CN114774397B - 牛肠激酶轻链蛋白突变体及重组融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体讲，涉及牛肠激酶轻链蛋白突变体及重组融合蛋白。本发明的牛肠激酶轻链蛋白突变体为在野生型牛肠激酶轻链基础上，包含一项或多项选自K101P突变、C112T突变、L134K突变、I135K突变、A177K突变或A177E的突变。本发明的重组融合蛋白包括牛肠激酶轻链蛋白突变体，该突变体具备显著提高牛肠激酶轻链蛋白的收率。而本发明提出的重组融合蛋白可有效提高目的蛋白表达量、并帮助其的正确折叠，保证蛋白的活性。

Description

牛肠激酶轻链蛋白突变体及重组融合蛋白
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体讲，涉及牛肠激酶轻链蛋白突变体及其重组融合蛋白。
背景技术
丝氨酸蛋白酶肠激酶（enterokinase）（简称肠激酶或EK酶），也被称为肠肽酶（enteropeptidase），是异源二聚体丝氨酸蛋白酶，一种催化胰蛋白酶原转变为活性胰蛋白酶的哺乳动物酶。肠激酶优先选择底物序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys（DDDDK），并选择性地在赖氨酸之后切割。由于肠激酶的轻链结构在人、牛和猪中保守, 其识底物别序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys在脊椎动物中也有很强的保守性, 且几乎所有被定序的胰蛋白酶原都具有作用于4个天冬酰胺相连识别序列的特征, 而此序列在其他的天然蛋白质上又非常罕见。肠激酶由1条结构亚基（重链）和1条催化亚基（轻链）构成，两者通过1个分子间二硫键结合，结构亚基负责将催化亚基固定在小肠刷状缘膜上并引导它向肠腔移动，催化亚基可以特异性识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并沿序列的羧基端切下，将胰蛋白酶原活化为胰蛋白酶，从而启动各种酶原活化的级联。
在大肠杆菌（E.coli）中，许多哺乳动物蛋白被表达为融合蛋白，其必须被切割以释放成熟的活性蛋白。为了实现该目的，就需要有使用加工酶，优选直接在连接处切割而在产物上不留下额外氨基酸的加工酶。由于肠激酶的底物酶切位点序列具有上述高度的特异性,使得其成为基因工程融合蛋白表达后修饰过程中一个极其有用的工具酶而被广泛应用。
目前，重组基因工程菌表达是制备重组工具酶的主要方法，表达系统包括原核基因表达系统、真核基因表达系统和动物细胞表达系统。而在工具酶制备中，前两者是最为常用的表达系统。对于原核基因表达系统，使用最多的即为大肠杆菌Escherichiacoli来作为宿主菌，这也是目前应用最广泛的蛋白表达系统。原因是大肠杆菌表达系统具有遗传背景和生理特性研究清楚，已开发有多种商业化工程菌可以使用；且大肠杆菌易于培养和控制、转化操作简单，并具有表达水平高、成本低、周期短等特点。
但由于肠激酶自身氨基酸序列和结构特点，对于目前广泛应用的大肠杆菌表达系统获得的其包涵体存在着蛋白表达量低、包涵体产物复性困难等的问题。因此，仍需要能够更优的适应大肠杆菌表达系统，具备更高的分泌表达和活性收率的重组肠激酶。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明通过大量的研究，提供了多种牛肠激酶轻链蛋白突变体及其重组融合蛋白，可显著提高在重组大肠杆菌表达系统中的表达及复性效率。
本发明的第一方面提出了一种牛肠激酶轻链蛋白突变体，为在野生型牛肠激酶轻链基础上，在101、112、134、135、177位中的至少一个氨基酸发生突变，具体的突变包括：K101P、C112T、L134K、I135K、A177K或A177E。具体的，本发明实施的牛肠激酶轻链蛋白突变体包含一项或多项选自K101P、C112T、L134K、I135K、A177K或A177E的突变。野生型牛肠激酶轻链的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。经研究发现，上述突变体可改善蛋白的体外复性效率，提高蛋白本身的溶解性，保持蛋白酶的特异性和活性，进而能够提高收率，实现产业化应用价值的有效提升。其中，突变所表示的含义如表1所示：
表1
突变名称 所表示含义
K101P 野生型牛肠激酶轻链第101位赖氨酸突变为脯氨酸
C112T 野生型牛肠激酶轻链第112位半胱氨酸突变为苏氨酸
L134K 野生型牛肠激酶轻链将第134位亮氨酸突变为赖氨酸
I135K 野生型牛肠激酶轻链第135位异亮氨酸突变为赖氨酸
A177K 野生型牛肠激酶轻链第177位丙氨酸突变为赖氨酸
A177E 野生型牛肠激酶轻链第177位丙氨酸突变为谷氨酸
作为本发明技术方案的一种改进，牛肠激酶轻链蛋白突变体的突变选自：
（1）C112T突变、L134K突变和I135K突变；
（2）C112T突变、K101P突变和A177K突变；或
（3）C112T突变、K101P突变和A177E突变。
作为本发明技术方案的一种改进，突变的具体实例包括：
（1）野生型牛肠激酶轻链EKL：
野生型牛肠激酶轻链EKL来源于Genebank中公开的牛源肠激酶催化亚基的氨基酸序列（AAA16035.1）。
（2）突变体EKLm1（商业化EK酶，雅心）：
鉴于野生型牛肠激酶在变复性过程中稳定性差、复性率低、不利于纯化，故目前商业化EK酶是将其中第112位半胱氨酸突变为苏氨酸，可以提高复性率。突变体EKLm1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
（3）突变体EKLm2：
在突变体EKLm1的氨基酸序列基础上将第134位亮氨酸突变为赖氨酸、第135位异亮氨酸突变为赖氨酸。突变体EKLm2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
（4）突变体EKLm3：
结合序列的保守型及三维空间结构分析，在野生型牛肠激酶轻链氨基酸序列的第101位引入脯氨酸残基，可以减少变性过程中聚集体的产生。在突变体EKLm1的氨基酸序列基础上将第101位赖氨酸突变为脯氨酸、第177位氨基酸突变为赖氨酸，得到突变体EKLm3，其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
（5）突变体EKLm4：
在突变体EKLm3的基础上将第177位氨基酸突变为谷氨酸，得到突变体EKLm4，其氨基酸序列如SEQ ID No:5所示。
各个突变体的突变情况如表2所示：
表2
突变体名称 所表示含义 氨基酸序列
EKLm1 C112T突变 SEQ ID NO:2
EKLm2 C112T突变、L134K突变和I135K突变 SEQ ID NO:3
EKLm3 C112T突变、K101P突变和A177K突变 SEQ ID NO:4
EKLm4 C112T突变、K101P突变和A177E突变 SEQ ID NO:5
具体的氨基酸序列如下：
(1) 野生型牛肠激酶轻链EKL氨基酸序列SEQ ID No:1：
IVGGSDSREGAWPWVVALYFDDQQVCGASLVSRDWLVSAAHCVYGRNMEPSKWKAVLGLHMASNLTSPQIETRLIDQIVINPHYNKRRKNNDIAMMHLEMKVNYTDYIQPICLPEENQVFPPGRICSIAGWGALIYQGSTADVLQEADVPLLSNEKCQQQMPEYNITENMVCAGYEAGGVDSCQGDSGGPLMCQENNRWLLAGVTSFGYQCALPNRPGVYARVPRFTEWIQSFLH；
(2) 突变体EKLm1氨基酸序列SEQ ID No:2：
IVGGSDSREGAWPWVVALYFDDQQVCGASLVSRDWLVSAAHCVYGRNMEPSKWKAVLGLHMASNLTSPQIETRLIDQIVINPHYNKRRKNNDIAMMHLEMKVNYTDYIQPITLPEENQVFPPGRICSIAGWGALIYQGSTADVLQEADVPLLSNEKCQQQMPEYNITENMVCAGYEAGGVDSCQGDSGGPLMCQENNRWLLAGVTSFGYQCALPNRPGVYARVPRFTEWIQSFLH；
(3) 突变体EKLm2氨基酸序列SEQ ID No:3：
IVGGSDSREGAWPWVVALYFDDQQVCGASLVSRDWLVSAAHCVYGRNMEPSKWKAVLGLHMASNLTSPQIETRLIDQIVINPHYNKRRKNNDIAMMHLEMKVNYTDYIQPITLPEENQVFPPGRICSIAGWGAKKYQGSTADVLQEADVPLLSNEKCQQQMPEYNITENMVCAGYEAGGVDSCQGDSGGPLMCQENNRWLLAGVTSFGYQCALPNRPGVYARVPRFTEWIQSFLH；
（4）突变体EKLm3氨基酸序列SEQ ID No:4：
IVGGSDSREGAWPWVVALYFDDQQVCGASLVSRDWLVSAAHCVYGRNMEPSKWKAVLGLHMASNLTSPQIETRLIDQIVINPHYNKRRKNNDIAMMHLEMPVNYTDYIQPITLPEENQVFPPGRICSIAGWGALIYQGSTADVLQEADVPLLSNEKCQQQMPEYNITENMVCAGYEKGGVDSCQGDSGGPLMCQENNRWLLAGVTSFGYQCALPNRPGVYARVPRFTEWIQSFLH；
（5）突变体EKLm4氨基酸序列SEQ ID No:5：
IVGGSDSREGAWPWVVALYFDDQQVCGASLVSRDWLVSAAHCVYGRNMEPSKWKAVLGLHMASNLTSPQIETRLIDQIVINPHYNKRRKNNDIAMMHLEMPVNYTDYIQPITLPEENQVFPPGRICSIAGWGALIYQGSTADVLQEADVPLLSNEKCQQQMPEYNITENMVCAGYEEGGVDSCQGDSGGPLMCQENNRWLLAGVTSFGYQCALPNRPGVYARVPRFTEWIQSFLH。
本发明为了进一步便于上述牛肠激酶轻链蛋白突变体表达，在上述牛肠激酶轻链蛋白突变体上进一步设计肠激酶酶切位点多肽、连接体多肽和伴侣蛋白等，进而提出一种重组融合蛋白，即重组牛肠激酶轻链蛋白。
作为本发明技术方案的一种改进，本发明的重组融合蛋白为在野生型牛肠激酶轻链蛋白或牛肠激酶轻链蛋白突变体的N端依次连接肠激酶酶切位点多肽、连接体多肽和伴侣蛋白所得。
作为本发明技术方案的一种改进，伴侣蛋白可选自TrxA蛋白，具体可选自如SEQID No:6氨基酸序列所示的TrxA蛋白。
作为本发明技术方案的一种改进，连接体多肽可选自30 ~ 100个氨基酸的多肽，进一步优选40 ~ 60个氨基酸的多肽；优选的，连接体多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。
作为本发明技术方案的一种改进，肠激酶酶切位点多肽的氨基酸序列如SEQ IDNo:8所示。
具体的氨基酸序列为：
（1）伴侣蛋白序列SEQ ID No:6：
MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLA；
（2）连接体（Linker）氨基酸序列SEQ ID No:7：
GSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGT；
（3）肠激酶酶切位点氨基酸序列SEQ ID No:8：DDDDK。
该重组融合蛋白的制备方法，至少包括以下步骤：
S1、设计并合成编码本发明重组融合蛋白的表达框序列；
S2、将合成得到的表达框序列插入到表达载体上，获得重组表达载体；
S3、将重组表达载体转化到宿主细胞中，筛选得到重组基因工程菌；
S4、重组基因工程菌进行诱导表达，并收集菌体；
S5、提纯重组基因工程菌表达的目的蛋白，获得重组牛肠激酶轻链蛋白。
优选地，在步骤S1中，合成表达框序列编码包含本发明牛肠激酶轻链的重组融合蛋白，重组融合蛋白为牛肠激酶或其突变体的N端依次连接肠激酶酶切位点多肽、连接体多肽和伴侣蛋白所得。其中，优选的，伴侣蛋白选自TrxA蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。连接体多肽的氨基酸序列如Seq ID No.7所示；肠激酶酶切位点多肽的氨基酸序列如SEQ ID No:8所示。
优选地，步骤S2具体为，将合成的表达框序列克隆到pET-30a(+)的酶切位点之间，获得重组pET-30a(+)表达载体。例如，可采用NdeI和XhoI酶切位点之间等。
优选地，S3中的具体步骤为，将步骤S2中构建的重组pET-30a(+)表达载体转化导入到宿主细胞中，具体可采用原核细胞系，并优选大肠杆菌表达宿主BL21（DE3）。转化的方式可采用热击法。并经过抗性筛选单克隆得到基因工程菌，将获得的基因工程菌冷冻保存。
本发明的第三方面提出了编码上述重组融合蛋白的核苷酸序列。
本发明的第四方面提出了用于表达上述重组融合蛋白的重组表达载体，重组表达载体包含表达本发明上述重组融合蛋白的表达框，即重组融合蛋白的编码核苷酸序列。具体的，本发明实施例的表达载体优选使用表达质粒，具体可选用质粒pET-30a（+）。
本发明的第五方面提出了包括上述重组表达载体的宿主细胞。宿主细胞选自原核细胞，进一步优选大肠杆菌，具体可选自大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）。
本发明中所用到的部分缩写如下：
EK：肠激酶；
EKL：肠激酶轻链；
IPTG：异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷；
Tris：三（羟甲基）氨基甲烷；
DTT：二硫苏糖醇；
Trx：硫氧还蛋白；
SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳；
BL21：大肠杆菌菌株大肠杆菌BL21 DE3；
PCR反应：聚合酶链式反应；
本发明中所用到的部分术语解释如下：
术语“蛋白酶”是指包括单独或与其它多肽组合破坏蛋白质的氨基酸之间的肽键的任何多肽。
术语“蛋白水解活性”指底物被酶切割的活性。在特定的实施方案中，该术语指肠激酶的酶切割。在示例性的实施方案中，该术语指本发明的牛肠激酶轻链类似物对Asp-Asp-Asp-Asp-Lys切割位点的特异活性。“非特异性蛋白水解活性”指不针对特定切割位点的切割活性。“特异性蛋白水解活性”指针对特定切割位点的切割活性。
术语“纯化”指应用于多多组分蛋白或与其他杂质如核酸、脂质等的一种分离提纯的技术统称，通常用纯度作为纯化效果的指标，比如纯度60%，表示经纯化的目的物质组分占比达到60%，对比未纯化之前，可以得出纯度提升比，判断纯化技术是否具有效果。纯化包括多种即使手段，既有物理方式也包括化学方式，根据目的物质的特性进行选择和灵活选用。本领域技术人员熟悉可用于纯化重组蛋白的技术，例如免疫亲和层析、亲和层析、蛋白质沉淀、反相层析、离子交换层析、疏水相互作用层析、尺寸排阻层析、电泳。另外，纯化可包含病毒灭活步骤，例如在干燥或液体状态下、在存在或不存在化学物质（包括蛋白酶抑制剂）的情况下进行热处理和/或溶剂去污剂（SD）处理。
术语“载体”指与适当的控制元件连接时能够复制的任何基因构建体，例如质粒、噬菌体、粘粒等，DNA片段可插入或克隆到其中。载体包含独特的限制性位点，并且可能能够在宿主细胞中自主复制。该术语包括克隆和表达载体。“载体”还可带有一个或多个其他调节元件，调节元件优选选自剪切位点、重组位点、多聚A位点、增强子、多克隆位点和原核质粒序列。
术语“编码”或“编码的”指置于适当调控序列的控制下时，核酸序列在体外或体内可转录（DNA的情况）或翻译（mRNA的情况）成多肽（蛋白质）的特性。
就本申请目的而言，术语“表达”指编码蛋白质的基因的转录和翻译。
术语“伴侣蛋白”（chaperone）指协助其他大分子结构折叠/退褶、组装/解体的蛋白质，在这些大分子结构具备了正常的生物学功能后停止工作。伴侣蛋白可以防止不正确折叠中间体的形成和没有组装的蛋白亚基的不正确聚集，协助多肽链跨膜转运以及大的多亚基蛋白质的组装和解体。
本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本发明多种牛肠激酶轻链蛋白突变体及重组融合蛋白可显著提高牛肠激酶轻链蛋白的收率，并可同时保证蛋白的活性，更有利于进行商业化生产，具备更好的商业应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1的酶活检测结果图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明实施例所用的试剂均为市售。
实施例1
一、重组牛肠激酶轻链表达框合成
合成表达本发明重组融合蛋白的重组表达框，表达框分别表达包含本发明EKL、EKLm1、EKLm2、EKLm3、EKLm4的重组融合蛋白，重组融合蛋白为本发明牛肠激酶轻链或其突变体的N端依次连接肠激酶酶切位点多肽（SEQ ID No:8）、连接体多肽（Seq ID No.7）和伴侣蛋白（SEQ ID No:6）所得。
以野生型牛肠激酶轻链重组融合蛋白为例，其串联后的序列如SEQ ID No:9所示。
2、重组蛋白的表达载体的构建及工程菌的构建
将上述步骤1中构建的表达EKL、EKLm1、EKLm2、EKLm3、EKLm4的表达框序列插入到表达载体pET-30a（+）的NdeI和XhoI酶切位点之间，从而构建得到重组表达载体，测序验证后，并将上述重组表达载体通过热击法转化导入到大肠杆菌表达宿主BL21（DE3）中，经过抗性筛选单克隆，挑取该阳性克隆接种到含有相关抗性的液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养至OD600=1 ~ 1.5，菌液在生物安全柜内加入50%甘油（菌液：50%甘油=2：1），即每个2mL的无菌冻存管中加菌液600μL和50%甘油300μL，在离心管内混合均匀（每个克隆至少保存10管），-80℃保存。
经测序验证，得到的工程菌中的序列与所设计的序列一致。
基因合成及测序服务业务均由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
3、重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测
（1）LB培养基配制，按照表3所示配置：
表3：
Figure 241558DEST_PATH_IMAGE001
（2）工程菌复苏
取前述得到甘油菌各一支，分别按照千分之一接种量接入到装有20 mL灭菌后培养基的三角瓶中，于37℃、200rpm的条件下过夜培养，得相应重组工程菌的复苏菌液。
（3）工程菌的诱导表达
取上述复苏菌液分别按照百分之一接种量接入到装有50 mL灭菌后培养基的三角瓶中于37℃，220rpm的条件下培养至OD600=0.6 ~ 0.8时加入终浓度为0.5 mM的IPTG，并于30℃、220rpm条件下进行过夜诱导表达。
（4）菌体收集及SDS-PAGE表达检测
菌液于8000 rpm，4℃离心30min，弃上清收获菌体。菌体经超声破碎后获得包涵体，并进行SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况。
（5）重组蛋白菌体制备
将SDS-PAGE检测并确定有目的蛋白的表达的工程菌进行5L摇瓶发酵制备菌体，方法同上述步骤（1）和步骤（2），菌液于8000 rpm，4℃离心30min，弃上清收获菌体。
（6）菌体破碎及包涵体制备
Buffer1配方：50mMTris+ 0.5mol/LNaCl，pH=8.5；
Buffer2配方：50mMTris+ 2M尿素 + 0.5mol/LNaCl + 1.5%Triton，pH=8.5；
按照W/V=1：10的比例用Buffer1重悬菌体，高压匀质机进行破碎处理（800 Bar 3次），离心（10000g，30min，4℃）处理留沉淀；按照W/V=1：10的比例用Buffer2重悬洗涤，20min后离心处理，同上；最后用UP水按照w/v=1：10重悬洗涤包涵体，离心（10000g，30min，4℃），留沉淀。
（7）包涵体变性和复性
变性液配方：6M尿素+ 50mMTris + 20mMDTT；
复性液配方：2M尿素+ 1%PEG1000 + 2mM还原型半胱氨酸 + 1mM氧化型半胱氨酸+ 50mMTris，pH=8.0；
包涵体变性：按照w/v=1：10比例，用变性液重悬包涵体，室温搅拌2 ~ 3小时；离心（13000g，30min，4℃）留上清；
包涵体复性：按照v/v=1：20比例将变性液稀释缓慢添加至复性液，室温搅拌过夜进行复性。
（8）目的蛋白纯化和检测
层析柱：QHP柱
缓冲液：缓冲液A：50mMTris，pH=8.0；
缓冲液B：1mol/LNaCl + 50mMTris，pH=8.0；
程序：流速5mL/min；
µµµ 20CV 0%~100%缓冲液B。
纯化蛋白经测序验证，均为本发明实施例设计的重组融合蛋白，即EK酶。
（9）活性检测
直接使用荧光底物DDDDK-肽底物测量酶活性，在含有100μL反应缓冲液的Fluorescent 96孔板的每个孔内加入1μL样品开始反应，混合10秒后，测量荧光（在380nm激发并在500nm发射），计算酶活性；酶活检测结果如图1所示。
相比于突变体EKLm1，本发明的突变EK酶活性均有一定程度提高，尤其是EKLm3其活性提高接近10%。
（9）纯化结果
根据纯化结果得到每克包涵体的目的蛋白收率情况，纯化结果见表4。
表4
突变体 EKL EKLm1 EKLm2 EKLm3 EKLm4
目的蛋白收率（每克包涵体） 0.2% 1.0% 2.5% 4.0% 2.0%
由表4可知，野生型由于二硫键和溶解性等因素造成得率极低，其复性获得的正确折叠的活性蛋白浓度低于0.01mg/mL。EKLm1虽然相较于也野生型经过改造后提高了数倍的蛋白回收率，但仍远低于本申请设计的三种突变EK酶。尤其突变体EKLm3的蛋白收率更是远远高于其他突变EK酶，复性获得的正确折叠的活性蛋白浓度甚至达到0.18mg/mL，相比野生型EK酶提高20倍以上。因此，相比于野生型和已商业化EK酶，本发明的提供的突变EK酶，其具备与之前者相当的酶活性情况下，具备远高于两者的蛋白收率，能够有效避免生产上使用巨大的储液罐生产大量EK酶，更有利于进行商业化生产，具备更好的商业应用价值。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 北京惠之衡生物科技有限公司
吉林惠升生物制药有限公司
<120> 牛肠激酶轻链蛋白突变体及重组融合蛋白
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 235
<212> PRT
<213> 丝氨酸蛋白酶肠激酶(enterokinase)
<400> 1
Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val
1 5 10 15
Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser
20 25 30
Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met
35 40 45
Glu Pro Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser Asn
50 55 60
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65 70 75 80
Asn Pro His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met
85 90 95
His Leu Glu Met Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Cys
100 105 110
Leu Pro Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile
115 120 125
Ala Gly Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu
130 135 140
Gln Glu Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln
145 150 155 160
Met Pro Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu
165 170 175
Ala Gly Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met
180 185 190
Cys Gln Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly
195 200 205
Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro
210 215 220
Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His
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<210> 2
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val
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20 25 30
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50 55 60
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165 170 175
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Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro
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225 230 235
<210> 3
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val
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Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser
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Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met
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Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro
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<210> 4
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val
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145 150 155 160
Met Pro Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu
165 170 175
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180 185 190
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Tyr Gln Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro
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225 230 235
<210> 5
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ile Val Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val
1 5 10 15
Ala Leu Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser
20 25 30
Arg Asp Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
Arg Phe Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His
225 230 235
<210> 6
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
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85 90 95
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100 105
<210> 7
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Ser Gly Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 9
<211> 393
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
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Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
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Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
115 120 125
Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln
130 135 140
His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val
145 150 155 160
Gly Gly Ser Asp Ser Arg Glu Gly Ala Trp Pro Trp Val Val Ala Leu
165 170 175
Tyr Phe Asp Asp Gln Gln Val Cys Gly Ala Ser Leu Val Ser Arg Asp
180 185 190
Trp Leu Val Ser Ala Ala His Cys Val Tyr Gly Arg Asn Met Glu Pro
195 200 205
Ser Lys Trp Lys Ala Val Leu Gly Leu His Met Ala Ser Asn Leu Thr
210 215 220
Ser Pro Gln Ile Glu Thr Arg Leu Ile Asp Gln Ile Val Ile Asn Pro
225 230 235 240
His Tyr Asn Lys Arg Arg Lys Asn Asn Asp Ile Ala Met Met His Leu
245 250 255
Glu Met Lys Val Asn Tyr Thr Asp Tyr Ile Gln Pro Ile Cys Leu Pro
260 265 270
Glu Glu Asn Gln Val Phe Pro Pro Gly Arg Ile Cys Ser Ile Ala Gly
275 280 285
Trp Gly Ala Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Thr Ala Asp Val Leu Gln Glu
290 295 300
Ala Asp Val Pro Leu Leu Ser Asn Glu Lys Cys Gln Gln Gln Met Pro
305 310 315 320
Glu Tyr Asn Ile Thr Glu Asn Met Val Cys Ala Gly Tyr Glu Ala Gly
325 330 335
Gly Val Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Met Cys Gln
340 345 350
Glu Asn Asn Arg Trp Leu Leu Ala Gly Val Thr Ser Phe Gly Tyr Gln
355 360 365
Cys Ala Leu Pro Asn Arg Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Pro Arg Phe
370 375 380
Thr Glu Trp Ile Gln Ser Phe Leu His
385 390

Claims (2)

1.一种牛肠激酶轻链蛋白突变体，其特征在于，所述牛肠激酶轻链蛋白突变体为在野生型牛肠激酶轻链基础上具有C112T突变、K101P突变和A177K突变，所述野生型牛肠激酶轻链的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示。
2.根据权利要求1所述的牛肠激酶轻链蛋白突变体，其特征在于，所述牛肠激酶轻链蛋白突变体选自SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
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