JP6828291B2 - ヒトＦｃＲｎをコードするポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチドを利用したヒトＦｃＲｎの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、ヒトｎｅｏｎａｔａｌ ＦｃＲ（ＦｃＲｎ）をコードするポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチドを利用したヒトＦｃＲｎの製造方法に係る。特に本発明は、ヒトＦｃＲｎを宿主で効率的に発現可能なポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチドを利用したヒトＦｃＲｎの製造方法に係る。

ヒトＦｃＲｎは免疫グロブリンスーパーファミリーに属するヒトＦｃγレセプターとは異なり、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ関連分子で、重鎖（α鎖）と、β２ミクログロブリン（β鎖）により構成されている（非特許文献1）。ＦｃＲｎはＩｇＧのリサイクリング機構に関与しており、ＩｇＧの分解を抑制する働きをもつ。また、ＦｃＲｎはｐＨ依存的にＩｇＧと結合し、ｐＨ６．５以下で結合する（非特許文献２）。
ヒトＦｃＲｎのα鎖のアミノ酸配列（配列番号１）は、ＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ５５８９９）などの公的データベースに公表されている。また、β鎖のアミノ酸配列（配列番号２）は、ＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｐ６１７６９）に公表されている。また、ヒトＦｃＲｎの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。図1にヒトＦｃＲｎのα鎖、図２にβ鎖の構造略図を示す。なお、図1中のアミノ酸番号は配列番号1に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号1中の1番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２３番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシグナル配列（Ｓ）、２４番目のアラニン（Ａｌａ）から２９７番目のセリン（Ｓｅｒ）までが細胞外領域（ＥＣ）、２９８番目のバリン（Ｖａｌ）から３２１番目のトリプトファン（Ｔｒｐ）までが細胞膜貫通領域（ＴＭ）および３２２番目のアルギニン（Ａｒｇ）から３６５番目のアラニン（Ａｌａ）までが細胞内領域（Ｃ）とされている。また、図２中のアミノ酸番号は配列番号２に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２０番目のアラニン（Ａｌａ）までがシグナル配列（Ｓ）、２１番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）から１１９番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）とされている。

遺伝子工学的手法を用いたＦｃＲｎの発現は、ＨＥＫ２９３細胞などの動物細胞を宿主として１０ｍｇ／Ｌの発現量で発現した例が報告されている（非特許文献３）。しかし、動物細胞に比べて簡便で安価に製造可能である大腸菌を宿主として発現させた場合、可溶性のＦｃＲｎとして発現させることは報告されていない。

Ｎ．Ｅ．Ｓｉｍｉｓｔｅｒ等，Ｎａｔｕｒｅ，３３７，１８４−１８７，１９８９ Ｍ．Ｒａｇｈａｖａｎ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３４，１４６４９−１４６５７，１９９５ Ｙ．Ｆｅｎｇ等，Ｐｒｏｔｅｉｎ ＥｘｐｒＰｕｒｉｆ．，７９（１），６６−７１，２０１１

本発明の課題は、ヒトＦｃＲｎを宿主で効率的に発現可能なポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチドを利用してヒトＦｃＲｎを効率的に製造する方法を提供することにある。

本発明者らは前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ヒトＦｃＲｎのうち、少なくとも細胞外領域の一部を含む領域のアミノ酸配列をヌクレオチド配列に変換する際に、大腸菌型のコドンを用いることで、大腸菌を宿主としたヒトＦｃＲｎの製造を実現し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下の態様を包含する：
（Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基と配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質を大腸菌型コドンを用いて変換した、ヒトＦｃＲｎをコードするポリヌクレオチド。

（Ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基と配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質を大腸菌型コドンを用いて変換した、ヒトＦｃＲｎをコードするポリヌクレオチド。

（Ｃ）配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含む、（Ａ）に記載のポリヌクレオチド。

（Ｄ）（Ａ）から（Ｃ）のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。

（Ｅ）（Ｄ）に記載のベクターで大腸菌を形質転換して得られる形質転換体。

（Ｆ）（Ｅ）に記載の形質転換体を培養し、得られた培養液からヒトＦｃＲｎを回収する、ヒトＦｃＲｎの製造方法。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃＲｎのα鎖のうち、細胞外領域（図１のＥＣ）である、２４番目のアラニンから２９７番目のセリンと配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃＲｎのβ鎖のうち少なくとも２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含むタンパク質をポリヌクレオチドに変換する際、大腸菌型コドンを用いて変換することを特徴としている。前記タンパク質は、α鎖の細胞外領域（図１のＥＣ）の一部である、２４番目のアラニンから２９７番目のセリンと配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるβ鎖の２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含んでいればよく、細胞外領域（図１のＥＣ）のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域（図１のＳ）の全てまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＣ末端側にある細胞膜貫通領域（図１のＴＭ）および細胞外領域（図１のＣ）の全てまたは一部を含んでもよい。さらにタンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃＲｎのα鎖のうち、２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基と配列番号２に記載のアミノ酸からなるヒトＦｃＲｎのβ鎖のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を少なくとも含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質であっても、本発明に含まれる。

本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃＲｎのα鎖のうち、２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基と配列番号２に記載のアミノ酸からなるヒトＦｃＲｎのβ鎖のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基（または、さらに前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したもの）を少なくとも含むタンパク質から、コードするアミノ酸は変えずに、大腸菌の翻訳機構において利用頻度が低いコドン（レアコドン）から利用頻度が高いコドンに変換することにより得られる。具体的には大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の場合、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれレアコドンであるため、それらのコドンを避けるように変換すればよい。なお宿主におけるコドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ等）を利用することで可能である。本発明のポリヌクレオチドは、α鎖、β鎖をそれぞれ発現させてもよく、α鎖とβ鎖をリンカーで結合させてもよい。一例として、ヒトＦｃＲｎのα鎖とβ鎖をリンカーで結合させた配列番号３に記載の配列を含むポリヌクレオチドがあげられる。

本発明のポリヌクレオチドの作製方法としては、
（Ｉ）ヒトＦｃＲｎをコードするポリヌクレオチドに対して、ＰＣＲ等のＤＮＡ増幅法を用いて、大腸菌型コドンとなるよう変異を導入し、作製する方法や、
（ＩＩ）ヒトＦｃＲｎのアミノ酸配列を大腸菌型コドンを用いてヌクレオチド配列に変換したものを設計し、当該設計した配列からなるポリヌクレオチドを人工的に合成する方法、
が例示できる。なお前記（Ｉ）または（ＩＩ）の方法で作製した本発明のポリヌクレオチドの５’末端側にシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドを付加してもよく、宿主が大腸菌の場合は、前記シグナルペプチドとしてｐｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｎｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、ＴｏｒＴといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドをあげることができる（特開２０１１−０９７８９８号公報）。

本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換する場合、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いてもよいが、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミド等）の適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入したものを用いると、より好ましい。なお当該発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクター、ｐＣＤＦプラスミドベクター、ｐＢＢＲプラスミドベクターを例示することができる。また前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で挿入すると好ましい。当該プロモータの例として、宿主が大腸菌の場合は、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータ等を例示することができる。前記方法により作製した本発明のポリヌクレオチドを挿入した（本発明のポリヌクレオチドを含む）ベクター（本発明のベクター）で宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。

本発明のポリヌクレオチドを挿入したベクターで宿主を形質転換して得られる本発明の形質転換体から、本発明のベクターを調製するには、本発明の形質転換体を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）等の市販の抽出キットを用いて調製すればよい。

本発明の形質転換体を培養し、得られた培養物からヒトＦｃＲｎを回収することで、ヒトＦｃＲｎを製造することができる。なお本明細書において培養物とは、培養された本発明の形質転換体の細胞そのもののほか、培養に用いた培地も含まれる。本発明のタンパク質製造方法で用いる形質転換体は、対象宿主の培養に適した培地で培養すればよく、宿主が大腸菌の場合は、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地が好ましい培地の一例としてあげられる。なお、本発明のベクターの導入の有無により本発明の形質転換体を選択的に増殖させるために、培地に当該ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養すると好ましい。例えば、当該ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加してもよく、さらにグリシンといった前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を添加してもよく、具体的には、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃、より好ましくは２５℃前後であるが、発現させるタンパク質の特性により選択すればよい。培地のｐＨは宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後である。また本発明のベクターに誘導性のプロモータが含まれている場合は、本発明のタンパク質が良好に発現できるような条件下で誘導をかけると好ましい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示することができる。宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、ヒトＦｃＲｎの発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１から０．５ｍＭの範囲が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。

本発明の形質転換体を培養して得られた培養物からヒトＦｃＲｎを回収するには、本発明の形質転換体におけるヒトＦｃＲｎの発現形態に適した方法で、当該培養物から分離／精製してヒトＦｃＲｎを回収すればよい。例えば、培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清からヒトＦｃＲｎを精製すればよい。また、細胞内（ペリプラズムを含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等の添加、超音波などにより菌体を破砕してヒトＦｃＲｎを抽出した後、精製すればよい。ヒトＦｃＲｎを精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として液体クロマトグラフィーを用いた分離／精製があげられる。液体クロマトグラフィーには、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があり、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより、ヒトＦｃＲｎを高純度に調製することができる。

得られたヒトＦｃＲｎのＩｇＧに対する結合活性を測定する方法としては、例えばＩｇＧに対する結合活性をＥｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（以下、ＥＬＩＳＡと表記）法や表面プラズモン共鳴法などを用いて測定すればよい。結合活性の測定に使用するＩｇＧは、ヒトＩｇＧが好ましい。

本発明は、配列番号１に記載のヒトＦｃＲｎのα鎖のアミノ酸配列のうち、細胞外領域の一部である２４番目のアラニンから２９７番目のセリンと配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃＲｎのβ鎖のうち少なくとも２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基（または、さらに前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したもの）を少なくとも含むタンパク質を大腸菌型コドンを用いて変換して得られるポリヌクレオチドであり、前記ポリヌクレオチドを用いて大腸菌を形質転換することで、大腸菌でヒトＦｃＲｎを効率的に製造することができる。
さらに本発明において得られたヒトＦｃＲｎは可溶性であるため、工業的用途に使用する場合に不溶性のヒトＦｃＲｎよりも簡便に加工することができる。

ヒトＦｃＲｎのα鎖の概略図である。図中の数字は配列番号１に記載のアミノ酸配列の番号を示している。図中のＳはシグナル配列、ＥＣは細胞外領域、ＴＭは細胞膜貫通領域、Ｃは細胞内領域を示している。 ヒトＦｃＲｎのβ鎖の概略図である。図中の数字は配列番号２に記載のアミノ酸配列の番号を示している。図中のＳはシグナル配列、Ｂ２Ｍはβ２ミクログロブリンを示している。 実施例１で得られた形質転換体で発現させたヒトＦｃＲｎのヒトＩｇＧへの結合性を示した図である。 ヒトＦｃＲｎをヒト型コドン（ｈｕｍａｎ、上段）および大腸菌型コドン（Ｅ．ｃｏｌｉ、下段）を用いてポリヌクレオチドに変換したときの、ヌクレオチド配列を比較した図である。 ヒトＦｃＲｎをヒト型コドン（ｈｕｍａｎ、上段）および大腸菌型コドン（Ｅ．ｃｏｌｉ、下段）を用いてポリヌクレオチドに変換したときの、ヌクレオチド配列を比較した図である。 ヒトＦｃＲｎをヒト型コドン（ｈｕｍａｎ、上段）および大腸菌型コドン（Ｅ．ｃｏｌｉ、下段）を用いてポリヌクレオチドに変換したときの、ヌクレオチド配列を比較した図である。

以下、本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。

実施例１ ヒトＦｃＲｎ発現ベクターの作製（大腸菌型コドン）
（１）配列番号１に記載のヒトＦｃＲｎのα鎖のアミノ酸配列のうち、２４番目のアラニンから２９７番目のセリンと配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃＲｎのβ鎖のアミノ酸配列のうち２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸配列を基に、ＤＮＡｗｏｒｋｓ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３０，ｅ４３，２００２）を用いて、コドンをヒト型から大腸菌型に変換し、リンカーでつないだヌクレオチド配列を設計した。また、両端にＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素を含めた。設計したヌクレオチド配列を配列番号３に示す。
（２）設計したヌクレオチドを人工的に合成した。
（３）（２）で得られたポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１株（ＤＥ３）を形質転換した。
（４）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲｎを抽出した。
（５）（４）で作製した発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲｎのうち、ＦｃＲｎをコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ライフサイエンス社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（ライフサイエンス社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号４（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）または配列番号５（５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ−３’）に記載のオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。

発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲｎで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号６に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号７に、それぞれ示す。なお配列番号６において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがリンカー配列であり、３４番目のイソロイシン（Ｉｌｅ）から１３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがヒトＦｃＲｎのβ鎖（配列番号２の２１番目から１１９番目までの領域）であり、１３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１５７番目のセリン（Ｓｅｒ）までがリンカー配列であり、１５８番目のアラニン（Ａｌａ）から４３１番目のセリン（Ｓｅｒ）までが、ヒトＦｃＲｎのα鎖の細胞外領域（配列番号１の２４番目から２９７番目までの領域）であり、４３２番目から４３７番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。

実施例２ ヒトＦｃＲｎの抗体結合確認
（１）実施例１で得られた、発現ベクターｐＥＴ−ｅＦｃＲｎで形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む４ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、イーストエキストラクト１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に接種後、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した１５ｍＬの２ＹＴ液体培地に（１）の前培養液を１５０μＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
（３）培養開始１５０分後、終濃度０ｍＭ／０．１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、２０℃で４時間、好気的に振とう培養した。
（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、超音波発生機（トミー精工社製）を用いて、可溶分画中のタンパク質抽出液を調製した。
（５）（４）で調製したタンパク質抽出液に含まれるヒトＦｃＲｎの抗体結合活性を、下記に示すＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
（５−１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１０μｇ／ｗｅｌｌ固定化した（４℃で１８時間）。固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ ＭＩＬＫ（ＢＤ社製）を含んだリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）によりブロッキングした。
（５−２）洗浄緩衝液（リン酸緩衝液（ｐＨ６．０））で洗浄後、（４）で調製したヒトＦｃＲｎを含む溶液を固定化ガンマグロブリンと反応させた（３０℃で１時間）。
（５−３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、ブロッキング溶液で１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ−６Ｈｉｓ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（５−４）３０℃で１時間反応させ、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ社製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。

（４）で調製したヒトＦｃＲｎを含む溶液を添加したときの、抗体結合活性に相当する吸光度（４５０ｎｍ）の関係をまとめた図を図３に示す。なお図３においてｐＥＴＭａｌＥは、ＦｃＲｎの遺伝子を挿入していないプラスミドを同様に培養、抽出したもの（ネガティブコントロール）である。ＦｃＲｎ遺伝子を挿入していない場合と比較して、挿入している方が吸光度が増加していることから、ヒトＦｃＲｎが活性状態で発現していることがわかる。

Claims (4)

1. 配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも２４番目のアラニンから２９７番目のセリンまでのアミノ酸残基と配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも２１番目のイソロイシンから１１９番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質であるヒトＦｃＲｎをコードする、配列番号３に記載のヌクレオチド配列を含む、大腸菌型コドンを用いて変換した、ポリヌクレオチド。
2. 請求項１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
3. 請求項２に記載のベクターで大腸菌を形質転換して得られる形質転換体。
4. 請求項３に記載の形質転換体を培養し、得られた培養物からヒトＦｃＲｎを回収する、ヒトＦｃＲｎの製造方法。

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