JP6911490B2 - 安定型Fc結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤 - Google Patents
安定型Fc結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤 Download PDFInfo
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Description
<1> 配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち24番目のアラニンから297番目のセリンまでのアミノ酸残基および配列番号2に記載のアミノ酸配列のうち21番目のイソロイシンから119番目のメチオニンまでのアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基において以下の(1)から(39)のうち少なくともいずれか1つの変異を有する、Fc結合性タンパク質:
(1)配列番号1の49番目のバリンがアラニンに置換される変異、
(2)配列番号1の62番目のアスパラギンがスレオニンに置換される変異、
(3)配列番号1の71番目のシステインがアルギニンに置換される変異、
(4)配列番号1の78番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
(5)配列番号1の79番目のグルタミンがヒスチジンに置換される変異、
(6)配列番号1の80番目のバリンがアスパラギン酸に置換される変異、
(7)配列番号1の96番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
(8)配列番号1の103番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
(9)配列番号1の125番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
(10)配列番号1の127番目のセリンがプロリンに置換される変異、
(11)配列番号1の151番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
(12)配列番号1の172番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
(13)配列番号1の173番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
(14)配列番号1の180番目のフェニルアラニンがチロシンに置換される変異、
(15)配列番号1の192番目のアルギニンがロイシンに置換される変異、
(16)配列番号1の193番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
(17)配列番号1の196番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
(18)配列番号1の206番目のアルギニンがシステインに置換される変異、
(19)配列番号1の210番目のアルギニンがシステインに置換される変異、
(20)配列番号1の219番目のロイシンがヒスチジンに置換される変異、
(21)配列番号1の220番目のスレオニンがアラニンに置換される変異、
(22)配列番号1の226番目のフェニルアラニンがセリンに置換される変異、
(23)配列番号1の232番目のグルタミンがロイシンに置換される変異、
(24)配列番号1の233番目のロイシンがプロリンに置換される変異、
(25)配列番号1の255番目のグリシンがセリンに置換される変異、
(26)配列番号1の256番目のセリンがプロリンに置換される変異、
(27)配列番号1の261番目のセリンがプロリンに置換される変異、
(28)配列番号1の262番目のセリンがシステインに置換される変異、
(29)配列番号1の263番目のロイシンがプロリンに置換される変異、
(30)配列番号1の266番目のリジンがグルタミン酸またはアルギニンに置換される変異、
(31)配列番号1の267番目のセリンがプロリンに置換される変異、
(32)配列番号1の273番目のチロシンがヒスチジンに置換される変異、
(33)配列番号1の282番目のロイシンがヒスチジンに置換される変異、
(34)配列番号1の286番目のロイシンがヒスチジンに置換される変異、
(35)配列番号1の295番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異
(36)配列番号2の32番目のアルギニンがヒスチジンに置換される変異、
(37)配列番号2の42番目のフェニルアラニンがイソロイシンまたはチロシンに置換される変異、
(38)配列番号2の68番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
(39)配列番号2の87番目のチロシンがヒスチジンに置換される変異。
<2> 配列番号3に記載の配列からなるアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基において以下の(1)から(45)のうち少なくともいずれか1つの変異を有する、請求項1に記載のFc結合性タンパク質:
(1)配列番号3の152番目のバリンがアラニンに置換される変異、
(2)配列番号3の165番目のアスパラギンがスレオニンに置換される変異、
(3)配列番号3の174番目のシステインがアルギニンに置換される変異、
(4)配列番号3の181番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
(5)配列番号3の182番目のグルタミンがヒスチジンに置換される変異、
(6)配列番号3の183番目のバリンがアスパラギン酸に置換される変異、
(7)配列番号3の199番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
(8)配列番号3の206番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
(9)配列番号3の228番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
(10)配列番号3の230番目のセリンがプロリンに置換される変異、
(11)配列番号3の254番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
(12)配列番号3の275番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
(13)配列番号3の276番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
(14)配列番号3の283番目のフェニルアラニンがチロシンに置換される変異、
(15)配列番号3の295番目のアルギニンがロイシンに置換される変異、
(16)配列番号3の296番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
(17)配列番号3の299番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
(18)配列番号3の309番目のアルギニンがシステインに置換される変異、
(19)配列番号3の313番目のアルギニンがシステインに置換される変異、
(20)配列番号3の322番目のロイシンがヒスチジンに置換される変異、
(21)配列番号3の323番目のスレオニンがアラニンに置換される変異、
(22)配列番号3の329番目のフェニルアラニンがセリンに置換される変異、
(23)配列番号3の335番目のグルタミンがロイシンに置換される変異、
(24)配列番号3の336番目のロイシンがプロリンに置換される変異、
(25)配列番号3の358番目のグリシンがセリンに置換される変異、
(26)配列番号3の359番目のセリンがプロリンに置換される変異、
(27)配列番号3の364番目のセリンがプロリンに置換される変異、
(28)配列番号3の365番目のセリンがシステインに置換される変異、
(29)配列番号3の366番目のロイシンがプロリンに置換される変異、
(30)配列番号3の369番目のリジンがグルタミン酸またはアルギニンに置換される変異、
(31)配列番号3の370番目のセリンがプロリンに置換される変異、
(32)配列番号3の376番目のチロシンがヒスチジンに置換される変異、
(33)配列番号3の385番目のロイシンがヒスチジンに置換される変異、
(34)配列番号3の389番目のロイシンがヒスチジンに置換される変異、
(35)配列番号3の398番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
(36)配列番号3の14番目のアルギニンがヒスチジンに置換される変異、
(37)配列番号3の24番目のフェニルアラニンがイソロイシンまたはチロシンに置換される変異、
(38)配列番号3の50番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
(39)配列番号3の69番目のチロシンがヒスチジンに置換される変異、
(40)配列番号3の107番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
(41)配列番号3の114番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
(42)配列番号3の117番目のグリシンがセリンに置換される変異、
(43)配列番号3の123番目のグリシンがセリンまたはアスパラギン酸に置換される変異、
(44)配列番号3の125番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
(45)配列番号3の126番目のセリンがアスパラギンに置換される変異。
<3> 少なくとも以下に示す4つの変異を有する、<2>に記載のFc結合性タンパク質:
(3)配列番号3の174番目のシステインがアルギニンに置換される変異、
(4)配列番号3の181番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
(15)配列番号3の295番目のアルギニンがロイシンに置換される変異、
(23)配列番号3の335番目のグルタミンがロイシンに置換される変異。
<4> 以下の変異をさらに有する、<3>に記載のFc結合性タンパク質:
(11)配列番号3の254番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異。
<5> 以下の変異をさらに有する、<4>に記載のFc結合性タンパク質:
(17)配列番号3の299番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異。
<6> 以下の変異をさらに有する、<5>に記載のFc結合性タンパク質:
(35)配列番号3の398番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異。
<7> 以下に示す変異のうち少なくとも1つをさらに有する、<6>に記載のFc結合性タンパク質:
(1)配列番号3の152番目のバリンがアラニンに置換される変異、
(12)配列番号3の275番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
(19)配列番号3の313番目のアルギニンがシステインに置換される変異、
(26)配列番号3の359番目のセリンがプロリンに置換される変異。
<8> 配列番号5から7のいずれかに記載の配列からなるアミノ酸残基を含む、<3>に記載のFc結合性タンパク質。
<9> <1>から<8>のいずれかに記載のFc結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
<10> <9>に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
<11> <10>に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
<12> 宿主が大腸菌である、<11>に記載の形質転換体。
<13> (A)<11>または<12>に記載の形質転換体を培養することによりFc結合性タンパク質を発現させる工程、および
(B)発現されたFc結合性タンパク質を培養物から回収する工程、
を含む、Fc結合性タンパク質の製造方法。
<14> <1>から<8>のいずれかに記載のFc結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤。
<15> <14>に記載の吸着剤に、抗体を含む溶液を接触させる工程を含む、抗体の分離方法。
(I)配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるヒトFcRnα鎖の細胞外領域(図1のECの領域)に相当する、24番目のアラニンから297番目のセリンまでのアミノ酸残基
(II)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるヒトFcRnβ鎖のβ2ミクログロブリン領域(図2のB2Mの領域)に相当する、21番目のイソロイシンから119番目のメチオニンまでのアミノ酸残基
したがって、本発明のFc結合性タンパク質は、ヒトFcRnα鎖の細胞外領域(図1のEC領域)やヒトFcRnβ鎖のβ2ミクログロブリン領域(図2のB2Mの領域)のN末端側にあるシグナルペプチド領域(図1および図2のSの領域)の全てまたは一部を含んでもよいし、ヒトFcRnα鎖の細胞外領域(図1のEC領域)のC末端側にある細胞膜貫通領域(図1のTMの領域)および細胞外領域(図1のCの領域)の全てまたは一部を含んでもよい。
(a)配列番号3に記載の配列からなるアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基においてCys174Arg、Asn181Asp、Arg295LeuおよびGln335Leuの置換が生じたFc結合性タンパク質(配列番号5に記載の配列からなるアミノ酸残基を含むFc結合性タンパク質)。
(b)配列番号3に記載の配列からなるアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基においてCys174Arg、Asn181Asp、Gly254Asp、Arg295Leu、Asn299Asp、Gln335LeuおよびLys398Gluの置換が生じたFc結合性タンパク質(配列番号6に記載の配列からなるアミノ酸残基を含むFc結合性タンパク質)。
(c)配列番号3に記載の配列からなるアミノ酸残基を含み、ただし当該アミノ酸残基においてVal152Ala、Cys174Arg、Asn181Asp、Gly254Asp、Arg295Leu、Asn299Asp、Gln335LeuおよびLys398Gluの置換が生じたFc結合性タンパク質(配列番号7に記載の配列からなるアミノ酸残基を含むFc結合性タンパク質)。
(i)本発明のFc結合性タンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
(ii)Fc結合性タンパク質の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドを直接人工的に、またはFc結合性タンパク質のcDNA等からPCR法等のDNA増幅法を用いて調製し、調製した当該ポリヌクレオチドを適当な方法で連結する方法、が例示できる。
前記(i)の方法において、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌(Escherichia coli)の場合は、アルギニン(Arg)ではAGA/AGG/CGG/CGAが、イソロイシン(Ile)ではATAが、ロイシン(Leu)ではCTAが、グリシン(Gly)ではGGAが、プロリン(Pro)ではCCCが、それぞれ使用頻度が少ないため(いわゆるレアコドンであるため)、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース(例えば、かずさDNA研究所のホームページにあるCodon Usage Databaseなど)を利用することによっても可能である。本発明のポリヌクレオチドは、α鎖、β鎖をそれぞれ発現させてもよく、α鎖とβ鎖をリンカーで結合させてもよい。後者の例として、GSリンカーを介してヒトFcRnのα鎖とβ鎖とが結合したFc結合性タンパク質である配列番号3に記載の配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである、配列番号4に記載の配列からなるポリヌクレオチドがあげられる。
例えば、本発明の形質転換体の宿主が大腸菌の場合、形質転換体を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはQIAprep Spin Miniprep kit(キアゲン製)等の市販の抽出キットを用いて調製すればよい。
(1)配列番号1に記載のヒトFcRnのα鎖のアミノ酸配列のうち24番目のアラニンから297番目のセリンまでのアミノ酸配列、および配列番号2に記載のアミノ酸配列からなるヒトFcRnのβ鎖のアミノ酸配列のうち21番目のイソロイシンから119番目のメチオニンまでのアミノ酸配列を基に、DNAworks法(Nucleic Acids Res.,30,e43,2002)を用いて、コドンをヒト型から大腸菌型に変換し、当該変換したヌクレオチド配列の間にGSリンカーをコードするヌクレオチド配列を挿入することで、配列番号4に記載のヌクレオチド配列を設計した。
(2)設計したヌクレオチド配列(配列番号4)の5’末端側にNcoI認識配列(CCATGG)を、3’末端側にHindIII認識配列(AAGCTT)を、それぞれ付加した配列からなるポリヌクレオチドを人工的に合成した。
(3)(2)で合成したポリヌクレオチドを制限酵素NcoIとHindIIIで消化後、あらかじめ制限酵素NcoIとHindIIIで消化した発現ベクターpETMalE(特開2011−206046号公報)にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌BL21株(DE3)を形質転換した。
(4)得られた形質転換体を50μg/mLのカナマイシンンを含むLB培地にて培養後、QIAprep Spin Miniprep kit(キアゲン製)を用いて、野生型Fc結合性タンパク質であるヒトFcRnの発現ベクターpET−eFcRnを抽出した。
(5)(4)で作製した発現ベクターpET−eFcRnのうち、FcRnをコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくBig Dye Terminator Cycle Sequencing FS read Reaction kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック製)を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動DNAシークエンサーABI Prism 3700 DNA analyzer(サーモフィッシャーサイエンティフィック製)にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号8(5’−TAATACGACTCACTATAGGG−3’)または配列番号9(5’−TATGCTAGTTATTGCTCAG−3’)に記載のオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。
(1)実施例1で得られた、発現ベクターpET−eFcRnで形質転換した大腸菌BL21(DE3)株を、50μg/mLのカナマイシンを含む4mLの2YT液体培地(ペプトン16g/L、酵母エキス10g/L、塩化ナトリウム5g/L)に接種後、37℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
(2)50μg/mLのカナマイシンを添加した15mLの2YT液体培地に(1)の前培養液を150μL接種し、37℃で好気的に振とう培養を行なった。
(3)培養開始150分後、終濃度0mM/0.1mMとなるようIPTGを添加し、20℃で4時間、好気的に振とう培養した。
(4)培養終了後、遠心分離により集菌し、超音波発生機(トミー精工製)を用いて、可溶分画中のタンパク質抽出液を調製した。
(5)(4)で調製したタンパク質抽出液に含まれるヒトFcRnの抗体結合活性を、下記に示すELISA法を用いて測定した。
(5−1)ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤(化学及血清療法研究所製)を、96穴マイクロプレートのウェルに10μg/well固定化した(4℃で18時間)。固定化終了後、2%(w/v)のSKIM MILK(Becton, Dickinson and Company製)、および150mMの塩化ナトリウムを含んだリン酸緩衝液(pH6.0)によりブロッキングした。
(5−2)洗浄緩衝液(150mMの塩化ナトリウムを含んだリン酸緩衝液(pH6.0))で洗浄後、(4)で調製したヒトFcRnを含む溶液を固定化ガンマグロブリンと反応させた(30℃で1時間)。
(5−3)反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、ブロッキング溶液で100ng/mLに希釈したAnti−6His抗体(Bethyl Laboratories製)を
100μL/wellで添加した。
(5−4)30℃で1時間反応させ、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、TMB Peroxidase Substrate(Kirkegaard and Perry Laboratories製)を50μL/wellで添加した。1Mのリン酸を50μL/wellで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー(Tecan製)にて450nmの吸光度を測定した。
実施例1で作製したFc結合性タンパク質発現ベクターpET−eFcRnのうち、Fc結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンPCRによりランダムに変異導入を施した。
(1)鋳型として実施例1で作製したpET−eFcRnを用いてエラープローンPCRを行なった。エラープローンPCRは、表2に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を95℃で2分間熱処理し、95℃で30秒間の第1ステップ、60℃で30秒間の第2ステップ、72℃で90秒間の第3ステップを1サイクルとする反応を35サイクル行ない、最後に72℃で7分間熱処理することで行なった。前記エラープローンPCRによりFc結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに良好に変異が導入され、その平均変異導入率は0.2%であった。
(3)ライゲーション反応終了後、反応液をエレクトロポレーション法により大腸菌BL21(DE3)株に導入し、50μg/mLのカナマイシンを含むLBプレート培地で培養(37℃で18時間)後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリーとした。
(1)実施例3で作製したランダム変異体ライブラリー(形質転換体)を、50μg/mLのカナマイシンを含む2YT液体培地(ペプトン16g/L、酵母エキス10g/L、塩化ナトリウム5g/L)200μLに接種し、96穴ディープウェルプレートを用いて、30℃で一晩振とう培養した。
(2)培養後、5μLの培養液を500μLの0.05mMのIPTG(isopropyl−β−D−thiogalactopyranoside)、0.3%(w/v)のグリシンおよび50μg/mLのカナマイシンを含む2YT液体培地に植え継ぎ、96穴ディープウェルプレートを用いて、さらに20℃で一晩振とう培養した。
(3)培養後、遠心操作によって得られた培養上清を150mMの塩化ナトリウムを含む20mMのトリス塩酸緩衝液(pH7.4)で2倍に希釈した。希釈した溶液を40℃で10分間熱処理を行なった。
(4)(3)の熱処理を行なったときのFc結合性タンパク質の抗体結合活性と、(3)の熱処理を行なわなかったときのFc結合性タンパク質の抗体結合活性を、それぞれ実施例2(5)に記載したELISA法にて測定し、熱処理を行なった時のFc結合性タンパク質の抗体結合活性を、熱処理を行なわなかったときのFc結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
(5)(4)の方法で約2700株の形質転換体を評価し、その中から野生型(アミノ酸置換のない)Fc結合性タンパク質と比較して熱安定性が向上したFc結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。前記選択した形質転換体を培養し、QIAprep Spin Miniprep kit(キアゲン製)を用いて発現ベクターを調製した。
(6)得られた発現ベクターに挿入されたFc結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を実施例1(5)の記載と同様の方法によりヌクレオチド配列を解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
Phe24Ile(この表記は、配列番号3の24番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換されていることを表す、以下同様)、Phe24Tyr、Gly114Asp、Gly117Ser、Gly123Ser、Gly123Asp、Cys174Arg、Asn181Asp、Val183Asp、Lys199Glu、Asn228Asp、Asn275Asp、Phe283Tyr、Arg295Leu、Arg309Cys、Leu322His、Thr323Ala、Phe329Ser、Gln335Leu、Ser365Cys、Leu366Pro、Tyr376His、Leu385His、Leu389Hisのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも1つ生じたFc結合性タンパク質は、野生型のFc結合性タンパク質と比較し熱安定性が向上しているといえる。
実施例4で判明した、Fc結合性タンパク質の熱安定性向上に関与するアミノ酸置換を集積することで、さらなる安定性向上を図った。置換アミノ酸の集積は、主にPCRを用いて行ない、以下の(a)から(c)に示す3種類のFc結合性タンパク質を作製した。
(a)FcRn_m1に対し、さらにCys174Argのアミノ酸置換を行なったFcRn_m2
(b)FcRn_m2に対し、さらにArg295Leuのアミノ酸置換を行なったFcRn_m3
(c)FcRn_m3に対し、さらにGln335Leuのアミノ酸置換を行なったFcRn_m4
以下、各Fc結合性タンパク質の作製方法を詳細に説明する。
実施例4で明らかになった、熱安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Cys174ArgおよびAsn181Aspを選択し、それらの置換を野生型のFc結合性タンパク質に集積したFcRn_m2を作製した。具体的には、FcRn_m1をコードするポリヌクレオチドに対してCys174Argを生じさせる変異導入を行なうことにより、FcRn_m2を作製した。
(a−1)実施例4で取得した、pET−FcRn_m1を鋳型としてPCRを実施した。当該PCRにおけるプライマーは、配列番号8および配列番号14(5’−CACGCACCGCGTGGTTCTGC−3’)に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。PCRは、表4に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を98℃で5分間熱処理し、98℃で10秒間の第1ステップ、55℃で5秒間の第2ステップ、72℃で1分間の第3ステップを1サイクルとする反応を30サイクル行ない、最後に72℃で7分間熱処理することで行なった。増幅したPCR産物をアガロースゲル電気泳動に供し、そのゲルからQIAquick Gel Extraction kit(キアゲン製)を用いて精製した。精製したPCR産物をm2Fとした。
(a−3)(a−1)および(a−2)で得られた2種類のPCR産物(m2F、m2R)を混合し、表5に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を98℃で5分間熱処理後、98℃で10秒間の第1ステップ、55℃で5秒間の第2ステップ、72℃で1分間の第3ステップを1サイクルとする反応を5サイクル行なうPCRを行ない、m2Fとm2Rを連結したPCR産物m2pを得た。
(a−6)得られた形質転換体を50μg/mLのカナマイシンを添加したLB培地で培養した。回収した菌体(形質転換体)からプラスミドを抽出することで、野生型Fc結合性タンパク質に対して2箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、FcRn_m2をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドpET−FcRn_m2を得た。
(a−7)pET−FcRn_m2のヌクレオチド配列の解析を、実施例1(5)と同様の方法で行なった。
実施例4で明らかになったFc結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Cys174Arg、Asn181AspおよびArg295Leuを選択し、それらの置換を野生型のFc結合性タンパク質に集積したFcRn_m3を作製した。具体的には、FcRn_m2をコードするポリヌクレオチドに対してArg295Leuを生じさせる変異導入を行なうことにより、FcRn_m3を作製した。
(b−1)pET−FcRn_m2を鋳型として、また、プライマーとして配列番号8および配列番号18(5’−CACGACCAAGTTCGAGATGTTC−3’)に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた他は(a−1)と同様の方法でPCR産物m3Fを得た。
(b−2)pET−FcRn_m2を鋳型として、また、プライマーとして配列番号9および配列番号19(5’−GAACATCTCGAACTTGGTCGTG−3’)に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた他は(a−2)と同様の方法でPCR産物m3Rを得た。
(b−3)(b−1)および(b−2)により得られた2種類のPCR産物(m3F、m3R)を混合後、(a−3)と同様の方法にてPCRを行ない、m3Fとm3Rを連結した。得られたPCR産物をm3pとした。
(b−4)(b−3)で得られたPCR産物m3pを鋳型とし、配列番号8および配列番号9に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをPCRプライマーとして、(a−4)と同様の方法でPCRを行なった。これによりFcRn_m3をコードするポリヌクレオチドを作製した。
(b−5)(b−4)で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素NcoIとHindIIIで消化し、あらかじめ制限酵素NcoIとHindIIIで消化した発現ベクターpETMalE(特開2011−206046号公報)にライゲーションし、これを用いて大腸菌BL21(DE3)株を形質転換した。
(b−6)得られた形質転換体を50μg/mLのカナマイシンを添加したLB培地で培養した。回収した菌体(形質転換体)からプラスミドを抽出することで、野生型Fc結合性タンパク質に対して3箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、FcRn_m3をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドpET−FcRn_m3を得た。
(b−7)pET−FcRn_m3のヌクレオチド配列の解析を、実施例1(5)と同様の方法で行なった。
実施例4で明らかになったFc結合性タンパク質の安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Cys174Arg、Asn181Asp、Arg295LeuおよびGln335Leuを選択し、それらの置換を野生型のFc結合性タンパク質に集積したFcRn_m4を作製した。具体的には、(b)で作製したFcRn_m3をコードするポリヌクレオチドに対してGln335Leuを生じさせる変異導入を行なうことにより、FcRn_m4を作製した。
(c−1)(b)で作製した、pET−FcRn_m3を鋳型とし、配列番号8および配列番号22(5’−GCGCAGCAGGAGTTCTGGAGG−3’)に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをPCRプライマーとした他は、(a−1)と同様の方法でPCRを行なった。精製したPCR産物をm4Fとした。
(c−2)(b)で作製したpET−FcRn_m3を鋳型とし、配列番号9および配列番号23(5’−CCTCCAGAACTCCTGCTGCGC−3’)に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをPCRプライマーとした他は、(a−2)と同様の方法でPCRを行なった。精製したPCR産物をm4Rとした。
(c−3)(c−1)および(c−2)で得られた2種類のPCR産物(m4F、m4R)を混合後、(a−3)と同様の方法にてPCRを行ない、m4Fとm4Rを連結した。得られたPCR産物をm4pとした。
(c−4)(c−3)で得られたPCR産物m4pを鋳型とし、配列番号8および配列番号9に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをPCRプライマーとして、(a−4)と同様の方法でPCRを行なった。これによりFcRn_m4をコードするポリヌクレオチドを作製した。
(c−5)(c−4)で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素NcoIとHindIIIで消化し、あらかじめ制限酵素NcoIとHindIIIで消化した発現ベクターpETMalE(特開2011−206046号公報)にライゲーションし、これを用いて大腸菌BL21(DE3)株を形質転換した。
(c−6)得られた形質転換体を50μg/mLのカナマイシンを添加したLB培地で培養した。回収した菌体(形質転換体)からプラスミドを抽出することで、野生型Fc結合性タンパク質に対して4箇所アミノ酸置換したポリペプチドである、FcRn_m4をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドpET−FcRn_m4を得た。
(c−7)pET−FcRn_m4のヌクレオチド配列の解析を、実施例1(5)と同様の方法で行なった。
実施例5(c)で作製したFcRn_m4をコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンPCRによりランダムに変異導入を施した。
(1)鋳型として実施例5(c)で作製した発現ベクターpET−FcRn_m4を用いてエラープローンPCRを行なった。エラープローンPCRは、鋳型にpET−FcRn_m4を用いた以外は表2に示す組成と同様の反応液を調製後、当該反応液を95℃で2分間熱処理し、95℃で30秒間の第1ステップ、60℃で30秒間の第2ステップ、72℃で90秒間の第3ステップを1サイクルとする反応を35サイクル行ない、最後に72℃で7分間熱処理することで行なった。この反応によりFc結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに良好に変異が導入された。
(2)(1)で得られたPCR産物を精製後、制限酵素NcoIとHindIIIで消化し、あらかじめ同制限酵素で消化した発現ベクターpETMalE(特開2011−206046号公報)にライゲーションした。
(3)ライゲーション反応終了後、反応液をエレクトロポレーション法により大腸菌BL21(DE3)株に導入し、50μg/mLのカナマイシンを含むLBプレート培地で培養後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異ライブラリーとした。
(1)実施例6で作製したランダム変異ライブラリーを、熱処理を45℃、10分間の条件で実施した他は実施例4(1)から(5)に記載の方法と同様にスクリーニングを実施し、安定性の向上したFc結合性タンパク質をコードする発現ベクターを取得した。
(2)得られた発現ベクターに挿入されたFc結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を実施例1(5)に記載の方法によりヌクレオチド配列を解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
実施例7で判明した、Fc結合性タンパク質の熱安定性向上に関与するアミノ酸置換を集積することで、さらなる安定性向上を図った。置換アミノ酸の集積は、主にPCRを用いて行ない、以下の(a)から(b)に示す2種類のFc結合性タンパク質を作製した。
(a)FcRn_m5に対し、さらにAsn299Aspのアミノ酸置換を行なったFcRn_m6
(b)FcRn_m6に対し、さらにLys398Gluのアミノ酸置換を行なったFcRn_m7
以下、各Fc結合性タンパク質の作製方法を詳細に説明する。
実施例7で明らかとなった、熱安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Gly254AspおよびAsn299Aspを選択し、それらの置換をFcRn_m4(実施例5)に集積したFcRn_m6を作製した。具体的には、FcRn_m5をコードするポリヌクレオチドに対して、Asn299Aspを生じさせる変異導入を行なうことにより、FcRn_m6を作製した。
(a−1)実施例7で取得した、pET−FcRn_m5を鋳型としてPCRを実施した。当該PCRにおけるプライマーは、配列番号8および配列番号27(5’−CCTTCCATTCGAGGTCACCACGACCAAGTT−3’)に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。PCRは、表5に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を98℃で5分間熱処理し、98℃で10秒間の第1ステップ、55℃で5秒間の第2ステップ、72℃で1分間の第3ステップを1サイクルとする反応を30サイクル行ない、最後に72℃で5分間熱処理することで行なった。増幅したPCR産物をアガロースゲル電気泳動に供し、そのゲルからQIAquick Gel Extraction kit(キアゲン製)を用いて精製した。精製したPCR産物をm6Fとした。
(a−2)実施例7で取得した、pET−FcRn_m5を鋳型とし、配列番号28(5’−AACTTGGTCGTGGTGACCTCGAATGGAAGG−3’)および配列番号9に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをPCRプライマーとした他は、(a−1)と同様に行なった。精製したPCR産物をm6Rとした。
(a−3)(a−1)および(a−2)で得られた2種類のPCR産物(m6F、m6R)を混合し、表6に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を98℃で5分間熱処理後、98℃で10秒間の第1ステップ、55℃で5秒間の第2ステップ、72℃で1分間の第3ステップを1サイクルとする反応を5サイクル行なうPCRを行ない、m6Fとm6Rを連結したPCR産物m6pを得た。
(a−4)(a−3)で得られたPCR産物m6pを鋳型とし、配列番号8および配列番号9に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをPCRプライマーとしてPCRを行なった。PCRは、表7に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を98℃で5分間熱処理し、98℃で10秒間の第1ステップ、55℃で5秒間の第2ステップ、72℃で1分間の第3ステップを1サイクルとする反応を30サイクル行なった。これによりFcRn_m5に1箇所アミノ酸置換を導入したFcRn_m6をコードするポリヌクレオチドを作製した。
(a−5)(a−4)で得られたポリヌクレオチドを制限酵素NcoIとHindIIIで消化し、あらかじめ制限酵素NcoIとHindIIIで消化した発現ベクターpETMalE(特開2011−206046号公報)にライゲーションし、これを用いて大腸菌BL21(DE3)株を形質転換した。
(a−6)得られた形質転換体を50μg/mLのカナマイシンを添加したLB培地で培養した。回収した菌体(形質転換体)からプラスミドを抽出することで、FcRn_m5に対して1箇所(野生型Fc結合性タンパク質に対して6箇所)アミノ酸置換したポリペプチドである、FcRn_m6をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドpET−FcRn_m6を得た。
(a−7)pET−FcRn_m6のヌクレオチド配列の解析を、実施例1(5)と同様の方法で行なった。
実施例7で明らかとなった、熱安定性向上に関与するアミノ酸置換の中から、Gly254Asp、Asn299AspおよびLys398Gluを選択し、それらの置換をFcRn_m4(実施例5)に集積したFcRn_m7を作製した。具体的には、FcRn_m6をコードするポリヌクレオチドに対して、Lys398Gluを生じさせる変異導入を行なうことにより、FcRn_m7を作製した。
(b−1)(a)で作製した、pET−FcRn_m6を鋳型とし、配列番号8および配列番号31(5’−ATGAGAAGATTCGGCAGGGGATT−3’)に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをPCRプライマーとした他は、(a−1)と同様の方法でPCRを行なった。精製したPCR産物をm7Fとした。
(b−2)(a)で作製したpET−FcR8を鋳型とし、配列番号23および配列番号32(5’−AATCCCCTGCCGAATCTTCTCAT−3’)に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをPCRプライマーとした他は、(a−1)と同様の方法でPCRを行なった。精製したPCR産物をm7Rとした。
(b−3)(b−1)および(b−2)で得られた2種類のPCR産物(m7F、m7R)を混合後、(a−3)と同様の方法にてPCRを行ない、m7Fとm7Rを連結した。得られたPCR産物をm7pとした。
(b−4)(b−3)で得られたPCR産物m7pを鋳型とし、配列番号8および配列番号9に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをPCRプライマーとして、(a−4)と同様の方法でPCRを行なった。これによりFcRn_m7をコードするポリヌクレオチドを作製した。
(b−5)(b−4)で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素NcoIとHindIIIで消化し、あらかじめ制限酵素NcoIとHindIIIで消化した発現ベクターpETMalE(特開2011−206046号公報)にライゲーションし、これを用いて大腸菌BL21(DE3)株を形質転換した。
(b−6)得られた形質転換体を50μg/mLのカナマイシンを添加したLB培地で培養した。回収した菌体(形質転換体)からプラスミドを抽出することで、FcRn_m5に対して2箇所(野生型Fc結合性タンパク質に対して7箇所)アミノ酸置換したポリペプチドである、FcRn_m7をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドpET−FcRn_m7を得た。
(b−7)pET−FcRn_m7のヌクレオチド配列の解析を、実施例1(5)と同様の方法で行なった。
実施例8(b)で作製したFcRn_m7をコードするポリヌクレオチド部分に、エラープローンPCRによりランダムに変異導入を施した。
(1)鋳型として実施例8(b)で作製した発現ベクターpET−FcRn_m7を用いてエラープローンPCRを行なった。エラープローンPCRは、鋳型にpET−FcRn_m7を用いた以外は表2に示す組成と同様の反応液を調製後、当該反応液を95℃で2分間熱処理し、95℃で30秒間の第1ステップ、60℃で30秒間の第2ステップ、72℃で90秒間の第3ステップを1サイクルとする反応を35サイクル行ない、最後に72℃で7分間熱処理することで行なった。この反応によりFc結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに良好に変異が導入された。
(2)(1)で得られたPCR産物を精製後、制限酵素NcoIとHindIIIで消化し、あらかじめ同制限酵素で消化した発現ベクターpETMalE(特開2011−206046号公報)にライゲーションした。
(3)ライゲーション反応終了後、反応液をエレクトロポレーション法により大腸菌BL21(DE3)株に導入し、50μg/mLのカナマイシンを含むLBプレート培地で培養後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異ライブラリーとした。
(1)実施例9で作製したランダム変異ライブラリーを、熱処理を52℃、30分間の条件で実施した他は実施例4(1)から(5)に記載の方法と同様にスクリーニングを実施し、安定性の向上したFc結合性タンパク質をコードする発現ベクターを取得した。
(2)得られた発現ベクターに挿入されたFc結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を実施例1(5)に記載の方法によりヌクレオチド配列を解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。
(1)野生型FcRn(配列番号3)、FcRn_m4(配列番号5)、FcRn_m7(配列番号6)およびFcRn_m8(配列番号7)を発現する形質転換体を、それぞれ50μg/mLのカナマイシンを含む3mLの2YT液体培地に接種し、37℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
(2)50μg/mLのカナマイシンを添加した20mLの2YT液体培地(ペプトン16g/L、酵母エキス10g/L、塩化ナトリウム5g/L)に前培養液を200μL接種し、37℃で好気的に振とう培養を行なった。
(3)培養開始1.5時間後、培養温度を20℃に変更して30分間振とう培養した。その後、終濃度0.01mMとなるようIPTGを添加し、引き続き20℃で一晩、好気的に振とう培養した。
(4)培養終了後、遠心分離により集菌し、BugBuster Protein extraction kit(タカラバイオ製)を用いてタンパク質抽出液を調製した。
(5)(4)で調製したタンパク質抽出液中の野生型FcRn、FcRn_m4、FcRn_m7およびFcRn_m8の抗体結合活性を、実施例2(5)に記載のELISA法を用いて測定した。この時、市販のFcRnおよびβ2ミクログロブリンのヘテロダイマー(コスモバイオ製:CI01)を用いて検量線を作製し、濃度測定を行なった。
(6)各Fc結合性タンパク質の濃度が30μg/mLになるよう純水で希釈後、前記希釈した溶液100μLと0.1Mのグリシン塩酸緩衝液(pH3.0)200μLとを混合し、30℃で15分間静置した。
(7)グリシン塩酸緩衝液(pH3.0)による酸処理を行なった後のタンパク質の抗体結合活性と、前記酸処理を行なわなかったときのタンパク質の抗体結合活性を、実施例2(5)に記載のELISA法によって測定した。その後、酸処理を行なった場合の抗体結合活性を、酸処理を行なわなかったときの抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。
(1)実施例8(b)で作製したpET−FcRn_m7を鋳型としてPCRを実施した。当該PCRにおけるプライマーは、配列番号8および配列番号35(5’−CCCAAGCTTATCCGCAGGTATCGTTGCGGCACCCAGAAGATTCGGCAGGGGATTCGAGC−3’)に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。PCRは、表4に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を98℃で5分熱処理し、98℃で10秒間の第1ステップ、55℃で5秒間の第2ステップ、72℃で1分間の第3ステップを1サイクルとする反応を30サイクル繰り返すことで実施した。
(2)(1)で得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素NcoIとHindIIIで消化後、あらかじめ制限酵素NcoIとHindIIIで消化した発現ベクターpETMalE(特開2011−206046号公報)にライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌BL21(DE3)株を形質転換した。
(3)得られた形質転換体を50μg/mLのカナマイシンを含むLB培地にて培養後、QIAprep Spin Miniprep kit(キアゲン製)を用いて、発現ベクターpET−FcRn_m7Cysを抽出した。
(4)pET−FcRn_m7Cysのヌクレオチド配列の解析を、実施例1(5)と同様の方法で行なった。発現ベクターpET−FcRn_m7Cysで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号36に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号37にそれぞれ示す。
(1)実施例12で作製したFcRn_m7Cysを発現する形質転換体を2Lのバッフルフラスコに入った50μg/mLのカナマイシンを含む400mLの2YT液体培地(ペプトン16g/L、酵母エキス10g/L、塩化ナトリウム5g/L)に接種し、37℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
(2)グルコース10g/L、酵母エキス20g/L、リン酸三ナトリウム十二水和物3g/L、リン酸水素二ナトリウム十二水和物9g/L、塩化アンモニウム1g/Lおよび硫酸カナマイシン50mg/Lを含む液体培地1.8Lに、(1)の培養液180mLを接種し、3L発酵槽(バイオット製)を用いて本培養を行なった。温度30℃、pH6.9から7.1、通気量1VVM、溶存酸素濃度30%飽和濃度の条件に設定し、本培養を開始した。pHの制御には酸として50%(w/v)リン酸、アルカリとして14%(w/v)アンモニア水をそれぞれ使用し、溶存酸素の制御は撹拌速度を変化させることで制御し、撹拌回転数は下限500rpm、上限1000rpmに設定した。培養開始後、グルコース濃度が測定できなくなった時点で、流加培地(グルコース248.9g/L、酵母エキス83.3g/L、硫酸マグネシウム七水和物7.2g/L)を溶存酸素(DO)により制御しながら加えた。
(3)菌体量の目安として600nmの吸光度(OD600nm)が約150に達したところで培養温度を25℃に下げ、設定温度に到達したことを確認した後、終濃度が0.5mMになるようIPTGを添加し、引き続き25℃で培養を継続した。
(4)培養開始から約48時間後に培養を停止し、培養液を4℃で8000rpm、20分間の遠心分離により菌体を回収した。
(5)回収した菌体を20mMのトリス塩酸緩衝液(pH7.0)に5mL/1g(菌体)となるように懸濁し、超音波発生装置(インソネーター201M(商品名)、久保田商事製)を用いて、4℃で約10分間、約150Wの出力で菌体を破砕した。菌体破砕液は4℃で20分間、8000rpmの遠心分離を2回行ない、上清を回収した。
(6)(5)で得られた上清を、あらかじめ150mMの塩化ナトリウムを含む20mMのトリス塩酸緩衝液(pH7.4)で平衡化したIgGセファロース(GEヘルスケア製)90mLを充填したXK26/20カラムカラム(GEヘルスケア製)にアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、0.1Mのグリシン塩酸緩衝液(pH3.0)で溶出した。なお溶出液は、溶出液量の1/4量の1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.0)を加えることでpHを中性付近に戻した。
(1)2mLの分離剤用親水性ビニルポリマー(東ソー製:トヨパール)の表面の水酸基をヨードアセチル基で活性化後、実施例13で調製したFcRn_m7Cysを4mg反応させることにより、FcRn_m7Cys固定化ゲルを得た。
(2)(1)で調製したFcRn_m7Cys固定化ゲル0.5mLをφ4.6mm×75mmのステンレスカラムに充填した。
(3)FcRn_m7Cys固定化ゲルを充填したカラムをHPLC装置に接続し、150mMの塩化ナトリウムを含む50mMのリン酸緩衝液(pH5.8)で平衡化した。
(4)150mMの塩化ナトリウムを含む50mMのリン酸緩衝液(pH5.8)で0.5mg/mLに希釈したモノクローナル抗体(リツキシマブ:全薬工業製リツキサン、トラスツズマブおよびベバシズマブ)を流速0.6mL/minにて0.01mLアプライした。
(5)流速0.6mL/minのまま150mMの塩化ナトリウムを含む50mMのリン酸緩衝液(pH5.8)の平衡化緩衝液で10分洗浄後、150mMの塩化ナトリウムを含む50mMのリン酸緩衝液(pH8.0)によるpHグラジエント溶出(30分で150mMの塩化ナトリウムを含む50mMのリン酸緩衝液(pH8.0)が100%となるグラジエント)で吸着したモノクローナル抗体を溶出した。
Claims (16)
- 配列番号3に記載のアミノ酸配列のうち34番目のイソロイシンから431番目のセリンまでのアミノ酸残基を含み、ただし、以下のアミノ酸置換のうちいずれか1つのアミノ酸置換を有するFc結合性タンパク質:
(37)配列番号3の24番目のフェニルアラニンがイソロイシンまたはチロシンに置換される変異、
(41)配列番号3の114番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
(42)配列番号3の117番目のグリシンがセリンに置換される変異、
(43)配列番号3の123番目のグリシンがセリンまたはアスパラギン酸に置換される変異、
(3)配列番号3の174番目のシステインがアルギニンに置換される変異、
(4)配列番号3の181番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
(6)配列番号3の183番目のバリンがアスパラギン酸に置換される変異、
(7)配列番号3の199番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
(9)配列番号3の228番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
(12)配列番号3の275番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
(14)配列番号3の283番目のフェニルアラニンがチロシンに置換される変異、
(15)配列番号3の295番目のアルギニンがロイシンに置換される変異、
(18)配列番号3の309番目のアルギニンがシステインに置換される変異、
(20)配列番号3の322番目のロイシンがヒスチジンに置換される変異、
(21)配列番号3の323番目のスレオニンがアラニンに置換される変異、
(22)配列番号3の329番目のフェニルアラニンがセリンに置換される変異、
(23)配列番号3の335番目のグルタミンがロイシンに置換される変異、
(28)配列番号3の365番目のセリンがシステインに置換される変異、
(29)配列番号3の366番目のロイシンがプロリンに置換される変異、
(32)配列番号3の376番目のチロシンがヒスチジンに置換される変異、
(33)配列番号3の385番目のロイシンがヒスチジンに置換される変異、
(34)配列番号3の389番目のロイシンがヒスチジンに置換される変異。 - 配列番号5に記載のアミノ酸配列のうち34番目のイソロイシンから431番目のセリンまでのアミノ酸残基を含み、ただし、以下のアミノ酸置換のうちいずれか1つのアミノ酸置換を有するFc結合性タンパク質:
(36)配列番号5の14番目のアルギニンがヒスチジンに置換される変異、
(38)配列番号5の50番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
(39)配列番号5の69番目のチロシンがヒスチジンに置換される変異、
(40)配列番号5の107番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
(44)配列番号5の125番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
(45)配列番号5の126番目のセリンがアスパラギンに置換される変異、
(2)配列番号5の165番目のアスパラギンがスレオニンに置換される変異、
(5)配列番号5の182番目のグルタミンがヒスチジンに置換される変異、
(8)配列番号5の206番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
(10)配列番号5の230番目のセリンがプロリンに置換される変異、
(11)配列番号5の254番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
(13)配列番号5の276番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異、
(16)配列番号5の296番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異、
(17)配列番号5の299番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
(24)配列番号5の336番目のロイシンがプロリンに置換される変異、
(25)配列番号5の358番目のグリシンがセリンに置換される変異、
(27)配列番号5の364番目のセリンがプロリンに置換される変異、
(30)配列番号5の369番目のリジンがグルタミン酸またはアルギニンに置換される変異、
(31)配列番号5の370番目のセリンがプロリンに置換される変異、
(35)配列番号5の398番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異。 - 配列番号6に記載のアミノ酸配列のうち34番目のイソロイシンから431番目のセリンまでのアミノ酸残基を含み、ただし、以下のアミノ酸置換のうちいずれか1つのアミノ酸置換を有するFc結合性タンパク質:
(1)配列番号6の152番目のバリンがアラニンに置換される変異、
(12)配列番号6の275番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
(19)配列番号6の313番目のアルギニンがシステインに置換される変異、
(26)配列番号6の359番目のセリンがプロリンに置換される変異。 - 配列番号3に記載のアミノ酸配列のうち34番目のイソロイシンから431番目のセリンまでのアミノ酸残基を含み、ただし、以下に示す4つのアミノ酸置換を有するFc結合性タンパク質:
(3)配列番号3の174番目のシステインがアルギニンに置換される変異、
(4)配列番号3の181番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異、
(15)配列番号3の295番目のアルギニンがロイシンに置換される変異、
(23)配列番号3の335番目のグルタミンがロイシンに置換される変異。 - 以下の変異をさらに有する、請求項4に記載のFc結合性タンパク質:
(11)配列番号3の254番目のグリシンがアスパラギン酸に置換される変異。 - 以下の変異をさらに有する、請求項5に記載のFc結合性タンパク質:
(17)配列番号3の299番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換される変異。 - 以下の変異をさらに有する、請求項6に記載のFc結合性タンパク質:
(35)配列番号3の398番目のリジンがグルタミン酸に置換される変異。 - 以下の変異をさらに有する、請求項7に記載のFc結合性タンパク質:
(1)配列番号3の152番目のバリンがアラニンに置換される変異。 - 配列番号5から7のいずれかの配列からなるアミノ酸残基を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載のFc結合性タンパク質。
- 請求項1から9のいずれか一項に記載のFc結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項10に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項11に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
- 宿主が大腸菌である、請求項12に記載の形質転換体。
- (A)請求項12または13に記載の形質転換体を培養することによりFc結合性タンパク質を発現させる工程、および
(B)発現されたFc結合性タンパク質を培養物から回収する工程、
を含む、Fc結合性タンパク質の製造方法。 - 請求項1から9のいずれか一項に記載のFc結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる吸着剤。
- 請求項15に記載の吸着剤に、抗体を含む溶液を接触させる工程を含む、抗体の分離方法。
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