CN117327719A - 一种分离的多核苷酸及其编码的LiCWIN2蛋白与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于转基因技术领域，具体涉及一种分离的多核苷酸及其编码的LiCWIN2蛋白与应用。本发明提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸分离自海滨石蒜(Lycoris insularis)。所述多核苷酸或其编码的LiCWIN2蛋白具有促进植物生长、提高植物产量的作用，在农业生产中具有广阔的应用前景。

Description

一种分离的多核苷酸及其编码的LiCWIN2蛋白与应用
技术领域
本发明属于转基因技术领域，具体涉及一种分离的多核苷酸及其编码的LiCWIN2蛋白与应用。
背景技术
大多数高等植物具备将光合同化物蔗糖从源器官经由韧皮部转运到库器官的特性。因“库-源”碳分配和库器官发生紧密相关，调控蔗糖代谢相关基因也是研究库器官发生的重要目标基因。其中，具有代表性的便是细胞壁蔗糖转化酶(Cell Wall Invertase，CWIN)。CWIN参与调控蔗糖在质外体中不可逆地水解为葡萄糖和果糖，为植物生命活动提供碳源、调控库-源碳分配；除了作为营养源外，CWIN介导的糖信号通过调节细胞周期、细胞分裂和生长素生物合成相关基因的表达，对库器官(如果实、种子、鳞茎等)发生也起到至关重要的作用。在水稻、小麦、番茄、玉米等的研究中均表明CWIN表达量下降或其酶活性降低与库器官发生受阻密切相关。近期，在拟南芥的研究中进一步明确特异性地沉默CWIN2/4的表达，会通过中断糖信号级联抑制胚珠的发生，导致转基因植株每角果中种子数量显著下降(50.8％-62.6％)，但不影响碳同化物质的运输。
虽然在双子叶植物拟南芥、番茄、木薯、马铃薯、杨树，单子叶植物水稻、玉米等物种中已有关于CWIN基因功能的研究，但主要以生物信息学方法对其保守结构域、系统进化关系、启动子作用元件等进行表征分析。
中国专利申请201110364661.9公开了一种甘蔗细胞壁结合转化酶基因及其编码蛋白序列，在对所有植物细胞壁结合转化酶基因全长序列进行进化分析的基础上，以同一家族的细胞壁结核转化酶基因序列的保守区设计引物，从甘蔗幼嫩叶片提取总RNA，并经反转录，用常规PCR法扩增，结合RACE技术克隆到甘蔗细胞壁结合转化酶(SoCWI)基因的全长cDNA序列。
中国专利申请201510655572.8首次克隆出5种荔枝细胞壁酸性转化酶基因，分别命名为LcCWAI 1、LcCWAI 2、LcCWAI 3、LcCWAI 4、LcCWAI 5，长度分别为1713bp、1722bp、1734(1758)bp、1677bp和1740bp，编码的氨基酸数目分别为570、573、577(585)、558、579个。
海滨石蒜为多年生单子叶植物，目前鲜有关于多年生单子叶植物CWIN基因功能的研究报道。
发明内容
本发明选择对海滨石蒜(Lycoris insularis)进行研究，从中分离出了LiCWIN2基因，并通过系列实验表征了其对植物生长的影响。
为了实现上述技术目的，本发明提出了以下技术方案：
本发明的目的之一，在于提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸为LiCWIN2基因，其分离自海滨石蒜(Lycoris insularis)。
在一个实施方案中，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少85％、90％、95％、98％、99％的序列同一性。
在一个实施方案中，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少99％的序列同一性。
在一个实施方案中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的目的之二，在于提供一种LiCWIN2蛋白(细胞壁蔗糖转化酶)，所述CWIN2蛋白由所述多核苷酸编码。
在一个实施方案中，所述LiCWIN2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明的目的之三，在于提供一种基因表达盒，所述基因表达盒包含所述多核苷酸。
在一个实施方案中，所述基因表达盒还包含在植物中具有活性且与所述多核苷酸可操作地连接的启动子。
在一个实施方案中，所述启动子可以为CaMV35S启动子。
本发明的目的之四，在于提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含所述多核苷酸和/或所述基因表达盒。
在一个实施方案中，所述重组表达载体为真核表达载体或原核表达载体。
在一个实施方案中，所述重组表达载体可以为pCAMBIA载体，例如pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pCAMBIA1302、pCAMBIA1303、pCAMBIA1304、pCAMBIA1305等。
在一个优选的实施方案中，所述重组表达载体可以为pCAMBIA1301。
本发明的目的之五，在于提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含所述重组表达载体。
在一个实施方案中，所述宿主细胞为真核细胞或原核细胞。
在一个实施方案中，所述细胞可以为大肠杆菌或农杆菌。
本发明的目的之六，在于提供一种植物生长促进剂，所述植物生长促进剂包含所述多核苷酸、所述细胞壁蔗糖转化酶、所述基因表达盒、所述重组表达载体和/或所述宿主细胞。
本发明的目的之七，在于提供所述多核苷酸、所述LiCWIN2蛋白、所述基因表达盒、所述重组表达载体、所述宿主细胞和/或所述植物生长促进剂在促进植物和/或植物繁殖体生长、和/或提高植物产量中的应用。
在一个实施方案中，所述植物包括藻类植物、苔藓植物、蕨类植物和种子植物。
在一个实施方案中，所述种子植物包括被子植物，例如玉米、大豆、棉花、加拿大油菜、水稻、大麦、燕麦、小麦、草皮草、苜蓿、甜菜、向日葵、甘蔗、拟南芥等。
在一个优选的实施方案，所述植物可以为拟南芥。
在一个实施方案中，所述植物繁殖体包括细胞、花粉、胚珠、花、胚芽、叶、根、茎、枝、分生组织、谷粒和种子等。
在一个优选的实施方案中，所述枝可以为侧枝。
本发明的目的之八，在于提供一种用于扩增所述多核苷酸的引物对，所述引物对包括：
如核苷酸序列SEQ ID NO:3所示的上游引物和如核苷酸序列SEQ ID NO:4所示的下游引物；或
如核苷酸序列SEQ ID NO:5所示的上游引物和如核苷酸序列SEQ ID NO:6所示的下游引物。
本发明的目的之九，在于提供一种促进植物和/或植物繁殖体生长、和/或提高植物产量的方法，所述方法包括提高目的植物的LiCWIN2蛋白的含量和/或活性。
在一个实施方案中，所述方法还包括将所述多核苷酸、所述基因表达盒、所述重组表达载体和/或所述宿主细胞导入目的植物和/或植物繁殖体。
在一个实施方案中，所述方法还包括向目的植物和/或植物繁殖体施用有效量的所述植物生长促进剂。
本发明首次从海滨石蒜中分离出了LiCWIN2基因，并确定了其ORF的核苷酸序列，在进一步的研究中发现LiCWIN2基因具有促进植物生长、提高植物产量的作用：
在将LiCWIN2基因转入拟南芥后发现，在相同的培养条件下，LiCWIN2基因过表达株系主根平均长度可达到50mm，相比野生型增加了43.34％，相比于cwin2突变体株系则增加了66.66％，cwin2突变体与cwin2/cwin4双突变体的主根长度均短于野生型拟南芥；
LiCWIN2基因过表达拟南芥根系鲜重相较于野生型拟南芥，根系鲜重增加了156.65％；而cwin2突变体株系与cwin2/cwin4双突变体株系相较于野生型拟南芥在根系鲜重上并无显著差异，即LiCWIN2基因过表达显著增加了拟南芥幼苗的地下部的生物量；
LiCWIN2基因过表达拟南芥侧枝(分枝)数量较于野生型拟南芥，侧枝数量增加了31.1％；而cwin2突变体株系与cwin2/cwin4双突变体株系相较于野生型拟南芥在侧枝数量上并无显著差异；
LiCWIN2基因过表达拟南芥果实数量较于野生型拟南芥，果实数量增加了91.4％；而cwin2突变体株系与cwin2/cwin4双突变体株系相较于野生型拟南芥在果实数量上并无显著差异。
附图说明
图1示出了LiCWIN2-ORF扩增结果。其中M为Marker，泳道1-3为样品。
图2示出了LiCWIN2基因亚细胞定位。其中YFP为YFP荧光场，PM-mCherry为mCherry红色荧光，Bright field为明场；Merge为明场与荧光视场叠加。
图3示出了转基因拟南芥LiCWIN2基因表达量。
图4示出了不同株系(WT，LiCWIN2，cwin2，cwin2cwin4)拟南芥主根的生长发育情况。
图5示出了不同株系(WT，LiCWIN2，cwin2，cwin2cwin4)拟南芥根系生长发育情况。
图6示出了不同株系(WT，LiCWIN2，cwin2，cwin2cwin4)拟南芥分枝生长发育情况。
图7示出了不同株系(WT，LiCWIN2，cwin2，cwin2cwin4)拟南芥果实生长发育情况。
具体实施方式
除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5％的范围。
本文所用的术语“分离的”，是指已经从其天然环境的组分中鉴定出并且与其天然环境的组分分离和/或从其天然环境的组分中回收的。
本文所用中的术语“多核苷酸”，通常指核苷酸(例如核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合物，并且可包括天然存在的(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶)、非天然存在的和经修饰的核酸。
本文所用的术语“核酸递送载体”或“表达载体”，是指在将上述分离的核酸分子连接到载体上时，可以将核酸序列与载体上的调控元件直接或者间接相连，只要这些调控元件能够调控该核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些调控元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。也就是说，核酸分子与调控元件可操作地连接。本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的调控元件，例如转录调控序列和翻译调控序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。当然用来编码抗体重链和轻链的多核苷酸，可以分别独立的插入到不同的载体上，常见的是插入到同一载体上。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。
本文所用的术语“细胞”、“宿主细胞”或“重组细胞”中可包含有表达载体。可以将表达载体导入到哺乳动物细胞中，获得重组细胞，然后利用这些重组细胞表达本公开提供的LiCWIN2蛋白。
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
表1本发明涉及的材料和试剂
实施例1构建CWIN2重组表达载体
1.1扩增目的片段
根据发明人前期获得的转录组数据，比对得到蔗糖转化酶基因序列(未公布)。利用Primer-BLAST在线设计工具设计特异性引物LiCWIN2-F(SEQ ID NO:3:5’-CGACAACAAGTATAGGACTGGCT-3’)和LiCWIN2-R(SEQ ID NO:4:5’-GTGTCGATACCAGTGTACAGGA-3’)。以获得的海滨石蒜鳞茎DNA为模板，使用Max高保真酶进行PCR扩增海滨石蒜LiCWIN2基因ORF编码区。
PCR反应体系如表2所示。
表2PCR反应体系
反应条件为：98℃，4min；98℃，10s，60℃，15s，72℃，90s，共30个循环；72℃，5min。
经凝胶电泳检测，使用DL2000 DNA Marker作为参照。结果显示，以海滨石蒜鳞茎中提取的DNA为模板，经1％琼脂糖凝胶电泳呈现单一明亮条带。根据设计的特异性引物，通过PCR反应扩增得到了LiCWIN2基因1708bp的ORF编码区序列。
1.2胶回收目的片段
将需要回收的目的条带用TaKaRa琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化。
1.3目的片段连接克隆载体
切胶回收的目的片段连接至平末端克隆载体pEASY-Blunt Zero进行重组反应。
表3连接反应体系
反应条件：37℃，15min。
1.4重组载体转化大肠杆菌
于冰上化冻50μL大肠杆菌感受态DH5α，在细胞化冻时以打圈的方式缓慢加入重组载体轻弹混匀，冰浴30min。于42℃水浴热激40s，立即于冰上静置3min。在超净台上加入500μL LB液体培养基，于37℃、200rpm培养1h。培养完成后，5000rpm离心3min，弃部分上清，保留100-150μL菌液，用枪头吸打使菌体充分悬浮，取全部菌液均匀涂布于LBK培养基，37℃倒置培养过夜。
经LBK培养基筛选后，挑取8个单克隆接种于LBK液体培养基中培养后，使用M13通用引物进行菌落PCR阳性检测，反应体系如表4所示：
表4PCR阳性检测体系
反应条件：94℃，5min；94℃，30s，57℃，30s，72℃，45s，32个循环；72℃，10min。
检测结果显示，扩增出来的片段长度与预期相符合，可以送测序。
反应产物经凝胶电泳检测，选取与预测长度一致的菌液进行测序。完成测序比对后，将需要保存的菌液加入10-15mL的LB液体培养基于50mL离心管内，于37℃，200rpm过夜摇菌，保菌。
将测序结果与转录本序列进行比对后，得到LiCWIN2的ORF基因序列，其序列如SEQID NO:1所示：
ATGGAGATTTCAAATGGGGTTATTTGGTTAGTAGTGTTCTTGTTTTATAATTTAGCTGAAGGATCTCATTTTGTTCATGACGAACTTCAATCGGTGCCGGCTGCCATAGTCGACAACAAGTATAGGACTGGCTACCACTTTCAGCCACCAAAGCATTGGATCAATGATCCAAATGGACCAATGTACTACAATGGCATCTACCATCTTTTTTATCAATACAACCCCTATGCTGCAGTATGGGGTAACATTGTGTGGGCCCACTCGGTTTCGACGGACATGATCAATTGGAAAGCACTCGAACCCGCGATCTATCCATCCAAACCATTCGATATTAACGGGTGCTGGTCCGGATCCGCAACGATCCTACCCGGTAAAAAACCCGCTATCCTGTACACTGGTATCGACACGCAAAACCGTCAAGTCCAAAACATTGCATTCCCTAAGAACCTATCCGATCCTTATCTTCGCGAATGGGTTAAACCTGATTACAACCCAATAATCGCCCCAGTGGATGGGATCAATGCTAGCTCGTTTCGCGACCCGACAACCGCTTGGTTTGGACCCGATAAGCGGTGGAGGTTGGTGATAGGGAGCAAGAGAATGCACCGAGGGATGGCGATTTTGTATCGAAGCAAAGATTTTATCCATTGGATTCGGGCAAAACACCCATTACACTCGGTTAGCAATACGGGTATGTGGGAGTGTCCGGATTTTTACCCGGTAGCTATGAATGGTAAATTGGGCGTCGATACTTCAGAATACGGTGATGGGTTAAAATACGTGCTTAAAGCCAGTTTGGACGTGACCAGATACGAG TATTATACTATTGGCTCGTACAATCATGAAATAGACAGGTACATACCAGACGGTACATCAGCTGATAATGGATCAGGGTTGAGGTACGATTATGGAAATTTTTACGCGTCGAAGACATTTTTCGACCCCGCGAAAAATAGGAGGATTCTGTGGGGGTGGTCCAATGAGTCTGATAGCAAGCAAGATGATGTAAGCAAGGGTTGGGCTGGGATTCAGACAATTCCTAGAGCAATTTGGCTTGATGTTGATGGGAGTCAACTTGTTCAATGGCCAATTGCAGAGCTTGAGAGTCTTAGAGGGAAGAAAGTTTCTTTGAGTCATAAAAAACTGAAGAGTGGGGATACAATTGAAATCTCAGGAATTATGAGTGCTCAGGCAGATATCGAAGTGACATTTCAATTGTCAAACTTAGCAAAGGCCGAGCCATTTGATCCAACATGGACTGATCCACAGAAGCTATGCGAGCGCAAGGGTGCGGATGTGAAGGGTGGGGTTGGACCATTCGGGCTCTTGACTTTGGCTTCGGCAACGAGGGAGGAGCAAACTGCTGTTTTCTTTAGAATCTTTAAAGGCCCCACCAAATATGTAGCCCTAATGTGCCATGACCCATCAAAATCATCAGTAAGACCAGGGCTCTACAAGCCAACCTATGGAGGGTTTGTAAATGTAGATATCCAGAAAACTGGAAAGATTTCTCTAAGGAGTCTGATCGATCACTCTGTGGTGGAGAGCTTTGGAGGTGAAGGAAGAACTTGCATGACATCAAGGGTTTATCCGAGCATCGCGTTGGGCGAGGCTGCTCATCTCTTTGTGTTCAACAATGGAGAGGAAGAAGTGAGGATCTCAGAGCTTTTTGCTTGGGAAATGAAGAAGCCTTTGATGATGAATTGA。
实施例2LiCWIN2序列测定与分析
LiCWIN2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示：
MEISNGVIWLVVFLFYNLAEGSHFVHDELQSVPAAIVDNKYRTGYHFQPPKHWINDPNGPMYYNGIYHLFYQYNPYAAVWGNIVWAHSVSTDMINWKALEPAIYPSKPFDINGCWSGSATILPGKKPAILYTGIDTQNRQVQNIAFPKNLSDPYLREWVKPDYNPIIAPVDGINASSFRDPTTAWFGPDKRWRLVIGSKRMHRGMAILYRSKDFIHWIRAKHPLHSVSNTGMWECPDFYPVAMNGKLGVDTSEYGDGLKYVLKASLDVTRYEYYTIGSYNHEIDRYIPDGTSADNGSGLRYDYGNFYASKTFFDPAKNRRILWGWSNESDSKQDDVSKGWAGIQTIPRAIWLDVDGSQLVQWPIAELESLRGKKVSLSHKKLKSGDTIEISGIMSAQADIEVTFQLSNLAKAEPFDPTWTDPQKLCERKGADVKGGVGPFGLLTLASATREEQTAVFFRIFKGPTKYVALMCHDPSKSSVRPGLYKPTYGGFVNVDIQKTGKISLRSLIDHSVVESFGGEGRTCMTSRVYPSIALGEAAHLFVFNNGEEEVRISELFAWEMKKPLMMN。
发明人通过ProtParam在线分析得到以下结果，LiCWIN2基因编码产物的分子量约为64.11kDa，预测的等电点pI值为7.66，含有60个负电荷的氨基酸残基数，含有61个正电荷的氨基酸残基数。LiCWIN2蛋白总平均疏水性为-0.348，属于亲水性蛋白，不稳定系数为32.28。以上结果证明LiCWIN2基因所编码蛋白是稳定的。
发明人使用TMHMM 2.0软件进行分析。结果表明，LiCWIN2基因所编码的蛋白跨膜区域，发现均为膜外蛋白，无跨膜区。
位点结构分析结果与二级结构预测显示，该序列主要含有α-螺旋、延伸链、无规则卷曲进一步组装折叠成三级结构。其中α-螺旋有90个氨基酸，占15.85％；延伸链含有138个氨基酸，占24.30％；无规则卷曲含313个氨基酸，占55.11％；β-转角结构有27个氨基酸，占4.75％。通过SWISS-MODEL预测LiCWIN2基因编码蛋白的三级结构，显示LiCWIN2基因编码的蛋白三级结构与二级结构结果相符合。
发明人利用MEGA 7.0软件中的邻接法，将海滨石蒜与其他15种不同植物的酸性蔗糖转化酶的氨基酸序列构建系统进化树。发现海滨石蒜LiCWIN2与百合科的野百合变种巨球百合LbgCWIN1在进化上同属于一个分支。
实施例3LiCWIN2基因亚细胞定位测定
3.1亚细胞定位载体构建
以海滨石蒜为试验材料，使用试剂盒提取RNA。将提取的RNA进行凝胶电泳，结果显示所提取额海滨石蒜总RNA质量较好。
根据克隆出的LiCWIN2基因序列，设计克隆LiCWIN2基因ORF序列的引物，进行PCR扩增得到目的片段(图1)。
纯化后的产物与克隆载体相连，转化感受态大肠杆菌。经LBK固体培养基筛选后挑取8个单克隆进行阳性检测。选择3，5，8号菌液测序，将所得的测序结果与已获得的换锦花LiCWIN2的DNA序列进行比对，比对正确后即获得带有与pCAMBIA1300-35S-YFP载体酶切位点相同位点同源臂的LiCWIN2-ORF片段。将阳性克隆菌液大摇后提质粒，质粒进行凝胶电泳检测。
使用限制性内切酶EcoRI和SalI对植物双元载体载体pCAMBIA1300-35S-YFP双酶切，将酶切过的线性载体质粒进行切胶回收。
对获得的LiCWIN2-ORF克隆载体质粒，使用EcoRI和SalI双酶切。对与LiCWIN2-ORF序列大小相似的2Kb左右的条带进行切胶回收纯化。
将LiCWIN2-ORF片段与线性化植物双元载体双酶切后切胶回收纯化的产物通过T4连接酶进行连接，将LiCWIN2替换pCAMBIA1300载体上的35S启动子构建35S::LiCWIN2-YFP表达载体，随即转化感受态大肠杆菌，经筛选培养后，挑取8个单拷贝菌落使用载体通用引物进行PCR检测。将菌液7，8送测序，测序结果与LiCWIN2-ORF比对一致，LiCWIN2基因亚细胞定位的35S::LiCWIN2-YFP表达载体构建完成。
3.2亚细胞定位载体转化农杆菌
使用试剂盒提取重组载体质粒，使用冻融法将重组载体35S::LiCWIN2-YFP质粒经冻融法转化感受态农杆菌，涂板，挑取单拷贝菌落，进行PCR阳性检测。
将35S::LiCWIN2-YFP表达载体阳性农杆菌和pCAMBIA1300-35S-YFP载体空载农杆菌经大摇重悬浮菌液后，使用注射器将菌液注入烟草叶片下表皮，暗培养2-3天后，取顺时转化后的叶片组织制成玻片标本，于激光共聚焦显微镜下观察。
结果显示，在YFP荧光场下，LiCWIN2基因翻译蛋白仅在细胞的边缘发出荧光，而空载体pCAMBIA1300-35S-YFP的细胞边缘及细胞内部都发出荧光；在PM-mCherry激光下，可以看到35S::LiCWIN2-YFP表达载体与空载的细胞质膜Marker均发出红色荧光；在明场下观察其均有完整细胞结构(图2)。叠加场的观察结果显示PM-mCherry荧光信号位于LiCWIN2-YFP荧光两侧，LiCWIN2-pCAMBIA1300-35S-YFP融合蛋白主要分布在细胞边缘的细胞壁上，而空载体对照显示PM-mCherry荧光信号与YFP荧光信号叠加融合(图2)。
亚细胞定位观察结果显示LiCWIN2定位于植物细胞细胞壁上。
实施例4LiCWIN2基因对拟南芥生长的影响
4.1LiCWIN2基因过表达载体构建
(1)扩增目的片段：以海滨石蒜鳞茎cDNA为模板，克隆LiCWIN2基因的ORF序列，使用无缝克隆引物进行PCR扩增，扩增引物如LiCWIN2-1301-F(SEQ ID NO:5:5’-ATTTACGAACGATAGGGTACCAATATTTACGTGATGGAGATTTC-3’)和LiCWIN2-1301-R(SEQ ID NO:6：5’-GCTCACCATGGATCCGTCGACATTCATCATCAAAGGCTTCT-3’)所示，将产物经凝胶电泳检测。
(2)酶切载体：使用限制性内切酶KpnI和SalI双酶切植物双元载体pCAMBIA1301，同时将未酶切的载体为对照进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，未酶切载体的电泳速度会略快于酶切的线性化载体。
(3)目的片段连接载体：使用无缝克隆试剂盒，将纯化后的目的片段与对应线性化植物表达的载体进行重组反应，重组构成35S::LiCWIN2质粒。冻融法转化大肠杆菌，使用pCAMBIA1301载体通用引物进行菌液检测，根据凝胶电泳结果送测1，2号菌液。测序比对结果正确，证明成功构建LiCWIN2基因过表达载体。
4.2LiCWIN2基因过表达载体转化拟南芥
将保存于-80℃的阳性大肠杆菌菌液，提取35S::LiCWIN2载体质粒，通过冻融法将其转入感受态农杆菌，经LBKR培养基上筛选，挑取单克隆扩增培养后，使用pCAMBIA1301载体通用引物进行PCR阳性检测，经凝胶电泳检测，结果显示其与目的条带大小一致。表明该载体包含目的片段，可用于拟南芥转化实验。
(1)将35S::LiCWIN2载体质粒转化感受态农杆菌。
(2)测序验证，选择阳性农杆菌扩增保菌。
(3)制备LBKR液体培养基，将农杆菌悬浮液(5％蔗糖溶液)、锥形瓶、透气过滤膜、50mL离心管进行高温高压灭菌，待用。
(4)将300μL含有重组载体35S::LiCWIN2质粒的农杆菌菌液加入至无菌锥形瓶，再加入50mL LBKR液体培养基，于28℃，200rpm的摇床扩繁。
(5)摇至菌液OD600约为1.5后，转入50mL离心管，于室温下，6000rpm，离心10min，集菌，弃去多余的液体。
(6)向菌液沉淀中加入40mL农杆菌悬浮液，轻摇振荡混匀后，加入0.005％的Silwet-77表面活性剂，此时已制备好所需的浸染液。
(7)处理待浸染的拟南芥。挑取长势良好的植株，剪去拟南芥上的所有果荚和盛开的花朵，只保留花蕾。
(8)将拟南芥上的全部花蕾完全浸没于已处理好的浸染液之中，轻轻晃动1min。需注意经过浸染的花蕾不要相互的接触，避免交叉污染。
(9)浸染后的拟南芥需于25℃黑暗处理一天，随后转入生长室。
(10)T3代转基因拟南芥抗性筛选。
T3代转基因拟南芥种子播种于Hyg抗性培养基上筛选，此时大部分种子应正常发芽生长。待培养2周后，移苗至营养土中继续生长，以各株系拟南芥叶片的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测，测量在稳定遗传的转基因拟南芥中LiCWIN2基因的相对表达情况(图3)。LiCWIN2基因过表达拟南芥植株的LiCWIN2基因相对表达量大幅上调，并显著高于野生型拟南芥。其中，尤以L9-1株系的LiCWIN2基因表达量上调辐度最高，为野生型的92329.86倍。后续功能验证均选自L9-1株系。
4.3转基因拟南芥的功能验证
分别将过表达拟南芥、cwin2突变体、cwin2/cwin4双突变体和野生型拟南芥种子播种到含有30g·L-1蔗糖的拟南芥培养基上，记录不同发育阶段(包括培养基无菌生长和移栽营养土后)拟南芥的生长情况。
通过测量主根长度发现，在30g·L-1蔗糖浓度培养基上，LiCWIN2基因过表达株系主根平均长度可达到50mm，相比野生型增加了43.34％，相比于cwin2突变体株系则增加了66.66％。统计分析表明，LiCWIN2基因过表达株系在30g·L-1蔗糖浓度培养基上主根长度显著增长且差异极显著(P<0.01)；在30g·L-1蔗糖浓度培养基上，LiCWIN2基因过表达株系主根长度明显长于cwin2突变体株系；cwin2突变体与cwin2/cwin4双突变体的主根长度均短于野生型拟南芥(图4)。
每10株拟南芥为一组统计根系总重量，3个重复。发明人发现，LiCWIN2基因过表达拟南芥根系鲜重极其显著(P<0.001)高于野生型拟南芥、cwin2突变体株系与cwin2/cwin4双突变体株系，其中LiCWIN2基因过表达拟南芥根系鲜重相较于野生型拟南芥，根系鲜重增加了156.65％(图5)。而cwin2突变体株系与cwin2/cwin4双突变体株系相较于野生型拟南芥在根系鲜重上并无显著差异。统计结果表明，LiCWIN2过表达显著增加了拟南芥幼苗的地下部的生物量。
LiCWIN2基因过表达拟南芥侧枝(分枝)数量较于野生型拟南芥，侧枝数量增加了31.1％；而cwin2突变体株系与cwin2/cwin4双突变体株系相较于野生型拟南芥在侧枝数量上并无显著差异(图6)
LiCWIN2基因过表达拟南芥果实数量较于野生型拟南芥，果实数量增加了91.4％；而cwin2突变体株系与cwin2/cwin4双突变体株系相较于野生型拟南芥在果实数量上并无显著差异(图7)
对比例
本对比例采用进化上同属于一个分支的巨球百合LbgCWIN1基因作为对照，探究是否其他CWIN基因是否同样具有促进植物生长的作用。
LbgCWIN1基因的LbgCWIN1-ORF序列如SEQ ID NO:7所示：
ATGGAGCTCTCAAAGCTCACCAAATGTGTATCAATGGTGATTCTCGTTTGCTTCAGCTTCTCATCCATGGAGGCTTCGCATGTGGTGTATCATACACAACTAACCAGCTCCCCTTTATCGAAGGGAGCTTACAGGACCGGCTATCACTTTCAGCCGCCTAAGAACTGGATCAATGATCCGAATGGCCCCATGTACTACAAGGGCATTTATCATCTCTTCTATCAATACAACCCTGAAGGAGCACAGTGGGGCAATATAGTATGGGCTCATTCCATCTCTTTCGATCTCATTAACTGGGTGCCCCTCCAACCCGCTATCTACCGATCCAAACCATTTGACATTAATGGATGTTGGTCGGGATCTGCCACCATCCTCCCTGGCAACAAACCAGCCATTCTCTATACAGGCATCGACCCGAACAACCGACAAGTTCAAAACCTAGCCATTCCCAAGAACCTGTCAGACCCGTTTCTCCGTGAGTGGCTTAAGCCTGACTACAACCCGGTCATCAATCCGGGACCCGGGATCAACGCCACCGCCTTCCGTGACCCAACTACCGCTTGGATGGGATCCGACGGGCATTGGCGGGTGTTGCTGGGCAGTAGAAAGCCTGGGACGTTGAGGGGTGAGGCCGTCCTGTATAGGAGTCGGGATTTTGTGAAGTGGGTGAAAGCTAAGCACCCGTTGCACTCGTTGCGGAATACTGGGATGTGGGAGTGTCCCGATTTTTTTCCAGTGGCCGTGAATGGGATGAAAG GGTTGGATACGTCGGAGAACAGAGAGGGGGTGAAGCATGTGCTTAAGGTGAGCTTGGATCTGAAGAGGACTGATTGCTATACGATCGGGACTTATGATGCTGGCAAGGATCGGTTTGTGCCTGACATTAGTTCGGATGATAATAGTACGGGGCTGAGATATGATTATGGTAACTTTTATGCATCGAAGACGTTTTTTGATCCGGTGGAGAGAAGGAGAATTTTGTGGGGGTGGTCGAATGAGTCTGATACACCGCAAGATGATACTGCCAAGGGTTGGTCGGGAATTCAGACAATTCCGAGATCTATTTGGCTTGATGTTAATGGCCGACAACTCGTGCAATGGCCGATCAAGGAACTCGATGCACTCAGAGGGAAGGGAATTCATTTGTACAATACTGTTTTGAAAAGCAGAAGCCATGATGAAATCAAAGGGATTAGTTCTGCACAGGCTGATGTAGTGGTTACATTTGACGTGCCAAGTCTGGAAAAGGCTGAGCCATTTGACCCGACGTGGACTGACCCACAAGCTCTATGTGGGCTCAAGGGTGCAGATGTGAACGGTGGGGTTGGACCATTTGGGCTGCTGGTCCTGGCTTCCGCGGATATGGAGGAAAAAACAGCTGTTTTTATTAGGATATTCAGAGGATTCAACAAGCATGTTGTTCTTATGTGTCATGATTCCAGCAAGTCGTCAGAAAGACCAGAGTTGTGGAAGCAGTCCTTCGGAGGTTTTGTGGATGTTGACGTGGAAAAAGTAAAGAAGATCTCACTTAGGAGTTTGATAGACAATTCGGTGGTAGAGAGCTTCGGTGCTGAAGGAAAAACTTGCATTACTTCTCGGGTCTATCCTGTGAATGCAGTAGGAGCAGGTGCACATCTATTCGCTTTTAACAATGGAGAACAAGACGTGAGGATTGAAAATCTAACCGCATGGGAGATGAAGAAACCACTCATGAATGGATTATAA。
目的片段克隆、重组表达载体构建、拟南芥转化方法及各种条件同实施例4。
结果显示，LbgCWIN1转化拟南芥过表达的三个纯合株系：LbgCWIN1-3，LbgCWIN1-4，LbgCWIN1-6在叶片数量、主枝果荚数量、株高、主枝果荚长度上与野生型(WT)无显著差异，即LbgCWIN基因对拟南芥无促进作用。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为LiCWIN2基因，其分离自海滨石蒜(Lycoris insularis)。
2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少85％、90％、95％、98％、99％的序列同一性；
优选地，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO:1所示。
3.一种LiCWIN2蛋白，其特征在于，所述LiCWIN2蛋白由根据权利要求1-2中任一所述的多核苷酸编码。
4.根据权利要求3所述的LiCWIN2蛋白，其特征在于，所述LiCWIN2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.一种基因表达盒，其特征在于，所述基因表达盒包含根据权利要求1-2中任一所述的多核苷酸；
任选地，所述基因表达盒还包含在植物中具有活性且与根据权利要求1-2中任一所述的多核苷酸可操作地连接的启动子，优选CaMV35S启动子。
6.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含根据权利要求1-2中任一所述的多核苷酸或权利要求5所述的基因表达盒。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含根据权利要求6所述的重组表达载体。
8.一种植物生长促进剂，其特征在于，包含根据权利要求1-2中任一所述的多核苷酸、权利要求3-4中任一所述的LiCWIN2蛋白、权利要求5所述的基因表达盒、权利要求6所述的重组表达载体或权利要求7所述的宿主细胞。
9.根据权利要求1-2中任一所述的多核苷酸、权利要求3-4中任一所述的LiCWIN2蛋白、权利要求5所述的基因表达盒、权利要求6所述的重组表达载体、权利要求7所述的宿主细胞、或权利要求8所述的植物生长促进剂在促进植物和/或植物繁殖体生长、和/或提高植物产量中的应用；
优选地，所述植物包括藻类植物、苔藓植物、蕨类植物和种子植物；
更优选地，所述植物为拟南芥。
10.一种促进植物和/或植物繁殖体生长、和/或提高植物产量的方法，其特征在于，所述方法包括以下至少一种条件：
(1)提高目的植物的LiCWIN2蛋白的含量和/或活性；
(2)将根据权利要求1-2中任一所述的多核苷酸、权利要求5所述的基因表达盒、权利要求6所述的重组表达载体或权利要求7所述的宿主细胞导入目的植物和/或植物繁殖体；
(3)向目的植物和/或植物繁殖体施用有效量的根据权利要求8所述的植物生长促进剂。
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