KR101321890B1 - 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 식물체 및 이의 용도 - Google Patents

인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 식물체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 엔테로키나아제(enterokinase) 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자, 상기 단백질을 코딩하는 합성 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물세포, 상기 재조합 벡터를 이용하여 식물체에서 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 방법, 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하여 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 식물체의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 식물체 및 이의 종자 및 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자를 포함하는, 식물체의 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 대량 생산용 조성물을 제공한다.

Description

인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 식물체 및 이의 용도{Plant producing human enterokinase light chain protein and uses thereof}
본 발명은 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 식물체 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 식물의 발현에 적합하도록 사용코돈을 최적화한 인간 엔테로키나아제(enterokinase) 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자, 상기 단백질을 코딩하는 합성 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물세포, 상기 재조합 벡터를 이용하여 식물체에서 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 방법, 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하여 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 식물체의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 식물체 및 이의 종자 및 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자를 포함하는, 식물체의 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 대량 생산용 조성물에 관한 것이다.
최근 새로운 질병 치료기술로 큰 주목을 받고 있는 세포치료(cell therapy)방법의 적용을 위한 세포의 생산을 위하여 특정한 단백질 분해효소를 사용해야 하나 일반적으로 이러한 단백질 분해효소는 단백질 분해효소의 특성상 유전자 발현에 의한 재조합 단백질로서의 생산이 불가능한 실정이어서 동물 유래의 트립신(trypsin) 등을 분리 정제하여 사용하고 있다.
그러나 동물장기에서 단백질 분해효소를 정제할 때에 동물 바이러스의 혼입에 따른 인간에의 2차 감염의 우려가 있어 사용이 제한되고 있으며, 현재 광우병 등의 문제로 소의 장기로부터 분리정제된 효소는 전 세계적으로 사용이 금지되고 있다. 또한, 산업용 및 연구용으로서 단백질 연구에 필수적인 특정 부위를 절단하는 펩타이드 절단효소(endopeptidase) 등 역시 재조합 단백질 생산에 어려움이 있으나 생명공학의 발전에 따라서 특정 부위를 절단하는 다양한 엔도펩티다아제의 수요가 급격하게 증가할 것으로 예상된다.
엔테로키나제는 트립시노겐의 아미노산 서열 Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys을 특이적으로 인식하고 절단하여 트립신으로 변환시키고 많은 췌장(pancreatic) 자이모겐(zymogen)을 활성화시킨다(Kunitz, J. Gen. physiol., 1939, 22:429-446). 엔테로키나제에 의하여 절단되는 아미노산 서열 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys는 많은 척추동물에서 엔테로키나제의 인식부위로서 보존된 부위로서 엔테로키나제는 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys로 기재되는 아미노산 서열에 대한 높은 특이성으로 융합 단백질의 위치-특이적 절단을 위한 용도로 많이 쓰이고 있다(LaVallie et al., J. Biol. Chem., 1993, 268:23311-17).
의료용 단백질인 엔테로키나아제는 유전자 발현에 의한 재조합 단백질 형태로의 생산이 매우 어려워 고가(200만원/500IU)의 효소로서 의료용으로 사용될 뿐만 아니라 재조합 의료용 단백질을 생산하고자 할 때에 일반적으로 사용하는 GST, 6XHis 등의 Tag 단백질을 제거할 때에도 사용되는 필수적인 효소이다(Yuan and Hua, Protein Expression and Purification, 2002, 25:300304). 현재까지 알려진 트립신 등 단백질 분해효소 종류는 의약용 및 산업용 단백질 소재로서 직접 활용이 되기도 하지만 다른 단백질의 기능 활성을 위한 단백질 프로세싱에 반드시 필요로 하는 효소이기 때문에 그 수요가 증가함에도 불구하고 효소의 특성상 숙주세포의 생육을 억제 또는 괴사시키는 관계로 생산에 제한을 받는 경우가 많다. 이러한 문제를 극복하기 위하여 숙주를 바꿔 재조합 단백질 생산을 시도하기는 하지만 아직도 유전자발현에 의한 재조합 단백질의 생산이 불가능한 실정이다. 현재, 엔테로키나아제 유전자를 대장균에서 발현시키면 불용성단백질 형태(inclusion body)로 발현되며, 발현된 단백질도 아미노말단에 부가적인 아미노산이 참가되어 활성이 낮아지는 문제가 있다(Collins-Racie et al., Bio/technology, 1995, 13:982-987). 이러한 문제를 해결하기 위하여 동물세포배양을 이용하여 엔테로키나아제를 생산하고 있으나 수율이 매우 낮아 미생물 및 동물세포배양을 이용한 재조합 단백질의 생산이 매우 어려워 일부는 돼지나 염소 등의 장기에서 분리 정제하여 사용하고 있다.
한편, 한국등록특허 제0507980호에서는 '엔테로키나제 경사슬의 아미노말단 또는 카르복실말단이 변형된 재조합 엔테로키나제'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제1999-0008525호에서는 '새로운 엔테로키나제 경사슬(EKL) 유전자, 그의 염기 서열, EKL을 생산하는 대장균 발현 벡터와 효모 발현 벡터 그리고 이를 이용한 EKL의 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 식물체 및 이의 용도에 관해서는 밝혀진 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 인간 엔테로키나아제(enterokinase) 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 벼 식물체에 도입하여 과발현시킨 후 재조합 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 분리 및 정제하는 재조합 엔테로키나아제 경사슬 단백질 대량생산 방법을 구축하였다. 본 발명에서는 생명공학 기술 중 분자생물학, 세포공학, 생물공정기술 및 분리정제 기술을 활용하여 재조합 유전자가 도입된 형질전환 식물세포를 미생물의 배양과 같은 방법으로 배양함으로써, 미생물 및 동물세포배양과는 달리 세포벽에 의하여 세포가 보호되는 식물세포를 이용하여 단백질 분해효소의 일종으로 난발현성 단백질인 엔테로키나아제 경사슬 단백질 대량생산할 수 있는 기술을 구축함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 인간 엔테로키나아제(enterokinase) 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 이용하여 식물체에서 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하여 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 식물체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
또한, 본 발명은 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자를 포함하는, 식물체의 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 대량 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명은 엔테로키나아제 유전자를 대장균에서 발현시킬 때 불용성단백질 형태(inclusion body)로 발현되고 아미노말단에 부가적인 아미노산이 첨가되어 활성이 낮아지는 문제와 동물세포배양을 이용하여 엔테로키나아제를 생산할 때 생산수율이 낮은 제약이 있었고, 동물세포에서 생산된 단백질의 경우 동물 바이러스의 혼입에 따른 인간에의 2차 감염의 우려가 있었으나, 본 발명의 식물세포배양 시스템은 이러한 문제점을 극복한 새로운 생산시스템이다. 식물세포배양 시스템은 미생물 배양과는 달리 불용성단백질 형태(inclusion body)로의 생산이 이루어지지 않고 모두 수용성 형태로 생산되어져 높은 생산성을 보이며, 동물세포에서 생산된 단백질의 경우 동물 바이러스의 혼입에 따른 인간에의 2차 감염의 우려가 있으나, 식물세포는 세포벽이 있어 생산된 단백질 분해효소에 의한 숙주세포의 사멸이 일어나지 않고 식물 바이러스의 혼입에 따른 인간에의 2차 감염의 우려가 전혀 없으므로 본 발명에서 생산하고자 하는 엔테로키나아제의 대량생산을 위한 최적의 시스템으로 판단된다.
도 1은 오버랩(Overlap PCR)을 이용하여 합성한 최종 DNA 단편을 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 코딩 유전자를 포함하는 식물발현 벡터 pJKF39 및 pJKF40의 모식도를 나타낸다.
도 3은 형질전환된 벼 캘러스 및 형질전환되어 증식 중인 벼 캘러스의 양상을 나타낸다.
도 4는 게놈 DNA PCR을 통하여 pJKF39 및 pJKF40 형질전환 벼 캘러스의 형질전환 여부를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 유전자 총(A) 및 아그로박테리움(B)을 이용하여 pJKF39를 형질전환한 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 생산 식물 세포주를 대상으로 웨스턴 블럿 분석을 수행한 결과 및 유전자 총(C) 및 아그로박테리움(D)을 이용하여 pJKF40을 형질전환한 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 생산 식물 세포주를 대상으로 웨스턴 블럿 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 6은 유전자 총을 이용하여 pJKF39를 형질전환한 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 생산 식물 세포주(A)와 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법을 이용하여 pJKF40을 형질전환한 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 생산 식물 세포주(B)를 대상으로 노던 블럿 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 7은 엔테로키나아제 인식서열을 포함하는 EGFP-hTNF-a 융합단백질의 구조(A) 및 EGFP-hTNFa 융합단백질을 이용하여 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 생산 식물 세포주에서 생산된 효소의 엔도펩티다아제 활성을 확인한 결과(B)를 나타낸다.
도 8은 형질전환된 50 ml 규모의 현탁세포(A) 및 형질전환된 300 ml 규모의 현탁세포(B) 배양을 나타낸다.
도 9는 형질전환된 캘러스로부터 재분화된 유식물체(A), 재분화되어 신장생장한 식물체(B) 및 엔테로키나아제 경사슬 단백질 코딩 유전자가 도입된 pJKF40 b4 식물체(C)를 나타낸다.
도 10은 엔테로키나아제 경사슬 단백질 고발현 세포주의 동결보존 후 세포활성 확인을 나타낸다.
도 11은 엔테로키나아제 경사슬 단백질 고발현 세포주의 대량생산 시스템 구축 현황(좌) 및 생물반응기에서 배양중인 형질전환 세포(우)를 나타낸다.
도 12는 크기 배제 크로마토그래피(Size exclusion chromatography) 및 FPLC를 이용한 정제시 엔테로키나아제 경사슬 단백질의 UV 피크를 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 엔테로키나아제(enterokinase) 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자를 제공한다.
본 발명의 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자는 인간 엔테로키나아제 유전자의 코돈 사용빈도(codon usage)를 분석하고 진뱅크(GeneBank)에서 확보한 후에 벼의 코돈 사용빈도와 비교하여 염기서열을 설계하고 프라이머를 합성하였으며 오버랩 PCR(overlap PCR)을 통하여 엔테로키나아제 유전자를 합성하였다.
상기 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 유전자에서, 상기 합성 유전자는 5'-말단에 벼 알파 아밀라아제 3D(RAmy3D) 분비신호를 코딩하는 유전자를 추가로 포함할 수 있는데 5'-말단에 벼 알파 아밀라아제 3D(RAmy3D) 분비신호를 코딩하는 유전자를 추가로 포함한 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자는 바람직하게는 서열번호 2으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 유전자에서, 상기 합성 유전자는 3'-말단에 6×His 코딩 유전자를 추가로 포함할 수 있다.
3'-말단에 6×His 코딩 유전자를 추가로 포함하고, 5'-말단에 벼 알파 아밀라아제 3D(RAmy3D) 분비신호를 코딩하는 유전자를 추가로 포함한 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자는 바람직하게는 서열번호 3으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 3'-말단에 6×His 코딩 유전자를 추가로 포함하는 것은 상기 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 숙주세포에서 발현시킨 후 분리 정제를 용이하게 하기 위한 것일 뿐, 단백질의 활성에는 어떠한 영향도 미치지 않는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
엔테로키나아제 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 벼 아밀라아제 3D(RAmy3D), CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 형질전환시키는 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이며, 더욱 바람직하게는 벼이다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 아그로박테리움 매개 형질전환, 유전자 밤바드먼트, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 등에 의해 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은
본 발명의 재조합 벡터를 식물체의 캘러스에 도입하여 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 캘러스를 선발하는 단계;
상기 선발된 캘러스를 현탁배양하는 단계; 및
상기 현탁배양액으로부터 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 식물체에서 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물체는 바람직하게는 벼, 옥수수, 밀, 보리, 기장, 호밀, 라이밀, 수수 및 귀리 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 벼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 식물체에서 생산된 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질의 분리 및 정제는 본 발명의 기술적 사상 범주 내에서 당업자가 용이하게 사용하는 방법으로 다양한 과정이 적용된다. 재조합 분자가 발현된 단백질은 발현 숙주의 배양물을 정제하여 생성물을 수득함으로써 얻는다. 세정, 원심분리, 여과, 한외여과, 황산암모늄 침전, 실리카 비드의 사용, 연속적인 원심분리, 레이트 구역 구배 원심분리(rate zonal gradient centrifugation), 겔 투과, 크기 배제, 친화성 및 이온 교환과 같은 다양한 크로마토그래피 방법 등과 같은 몇 단계의 정제가 일반적으로 적용된다. 바람직하게는 상기 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질의 분리 및 정제는 황산암모늄 침전, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 순차적으로 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에서, 상기 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열, 서열번호 2로 이루어진 5'-말단에 벼 알파 아밀라아제 3D(RAmy3D) 분비신호를 코딩하는 유전자를 추가로 포함한 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자 또는 서열번호 3으로 이루어진 3'-말단에 6×His 코딩 유전자를 추가로 포함하고, 5'-말단에 벼 알파 아밀라아제 3D(RAmy3D) 분비신호를 코딩하는 유전자를 추가로 포함한 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 유전자 밤바드먼트 또는 아그로박테리움 매개 형질전환일 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물체에서, 상기 식물체는 바람직하게는 벼, 옥수수, 밀, 보리, 기장, 호밀, 라이밀, 수수 및 귀리 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 벼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자를 포함하는, 식물체의 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 대량 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열, 서열번호 2로 이루어진 5'-말단에 벼 알파 아밀라아제 3D(RAmy3D) 분비신호를 코딩하는 유전자를 추가로 포함한 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자 또는 서열번호 3으로 이루어진 3'-말단에 6×His 코딩 유전자를 추가로 포함하고, 5'-말단에 벼 알파 아밀라아제 3D(RAmy3D) 분비신호를 코딩하는 유전자를 추가로 포함한 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 조성물은 유효성분으로 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 식물체에 형질전환시킴으로써 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 대량생산할 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험 방법
1. 유전자 합성
유전자 분석프로그램인 DNASIS 프로그램을 이용하여 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 코딩 유전자의 코돈 사용빈도(codon usage)를 분석하고 진뱅크(GeneBank)에서 확보한 후에 Kazusa DNA Research Instirute의 codon usage data base(http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html)를 이용하여 벼의 코돈 사용빈도와 비교하여 염기서열을 설계하고 프라이머를 합성하였으며 오버랩 PCR(overlap PCR)을 통하여 본 발명의 엔테로키나아제 경사슬 단백질 코딩 유전자를 합성하였다.
2. 식물발현벡터의 제작
오버랩 PCR을 이용하여 합성된 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 코딩 유전자를 식물발현벡터인 pMYN75에 도입하여 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 생산을 위한 식물발현벡터를 제작하였다.
3. 식물의 형질전환
벼(Oryza sativa L.)의 형질전환에는 종자를 1주일 정도 기내 발아시킨 후 형성된 배반 유래 캘러스를 사용하였다. 형질전환은 두 가지 방법을 사용하였는데, 유전자총을 사용하여 캘러스에 유전자총(particle-bombardment)으로 형질전환을 하는 방법과 토양균인 아그로박테리움을 이용하는 방법으로 실시하였다. 유전자총 사용시 7~10일 된 캘러스를 사용하였다. 반면, 아그로박테리움을 이용한 형질전환은 3~4주 배양된 캘러스를 아그로박테리움 용액에 10분간 접종하고 치상체 표면의 아그로박테리움은 멸균된 거름종이 위에 블럿팅한 후 배지에 치상하여 28℃ 암소에서 3일간 공조배양 하였다. 공조배양 후 DW와 세포탁심(cefotaxime)을 첨가한 DW로 수회 씻어 물기를 제거한 다음 하이그로마이신이 첨가된 N6 선발 배지에 치상하였다. 배양환경은 온도 25℃, 명/암의 주기를 8/16 시간으로 조절하였으며, 생장한 캘러스는 엔테로키나아제 경사슬 단백질 코딩 유전자의 도입을 확인하기 위한 재료로 사용하였고 한달에 1회 계대배양 하였다.
4. 엔테로키나아제 경사슬 단백질 고생산 세포주의 확립
① PCR 및 웨스턴 블럿 분석
N6 선발 배지에서 선발된 캘러스에 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 코딩 유전자가 안정적으로 도입되었는지를 확인하기 위하여 형질전환된 캘러스로부터 게놈 DNA를 분리하고 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 코딩 유전자의 특이적 프라이머를 이용하여 PCR 분석을 수행하였다. 캘러스를 소량 취하여 균질화한 후 일련의 과정을 통하여 게놈 DNA를 추출하였고 200 ng의 DNA를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질에 대한 정방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 94℃에서 5분간 전변성하고, 94℃에서 30초간 변성, 50℃에서 30초간 프라이머 어닐링, 72℃에서 1분간 프라이머 신장하는 과정을 30번 반복하고 마지막으로 72℃에서 3분간 반응시켰다. 증폭된 산물은 1% 아가로스 젤로 전기영동 하였으며 EtBt로 염색하여 UV 램프 하에서 밴드를 확인하고 확인된 캘러스로 현탁배양을 실시하였다. 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질의 발현을 확인하기 위하여 현탁배양세포를 수크로스 무첨가 N6 배지에서 5일 동안 배양하여 그 배양액을 이용하여 SDS-PAGE와 웨스턴 블럿 분석을 실시하였다.
② RNA 추출 및 노던 블럿 분석
게놈 PCR 분석을 통해 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 코딩 유전자 도입이 확인된 캘러스에서 정상적으로 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 코딩 유전자의 발현이 일어났는지의 여부를 확인하기 위해서 노던 블럿 분석을 실시하였다. 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 코딩 유전자 도입이 확인된 현탁배양 세포를 수크로스 무첨가 N6배지에서 5일 동안 배양하여 캘러스를 취하고 Tri-reagent로 RNA를 추출한 다음 30㎍으로 정량하여 포름알데히드 아가로스 젤에서 전기영동한 후 모세관 이전법(capillary transfer)에 의해 Hybond N+-막으로 전이하고 α32P-dCTP로 표지한 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 코딩 DNA를 프로브로 하여 혼성화 하였다.
5. 엔테로키나아제 경사슬 단백질 고생산 세포주의 현탁세포 확립
웨스턴 블럿 분석 및 노던 블럿 분석을 통하여 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 코딩 유전자의 발현이 확인된 캘러스를 이용하여 현탁배양을 실시하였다. 즉, 캘러스를 한천이 첨가되지 않은 N6 선발 배지에 치상하여 2~3주 생장시킨 후 1mm x 1mm 스텐레스 망을 이용하여 미세한 세포만을 확보하였으며 1주 간격으로 50 ml 규모로 계대배양 하였다. 또한, 배양온도 25℃, 90 rpm으로 조절한 진탕배양기를 사용하여 배양하였다.
6. 엔테로키나아제 경사슬 단백질 고생산 세포주의 식물체 재분화
엔테로키나아제 경사슬 단백질 고생산 캘러스를 MS-Re 배지(MS배지에 수크로스 5%, 솔비톨 2%, 키네틴 2ppm, NAA 1ppm, 한천 1.6%가 되도록 첨가한 후 pH를 5.8로 맞춤)에 치상하여 신초 및 뿌리를 유도하고 재분화된 식물체는 순화과정을 거쳐 포토에 이식하였다. 생육조건을 최적으로 유지하여 건전한 식물체로의 생장을 유도하고 종자형성을 유도하였다.
7. 엔테로키나아제 경사슬 단백질 고생산 세포주의 세포주 은행( cell bank ) 구축
본 발명자들이 기확립한 벼의 현탁세포 동결건조법에 따라 엔테로키나아제 경사슬 단백질 고발현 세포주에 대한 세포주 은행을 구축하였다.
8. 엔테로키나아제 경사슬 단백질 고생산 세포주의 대량배양
① 엔테로키나아제 경사슬 단백질 고생산 세포주의 대량배양
50 ml 규모로 확립된 현탁세포를 규모를 증가시켜 에어 버블 타입 10 L 생물반응기를 이용하여 대량배양하였다. 즉, 100 ml의 세포를 특수제작된 10L 생물반응기에 넣고 5L의 N6 배지를 분주하였다. 7일 후 수크로스가 첨가되지 않은 동일 배지로 교환하였으며 5일 후 수확하였다. 수확 후 배양과 배양세포를 취하여 엔테로키나아제 경사슬 단백질의 발현 여부를 확인하기 위한 분석재료로 사용하였다.
② 엔테로키나아제 경사슬 단백질의 분리정제
생물반응기를 이용하여 배양되어 분비된 엔테로키나아제 경사슬 단백질의 분리정제를 위하여 황산암모늄 침전법, 페닐 세파로스 6FF 레진을 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography), 모노 S(mono S) 및 모노 Q(mono Q)를 이용한 이온 교환 크로마토그래피의 3 단계의 정제를 거쳐서 형질전환 벼 현탁세포 배양을 통해 생산된 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 분리정제 하였다.
실시예 1. 유전자 합성
표 1의 프라이머 shEK-F1(서열번호 4)에 shEK-R1(서열번호 5), shEK-R2(서열번호 6), shEK-R3(서열번호 7), shEK-R4(서열번호 8), shEK-R5(서열번호 9)를 차례로 중합반응시켜 연결하였으며, 프라이머 shEK-F2(서열번호 10)에 shEK-R6(서열번호 11), shEK-R7(서열번호 12), shEK-R8(서열번호 13), shEK-R9(서열번호 14), shEK-R10(서열번호 15)을 차례로 중합반응시켜 연결한 후 각각의 단편을 중합반응시켜 벼의 코돈으로 최적화된 합성 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 코딩 유전자에 해당하는 705 bp의 DNA 단편을 확보하였으며(서열번호 1), 이를 pGEM-T 이지 벡터에 클로닝하여 합성된 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 코딩 유전자를 포함하는 pJKFEK를 제작한 후 염기서열을 확인한 결과 정확하게 합성되었음을 확인하였다. 벼 세포에서 발현된 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질이 세포 밖으로 분비되도록 하기 위하여 벼 알파 아밀라아제 3D(RAmy3D) 단백질의 분비신호서열을 포함하는 pMYN44(Shin et al., J. Biotechnology and Bioengineering, 2003, 82:-778783)로부터 표 1에 제시한 프라이머 3Dsp-F(서열번호 16)와 프라이머 3Dsp-R(서열번호 17)로 증폭하여 147bp의 벼 알파 아밀라아제 3D(RAmy3D) 단백질의 분비신호서열 DNA 단편을 확보하였다. 알파 아밀라아제 3D(RAmy3D) 단백질의 분비신호를 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질에 융합하기 위하여 705bp 유전자 단편을 3Dsp-EK-F(서열번호 18)와 프라이머 EK(KpnI)-R(서열번호 19)로 증폭하여 얻은 729bp의 DNA 단편과 147bp의 서열번호 19 벼 알파 아밀라아제 3D(RAmy3D) 단백질의 분비신호서열 DNA 단편을 혼합하고 프라이머 3Dsp-F (서열번호 16)와 프라이머 EK(KpnI)-R(서열번호 19)로 증폭하여 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 코딩 유전자 5‘- 측에 벼 알파 아밀라아제 3D(RAmy3D) 단백질의 분비신호에 해당하는 염기서열을 부가하고 이를 pGEM-T 이지 벡터에 클로닝하여 pJKF3DEK를 제작한 후 염기서열을 확인한 결과 861bp의 서열번호 2의 벼 알파 아밀라아제 3D(RAmy3D) 단백질의 분비신호를 포함하는 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 코딩 유전자 염기서열로 정확하게 합성되었음을 확인하였다. pJKF3DEK를 프라이머 3Dsp-F (서열번호 16)와 EK(His6)-R(서열번호 20)로 증폭하여 879bp의 단편을 얻은 후 이를 pGEM-T 이지 벡터에 클로닝하여 pJKF3DEKHis를 제작한 후 염기서열을 확인한 결과 벼 알파 아밀라아제 3D(RAmy3D) 단백질의 분비신호를 포함하는 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질의 카복실말단에 6개의 히스틴을 포함하는 서열번호 3의 유전자를 합성하였다.
Figure 112012027815561-pat00001
실시예 2. 식물 발현벡터의 제작
pJKF3DEK를 제한효소 BamHI과 KpnI으로 절단한 후 아가로스 전기영동으로 857bp의 벼 알파 아밀라아제 3D(RAmy3D) 단백질의 분비신호를 포함하는 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 코딩 유전자 단편을 분리한 후 식물 발현벡터인 pMYN75를 BamHI과 KpnI으로 절단한 후 도입하여 인간 엔테로키나아제 경사슬(light chain)(HEKL) 단백질 생산을 위한 식물 발현벡터 pJKF39를 제작하였다. 또한, pJKF3DEKHis를 제한효소 BamHI과 KpnI으로 절단한 후 아가로스 전기영동으로 877bp의 벼 알파 아밀라아제 3D(RAmy3D) 단백질의 분비신호를 포함하는 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 코딩 유전자 단편을 분리한 후 식물 발현벡터인 pMYN75를 BamHI과 KpnI으로 절단한 후 도입하여 C-말단에 6개의 His tag이 존재하는 인간 엔테로키나아제 경사슬(light chain)(HEKL) 단백질 생산을 위한 식물 발현벡터 pJKF40를 제작하였다. 본 실시예에서 사용한 pMYN75 벡터는 현탁세포가 당 결핍상태에 있을 때 매우 강하게 발현하는 벼 알파 아밀라아제 3D(RAmy3D) 프로모터(Shin et al., J. Biotechnology and Bioengineering, 2003, 82:778-783)를 포함하는 벼 발현 벡터이다.
실시예 3. 식물의 형질전환
pJKF39와 pJKF40을 Bio-Rad사의 PDS-1000/He Biolistic Particle Delivery system과 아그로박테리움 형질전환법을 통해 벼의 캘러스에 도입하였다. 벼의 캘러스에 엔테로키나아제 경사슬 단백질 코딩 유전자를 도입시키기 위하여 제조된 재조합 벡터를 포함하고 있는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefacience)를 10분간 접종한 후에 3일간 공조배양하였다. 공조배양 후 하이그로마이신이 첨가된 선발 배지에 계대 배양한 결과 캘러스가 정상적으로 생장하는 것을 확인할 수 있었으며, 유전자총을 이용하여 형질전환 한 개체를 포함하여 총 67 라인(Agrobacterium)을 이용하여 pJKF39를 형질전환한 라인(pJKF39 a1~9), 유전자총을 이용하여 pJKF39를 형질전환한 라인(pJKF39 b1~30), 아그로박테리움을 이용하여 pJKF40을 형질전환한 라인(pJKF40 a1~12), 유전자총을 이용하여 pJKF40을 형질전환한 라인(pJKF40 b1~16)을 얻었다. 도 3은 생장하고 있는 캘러스의 모습이며 매달 1회씩 선발 배지에 계대 배양하여 유지증식시킴으로써 연노란색의 건전한 캘러스의 획득이 가능하였다(도 3).
실시예 4. 엔테로키나아제 경사슬 단백질 고생산 세포주의 확립
① PCR 및 웨스턴 블럿 분석
유전자 도입 후 게놈 DNA를 대상으로 PCR을 통해 식물체의 형질전환 여부를 확인하였다. PCR을 수행한 결과 하이그로마이신을 포함하는 배지에서 생육하는 캘러스에서만 벼 알파 아밀라제 3D 시그널 펩티드가 결합된 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 코딩 유전자에 해당하는 약 850bp의 DNA 밴드를 확인하였다(도 4). 또한 캘러스가 형성된 67라인 중 56라인에서 유전자의 도입을 확인할 수 있었다. PCR을 이용하여 유전자의 도입이 확인된 각각의 캘러스를 RNA와 단백질 수준에서 분석하기 위하여 현탁세포를 유도하였다. 도 5의 웨스턴 블럿 분석을 통하여 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 고발현 세포주를 선발하였다. 웨스턴 분석을 수행한 결과, 각각의 형질전환 벼 현탁세포에서 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질이 다양한 수준으로 발현되는 것을 확인할 수 있었으며 야생형 벼 현탁세포에서는 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질이 발현하지 않는 것을 확인하였다.
② RNA 추출 및 노던 블럿 분석
도 6의 노던 블럿 분석을 통하여 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 고발현 세포주를 선발하였다.
③ 식물유래 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질의 효소활성 확인
EGFP-hTNF-a 융합단백질을 기질로 이용하여 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 생산 세포주에서 생산된 효소의 엔도펩티다아제 경사슬의 활성을 확인한 결과 각각의 형질전환 벼 현탁세포에서 생산된 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질이 DDDDK 아미노산 서열을 인식하고 절단하는 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 활성을 나타내었으나 야생형 벼 현탁세포(NC)에서는 효소 활성이 확인되지 않았다(도 7B).
실시예 5. 엔테로키나아제 경사슬 단백질 고생산 세포주의 현탁세포 확립
엔테로키나아제 경사슬 단백질 고생산 세포주의 현탁세포 확립을 위하여 엔테로키나아제 경사슬 단백질 코딩 유전자의 발현이 확인된 캘러스를 이용하여 현탁배양을 실시하였다. 연노란색의 잘게 흩어져서 자라는 캘러스는 N6 선발 배지에서 비교적 잘 자라는 편이었으나 간혹 단단해 보이는 흰색의 캘러스가 혼재해 있는 경우도 있었으며 mesh로 체질(seiving)한 후 미세한 세포를 1주 간격으로 50ml 규모로 계대배양 하였다(도 8A). 배양기간이 경과함에 따라 세포가 증식되어 1 L의 플라스크에 300 ml 규모의 증식이 가능하였다(도 8B).
실시예 6. 엔테로키나아제 경사슬 단백질 고생산 세포주의 식물체 재분화
노던 블럿 분석 및 웨스턴 블럿 분석을 통하여 선발된 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 고생산 라인의 캘러스를 0.5 mg/L 키네틴과 0.05 mg/L NAA를 첨가한 MS배지에 계대배양하였다. 약 7일이 경과하여 녹색의 원기가 형성됨을 관찰할 수 있었으며 계대배양 2~3주경부터 신초가 형성된 후 1달이 경과하면 뿌리가 발생되기 시작하였다(도 9A). MS 재분화배지에서 재분화가 이루어진 개체의 라인은 다음과 같다; 아그로박테리움을 이용하여 pJKF39를 형질전환한 엔테로키나아제 경사슬 단백질 생산라인(pJKF39 a7), 유전자총을 이용하여 pJKF39를 형질전환한 엔테로키나아제 경사슬 단백질 생산라인(pJKF39 b1, pJK39 b6, pJK39 b8, pJK39 b14 및 pJKF b22), 유전자총을 이용하여 pJKF40을 형질전환한 엔테로키나아제 경사슬 단백질 생산라인(pJK40 b4, pJK40 b5, pJK40 b8, pJK40 b9 및 pJKF b16). 신초 및 뿌리가 발생한 재분화된 유식물체를 신장생장이 가능한 배양용기에 계대배양하여 건전한 식물체로의 생장을 유도하였다(도 9B). 뿌리가 완전히 형성되고 신초 활력이 좋은 식물체를 선발하여 순화과정을 거쳐 생장한 벼 식물체를 확인하였다(도 9C).
실시예 7. 엔테로키나아제 경사슬 단백질 고생산 세포주의 세포주 은행( cell bank) 구축
벼의 현탁 세포 동결보존은 본 발명자가 기 구축하였던 전배양(5일, 0.5M 수크로스)→ 전 동결(2시간, 1M 수크로스, 1M DMSO, 1M 글리세롤)→ 재성장 (냉각율 : -0.5 - 0.5 ~ 1 /min)→ 장기간 보관의 방법에 따라 진행하여 엔테로키나아제 경사슬 단백질 고발현 세포주에 대한 세포주 은행을 구축하였다. 상기 방법으로 동결보존 처리한 세포주를 장기 보존한 후에 세포주의 세포활성을 측정한 결과를 도 10에 나타내었다. 보존처리 1개월 후에는 90% 이상의 활성을 보였으며, 5개월 이후에도 약 70% 정도의 활성을 유지하여 정상적으로 세포주 은행 구축이 이루어졌음을 확인하였다.
실시예 8. 엔테로키나아제 경사슬 단백질 고생산 세포주의 대량생산
엔테로키나아제 경사슬 단백질 고생산 세포주의 현탁배양 체계를 확립하기 위하여 노던 블럿 분석 및 웨스턴 블럿 분석을 통하여 엔테로키나아제 경사슬 단백질 코딩 유전자의 발현을 확인하고 현탁배양 결과 캘러스의 활력이 좋은 것으로 판명된 라인을 선발하였다 ; 아그로박테리움을 이용하여 pJKF39를 형질전환한 엔테로키나아제 경사슬 단백질 생산라인(pJKF39 a3, ppJKF39 a5, pJKF39 a9), 유전자총을 이용하여 pJKF39를 형질전환한 엔테로키나아제 경사슬 단백질 생산라인(pJKF39 b11, pJKF39 b14, pJKF39 b 26, pJKF39 b30), 아그로박테리움을 이용하여 pJKF40을 형질전환한 엔테로키나아제 경사슬 단백질 생산라인(pJK40 a3, pJK40 a5, pJK40 a7), 유전자총을 이용하여 pJKF40을 형질전환한 엔테로키나아제 경사슬 단백질 생산라인(pJK40 b4, pJK40 b6). 이 후 형질전환된 벼 현탁세포의 대량배양을 위하여 10 L 에어 버블 타입 생물반응기 30대가 설치되어 운용가능한 배양실에서 세포의 대량배양을 실시하였다(도 11). 50 ml 규모로 확립된 현탁 세포의 규모를 증가시켜 10 L 생물반응기를 이용하여 대량 배양 하였다. 즉, 100 ml의 세포를 특수 제작된 10 L 생물반응기에 넣고 5L의 N6 배지를 분주하였다. 배양 7일 후 수크로스가 첨가되지 않은 동일 배지로 교환하였으며 5일 후 수확하였다.
이상의 연구 결과를 토대로 pJKF39 b14, pJKF40 b4를 선발하였으며 현탁세포 대량배양을 진행하였다. 이들은 노던 블럿 분석 및 웨스턴 블럿 분석을 통하여 엔테로키나아제 경사슬 단백질 유전자의 발현을 확인하였고 현탁배양 결과 캘러스의 색이나 세포의 증식 면에서 활력이 좋은 것으로 판명되며 또한 재분화가 용이하여 정상적 생육을 하고 있는 것으로 확인하였다. 따라서, 대량배양을 하여 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 분리·정제하기 위한 재료로 사용하였다.
실시예 9. 엔테로키나아제 경사슬 단백질의 분리·정제
① 엔테로키나아제 경사슬 단백질 정제조건 확립
황산암모늄 침전법 → 페닐 세파로스 6FF 레진을 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography) → 모노 S(mono S) 및 모노 Q(mono Q)를 이용한 이온 교환 크로마토그래피의 3 단계의 정제를 거쳐서 형질전환 벼 현탁세포 배양을 통해 생산된 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 90% 이상의 순도로 정제할 수 있었다. 형질전환 현탁세포 배양액 1L에 472g의 황산암모늄(최종농도 70%)을 넣고 2~4시간 동안 교반하여 원심분리한 후 상등액을 취하여 페닐 세파로스 6FF 레진(GE healthcare)을 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하였다. 페닐 세파로스 6FF 레진(GE healthcare)을 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피의 수행 중 엔테로키나아제 경사슬 단백질의 추출을 위하여 사용하는 용출 버퍼 내의 황산암모늄 농도에 따른 영향을 확인한 결과 용출 버퍼 내의 황산암모늄 이온 0.4M 이하의 농도에서는 전체적으로 추출된 단백질의 수율이 현저하게 낮았으며 0.4M 이상의 농도에서는 추출된 전체 단백질의 수율은 높았으나 엔테로키나아제 경사슬 단백질의 순도가 낮아지는 경향을 확인하였다. 이상의 연구결과를 종합적으로 판단하면 페닐 세파로스 6FF 레진(GE healthcare)을 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여 벼의 세포 유래 엔테로키나아제 경사슬 단백질의 정제에는 용출 버퍼 내의 황산암모늄 이온이 0.4M 농도가 가장 적당한 것으로 판단되었다. 황산암모늄 침전을 이용하여 일차적으로 정제한 배양액을 페닐 세파로스 6FF 레진을 이용하여 정제를 수행하였으며 약 80%의 순도로 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 정제하였다.
② 크기 배제 크로마토그래피(Size exclusion chromatography) 및 FPLC를 이용한 정제
페닐 세파로스 6FF 레진을 이용하여 정제한 약 80% 정도의 순도를 보인 벼 현탁세포 유래 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 정제하기 위해 FPLC와 Hiprep 16/60 sephacryl S200 HR column(GE healthcare)을 이용하여 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였으며 이의 결과를 도 12에 나타내었다. FPLC를 이용하여 Hi-prep 16/60 sephacryl S200 HR column(GE healthcare)을 장착하고 페닐 세파로스 6FF 레진을 이용하여 일차 정제한 약 80% 순도를 보인 벼 현탁 세포 유래 엔테로키나아제 경사슬 단백질의 UV 피크를 통하여 분리 정도를 확인한 결과 시료 투입 후 60분 ~ 80분 사이에서 다량의 단백질이 통과하고 있음을 확인하였으며 이 구간을 각각 1ml/min의 용량으로 분리하여 용출액을 확보하였다. SDS-PAGE를 이용하여 각각의 용출액에 대한 엔테로키나아제 경사슬 단백질의 순도를 확인한 결과 65분 - 80분 사이 (Fraction number 45 ~ 55)에서 효율적으로 분리할 수 있었으며, 이때의 재조합 엔테로키나아제 경사슬 단백질의 순도는 약 90% 이상으로 추정되었다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (14)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진, 인간 엔테로키나아제(enterokinase) 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 합성 유전자는 5'-말단에 벼 알파 아밀라아제 3D(RAmy3D) 분비신호를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 합성 유전자는 3'-말단에 6×His 코딩 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  5. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 식물세포.
  6. 제4항의 재조합 벡터를 식물체의 캘러스에 도입하여 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 캘러스를 선발하는 단계;
    상기 선발된 캘러스를 현탁배양하는 단계; 및
    상기 현탁배양액으로부터 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 식물체에서 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 식물체는 벼인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질의 분리 및 정제는 황산암모늄 침전, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 순차적으로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 식물체의 제조방법.
  10. 제9항의 방법에 의해 제조된 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 생산하는 식물체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 식물체는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 식물체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 단자엽 식물은 벼인 것을 특징으로 하는 식물체.
  13. 제10항에 따른 식물체의 종자.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질을 코딩하는 합성 유전자를 포함하는, 식물체의 인간 엔테로키나아제 경사슬 단백질 대량 생산용 조성물.
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