CN110564740A

CN110564740A - 一种提高植物抗病性的基因AtPIP2；7及其应用

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Publication number: CN110564740A
Application number: CN201910976927.1A
Authority: CN
Inventors: 董汉松; 陈蕾; 徐德坤; 徐玉恒; 王浩; 张丽媛; 王延玲
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2019-10-15
Filing date: 2019-10-15
Publication date: 2019-12-13
Anticipated expiration: 2039-10-15
Also published as: CN110564740B

Abstract

本发明公开了一种提高植物抗病性的基因AtPIP2；7及其应用。本发明在十字花科植物拟南芥中克隆得到一种拟南芥水通道蛋白质AtPIP2；7基因，并且基于此基因构建了可以用于拟南芥、烟草、水稻等植物的AtPIP2；7过表达载体。将所述基因AtPIP2；7或其编码的蛋白质或重组表达载体或转化体在导入拟南芥后能够获得具有显著抗病性/或促进植物生长的品种。本发明可以运用在作物育种抗病性改良方面，有望提高植物的抗病性，从而达到增产减药的目的。

Description

一种提高植物抗病性的基因AtPIP2；7及其应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物学与植物遗传工程技术领域，具体涉及一种提高植物抗病性的基因AtPIP2；7及其应用。

背景技术

植物在生长发育过程中，常常受到多种病原物，如真菌、细菌、病毒和线虫等植物病原物的侵害，所引起的植物病害对植物的生长、发育、繁殖等产生不同程度的影响，导致植物产量下降。因此，改良植物抗病性，对有效控制作物病害的发生具有重要的意义。

植物水通道蛋白(aquaporin，AQP)分布普遍，在拟南芥、水稻等多种植物中已经鉴定出不同种类的水通道蛋白，这类蛋白质分子量在26-32KDa之间，属于跨膜通道蛋白MIP(major intrinsic protein)超家族，能双向高效介导自由水被动的跨膜转运(Maurel etal.,2008)。

植物水通道蛋白根据其定位、氨基酸序列同源性以及结构特征等可分为7类：质膜内在蛋白(Plasma membrane intrinsic proteins,PIPs)，液泡膜内在蛋白(Tonoplastintrinsic proteins,TIPs)，类Nod26膜内在蛋白(Nodulin 26-like intrinsicproteins,NIPs)，小分子碱性膜内在蛋白(Small and basic intrinsic proteins,SIPs)、未鉴定的膜内在蛋白(X intrinsic proteins,XIPs)、HIPs(hybrid intrinsic proteins)和GIPs(GlpF-like intrinsic proteins)(Danielson and Johanson,2008；Johanson etal.,2001；Maurel et al.,2015)。PIPs分布最为广泛，在各个植物组织器官中均有发现。植物细胞中主要定位于质膜上，孔道狭窄，并且基因序列高度保守，同源性较高，是典型的高选择性水分子通道(Marty et al.,1999)。PIPs又被分为两个亚类：PIP1与PIP2。两亚类在结构和氨基酸序列上有明显区别。

拟南芥总共有13个PIPs，通过非洲爪蟾卵母细胞异源表达相关实验发现，AtPIP2；1、AtPIP2；2、AtPIP2；3和AtPIP2；7等表现出较高的水分子通透活性(Daniels et al.,1994；Kammerloher et al.,1994；Weig et al.,1997)。随着对植物水通道蛋白研究的深入，发现植物水通道蛋白除了能介导水分子快速高效跨膜运输外，还兼具多种其他生理生化功能。AtPIP1；2能通透CO₂，从而使叶片的光合效率在一定程度上得到提高(Heckwolf etal.,2011)。不仅如此，AtPIP2；7可以被脱落酸诱导产生磷酸化并可能参与调控气孔开闭(Kelli G.Kline et al.,2010)。此外，植物水通道蛋白质还参与植物-微生物互作与植物防卫反应。新的研究证据表明，OsPIP1；3是Xoo参与水稻感染的病害易感因子(Li et al.,2019)。作为多功能蛋白的水通道蛋白在植物-微生物互作与植物防卫反应、营养元素的运输和信号传递、植物生长发育、气孔运动等生理过程中扮演不可或缺的角色。

目前，PIP1亚家族的AtPIP1；4和OsPIP1；3已经被报道分别参与拟南芥和水稻对病原细菌侵染的防卫反应中(Tian et al.,2016，Li et al.,2019)。但由于植物水通道蛋白种类和结构的复杂性，导致了其功能的多样性和难以预测性，而PIP2亚家族是否与植物抗病反应有关还未见报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种能够提高植物抗病性的基因AtPIP2；7。本发明研究发现，将所述基因AtPIP2；7或其编码的蛋白质或重组表达载体或转化体在导入拟南芥后能够显著提高其抗病性，并且可促进植物生长。

基于上述基因，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种提高植物抗病性的基因，是如下1)-2)中任一所述的基因：

1)其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白的编码基因。

本发明的第二方面，提供携带上述基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌。

本发明的第三方面，提供如下a)-c)中任一项所述的DNA片段在提高植物抗病性中的应用；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段；

c)DNA片段，与a)或b)限定的DNA片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与SEQ ID NO.2所示的蛋白等价。

上述应用中，所述提高植物抗病性包括：提高植物对致病菌的免疫抗性；和/或，提高植物抗致病菌引起的病害。

所述致病菌为能够侵染主要粮食及经济作物的致病菌；优选为丁香假单胞菌、黄单胞菌或大白菜软腐菌。

本发明的第四方面，提供如下1)-3)中任一项所述的蛋白在提高植物抗病性中的应用；

1)氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的蛋白；

2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的与SEQ ID NO.2所示的蛋白具有相同功能的蛋白；

3)在SEQ ID NO.2所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。

本发明的第五方面，提供携带SEQ ID NO.1所示基因片段的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在提高植物抗病性中的应用。

本发明的第六方面，提供一种提高植物抗病性的方法，包括用如下a)-c)任一项所述的多核苷酸转化植物并使所述多核苷酸在所述植物中表达的步骤；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段；

本发明的第七方面，提供一种培育抗病转基因植物的方法，是将如下a)-c)任一项所述的多核苷酸导入受体植物得到抗病转基因植物；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段；

上述方法中，所述抗病转基因植物为如下1)-2)中的至少一种：

1)所述抗病转基因植物的抗病性高于所述受体植物；

2)所述抗病转基因植物的产量高于所述受体植物。

优选的，所述受体植物为拟南芥、番茄、大白菜或水稻。

本发明的有益效果：

本发明在十字花科植物拟南芥中克隆得到一种拟南芥水通道蛋白质AtPIP2；7基因，并且基于此基因构建了可以用于拟南芥、烟草、水稻等植物的AtPIP2；7过表达载体。将所述基因AtPIP2；7或其编码的蛋白质或重组表达载体或转化体在导入拟南芥后能够获得具有显著抗病性/或促进植物生长的品种。本发明可以运用在作物育种抗病性改良方面，有望提高植物的抗病性，从而达到增产减药的目的。

附图说明

图1：pCAMBIA1300::AtPIP2；7载体构建；图中，(A)pCAMBIA1300::AtPIP2；7质粒示意图，Right border：右界，最终插入植入基因组的DNA片段的右边界保守序列；35Spromoter：35S启动子序列；Kpn I、Xba I：两种限制性内切酶，用于酶切目的基因并连接插入pCAMBIA1300载体；NOS：NOS转录终止信号；HygR：潮霉素抗性基因；CaMV poly(A)：CaMV转录终止信号；Left border：左界，最终插入植入基因组的DNA片段的左边界保守序列。(B)AtPIP2；7基因的扩增。(C)pCAMBIA1300::AtPIP2；7的双酶切验证，载体构建后，使用Kpn I和Xba I两种限制性内切酶对#1、#3、#5和#6四个重组子进行双酶切验证。

图2：在潮霉素抗性平板筛选AtPIP2；7过表达转基因株系结果图；

在含有潮霉素的1/2MS培养基上筛选T2和T3代AtPIP2；7过表达转基因植株的阳性克隆。由于pCAMBIA13000::AtPIP2；7带有潮霉素抗性，因此，pCAMBIA13000::AtPIP2；7有效重组到基因组里的转基因株系带有潮霉素抗性，也就可以在含有潮霉素的平板上正常生长，而没有转入pCAMBIA13000::AtPIP2；7的野生型拟南芥植株不含有潮霉素抗性，也就不能在含有潮霉素的平板上正常生长。

图3：AtPIP2；7过表达株系中AtPIP2；7基因表达量分析；通过荧光定量PCR的方法检测AtPIP2；7过表达株系中AtPIP2；7基因的表达量。

图4：AtPIP2；7过表达株系生长表型分析；分别比较3周、5周、8周的AtPIP2；7过表达拟南芥和对应时期的野生型植株的生长情况。

图5：AtPIP2；7过表达株系抗病表型观察；其中，(A)AtPIP2；7过表达株系胼胝质沉积分析，丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000(Pst.DC3000)接种野生型拟南芥和AtPIP2；7过表达株系后产生的胼胝质沉积。亮绿色点状荧光信号即为胼胝质。(B)AtPIP2；7过表达株系的抗病表型，丁香假单胞菌番茄致病变种DC3000接种野生型拟南芥和AtPIP2；7过表达株系的表型情况。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，植物水通道蛋白的组分和结构复杂多样，种类和结构的复杂性决定了其功能的多样性和不可预测性。目前有报道PIP1亚家族的AtPIP1；4和OsPIP1；3能够参与拟南芥和水稻对病原细菌侵染的防卫反应中。而PIP2亚家族是否与植物抗病反应有关还未见报道。由于PIP1亚家族和PIP2亚家族在结构组成上的差异，难以通过PIP1亚家族蛋白的功能来预测PIP2亚家族蛋白的功能。

本发明对PIP2亚家族蛋白的功能进行了深入研究，在十字花科植物拟南芥中克隆得到一种拟南芥水通道蛋白质AtPIP2；7基因；该基因来源于拟南芥Col-0型，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

基于上述发现的AtPIP2；7基因，本发明的保护范围还包括与上述基因同源的DNA片段，只要它们编码的蛋白与SEQ ID NO.2所示的蛋白功能等价。SEQ ID NO.2所示的蛋白的氨基酸序列如下：

MSKEVSEEGKTHHGKDYVDPPPAPLLDMGELKSWSFYRALIAEFIATLLFLYVTVATVIGHKKQTGPCDGVGLLGIAWAFGGMIFVLVYCTAGISGGHINPAVTFGLFLARKVSLVRALGYMIAQCLGAICGVGFVKAFMKTPYNTLGGGANTVADGYSKGTALGAEIIGTFVLVYTVFSATDPKRSARDSHIPVLAPLPIGFAVFMVHLATIPITGTGINPARSFGAAVIYNNEKAWDDQWIFWVGPFLGALAAAAYHQYILRASAIKALGSFRSNATN。

本文所指的“与SEQ ID NO.2所示的蛋白功能等价”意味着目标DNA片段所编码的蛋白在生物学功能和生理生化特征等方面与本发明中SEQ ID NO.2所示的蛋白相同或相近。SEQ ID NO.2所示的蛋白典型的生物学功能是提高植物的免疫抗性或抗病性。通过上调SEQ ID NO.2所示的蛋白的表达量和/或活性，可以用于提高植物的抗性。

这些与AtPIP2；7基因同源的DNA片段包括本发明核苷酸序列(SEQ ID NO.1)对应的等位基因、同源基因、突变基因和衍生基因；它们编码的蛋白类似于本发明SEQ ID NO.2所示的蛋白，或存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入现象，都属于本发明内容。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的AtPIP2；7基因的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明AtPIP2；7基因的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码的蛋白与SEQ IDNO.2所示的蛋白功能等价，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。氨基酸或核苷酸序列的等同率可采用BLAST算法测定(Altschul et al.1990.Journal of Molecular Biology 215:403-410；Karlin andAltschul.1993.Proceedings of the National Academy of Sciences 90:5873-5877)。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

在本发明的一个实施方案中，还提供一种包括所述基因AtPIP2；7的过表达载体。此过表达载体可应用于拟南芥、水稻、烟草等植物。

本发明所示过表达载体优选为植物转化质粒，可以表达为pCAMBIA1300、pCAMBIA1301等。

在一种具体的实施方式中，所述的过表达载体是将基因AtPIP2；7插入到双元表达载体pCAMBIA1300酶切位点Kpn I和Xba I中得到载体pCAMBIA1300::AtPIP2；7。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记等。

一种转化体，由所述的重组表达载体导入宿主细胞所得，所述的宿主细胞优选大肠杆菌细胞或农杆菌细胞。

本发明还提供了所述基因AtPIP2；7或其编码的蛋白质或重组表达载体或转化体在提高植物免疫抗性或抗病性中的应用。

本发明还提供了所述基因AtPIP2；7或其编码的蛋白质(SEQ ID NO.2)或重组表达载体或转化体在植物提高致病菌免疫抗性或提高植物抗致病菌引起的病害中的应用。

进一步的，本发明所述致病菌为能够侵染主要粮食及经济作物的致病菌，优选细菌，丁香假单胞菌、黄单胞菌、大白菜软腐菌等引起的植物病害。

本发明还提供所述基因AtPIP2；7或其编码的蛋白质或重组表达载体或转化体在导入植物后获得显著抗病性/或促进植物生长的品种中的应用，优选导入拟南芥、番茄或大白菜等十字花科植物中。

本研究在过表达AtPIP2；7基因的拟南芥上接种丁香假单胞菌Pst.DC3000获得增强抗病性和/或增加产量的品种。拟南芥作为一种模式植物，能够带动水稻、番茄、白菜等多种作物的抗病蛋白相关研究。这些研究将能更好的阐明植物对病原菌的抗病功能，可为抗病基因工程育种提供优秀的抗病基因资源。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：AtPIP2；7过表达载体的构建

提取拟南芥Col-0生态型RNA，并反转录为cDNA.使用PrimerSTAR Max DNA聚合酶(Takara)，以上述得到的cDNA为模板，以表1中的序列为引物，扩增带有Kpn I和Xba I两个酶切位点的AtPIP2；7基因。扩增程序如下：98℃，5分钟；98℃，30秒，60℃，30秒，72℃，30秒，30个循环；72℃，10分钟。将扩增得到的6管DNA产物(分别为序号1-6)进行凝胶电泳检测(图1B)。

将扩增得到的产物经纯化和Kpn I和Xba I两个限制性内切酶酶切后，再次纯化，获得两端含有粘性末端的基因片段。同时，准备用于植物过表达的载体pCAMBIA1300，并经Kpn I和Xba I两个限制性内切酶酶切后，纯化获得两端含有粘性末端的线性化载体。使用T4连接酶将上述AtPIP2；7基因片段连接到双酶切后的pCAMBIA1300载体上(图1A)，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态，涂布于含有卡那霉素的抗性平板上。挑选生长正常的10个克隆(分别编号为1-10)并提取其质粒，经双酶切验证(图1C)和测序验证后，证实3号、5号和6号为正确构建的表达载体，命名为pCAMBIA1300::AtPIP2；7。

表1：基因克隆相关引物参数

实施例2：pCAMBIA1300::AtPIP2；7的转基因操作和过表达株系筛选

将pCAMBIA1300::AtPIP2；7质粒(实施例1制备)转入农杆菌EHA105感受态中，取阳性克隆于20mL含有50μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃，220rpm过夜培养。取5mL培养物，转接到100mL新的含有50μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的液体YEB培养基中，28℃，220rpm培养12小时。4℃，10000xg离心5分钟收集菌体。使用1/2MS洗涤菌体，4℃，10000xg离心5分钟收集菌体。使用1/2MS重悬菌体，调节菌悬液OD₆₀₀至0.8，加入万分之三的表面活性剂Silwet L-77，将得到的菌悬液放置于冰上待用。

拟南芥抽薹后，在只有少量的花朵开放的情况下进行农杆菌介导的转基因操作。选取合适的植株，将所有花序浸没在上述得到的农杆菌菌悬液中，持续30秒，再用吸水纸吸去表面多余的菌液，于黑暗中保湿处置1天后，放于正常的植物生殖生长培养室中培养。十天之后同样的步骤，再转化一次。待植株成熟结荚后，收取种子用于后续筛选。

将得到的种子点播于含有100μg/ml潮霉素(HyB)的1/2MS平板上进行转化子筛选。潮霉素的存在会抑制种苗根系发育，同时影响叶绿体进行正常的光合作用。没有转入潮霉素抗性基因的拟南芥在1/2MS+HyB平板上的生长和发育会受到抑制，幼苗黄化畸形，且根系发育不完全，植株真叶生长发育遇阻，至10-14天时，幼苗逐渐枯黄死亡。而转基因阳性植株由于潮霉素抗性基因的有效表达，植株在1/2MS+HyB平板上生长不受潮霉素影响，生理发育正常。转基因产生的T0代拟南芥植株收种后获得的T1代种质被点播于1/2MS+HyB平板上进行筛选，14天后，未能成功地将待转的基因和潮霉素抗性基因整合进基因组的拟南芥会和野生型拟南芥一样在1/2MS+HyB平板上无法正常生长，直至死亡。而那些成功插入基因组的拟南芥则正常发苗生长。小心地用牙签从平板上挑出生长正常的绿苗，并移至含有营养土的盆钵中，在短日照(8小时日照/16小时黑暗)生长室中培养三周后，转入长日照(16小时光照/8小时黑暗)生长室进行生殖生长。抽薹并结荚后，对每株T1代转基因植株分别编号，待种荚成熟、行将开裂时进行单株收种。从得到的T2代转基因种子中选择100颗左右的种子铺布于1/2MS+HyB平板上让其生根发芽，根据孟德尔遗传定律，杂合子后代会产生性状分离。如若14天后幼苗生长正常和黄化死亡的比例约为3:1，则可认定改转基因株系为杂合子；如若幼苗生长全部正常，则改转基因株系为纯合子；如若幼苗全部黄化死亡，则该转化子可能是未成功插入到拟南芥基因组中，仍为野生型拟南芥(图2)。继续单株收种T2代产生的子代，即T3代，采取和T2代筛选相同的方法，选择不发生性状分离的转基因株系，即为纯合体的AtPIP2；7过表达株系(图2)。

实施例3：过表达株系AtPIP2；7表达量分析

选择在短日照条件下生长4周的野生型和AtPIP2；7过表达拟南芥，迅速剪取地上部分置于液氮中，在液氮中将拟南芥组织磨成粉末，并将粉末放入含有1毫升Trizol(Invitrogen公司购买)的2.0毫升eppendorf试管中。待植物组织破碎完全后，采用酚-氯仿抽提方法提取植物组织RNA。反转录为cDNA后保存于-20℃冰箱中待用。

以上述cDNA为模板，使用表2中的引物和ChamQ Universal SYBR qPCR MasterMix(诺唯赞公司购买)进行荧光定量PCR试验。荧光定量PCR程序如下：95℃，30秒；95℃，3秒；60℃，10秒；共40个循环。

表2：AtPIP2；7荧光定量引物

结果表明，AtPIP2；7在过表达植株中的表达量远高于野生型拟南芥，达至25倍以上(图3)。由此可见，过表达植株中以35S为启动子的AtPIP2；7基因被成功插入到拟南芥基因组中，并且过量的AtPIP2；7被成功表达。

实施例4：过表达株系AtPIP2；7生长表型观察

AtPIP2；7过表达纯核株系以及野生型拟南芥的种子被单粒点播于含有营养土的盆钵中，保持湿度在80-90％，直至种子萌芽，此后将湿度一直控制在60％左右。在短日照生长室中培养4周后，转入长日照生长室培养。分别于生长周期的第三周、第五周和第八周比较生长情况并拍照。

相比野生型拟南芥，AtPIP2；7过表达植株在前三周的生长更为健壮。生长五周之后，这种生长上的差异逐渐消失，野生型拟南芥和AtPIP2；7过表达拟南芥生长状况几乎一致，不可见明显的差异(图4)。

实施例5：过表达株系AtPIP2；7抗病表型观察

在液体LB培养基中过夜培养拟南芥的致病性细菌Pst.DC3000。5000x g离心3分钟，移去培养基，用10mM MgCl₂重悬菌体，离心收集菌体，移去上清，用10mM MgCl₂重悬菌体并调节OD₆₀₀至0.2备用。选取生长四周且生长良好的拟南芥野生型Col-0和AtPIP2；7过表达植株。将调节好OD₆₀₀的Pst.DC3000倒入雾化喷瓶中，并加入0.02％(体积/体积)的Silwet-77(索莱宝公司购买)表面活性剂。将雾化喷瓶中菌液均匀地喷施于拟南芥野生型Col-0和AtPIP2；7过表达植株叶表面和背面。菌液接种后，12小时内保持生长环境90％的湿度。12小时后恢复60％的湿度。

在植物受到病菌侵染时，植物会围绕筛孔的边缘形成胼胝质沉积以抵抗病菌。所以植物在受到病菌侵染后产生胼胝质沉积的强弱也反映了植物的抗病能力。这里我们检测了拟南芥在接种Pst.DC3000后胼胝质沉积的情况。具体实施情况如下。接种Pst.DC3000 3天后，剪取部分发病叶片，置于脱色液(酒精乙酸混合液，酒精:乙酸＝3:1)中脱色3个小时。取出脱色完成的叶片，置于胼胝质染色液(0.1％水溶性苯胺蓝，150mM K₂HPO₄，pH＝9.5)中，染色三个小时。取出叶片，用150mM K₂HPO₄(pH＝9.5)溶液冲洗以去除表面的染色液。冲洗干净的叶片平放于载玻片上，覆上盖玻片，置于荧光显微镜上，调节激发波长到350nm处，观察胼胝质荧光的情况。结果表明，AtPIP2；7过表达比野生型拟南芥产生了更多的胼胝质(图5A)，由此可以反映出AtPIP2；7过表达比野生型拟南芥更加抗病。

在Pst.DC3000接种5天后，观察野生型和AtPIP2；7过表达拟南芥所产生的感病表型，发现AtPIP2；7过表达拟南芥感病弱于野生型(图5B)，即AtPIP2；7的过量表达增强了拟南芥对Pst.DC3000的抗性。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一种提高植物抗病性的基因AtPIP2;7及其应用

<130> 2019

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 843

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtcgaaag aagtgagcga agaaggcaaa acccaccatg gaaaagacta cgtggatcct 60

ccaccagctc ctcttctcga catgggtgag ctcaaatcct ggtctttcta cagagctctc 120

atcgctgagt tcatcgctac actcctcttc ctctacgtca ccgtcgctac tgtcatcggc 180

cacaagaagc aaaccggtcc ttgtgacggc gttggtttac ttggtatcgc ttgggctttc 240

ggtggtatga tcttcgtcct cgtctactgc accgccggta tctctggtgg tcacattaac 300

ccagctgtga ctttcggtct gttcttggcc cgtaaggtct ctttggtgcg agctcttggt 360

tacatgatag ctcagtgtct tggagccatt tgtggtgtgg gtttcgtgaa agctttcatg 420

aaaactcctt acaacactct tggtggagga gctaacaccg tagctgacgg ttacagcaaa 480

ggaactgctc tcggagctga gattattgga actttcgtcc ttgtttacac cgttttctct 540

gcaactgacc ctaagagaag cgctcgtgac tctcacatcc ccgttttggc tccacttcca 600

attggatttg ctgtgttcat ggtgcatttg gctactatcc ccattactgg aactggtatc 660

aacccagcta gaagctttgg tgctgctgtt atctacaaca acgagaaggc gtgggatgac 720

caatggatct tttgggttgg tccgttcttg ggagcactag ctgcagcagc ttaccaccaa 780

tacatattga gagcttcagc aattaaggcc ttgggctcgt tccgaagcaa cgcaaccaat 840

taa 843

<210> 2

<211> 280

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ser Lys Glu Val Ser Glu Glu Gly Lys Thr His His Gly Lys Asp

1 5 10 15

Tyr Val Asp Pro Pro Pro Ala Pro Leu Leu Asp Met Gly Glu Leu Lys

20 25 30

Ser Trp Ser Phe Tyr Arg Ala Leu Ile Ala Glu Phe Ile Ala Thr Leu

35 40 45

Leu Phe Leu Tyr Val Thr Val Ala Thr Val Ile Gly His Lys Lys Gln

50 55 60

Thr Gly Pro Cys Asp Gly Val Gly Leu Leu Gly Ile Ala Trp Ala Phe

65 70 75 80

Gly Gly Met Ile Phe Val Leu Val Tyr Cys Thr Ala Gly Ile Ser Gly

85 90 95

Gly His Ile Asn Pro Ala Val Thr Phe Gly Leu Phe Leu Ala Arg Lys

100 105 110

Val Ser Leu Val Arg Ala Leu Gly Tyr Met Ile Ala Gln Cys Leu Gly

115 120 125

Ala Ile Cys Gly Val Gly Phe Val Lys Ala Phe Met Lys Thr Pro Tyr

130 135 140

Asn Thr Leu Gly Gly Gly Ala Asn Thr Val Ala Asp Gly Tyr Ser Lys

145 150 155 160

Gly Thr Ala Leu Gly Ala Glu Ile Ile Gly Thr Phe Val Leu Val Tyr

165 170 175

Thr Val Phe Ser Ala Thr Asp Pro Lys Arg Ser Ala Arg Asp Ser His

180 185 190

Ile Pro Val Leu Ala Pro Leu Pro Ile Gly Phe Ala Val Phe Met Val

195 200 205

His Leu Ala Thr Ile Pro Ile Thr Gly Thr Gly Ile Asn Pro Ala Arg

210 215 220

Ser Phe Gly Ala Ala Val Ile Tyr Asn Asn Glu Lys Ala Trp Asp Asp

225 230 235 240

Gln Trp Ile Phe Trp Val Gly Pro Phe Leu Gly Ala Leu Ala Ala Ala

245 250 255

Ala Tyr His Gln Tyr Ile Leu Arg Ala Ser Ala Ile Lys Ala Leu Gly

260 265 270

Ser Phe Arg Ser Asn Ala Thr Asn

275 280

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggggtaccat gtcgaaagaa gtgag 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gctctagatt aattggttgc gttgc 25

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtcgaaagaa gtgagcgaag aa 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgtagaaaga ccaggatttg agc 23

Claims

1.一种提高植物抗病性的基因，其特征在于，是如下1)-2)中任一所述的基因：

1)其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白的编码基因。

2.携带权利要求1所述的基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌。

3.如下a)-c)中任一项所述的DNA片段在提高植物抗病性中的应用；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述提高植物抗病性包括：提高植物对致病菌的免疫抗性；和/或，提高植物抗致病菌引起的病害；

优选的，所述致病菌为丁香假单胞菌、黄单胞菌和/或大白菜软腐菌。

5.如下1)-3)中任一项所述的蛋白在提高植物抗病性中的应用；

1)氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的蛋白；

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述提高植物抗病性包括：提高植物对致病菌的免疫抗性；和/或，提高植物抗致病菌引起的病害；

7.携带SEQ ID NO.1所示基因片段的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在提高植物抗病性中的应用。

8.一种提高植物抗病性的方法，其特征在于，包括用如下a)-c)任一项所述的多核苷酸转化植物并使所述多核苷酸在所述植物中表达的步骤；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段；

9.一种培育抗病转基因植物的方法，其特征在于，是将如下a)-c)任一项所述的多核苷酸导入受体植物得到抗病转基因植物；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段；

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述抗病转基因植物为如下1)-2)中的至少一种：

1)所述抗病转基因植物的抗病性高于所述受体植物；

2)所述抗病转基因植物的产量高于所述受体植物；

优选的，所述受体植物为拟南芥、番茄、大白菜或水稻。