JP7435939B2 - 高生産性Fc結合性タンパク質、およびその製造方法 - Google Patents
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Description
<1>
配列番号1に記載のアミノ酸配列の34番目から431番目までのアミノ酸残基において少なくとも以下の(A)から(F)のうち1以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Fc結合性タンパク質:
(A)配列番号1の214番目のバリンがアスパラギン酸に置換、
(B)配列番号1の230番目のリジンがグルタミン酸に置換、
(C)配列番号1の242番目のリジンがグルタミン酸に置換、
(D)配列番号1の400番目のリジンがグルタミン酸に置換、
(E)配列番号1の306番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換、
(F)配列番号1の315番目のセリンがスレオニンに置換。
以下の(1)~(3)の何れかに記載のタンパク質である、Fc結合性タンパク質:
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列の34番目から431番目までのアミノ酸残基において、前記1以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Fc結合性タンパク質;
(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列の34番目から431番目までのアミノ酸残基において、前記1以上のアミノ酸置換を有し、さらに前記少なくとも1つのアミノ酸置換の位置以外の1若しくは数個の位置での1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか1つ以上を有するアミノ酸配列を含む、Fc結合性タンパク質;
(3)配列番号1に記載のアミノ酸配列の34番目から431番目までのアミノ酸残基において、前記1以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列全体に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記1以上のアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含む、Fc結合性タンパク質。
配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち34番目から431番目までのアミノ酸残基において前記(A)から(D)のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、<1>または<2>に記載のFc結合性タンパク質。
さらに前記(E)および/または(F)のアミノ酸置換を有する、<1>~<3>のいずれかに記載のFc結合性タンパク質。
配列番号2、配列番号3、配列番号4および配列番号5のうちいずれか1つに記載のアミノ酸配列における34番目から431番目までのアミノ酸残基を含む、<1>~<4>のいずれかに記載のFc結合性タンパク質。
配列番号2、配列番号3、配列番号4および配列番号5のうちいずれか1つに記載のアミノ酸配列からなる、請求項1~5のいずれかに記載のFc結合性タンパク質。
<1>~<6>のいずれかに記載のFc結合性タンパク質をコードするDNA。
<7>に記載のDNAを含む発現ベクター。
<8>に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
宿主が大腸菌(Escherichia coli)である、<9>に記載の形質転換体。
<9>または<10>に記載の形質転換体を培養することにより<1>~<6>のいずれかに記載のFc結合性タンパク質を生産する工程、および第1工程で生産されたFc結合性タンパク質を回収する工程、の2つの工程を含む、Fc結合性タンパク質の製造方法。
配列番号1に記載のアミノ酸配列の34番目から431番目までのアミノ酸残基において少なくとも以下の(A)から(F)のうち1以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸残基を含む、Fc結合性タンパク質:
(A)配列番号1の214番目のバリンがアスパラギン酸に置換、
(B)配列番号1の230番目のリジンがグルタミン酸に置換、
(C)配列番号1の242番目のリジンがグルタミン酸に置換、
(D)配列番号1の400番目のリジンがグルタミン酸に置換、
(E)配列番号1の306番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換、
(F)配列番号1の315番目のセリンがスレオニンに置換。
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列の34番目から431番目までのアミノ酸残基において、前記1以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Fc結合性タンパク質。
(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列の34番目から431番目までのアミノ酸残基において、前記1以上のアミノ酸置換を有し、さらに前記少なくとも1つのアミノ酸置換の位置以外の1若しくは数個の位置での1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか1つ以上を有するアミノ酸配列を含む、Fc結合性タンパク質。
(3)配列番号1に記載のアミノ酸配列の34番目から431番目までのアミノ酸残基において、前記1以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列全体に対して80%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記1以上のアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含む、Fc結合性タンパク質。
(a)配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち34番目から431番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該34番目から431番目までのアミノ酸配列において置換(A)、置換(B)、置換(C)および置換(D)に記載のアミノ酸置換が生じているFc結合性タンパク質(配列番号2に記載のアミノ酸配列のうち34番目から431番目までのアミノ酸配列を含むFc結合性タンパク質)、
(b)配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち34番目から431番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該34番目から431番目までのアミノ酸配列において置換(A)、置換(B)、置換(C)、置換(D)および置換(E)に記載のアミノ酸置換が生じているFc結合性タンパク質(配列番号3に記載のアミノ酸配列のうち34番目から431番目までのアミノ酸配列を含むFc結合性タンパク質)、
(c)配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち34番目から431番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該34番目から431番目までのアミノ酸配列において置換(A)、置換(B)、置換(C)、置換(D)および置換(F)に記載のアミノ酸置換が生じているFc結合性タンパク質(配列番号4に記載のアミノ酸配列のうち34番目から431番目までのアミノ酸配列を含むFc結合性タンパク質)、および
(d)配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち34番目から431番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該34番目から431番目までのアミノ酸配列において置換(A)、置換(B)、置換(C)、置換(D)、置換(E)および置換(F)に記載のアミノ酸置換が生じているFc結合性タンパク質(配列番号5に記載のアミノ酸配列のうち34番目から431番目までのアミノ酸配列を含むFc結合性タンパク質)、
が挙げられる。
(e)配列番号2のアミノ酸配列からなるFc結合性タンパク質、
(f)配列番号3のアミノ酸配列からなるFc結合性タンパク質、
(g)配列番号4のアミノ酸配列からなるFc結合性タンパク質、
(h)配列番号5のアミノ酸配列からなるFc結合性タンパク質、
が挙げられる。
(1)Fc結合性タンパク質FcRn_m7の製造
特開2018-183087号公報では、Fc結合性タンパク質FcRn_m7が開示されている。Fc結合性タンパク質FcRn_m7のアミノ酸配列を配列番号1に示す。
(1-1)発現ベクターpET-FcRn_m7の作製
特開2018-183087号公報で開示されている発現ベクターpET-FcRn_m7を、当該公報に記載された方法で作製した。この発現ベクターpET-FcRn_m7を用いて大腸菌BL21(DE3)を形質転換し、組換え大腸菌BL21(DE3)/pET-FcRn_m7を得た。
(1-2)Fc結合性タンパク質FcRn_m7の製造
前記の組換え大腸菌BL21(DE3)/pET-FcRn_m7を30μg/mLのカナマイシンを添加したLB培地(10g/L tryptone,5g/L Yeast extractおよび5g/L NaCl)に接種し、37℃で一晩振盪することで前培養を行った。前培養液をそれぞれ30μg/mLのカナマイシンを添加した150mLのTB培地(24g/L Yeast extract、12g/L tryptone、9.4g/L K2HPO4、2.2g/L KH2PO4および4mL/L Glycerol)に接種し、37℃で振盪培養した。培養液の濁度(O.D.600)が凡そ0.6になったところで、培養温度を20℃に切り替え、終濃度0.05mMのIPTGを添加し約18時間振盪培養した。遠心操作により培養液から得られた菌体から、BugBuster Protein extraction kit(メルク製)を用いて可溶性タンパク質抽出液を回収した。可溶性タンパク質抽出液からのFc結合性タンパク質FcRn_m7の精製は、His・Bind Resin(メルク製)を用いたニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーにより行った。精製済みのFc結合性タンパク質FcRn_m7が高純度であることをSDS-PAGEにより確認した。精製済みのFc結合性タンパク質FcRn_m7のタンパク質濃度はMicro BCA Protein Assay Kit(サーモフィッシャーサイエンティフィック製)を用いて定量した。
(2)Fc結合性タンパク質FcRn_m7の生産性評価
Fc結合性タンパク質FcRn_m7の生産性評価として、培養液1Lあたりの発現タンパク質量(発現量)を評価した。
Fc結合性タンパク質FcRn_m7のヒト抗体に対する結合親和性評価を表面プラズモン共鳴法により行った。具体的には、Biacore T100(T200 Sensitivity Enhanced)機器(GEヘルスケア製)を用い、アナライトをヒト抗体製剤(人免疫グロブリン グロブリン筋注、日本薬局方製)、固相をFc結合性タンパク質FcRn_m7としてカイネティクス解析を行った。センサーチップはニトリロ三酢酸(NTA)をコートしたセンサーチップ(Sensor Chip NTA、GEヘルスケア製)を使用し、NTAにニッケルを固定した後、精製済みのFc結合性タンパク質FcRn_m7をセンサーチップに固定した(Fc結合性タンパク質FcRn_m7のC末端側のポリヒスチジンとニッケルの結合を利用)。抗体結合性の測定にはpH6.0緩衝液(67mM リン酸緩衝液、150mM 塩化ナトリウム、0.05% Tween20)を用い、カイネティクス解析はシングルサイクルカイネティクス法により行った。測定条件は表2に示す。解析はBiacore T100(T200 Sensitivity Enhanced)機器に付属の解析ソフト(Biacore T200 Evaluation Software)を用いて行い、アナライト濃度(C)に対する平衡値(Req)のプロットから解離定数(KD)の値を算出した。解離定数(KD)の値は小さいほど結合親和性が高いことを示す。
(4-1)サンプル調製
比較例1の(1)で製造した精製済みのFc結合性タンパク質FcRn_m7の溶媒を、Amicon Ultra遠心式フィルター(メルク製)を使用してD-PBS(-)緩衝液に置換し、タンパク質濃度を定量した(紫外線吸収法;A280=1.0を1.0mg/mLとした)。
(4-2)熱安定性評価
熱安定性の評価はリアルタイムPCR装置QuantStudio3(サーモフィッシャーサイエンティフィック製)を使用してThermal shift Assay法により行った。タンパク質濃度は0.25から0.5mg/mLの範囲、蛍光色素はSYPRO Orange[終濃度0.5%(v/v)]、昇温温度は30℃から85℃、昇温速度は0.025℃/sの測定条件とした。変性中点の算出にはQuantStudio Design&Analysis Software ver.1.2(サーモフィッシャーサイエンティフィック製)を使用した。
(1)Fc結合性タンパク質へのランダム変異導入とランダム変異体ライブリーの作製
比較例1の(1-1)に記載の発現ベクターpET-FcRn_m7を鋳型として、配列番号12および配列番号13からなる各オリゴヌクレオチドをPCRプライマーとしてエラープローンPCRを行なった。エラープローンPCRは、特開2018-50616号公報で開示されている方法で実施した。得られたPCR産物をm7-EPとした。PCR産物m7-EPは、制限酵素NcoIおよびHindIIIで消化し、あらかじめ同制限酵素で消化した特開2018-183087号公報で開示されている発現ベクターpETMalEとライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いて大腸菌BL21(DE3)を形質転換し、30μg/mLのカナマイシンを添加したLB寒天培地(10g/L tryptone,5g/L Yeast extract,5g/L NaCl,15g/L Agar)で培養(37℃で約18時間)後、LB寒天培地上に形成されたコロニーをランダム変異体ライブリー(形質転換体)とした。
(2)Fc結合性タンパク質候補のスクリーニング
(2-1)発現培養
前記(1)のランダム変異体ライブリー(形質転換体)および比較例1の(1-1)に記載の組換え大腸菌BL21(DE3)/pET-FcRn_m7(比較対照として)をそれぞれ30μg/mLのカナマイシンを添加したLB培地400μLに接種し、96穴ディープウェルプレートを用いて、37℃で一晩振盪することで前培養を行った。各前培養液15μLは30μg/mLのカナマイシンを添加したTB培地500μLに接種し、96穴ディープウェルプレートを用いて、37℃で振盪培養した。2時間後に培養温度を20℃に切り替え、終濃度0.05mMのIPTGおよび0.3%(w/v)のグリシンをそれぞれ添加後、約18時間振盪培養した。各培養液に対して遠心操作を行い、発現した組換えタンパク質を含む培養上清を得た。この培養上清サンプルに対して加熱処理(46℃で10分間)を行い、評価サンプルとした。
(2-2)抗体結合性評価を指標としたスクリーニング
抗体結合性評価として以下のELISA法を実施した。
(3)Fc結合性タンパク質候補
前記(2)のスクリーニングの結果、以下のFc結合性タンパク質を発現可能な形質転換体を取得した。
(3-1)Fc結合性タンパク質FcRn_m8a
Fc結合性タンパク質FcRn_m8a(アミノ酸配列:配列番号14)をコードする塩基配列(配列番号15)を含む発現ベクターpET-FcRn_m8a、およびそれを含有する形質転換体である組換え大腸菌BL21(DE3)/FcRn_m8aを取得した。
(3-2)Fc結合性タンパク質FcRn_m8b
Fc結合性タンパク質FcRn_m8b(アミノ酸配列:配列番号16)をコードする塩基配列(配列番号17)を含む発現ベクターpET-FcRn_m8b、およびそれを含有する形質転換体である組換え大腸菌BL21(DE3)/FcRn_m8bを取得した。
(3-3)Fc結合性タンパク質FcRn_m11
Fc結合性タンパク質FcRn_m11(アミノ酸配列:配列番号2)をコードする塩基配列(配列番号8)を含む発現ベクターpET-FcRn_m11、およびそれを含有する形質転換体である組換え大腸菌BL21(DE3)/FcRn_m11を取得した。
実施例1の(3-1)に記載のFc結合性タンパク質FcRn_m8aのアミノ酸配列(配列番号14)は、配列番号1のアミノ酸配列に対して前記の置換(E)(配列番号1の306番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換)が生じたアミノ酸配列である。
(1)Fc結合性タンパク質FcRn_m8aの製造
製造は、実施例1の(3-1)に記載の組換え大腸菌BL21(DE3)/FcRn_m8aを使用して比較例1の(1-2)と同様の方法で行った。
(2)Fc結合性タンパク質FcRn_m8aの生産性評価
生産性評価は、実施例1の(3-1)に記載の組換え大腸菌BL21(DE3)/FcRn_m8aを使用して比較例1の(2)と同様の方法で行った。比較例1の(1)で作製した精製済みのFc結合性タンパク質FcRn_m7を濃度の標準として使用した。その結果、Fc結合性タンパク質FcRn_m8aの発現量は50mg/Lであった。
(3)Fc結合性タンパク質FcRn_m8aの抗体に対する結合親和性評価
抗体に対する結合親和性評価は、精製済みのFc結合性タンパク質FcRn_m8aを用いて、比較例1の(3)と同様の方法で行った。その結果、Fc結合性タンパク質FcRn_m8aのヒト抗体に対する解離定数(KD)の値は17±4μM(n=4)であった。この値は、比較例1に記載のFc結合性タンパク質FcRn_m7のヒト抗体に対する解離定数(KD)の値(10±4μM)に近く、抗体に対する結合親和性が維持されていることが判明した。
実施例1の(3-2)に記載のFc結合性タンパク質FcRn_m8bのアミノ酸配列(配列番号16)は、配列番号1のアミノ酸配列に対して前記の置換(F)(配列番号1の315番目のセリンがスレオニンに置換)が生じたアミノ酸配列である。
(1)Fc結合性タンパク質FcRn_m8bの製造
製造は、実施例1の(3-2)に記載の組換え大腸菌BL21(DE3)/FcRn_m8bを使用して比較例1の(1-2)と同様の方法で行った。
(2)Fc結合性タンパク質FcRn_m8bの生産性評価
生産性評価は、実施例1の(3-2)に記載の組換え大腸菌BL21(DE3)/FcRn_m8bを使用して比較例1の(2)と同様の方法で行った。比較例1の(1)で作製した精製済みのFc結合性タンパク質FcRn_m7を濃度の標準として使用した。その結果、Fc結合性タンパク質FcRn_m8bの発現量は38mg/Lであった。
(3)Fc結合性タンパク質FcRn_m8bの抗体に対する結合親和性評価
抗体に対する結合親和性評価は、精製済みのFc結合性タンパク質FcRn_m8bを用いて、比較例1の(3)と同様の方法で行った。その結果、Fc結合性タンパク質FcRn_m8bのヒト抗体に対する解離定数(KD)の値は16±6μM(n=4)であった。この値は、比較例1に記載のFc結合性タンパク質FcRn_m7のヒト抗体に対する解離定数(KD)の値(10±4μM)に近く、抗体に対する結合親和性が維持されていることが判明した。
実施例1の(3-3)に記載のFc結合性タンパク質FcRn_m11のアミノ酸配列(配列番号2)は、配列番号1のアミノ酸配列に対して前記の置換(A)(配列番号1の214番目のバリンがアスパラギン酸に置換)、置換(B)(配列番号1の230番目のリジンがグルタミン酸に置換)、置換(C)(配列番号1の242番目のリジンがグルタミン酸に置換)および置換(D)(配列番号1の400番目のリジンがグルタミン酸に置換)が生じたアミノ酸配列である。
(1)Fc結合性タンパク質FcRn_m11の製造
製造は、実施例1の(3-3)に記載の組換え大腸菌BL21(DE3)/FcRn_m11を使用して比較例1の(1-2)と同様の方法で行った。
(2)Fc結合性タンパク質FcRn_m11の生産性評価
生産性評価は、実施例1の(3-3)に記載の組換え大腸菌BL21(DE3)/FcRn_m11を使用して比較例1の(2)と同様の方法で行った。比較例1の(1)で作製した精製済みのFc結合性タンパク質FcRn_m7を濃度の標準として使用した。その結果、Fc結合性タンパク質FcRn_m11の発現量は69mg/Lであり、比較例1に記載のFc結合性タンパク質FcRn_m7の発現量(45mg/L)より高く、前記の置換(A)、置換(B)、置換(C)および置換(D)を有することで生産性が向上した(表1)。
(3)Fc結合性タンパク質FcRn_m11の抗体に対する結合親和性評価
抗体に対する結合親和性評価は、精製済みのFc結合性タンパク質FcRn_m11を用いて、比較例1の(3)と同様の方法で行った。その結果、Fc結合性タンパク質FcRn_m11のヒト抗体に対する解離定数(KD)の値は8±3μM(n=3)であった。この値は、比較例1に記載のFc結合性タンパク質FcRn_m7のヒト抗体に対する解離定数(KD)の値(10±4μM)に近く、抗体に対する結合親和性が維持されていることが判明した。
実施例3 Fc結合性タンパク質FcRn_m12aの製造と評価
Fc結合性タンパク質FcRn_m12aのアミノ酸配列を配列番号3に示す。なお、配列番号3において、その1番目のメチオニンから431番目のセリンまでは、配列番号1の1番目のメチオニンから431番目のセリンに相当するアミノ酸配列に対して前記の置換(A)(配列番号1の214番目のバリンがアスパラギン酸に置換)、置換(B)(配列番号1の230番目のリジンがグルタミン酸に置換)、置換(C)(配列番号1の242番目のリジンがグルタミン酸に置換)および置換(D)(配列番号1の400番目のリジンがグルタミン酸に置換)および置換(E)(配列番号1の306番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換)が生じたアミノ酸配列に相当する。配列番号3において、その432番目のロイシンから439番目のヒスチジンまではポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドである。
(1)Fc結合性タンパク質FcRn_m12aの製造
Fc結合性タンパク質FcRn_m12aをコードする塩基配列(配列番号9)を含む発現ベクターpET-FcRn_m12aおよびそれを有する形質転換体の組換え大腸菌BL21(DE3)/pET-FcRn_m12aの作製は、下記の方法で行った。
(2)Fc結合性タンパク質FcRn_m12aの生産性評価
生産性評価は、前記の組換え大腸菌BL21(DE3)/pET-FcRn_m12aを使用して比較例1の(2)と同様の方法で行った。比較例1の(1)で作製した精製済みのFc結合性タンパク質FcRn_m7を濃度の標準として使用した。その結果、Fc結合性タンパク質FcRn_m12aの発現量は125mg/Lであり、比較例1に記載のFc結合性タンパク質FcRn_m7の発現量(45mg/L)より高く、前記の置換(A)、置換(B)、置換(C)、置換(D)および置換(E)を有することで生産性が向上した(表1)。
(3)Fc結合性タンパク質FcRn_m12aの抗体に対する結合親和性評価
抗体に対する結合親和性評価は、精製済みのFc結合性タンパク質FcRn_m12aを用いて、比較例1の(3)と同様の方法で行った。その結果、Fc結合性タンパク質FcRn_m12aのヒト抗体に対する解離定数(KD)の値は18±11μM(n=3)であった。この値は、比較例1に記載のFc結合性タンパク質FcRn_m7のヒト抗体に対する解離定数(KD)の値(10±4μM)に近く、抗体に対する結合親和性が維持されていることが判明した。
実施例4 Fc結合性タンパク質FcRn_m12bの製造と評価
Fc結合性タンパク質FcRn_m12bのアミノ酸配列を配列番号4に示す。なお、配列番号4において、その1番目のメチオニンから431番目のセリンまでは、配列番号1の1番目のメチオニンから431番目のセリンに相当するアミノ酸配列に対して前記の置換(A)(配列番号1の214番目のバリンがアスパラギン酸に置換)、置換(B)(配列番号1の230番目のリジンがグルタミン酸に置換)、置換(C)(配列番号1の242番目のリジンがグルタミン酸に置換)および置換(D)(配列番号1の400番目のリジンがグルタミン酸に置換)および置換(F)(配列番号1の315番目のセリンがスレオニンに置換)が生じたアミノ酸配列に相当する。配列番号4において、その432番目のロイシンから439番目のヒスチジンまではポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドである。
(1)Fc結合性タンパク質FcRn_m12bの製造
Fc結合性タンパク質FcRn_m12bをコードする塩基配列(配列番号10)を含む発現ベクターpET-FcRn_m12bおよびそれを有する形質転換体の組換え大腸菌BL21(DE3)/pET-FcRn_m12bの作製は、下記の方法で行った。
(2)Fc結合性タンパク質FcRn_m12bの生産性評価
生産性評価は、前記の組換え大腸菌BL21(DE3)/pET-FcRn_m12bを使用して比較例1の(2)と同様の方法で行った。比較例1の(1)で作製した精製済みのFc結合性タンパク質FcRn_m7を濃度の標準として使用した。その結果、Fc結合性タンパク質FcRn_m12bの発現量は159mg/Lであり、比較例1に記載のFc結合性タンパク質FcRn_m7の発現量(45mg/L)より高く、前記の置換(A)、置換(B)、置換(C)、置換(D)および置換(F)を有することで生産性が向上した(表1)。
(3)Fc結合性タンパク質FcRn_m12bの抗体に対する結合親和性評価
抗体に対する結合親和性評価は、精製済みのFc結合性タンパク質FcRn_m12bを用いて、比較例1の(3)と同様の方法で行った。その結果、Fc結合性タンパク質FcRn_m12bのヒト抗体に対する解離定数(KD)の値は15±8μM(n=3)であった。この値は、比較例1に記載のFc結合性タンパク質FcRn_m7のヒト抗体に対する解離定数(KD)の値(10±4μM)に近く、抗体に対する結合親和性が維持されていることが判明した。
Fc結合性タンパク質FcRn_m13のアミノ酸配列を配列番号5に示す。なお、配列番号5において、その1番目のメチオニンから431番目のセリンまでは、配列番号1の1番目のメチオニンから431番目のセリンに相当するアミノ酸配列に対して前記の置換(A)(配列番号1の214番目のバリンがアスパラギン酸に置換)、置換(B)(配列番号1の230番目のリジンがグルタミン酸に置換)、置換(C)(配列番号1の242番目のリジンがグルタミン酸に置換)および置換(D)(配列番号1の400番目のリジンがグルタミン酸に置換)、置換(E)(配列番号1の306番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換))および置換(F)(配列番号1の315番目のセリンがスレオニンに置換)が生じたアミノ酸配列に相当する。配列番号5において、その432番目のロイシンから439番目のヒスチジンまではポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドである。
(1)Fc結合性タンパク質FcRn_m13の製造
Fc結合性タンパク質FcRn_m13をコードする塩基配列(配列番号11)を含む発現ベクターpET-FcRn_m13およびそれを有する形質転換体の組換え大腸菌BL21(DE3)/pET-FcRn_m13の作製は、下記の方法で行った。
(2)Fc結合性タンパク質FcRn_m13の生産性評価
生産性評価は、前記の組換え大腸菌BL21(DE3)/pET-FcRn_m13を使用して比較例1の(2)と同様の方法で行った。比較例1の(1)で作製した精製済みのFc結合性タンパク質FcRn_m7を濃度の標準として使用した。その結果、Fc結合性タンパク質FcRn_m13の発現量は156mg/Lであり、比較例1に記載のFc結合性タンパク質FcRn_m7の発現量(45mg/L)より高く、前記の置換(A)、置換(B)、置換(C)、置換(D)、置換(E)および置換(F)を有することで生産性が向上した(表1)。
(3)Fc結合性タンパク質FcRn_m13の抗体に対する結合親和性評価
抗体に対する結合親和性評価は、精製済みのFc結合性タンパク質FcRn_m13を用いて、比較例1の(3)と同様の方法で行った。その結果、Fc結合性タンパク質FcRn_m13のヒト抗体に対する解離定数(KD)の値は12±1μM(n=3)であった。この値は、比較例1に記載のFc結合性タンパク質FcRn_m7のヒト抗体に対する解離定数(KD)の値(10±4μM)に近く、抗体に対する結合親和性が維持されていることが判明した。
(4)Fc結合性タンパク質FcRn_m13の熱安定性評価
精製済みのFc結合性タンパク質FcRn_m13を用いて、比較例1の(4)と同様の方法で熱安定性評価を行った。
Claims (9)
- 以下の(1)~(3)から選択される、Fc結合性タンパク質。
(1)配列番号1に記載のアミノ酸配列の34番目から431番目までのアミノ酸残基において以下の(A)から(D)のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Fc結合性タンパク質:
(A)配列番号1の214番目のバリンがアスパラギン酸に置換、
(B)配列番号1の230番目のリジンがグルタミン酸に置換、
(C)配列番号1の242番目のリジンがグルタミン酸に置換、
(D)配列番号1の400番目のリジンがグルタミン酸に置換。
(2)配列番号1に記載のアミノ酸配列の34番目から431番目までのアミノ酸残基において、前記(A)から(D)のアミノ酸置換を有し、
さらに前記(A)から(D)に示すアミノ酸置換以外に1から30個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか1つ以上を有するアミノ酸配列を含み、かつ抗体結合活性を有するFc結合性タンパク質。
(3)配列番号1に記載のアミノ酸配列の34番目から431番目までのアミノ酸残基において、前記(A)から(D)のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列全体に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、前記(A)から(D)のアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつ抗体結合活性を有するFc結合性タンパク質。 - 以下の(4)~(6)から選択される、請求項1に記載のFc結合性タンパク質。
(4)配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち34番目から431番目までのアミノ酸残基において前記(A)から(D)ならびに以下の(E)または/および(F)のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、Fc結合性タンパク質:
(E)配列番号1の306番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換、
(F)配列番号1の315番目のセリンがスレオニンに置換。
(5)配列番号1に記載のアミノ酸配列の34番目から431番目までのアミノ酸残基において、前記(A)から(D)ならびに(E)または/および(F)のアミノ酸置換を有し、
さらに前記(A)から(F)に示すアミノ酸置換以外に1から30個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか1つ以上を有するアミノ酸配列を含み、かつ抗体結合活性を有するFc結合性タンパク質。
(6)配列番号1に記載のアミノ酸配列の34番目から431番目までのアミノ酸残基において、前記(A)から(D)ならびに(E)または/および(F)のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列全体に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列であって、前記(A)から(F)のアミノ酸置換が残存したアミノ酸配列を含み、かつ抗体結合活性を有するFc結合性タンパク質。 - 配列番号2、配列番号3、配列番号4および配列番号5のうちいずれか1つに記載のアミノ酸配列における34番目から431番目までのアミノ酸残基を含む、請求項1または2に記載のFc結合性タンパク質。
- 配列番号2、配列番号3、配列番号4および配列番号5のうちいずれか1つに記載のアミノ酸配列からなる、請求項1~3のいずれかに記載のFc結合性タンパク質。
- 請求項1~4のいずれかに記載のFc結合性タンパク質をコードするDNA。
- 請求項5に記載のDNAを含む発現ベクター。
- 請求項6に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
- 宿主が大腸菌(Escherichia coli)である、請求項7に記載の形質転換体。
- 請求項7または請求項8に記載の形質転換体を培養することにより請求項1~4のいずれかに記載のFc結合性タンパク質を生産する工程、および前記工程で生産されたFc結合性タンパク質を回収する工程、の2つの工程を含む、Fc結合性タンパク質の製造方法。
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