈도 사용 코돈으로 합성하기 위하여 KDRI(Kazusa DNA Research Institute)의 코돈 사용 데이터(http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html)를 이용하였다. 이러한 컴퓨터 분석 결과를 바탕으로 최적의 아몬드 유래의 PNGase A 유전자의 염기서열(이하, 아몬드 유래의 PNGase A 유전자: 서열번호 4)을 설계하였다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함되는데, 구체적으로는 전술한 바와 같다.

본 발명의 벼 형질전환용 재조합 벡터는 상기 벼 유래의 α-아밀라제 3D 프로모터에 아몬드 유래 PNGase A 단백질 코딩 유전자가 전사방향으로 작동가능하게 연결되도록 구성된다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 벼 형질전환용 재조합 벡터는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 α-아밀라제(RAmy3D) 프로모터, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 5'-말단 비번역영역(5'-UTR), 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 RAmy3D 신호 서열(3Dsp), 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 아몬드 유래 PNGase A(Peptide-N-glycosidase A) 단백질 코딩 유전자 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 His6 코딩 유전자가 작동가능하게 연결된 것일 수 있고, 바람직하게는 본 발명의 도 2에 나타낸 pJKS117일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

여기서 '작동가능하게 연결된(operatively linked)'은 유전자 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 유전자 서열(예컨대, 아몬드 유래 PNGase A 코딩 유전자) 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 유전자 서열의 전사 및/또는 해독 과정을 조절하게 된다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 유전자를 복제하거나, 상기 유전자를 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 유전자에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 DNA 단편(들), 유전자 분자를 세포 내로 전달할 수 있는 수단을 지칭할 때 사용된다. 벡터는 숙주세포에서 독립적으로 DNA를 복제시키고, 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 유전자 서열을 포함하는 재조합 벡터를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한, 이와 같은 발현유전자 서열인 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

"프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다.

본 발명의 일 구현 예에서 사용되는 프로모터인 α-아밀라제 3D(RAmy3D) 프로모터는 외래 유전자의 발현량이 높아, PNGase A의 대량생산의 목적 달성에 적합하다. 또한, 당이 고갈된 상태에서 단백질 분해 효소 활성이 현저히 낮으므로, 당 고갈 상태에서 강력하게 발현되는 프로모터가 발현된 PNGase A의 분해 가능성을 낮출 수 있어 바람직한데, 본 발명의 일 구현 예에서 사용되는 프로모터인 α-아밀라제 3D 프로모터는 당이 고갈된 상태에서 강력하게 발현되므로, 본 발명의 목적 달성에 바람직하다. 만일, 통상의 식물체 형질전환에 사용되는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터를 사용하는 경우 발현되는 PNGase A의 분해 속도가 높아, 목적하는 PNGase A의 축적을 기대할 수 없다.

본 발명에서, PNGase A 단백질을 코딩하는 DNA를 벼 캘러스에 도입시키는데 이용될 수 있는 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터일 수 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 유전자 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자 서열이 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신 (phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 벼 형질전환용 재조합 벡터는 터미네이터를 포함할 수 있다. 상기 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 바람직할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 α-아밀라제(RAmy3D) 프로모터 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 아몬드 유래 PNGase A(Peptide-N-glycosidase A) 단백질 코딩 유전자가 작동가능하게 연결된 벼 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환되어 재조합 PNGase A를 생산하는 벼 캘러스를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 PNGase A 단백질을 생산하는 벼 캘러스는 도 2의 재조합 벡터 pJKS117로 벼 캘러스를 형질전환하여 제조하였고, 형질전환된 벼 캘러스를 현탁 배양하여 PNGase A 단백질의 생산 수준을 확인하여 선별하였다.

식물의 형질전환은 유전자(DNA)를 식물에 전이시켜 이루어진다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 유전자를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법 (Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 유전자 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 (a) 단계는 아몬드 유래 PNGase A 단백질 코딩 유전자를 합성하는 단계를 수행하며, 본 발명에서는 오버랩 PCR 방법을 이용하였지만, 이에 제한되는 것은 아니며 다양한 공지의 방법을 통해 PNGase A 단백질 코딩 유전자를 합성할 수 있다.

또한, 본 발명의 PNGase A을 생산하기 위한 상기 현탁 배양 조건은 당이 결핍된 조건일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 재조합 PNGase A를 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 식물 발현벡터 제작

1-1. PNGase A 유전자의 코돈 최적화

유전자은행(GeneBank)의 아몬드 유래의 PNGase A 단백질서열(Assession number: P81898)을 바탕으로 하고, PNGase A 유전자의 코돈을 벼의 고빈도 사용 코돈으로 합성하기 위하여 KDRI(Kazusa DNA Research Institute)의 코돈 사용 데이터(http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html)를 이용하였다. 이러한 컴퓨터 분석 결과를 바탕으로 최적의 아몬드 유래의 PNGase A 유전자의 염기서열(이하, 아몬드 유래의 PNGase A 유전자: 서열번호 4)을 설계하였다. 오버랩 PCR 방법에 의하여 총 1740bp (mature PNGase A+6×histidine+제한효소KpnI)의 유전자를 합성하였다.

1-2. 식물 발현벡터 제작

목적 유전자의 고발현 유도를 위하여 RAmy3D 프로모터를 사용하고 RAmy3D 시그널 펩티드 (3Dsp)를 사용하여 당 결핍 조건의 배지에서 목적 단백질의 분비 효율을 더 높이기 위하여 RAmy3D 프로모터/3Dsp/PNGase A/His6 구조물(pJKS107, 도 1)를 제작하였다. 그리고 PNGase A 전사 효율을 더욱 높이기 위하여 3Dsp/PNGase A/His6의 5'-영역에 비번역영역(untranslation region)을 추가 도입하여 RAmy3D 프로모터/5'UTR/3Dsp/PNGase A/His6 구조물(pJKS117, 도 2)을 제작하였다.

실시예 2. 식물 발현벡터( pJKS107 , pJKS117 )의 아그로박테리움 형질전환

pJKS107, pJKS117 식물 발현 벡터를 화학적 형질전환 방법으로 아그로박테리움 투머파시엔스 LBA4404에 형질전환하였으며 리팜피신과 카나마이신이 포함된 배지에서 자란 콜로니를 선별하기 위해 콜로니 PCR을 수행하였다. 콜로니 PCR을 수행 한 결과, 벡터 구조물의 PCR 밴드를 확인하였고(도 3), 각각의 콜로니 1번을 선별하여 pJKS107(LBA4404), pJKS117(LBA4404)로 명명하여 식물 형질전환을 수행하였다.

벼 형질전환을 위한 준비과정으로 캘러스 유도 과정은 다음과 같다. 먼저 종피를 제거한 종자를 70% 에탄올로 표면소독을 하고, 2% 락스에 20분간 소독하여 30g의 수크로스, 4.4g의 N6 염, 1g의 카자미노산과 2,4-D가 포함된 N6CI 배지에 약 16개씩 치상하였다. 3주 후, 지름 3-4mm 정도 크기의 유백색 캘러스만을 분리하여 새로운 N6CI 배지로 옮겨주고, 동시에 식물발현벡터가 포함된 LBA4404 균(pJKS107(LBA4404), pJKS117(LBA4404))을 배양하였다. 3일 후, 벼 캘러스를 LBA4404에 감염시켜, 100μM 아세토시링원이 포함된 N6CO 배지에 3일간, 25℃에서 암배양하였다. 그 후, 벼 캘러스를 취해 물로 세척하여 여분의 LBA4404를 제거하고, N6S 배지(N6CI 배지에 50ug/ml의 하이그로마이신 B와 500ug/ml 세포탁심이 포함)에 치상하여 3-4주 정도 배양하고, 항생제 저항성을 보이며 새로 자라난 캘러스만을 분리하여 30g/L 수크로스, 2mg/L 2,4-D, 0.2mg/L 키네틴, 50mg/L 하이그로마이신 B를 첨가한 N6 배지(N6SE)로 옮겨주었다(도 4).

실시예 3. 벼 형질전환 캘러스 분석

3-1. 총 RNA 추출 및 cDNA 합성

아그로박테리움을 이용하여 형질전환하여 하이그로마이신 B의 저항성을 가지는 세포라인을 선별하여 각각의 캘러스로부터 Tri-reagent와 액체질소를 이용하여 총 RNA를 추출하였다. RNA 펠렛을 150ul DEPC 워터에 녹인 후 nanodrop으로 농도를 측정하였다. 측정된 RNA 농도를 근거로 하여 30ug의 RNA에 DNase I을 첨가하여 37℃에서 40분간 처리한 후, 400ul DEPC 워터를 첨가해 총 부피를 500ul로 맞춘 뒤 페놀 추출 및 EtOH 침전을 수행하였다. 정제한 RNA 펠렛을 40ul DEPC 워터에 녹이고 nanodrop으로 농도를 측정하였다. 각각의 1ul 정제된 RNA를 주형으로 하여 1ul 올리고-dT를 첨가해 70℃에서 5분간 변성을 실시하고 아이스에 5분간 고정하였다. 그리고 프로메가(Promega)의 1st 가닥 cDNA 합성 키트를 이용해서 어닐링 25℃ 5분, 합성 42℃ 1시간, RTase 불활성 70℃ 15분의 조건으로 cDNA를 합성하였다.

3-2. 노던 블럿 분석

각각의 캘러스로부터 Tri-reagent를 이용하여 추출한 총 RNA를 사용하여 RNA 수준에서 고발현 PNGase A 우수 라인을 선별하기 위해 노던 블럿 분석을 수행하였다. 각각의 총 RNA를 20ug씩 사용하여 포름알데히드 겔에 40 볼트로 3시간 정도 로딩하여 겔 1개는 18s, 28s RNA를 확인하기 위해 EtBr 염색을 수행하였고 다른 한 개의 겔은 양전하의 나일론 막(positive charged nylon membrane)에 트랜스퍼를 수행하였다. 트랜스퍼된 막은 PNGase A 프로브를 사용하여 혼성화를 수행한 후, PNGase A mRNA의 발현을 분석하였다. 노던 블럿 분석 결과, pJKS107 벼 형질전환 캘러스 라인은 #1, #2를 선별하였고 pJKS117 캘러스 라인은 #1, #12, #14, #16, #18, #22, #23을 선별하였다(도 5).

3-3. 정량적 실시간 PCR ( Quantitative real - time PCR )

추가적으로 정량적 실시간 PCR (qrPCR)을 수행하였다. 각각의 합성된 cDNA 1ul를 주형으로 사용하였고, 정규화된 발현 수준(normalized expression level)을 확인하기 위한 레퍼런스 유전자로는 벼 액틴 유전자(GeneBank: X15865.1)를 사용하였다. 액틴은 정방향 프라이머 5'-AGC TTC CTG ATG GAC AGG TTA TC-3'(서열번호 6), 역방향 프라이머 5'-ACC ACT GAG AAC GAT GTT GCC-3'(서열번호 7)를 이용하여 증폭하였고, PNGase A는 PNGase A(qPCR)_정방향 프라이머 5'-TAA CGA GTA CAT CGC TGC CAA C-3'(서열번호 8), PNGase A(qPCR)_역방향 프라이머 5'-AAT GGT GTG ATC TCG ATA TCG TAA G-3'(서열번호 9)를 이용하여 증폭하였다. 염색은 SYBR Green을 사용하였고, PCR 조건은 전변성은 95℃ 15분이며 변성은 95℃ 10초, 어닐링 54℃ 15초, 합성 72℃ 30초를 총 50회로 하여 3 반복으로 분석을 진행하였다. 실시간 PCR이 잘 수행되었는지 확인하기 위하여 증폭, 멜팅 커브(Melt Curve), 멜팅 피크(Melt Peak) 그래프를 확인하였다. 레퍼런스 유전자인 액틴 PCR 경우, 주형이 없는 대조구(NTC, no template control; 회색선)를 제외한 음성 대조구(N75 ; 공 벡터 형질전환 캘러스, 검은색선), 양성 대조구(pJKS117-14, 붉은색선), 추가로 선별된 PNGase A 라인(pJKS117(2), pJKS107(2) 라인)에서 30회 이전에 증폭이 잘 이루어졌다는 것을 확인하였다. 그리고 멜팅(melting) 온도도 NTC를 제외한 나머지 샘플에서 83℃로 일정하게 나와 액틴이 잘 증폭이 되었다는 것을 확인하였다. PNGase A PCR 경우, NTC (회색선)와 음성 대조구(N75, 검은색선)를 제외한 나머지 샘플에서 30회 이전에 증폭이 된 것을 확인하였고, 멜팅(melting) 온도도 85.5℃로 일정하게 나와 PNGase A 유전자가 잘 증폭이 된 것을 확인하였다. 레퍼런스 유전자인 액틴의 발현을 기준으로 PNGase A 유전자 발현을 비교한 결과 높은 수준의 mRNA의 발현이 이루어짐을 확인하였다(도 6).

실시예 4. 선발된 벼 형질전환 캘러스로부터 PNGase A 생산성을 웨스턴 블럿으로 분석한 결과와 PNGase A의 활성 체크

4~20% 그레디언트 아크릴아마이드 겔에 각각의 샘플을 로딩한 후 웨스턴 블롯을 수행하여 PNGase A의 활성을 측정하였다. 1차 항체로 항-PNGase(본 발명자의 연구실 제작)를 1:1000으로 첨가하여 반응시킨 후 PBST로 3회 세척하고 2차 항체, 항-토끼 IgG(conjugated alkaline phosphatase, Sigma/Cat)를 1:10,000의 비율로 첨가하여 반응시킨 후 NBT/BCIP로 발색하였다. 로딩된 레인 번호는 다음과 같다. M은 단백질 사이즈 마커(PageRuler TM Protein Ladder Fermentas, MD, USA)이고, P는 양성 대조구로서 상품으로 시판되는 스위트아몬드 추출 PNGase A 단백질(Roche-applied-science, Mannheim, Germany)을 사용하였다. N은 음성 대조구로 사용한 벼 캘러스 세포주 N75의 배양액 추출 총 수용성 단백질(total soluble protein, TSP)이며, 레인 1, 2 및 3은 PNGase A 발현 세포주로부터 확보한 배양액 추출 TSP이다.

그 결과 우수 선발 캘러스 세포주 14번 (레인 1번)에서 PNGase A의 당쇄화가 완성된 당단백질의 크기에 해당되는 특이적 밴드를 확인하였고 이 결과로 PNGase A가 벼 캘러스에서 매우 높은 수준으로 발현되어 생산되는 것을 확인하였다(도 7). 식물 유래의 PNGase A는 12개의 당쇄가 붙는 당단백질로서 당쇄가 제거되지 않는 상태에서는 도 7과 같이 110kDa 정도의 크기를 나타내는 것으로 분석되었다. 이 결과는 PNGase A 전사 효율을 더욱 높이기 위하여 3Dsp/PNGase A/His6의 5'-영역에 비번역영역(untranslation region)을 추가 도입한 벡터 pJKS117에 의하여 발현된 형질전환 개체 14번인 점으로 보아 5'-UTR이 PNGase A 발현에 효율적임을 알 수 있었다.

본 발명의 벼 캘러스 배양시스템을 통해 배지 분비 형태로 생산된 PNGase A 단백질의 활성을 알아보기 위하여 식물-유래의 Activin A 단백질을 기질로 사용하였다. Activin A는 퓨린(furin) 처리에 의하여 전구 영역(pro-domain)을 가진 상태에서 성숙 단백질(mature protein)로 완성되는데, 이때 PNGase A 전처리를 통하여 탈당화(deglycosylation)시켜 퓨린 처리 효율을 높이고자 하였다(도 8A). 그 결과, PNGase A를 처리하지 않고 퓨린을 처리한 경우 관찰되지 않던 성숙 단백질이 PNGase A를 전처리하고 퓨린을 처리한 처리구에서는 관찰되었다(도 8A의 레인 4). 또한 대표적인 당쇄 단백질인 페투인(Fetuin)에 시판용 PNGase A와 캘러스 유래 PNGaseA를 처리하여 당쇄가 제거(deglycosylation) 되는지를 확인하였다. 그 결과, 시판용 PNGaseA 처리구에 비해 당쇄가 제거된 페투인 특이적인 밴드들이 캘러스 유래 PNGaseA 처리구에서 더욱 뚜렷하게 관찰됨으로서 그 효능을 확인할 수 있었다(도 8B).

실시예 5. 선발된 벼 형질전환 캘러스의 현탁배양

우수 선발 캘러스 세포주 14번으로부터 PNGase A 단백질의 분비를 유도하기 위한 현탁배양을 수행하였다(도 9). 30g/L 수크로스, 2mg/L 2,4-D, 0.2mg/L 키네틴, 50mg/L 하이그로마이신 B를 첨가한 N6 액체 배지(N6SE)에 캘러스를 넣고 28℃에서 150rpm으로 암배양을 수행하였다. 1주일 후 어느 정도 자란 캘러스를 메쉬(mesh) 망을 이용하여 잘게 걸러 새로운 N6SE 배지에 현탁배양을 하였다. 1주일 간격으로 계대 배양을 수행하면서 항생제 포함 배지에서 캘러스 입자의 굵기가 잘게 유지하면서 증식을 유도하였다. 수확한 배지로부터 TSP를 추출하였다. TSP를 아이스에 넣어 놓고 다음날 다시 원심분리하여(13,000rpm, 30분, 4℃) 상층액만 취하여 목적 단백질의 분석에 사용하였다(도 7).

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology NBM Co., Ltd <120> Transgenic rice callus producing PNGase A and uses thereof <130> PN16228 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1080 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 gatcttcaac cacctgtgct agctactcca ctgctccata ggcaatcatc aatcagtaat 60 ccgttctgaa aagaagatat aggtgtgcgc aatcaggaac gttctagttc gtgctagaaa 120 tcagcagctc ctaagttagc atctcgatga acttaaatgc tcgctgcggg cgtccggcgg 180 agatgaagtt tgtgataaac ttggtcatga cattcatata tgtgcctggt gtacggagta 240 gttcatcagc aaacatacac ctacttctac cttatccatt tggattgctc atggcggctt 300 tgatatggaa tttgtaatga acttggttat gacttatgac atactgatac tcgtaacatt 360 catagatact gacataaatt catcaactac aatagatgag atggctagtc ttagtagaac 420 agtagtctct ctttccggct tgctccattg gctgatgacg atgaacaact cggactcatt 480 gattccagca ttatctgatt ctcgcatttc gaggtccgga ttagggtctc accgagatgt 540 ggatagaatt gccatgtcag gaattgaagg aggacgagcc atatgtgcat atacatgacg 600 ggagatcaag cggccagtca agaggctaac tgcaacccta ttatatacga tcagcctgct 660 agaacacgta gcactgtctt ttttgtctga actctgaaga tgaaaggttc agagaaatgg 720 ctcgccttat ccaagccggc gatggatgga ggaggaggta gccggcgccc gcctcaggca 780 gtcgtcgcga tcacgccgcc gcatcccgtc gccttggaga ccgggccccg acgcggccga 840 cgcggcgcct acgtggccat gctttattgc cttatccata tccacgccat ttattgtggt 900 cgtctctcct gatcattctc attcccctgc cacggtgacc gtgcccccgg tgttctatat 960 atgccccccg acgtcgaggt cattcgccac gaacacatcg atcatccatc atctacaaga 1020 gatcgatcag tagtggttag cagcaactca ctatcgaaca cggtttcagc ttacacagat 1080 1080 <210> 2 <211> 58 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 2 atcagtagtg gttagcagca actcactatc gaacacggtt tcagcttaca cagatatg 58 <210> 3 <211> 69 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 3 aagaacacca gcagcttgtg tttgctgctc ctcgtggtgc tctgctcctt gacctgcaac 60 tcgggccaa 69 <210> 4 <211> 1725 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNGase A <400> 4 gcccaggtcc tcgagccaac accactccat gacacaccac caacagtgtt cttcgaagtc 60 accaagccta tcgaagtgcc taagaccaag ccgtgttccc agctcatcct ccagcatgac 120 ttcgcctaca catatggcca agctccagtc ttcgccaact acactcctcc ttccgactgt 180 ccgtctcaga ccttctccac catcgtcctc gaatggaagg ctacatgcag acgcaggcag 240 ttcgatagga tcttcggtgt gtggctcggt ggtgttgaga tcctcaggag ctgcacagca 300 gaaccaagac ctaatggcat cgtctggact gtcgagaagg acatcacaag gtactactca 360 ctcctcaaga gcaaccagac acttgccgtg tatcttggca acttgatcga caagacctac 420 actggcatct atcatgtgaa catcagcctt catttctacc ctgccaagga gaagttgaac 480 tctttccagc agaagttgga caacttggcc tctggctacc actcttgggc tgatttgatc 540 ctcccaatct cgaggaatct gccgttgaat gacggcttgt ggttcgaggt tcagaactcc 600 aatgacacgg agttgaagga gttcaagatt ccacagaatg cctacagagc tgtgttggag 660 gtgtatgtgt ccttccacga gaatgatgag ttctggtact caaatcttcc taacgagtac 720 atcgctgcca acaacctcag cggcacacca ggcaatggcc ctttcagaga ggtggtggtc 780 agcctcgatg gtgaggtggt tggtgcagtc tggcctttca ctgtgatctt cactggaggc 840 atcaatcctc tcttgtggag accaatcact gccattggct cattcgatct tccgacttac 900 gatatcgaga tcacaccatt cctcggcaag atcttggatg gcaagagcca caagttcggc 960 ttcaatgtca caaacgcctt gaacgtctgg tacgtcgatg ccaacttgca tctctggttg 1020 gacaagcaga gcacaaagac tgaaggcaag ctctcgaagc atagcagctt gcctctcgtc 1080 gtctccctgg tctccgactt caagggtttg aacggcacat tcttgacaag gacaagcagg 1140 tccgtgtcat ccaccggatg ggtgaagtct tcctatggca acatcacaac ccgctccatc 1200 caggacttct actacagcaa ctcaatggtc ctcggcaagg atggcaacat gcagatcgtc 1260 aaccagaaga tcatcttcaa cgactccgtc tacatcaacc tgccatcctc ctacgtccac 1320 tcactgacct cacacaagac cttcccactc tacttgtaca ctgacttcct cggacaaggc 1380 aatggcacct acttgttgat caccaacgtg gacttgggat tcatcgagaa gaagtctggc 1440 ttgggcttct ccaacagctc cctcaggaac ctgaggagcg ccgagggcaa catggtcgtg 1500 aagaacaact tggtcgtgag cggattggag agcacccagc agatctacag gtacgatggt 1560 ggtaagttct gctacttcag gaacatcagc agctcaaact acaccatcct ctacgacaag 1620 gtgggcagca agtgcaacaa gaagtccttg tccaacttgg acttcgtctt gagcagactg 1680 tggcctttcg gcgcccggat gaacttcgcc ggtctccggt tcacc 1725 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6XHis tag <400> 5 caccatcacc atcaccat 18 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 agcttcctga tggacaggtt atc 23 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 accactgaga acgatgttgc c 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 taacgagtac atcgctgcca ac 22 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 aatggtgtga tctcgatatc gtaag 25

Claims

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(a) 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼 유래의 α-아밀라제(RAmy3D) 프로모터, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 5'-말단 비번역영역(5'-UTR), 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 RAmy3D 신호 서열(3Dsp), 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 아몬드 유래 PNGase A(Peptide-N-glycosidase A) 단백질 코딩 유전자 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 His6 코딩 유전자가 작동가능하게 연결된 벼 형질전환용 재조합 벡터를 벼 캘러스에 형질전환하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 형질전환된 벼 캘러스를 당 결핍 배양 배지에서 현탁 배양하여 PNGase A를 생산하는 단계를 포함하는 재조합 PNGase A의 생산방법.
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