JP2022067620A - 熱安定性が向上したフコース結合性タンパク質、およびその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖のいずれかに対する結合親和性を有し、熱に対する安定性が向上したフコース結合性タンパク質およびその製造方法を提供する。【解決手段】特定の配列で示されるフコース結合性タンパク質を構成する特定のアミノ酸配列において、特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換すること、加えて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを用いて当該フコース結合性タンパク質を製造する、製造方法を提供する。【選択図】なし
Description
本発明は、熱安定性が向上したフコース結合性タンパク質、およびその製造方法に関する。
グラム陰性細菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）が産生するＢＣ２Ｌ－ＣレクチンのＮ末端ドメインに由来するＢＣ２ＬＣＮは、フコース残基を含む糖鎖への結合親和性を有するレクチンであり、Ｈタイプ１型糖鎖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃ）、Ｈタイプ３型糖鎖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ）、ルイスＹ型糖鎖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃ）、ルイスｂ型糖鎖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃ）およびルイスＸ型糖鎖（Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃ）等のフコース残基を含む複数種の糖鎖に高い結合親和性を有することが知られている（非特許文献１）。これらの糖鎖への結合親和性をもつことから、ＢＣ２ＬＣＮはこれらの糖鎖が高発現している細胞やタンパク質の検出や分離に使用することが可能である。例えば、非特許文献２、特許文献１および特許文献２には、未分化状態のヒトＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞はＨタイプ１型糖鎖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃ）、Ｈタイプ３型糖鎖（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ）を高発現していることから、ＢＣ２ＬＣＮを用いてヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の未分化細胞を検出する方法が開示されている。また、Ｈタイプ１型糖鎖やルイスＹ糖鎖は特定のがん細胞に高発現していることが知られている（Ｈ１：非特許文献３、ＬｅｗｉｓＹ：非特許文献４）。ルイスｂ型糖鎖は赤血球で血液型抗原であるほか、ヘリコバクター・ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）が宿主細胞のルイスｂ型糖鎖を感染に用いていることが知られている（非特許文献５）。
タンパク質の機能を向上させる方法として、タンパク質工学的手法によりタンパク質にアミノ酸変異を導入し、目的とする機能を向上させる方法が知られており、特許文献３にはＢＣ２ＬＣＮの特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することにより、熱に対する安定性が向上する旨、開示されているが、より熱安定性の高いＢＣ２ＬＣＮが求められている。
Ｓｕｌａｋ，Ｏ．等，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２０１０，１８（１）：５９－７２．
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Ｈａｇｅ，Ｎ．等，Ｓｃｉ． Ａｄｖ．２０１５，１４；１（７）：ｅ１５００３１５．
ＢＣ２ＬＣＮは種々の糖鎖への高い結合親和性を持つため、特定の細胞の検出に有用であるものの、ＢＣ２ＬＣＮは熱に不安定であり、生産、保管および使用時の熱による失活・変性が問題であった。このため、長期的に糖鎖への結合親和性が保証される安定性の高いＢＣ２ＬＣＮが求められている。特に、ＢＣ２ＬＣＮを工業的に生産し提供するためには、製造や加工、保管が容易で、安定性が向上したＢＣ２ＬＣＮが求められる。本発明の課題は、高い熱安定性を有するフコース結合性タンパク質を提供することである。
本発明者らは前記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、配列番号１に示される１５５アミノ酸残基からなるＢＣ２ＬＣＮを構成するアミノ酸配列において、８３番目のスレオニン残基をプロリン残基、アラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基およびセリン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基に置換すること、および/または、配列番号１に示されるアミノ酸配列の８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基またはバリン残基に置換すること、および／または、配列番号１に示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基、３７番目のリジン残基、３９番目のグルタミン残基、４６番目のスレオニン残基、４７番目のプロリン残基および１２２番目のセリン残基から選ばれる１個のアミノ酸残基をアラニン残基に置換することにより、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃおよび/またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃおよび/またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖のいずれかに対する結合親和性を維持しつつ、熱に対する安定性が向上したフコース結合性タンパク質が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下の［１］から［１１］に記載した発明を包含するものである。
［１］
以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、以下の（１）～（３）に記載のアミノ酸配列への置換がいずれか１個以上を含む、フコース結合性タンパク質
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の８３番目のスレオニン残基の、スレオニン残基以外の任意のアミノ酸残基への置換
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の８６番目のメチオニン残基の、メチオニン残基以外の任意のアミノ酸残基への置換
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうちアラニン残基以外の任意の１個のアミノ酸残基の、アラニン残基への置換
（ｂ）前記（ａ）に記載のフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の８３番目、配列番号１の８６番目、および配列番号１で示されるアミノ酸配列のうちアラニンであるアミノ酸残基を含まない領域に１個若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃおよび/またはＦ
ｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃおよび/またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖のいずれかに対する結合親和性を有するフコース結合性タンパク質
（ｃ）前記（１）～（３）に記載のいずれか１個以上の置換が行われたアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、かつ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃおよび/またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖のいずれかに対する結合親和性を有するフコース結合性タンパク質
［２］
前記（１）において、スレオニン残基以外の任意のアミノ酸残基が、プロリン残基、アラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基およびセリン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換である、および／または、前記（２）において、メチオニン残基以外の任意のアミノ酸残基が、イソロイシン残基またはバリン残基への置換である、および／または、前記（３）において、アラニン残基へ置換される任意の１個のアミノ酸残基が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基、３７番目のリジン残基、３９番目のグルタミン残基、４６番目のスレオニン残基、４７番目のプロリン残基または１２２番目のセリン残基から選ばれる１個のアミノ酸残基である、請求項１に記載のフコース結合性タンパク質。
［３］
配列番号２から配列番号２４のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、前記［１］または［２］に記載のフコース結合性タンパク質。
［４］
Ｎ末端および／またはＣ末端に付加的なアミノ酸配列を有する前記［１］から［３］のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質。
［５］
Ｃ末端に付加したアミノ酸配列がシステイン残基を含むオリゴペプチドである、前記［１］から［４］のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質。
［６］
Ｎ末端に付加したアミノ酸配列がポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドである、前記［１］から［５］のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質。
［７］
前記［１］から［６］のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡ。
［８］
前記［７］に記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。
［９］
前記［８］に記載の発現ベクターで宿主を形質転換した形質転換体であって、［１］から［６］のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質を生産可能な形質転換体。
［１０］
宿主がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、前記［９］に記載の形質転換体。
［１１］
前記［９］または［１０］に記載の形質転換体を培養することによりフコース結合性タンパク質を生産する工程、得られた培養物から生産されたフコース結合性タンパク質を回収する工程、の２つの工程を含む、［１］から［６］のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質の製造方法。
［１］
以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、以下の（１）～（３）に記載のアミノ酸配列への置換がいずれか１個以上を含む、フコース結合性タンパク質
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の８３番目のスレオニン残基の、スレオニン残基以外の任意のアミノ酸残基への置換
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の８６番目のメチオニン残基の、メチオニン残基以外の任意のアミノ酸残基への置換
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうちアラニン残基以外の任意の１個のアミノ酸残基の、アラニン残基への置換
（ｂ）前記（ａ）に記載のフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列において、配列番号１の８３番目、配列番号１の８６番目、および配列番号１で示されるアミノ酸配列のうちアラニンであるアミノ酸残基を含まない領域に１個若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃおよび/またはＦ
ｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃおよび/またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖のいずれかに対する結合親和性を有するフコース結合性タンパク質
（ｃ）前記（１）～（３）に記載のいずれか１個以上の置換が行われたアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、かつ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃおよび/またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖のいずれかに対する結合親和性を有するフコース結合性タンパク質
［２］
前記（１）において、スレオニン残基以外の任意のアミノ酸残基が、プロリン残基、アラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基およびセリン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換である、および／または、前記（２）において、メチオニン残基以外の任意のアミノ酸残基が、イソロイシン残基またはバリン残基への置換である、および／または、前記（３）において、アラニン残基へ置換される任意の１個のアミノ酸残基が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基、３７番目のリジン残基、３９番目のグルタミン残基、４６番目のスレオニン残基、４７番目のプロリン残基または１２２番目のセリン残基から選ばれる１個のアミノ酸残基である、請求項１に記載のフコース結合性タンパク質。
［３］
配列番号２から配列番号２４のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、前記［１］または［２］に記載のフコース結合性タンパク質。
［４］
Ｎ末端および／またはＣ末端に付加的なアミノ酸配列を有する前記［１］から［３］のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質。
［５］
Ｃ末端に付加したアミノ酸配列がシステイン残基を含むオリゴペプチドである、前記［１］から［４］のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質。
［６］
Ｎ末端に付加したアミノ酸配列がポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドである、前記［１］から［５］のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質。
［７］
前記［１］から［６］のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡ。
［８］
前記［７］に記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。
［９］
前記［８］に記載の発現ベクターで宿主を形質転換した形質転換体であって、［１］から［６］のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質を生産可能な形質転換体。
［１０］
宿主がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、前記［９］に記載の形質転換体。
［１１］
前記［９］または［１０］に記載の形質転換体を培養することによりフコース結合性タンパク質を生産する工程、得られた培養物から生産されたフコース結合性タンパク質を回収する工程、の２つの工程を含む、［１］から［６］のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質の製造方法。
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
本発明のフコース結合性タンパク質は、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃからなる構造を持つＨタイプ１型糖鎖、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を持つＨタイプ３型糖鎖、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃからなる構造を持つルイスＹ型糖鎖、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を持つルイスｂ型糖鎖等のフコース含有糖鎖への結合親和性を有するレクチンであるＢＣ２ＬＣＮを構成するアミノ酸配列（配列番号１で示される１５５アミノ酸残基からなるアミノ酸配列であり、ＧｅｎＰｅｐｔに登録番号ＷＰ＿００６４９０８２８として登録されているアミノ酸配列の２番目から１５６番目までのアミノ酸配列と一致する。）において、特定の位置にあるアミノ酸残基に変異を導入し、形質転換Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで組換えタンパク質として発現させたものである。具体的には、配列番号１で示されるアミノ酸配列における８３番目のスレオニン残基のプロリン残基、アラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基、セリン残基およびシステイン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換、および／または、配列番号１で示されるアミノ酸配列における８６番目のメチオニン残基のイソロイシン残基またはバリン残基への置換、および／または、配列番号１で示されるアミノ酸配列における１番目のプロリン残基、３７番目のリジン残基、３９番目のグルタミン残基、４６番目のスレオニン残基、４７番目のプロリン残基および１２２番目のセリン残基から選ばれる１個のアミノ酸残基のアラニン残基への置換を行い、形質転換Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉで組換えタンパク質として発現させたものである。配列番号１で示されるアミノ酸配列における８３番目のスレオニン残基をプロリン残基またはアラニン残基またはチロシン残基またはトリプトファン残基またはセリン残基で置換すること、および／または、８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基またはバリン残基で置換すること、および／または、１番目のプロリン残基または３７番目のリジン残基または３９番目のグルタミン残基または４６番目のスレオニン残基または４７番目のプロリン残基または１２２番目のセリン残基８６番目をアラニン残基で置換することにより、前記組換えタンパク質のＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖に対する結合親和性を維持しながら、熱に対する安定性を向上させることができる。これらのアミノ酸残基の置換の中では、熱安定性が高い点で、８３番目のスレオニン残基をプロリン残基に、８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基またはバリン残基に置換することが好ましく、前記４種類の糖鎖すべてに対する結合親和性を維持しつつ、変性中点温度がアミノ酸置換を行っていない前記組換えタンパク質よりも１０℃以上高く熱安定性が顕著に向上した点で、８３番目のスレオニン残基をプロリン残基に、または、８３番目のスレオニン残基をチロシン残基またはセリン残基に、および８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基またはバリン残基に置換することが好ましい後述する実施例および比較例で示すように、配列番号１で示されるアミノ酸配列における任意の位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換するのではなく、特定の位置のアミノ酸残基を特定のアミノ酸残基に置換することにより、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖に対する結合親和性を維持しながら、熱に対する安定性を向上させることができる。
本発明のフコース結合性タンパク質の具体例としては、配列番号２（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をプロリン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号３（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号４（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をチロシン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号５（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をトリプトファン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号６（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号７（配列番号１の８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号８（配列番号１の８６番目のメチオニン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号９（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をプロリン残基に、８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号１０（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をアラニン残基に、８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号１１（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をチロシン残基に、８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号１２（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をトリプトファン残基に、８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号１３（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をセリン残基に、８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号１４（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をプロリン残基に、８６番目のメチオニン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号１５（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をアラニン残基に、８６番目のメチオニン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号１６（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をチロシン残基に、８６番目のメチオニン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号１７（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をトリプトファン残基に、８６番目のメチオニン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号１８（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をセリン残基に、８６番目のメチオニン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号１９（配列番号１の１番目のプロリン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号２０（配列番号１の３７番目のリジン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号２１（配列番号１の３９番目のグルタミン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号２２（配列番号１の４６番目のスレオニン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列）、配列番号２３（配列番号１の４７番目のプロリン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列）および配列番号２４（配列番号１の１２２番目のセリン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列）のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むフコース結合性タンパク質を挙げることができる。これらのフコース結合性タンパク質の中では、後述する実施例で示すように、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに比べて熱安定性が高い点で、配列番号９および配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含むフコース結合性タンパク質が好ましく、Ｈタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖およびルイスｂ型糖鎖すべてに対する結合親和性を維持し、変性中点温度が前記組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに比べて１０℃以上高く熱安定性が顕著に向上した点で、配列番号２、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１６および配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含むフコース結合性タンパク質が好ましい。
本発明のフコース結合性タンパク質は、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合性を有している限り、配列番号１で示されるアミノ酸配列において以下の（１）～（３）に記載のアミノ酸置換のいずれか１つ以上を有するアミノ酸配列のバリアント配列であってもよい。
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の８３番目のスレオニン残基の、スレオニン残基以外の任意のアミノ酸残基への置換
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の８６番目のメチオニン残基の、メチオニン残基以外の任意のアミノ酸残基への置換
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうちアラニン残基以外の任意の１個のアミノ酸残基が、アラニン残基へ置換されたアミノ酸配列
バリアント配列としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、８３番目、８６番目およびアラニン残基を含まない領域に１個若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加を含むアミノ酸配列が挙げられる。前記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によって異なり得るが、例えば１～１５個、１～１２個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、または１個を意味してよい。上記のアミノ酸残基の置換の一例としては、物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸間で置換が生じる保守的置換が挙げられる。物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸残基としては、側鎖の性質が類似したアミノ酸残基が挙げられる。側鎖の性質が類似したアミノ酸残基は下記に例示する。
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の８３番目のスレオニン残基の、スレオニン残基以外の任意のアミノ酸残基への置換
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の８６番目のメチオニン残基の、メチオニン残基以外の任意のアミノ酸残基への置換
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうちアラニン残基以外の任意の１個のアミノ酸残基が、アラニン残基へ置換されたアミノ酸配列
バリアント配列としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、８３番目、８６番目およびアラニン残基を含まない領域に１個若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加を含むアミノ酸配列が挙げられる。前記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によって異なり得るが、例えば１～１５個、１～１２個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、または１個を意味してよい。上記のアミノ酸残基の置換の一例としては、物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸間で置換が生じる保守的置換が挙げられる。物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸残基としては、側鎖の性質が類似したアミノ酸残基が挙げられる。側鎖の性質が類似したアミノ酸残基は下記に例示する。
バリアント配列としては、配列番号１で示されるアミノ酸配列において前記（１）およ
び／または（２）および／または（３）に記載のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列も挙げられる。「高い相同性」とは、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の相同性を意味してよい。「相同性」とは、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）または類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を意味してよい。本明細書においては、比較対照とするアミノ酸配列において、アミノ酸残基の種類が同一な部分の割合を「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とし、さらに、アミノ酸残基の側鎖の性質が類似している部分を加えた割合を「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」とする（実験医学 ２０１３年２月号 Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．３、羊土社）。ここで、側鎖の性質が類似しているアミノ酸残基としては、例えば、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基としてはグリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、プロリン残基、フェニルアラニン残基、メチオニン残基およびトリプトファン残基を挙げることができる。また、親水性の酸性側鎖を有するアミノ酸としてはアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基を、親水性の塩基性側鎖を有するアミノ酸としてはリジン残基、アルギニン残基およびヒスチジン、親水性の電荷を持たない側鎖を有するアミノ酸としてはアスパラギン残基、グルタミン残基、セリン残基、スレオニン残基、システイン残基およびチロシン残基を挙げることができる。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ等のアラインメントプログラムを利用して決定することができる。例えば、アミノ酸配列の同一性とは、ｂｌａｓｔｐを用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してよく、具体的には、ｂｌａｓｔｐをデフォルトのパラメータで用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してもよい。得られるフコース結合性タンパク質の熱安定性が高い点で９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列が好ましい。
び／または（２）および／または（３）に記載のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列も挙げられる。「高い相同性」とは、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上の相同性を意味してよい。「相同性」とは、同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）または類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を意味してよい。本明細書においては、比較対照とするアミノ酸配列において、アミノ酸残基の種類が同一な部分の割合を「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とし、さらに、アミノ酸残基の側鎖の性質が類似している部分を加えた割合を「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」とする（実験医学 ２０１３年２月号 Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．３、羊土社）。ここで、側鎖の性質が類似しているアミノ酸残基としては、例えば、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基としてはグリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、プロリン残基、フェニルアラニン残基、メチオニン残基およびトリプトファン残基を挙げることができる。また、親水性の酸性側鎖を有するアミノ酸としてはアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基を、親水性の塩基性側鎖を有するアミノ酸としてはリジン残基、アルギニン残基およびヒスチジン、親水性の電荷を持たない側鎖を有するアミノ酸としてはアスパラギン残基、グルタミン残基、セリン残基、スレオニン残基、システイン残基およびチロシン残基を挙げることができる。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ等のアラインメントプログラムを利用して決定することができる。例えば、アミノ酸配列の同一性とは、ｂｌａｓｔｐを用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してよく、具体的には、ｂｌａｓｔｐをデフォルトのパラメータで用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してもよい。得られるフコース結合性タンパク質の熱安定性が高い点で９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列が好ましい。
また、本発明のフコース結合性タンパク質は、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃおよび/またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃおよび/またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有している限り、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側および／またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から分離する際に有用な付加的なアミノ酸配列を有していてもよい。前記付加的なアミノ酸配列としては、ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、セルロース結合性ドメイン、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等が挙げられる。これらの付加的なアミノ酸配列の中では、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる精製が容易に行える点で、ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドであることが好ましい。前記ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドにおけるヒスチジンの繰返し配列数に特に制限はないが、ヒスチジンの繰返し配列が短い場合はニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる精製が困難となり、長い場合は、本発明のフコース結合性タンパク質の前記糖鎖への結合親和性が損なわれる可能性がある。従って、ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドにおけるヒスチジンの繰返し配列数はヒスチジン残基が５個から１５個からなる繰返し配列であることが好ましく、５個から１０個からなる繰返し配列であることがより好しい。また、前記ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドの長さは、前記ヒスチジンの繰返し配列が含まれていれば特に制限はなく、ヒスチジン残基が５個から１５個からなる繰返し配列を含む２０個以下のオリゴペプチドであることが好ましく、ヒスチジン残基が５個から１０個からなる繰返し配列を含む１５個以下のオリゴペプチドであることがより好ましい。前記ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドがフコース結合性タンパク質に付加する位置に特に制限はなく、Ｎ末端側とＣ末端側の双方、Ｎ末端側或いはＣ末端側のいずれかであってもよいが、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる精製が効率的に行える点で、前記ポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドはフコース結合性タンパク質のＮ末端側に付加されていることが好ましい。
さらに、本発明のフコース結合性タンパク質は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のＮ末端側および／またはＣ末端側に、本発明のフコース結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の担体に固定化する際に有用な、システイン残基またはリジン残基を含むオリゴペプチドからなる付加的なアミノ酸配列（以下、担体固定化用タグと呼ぶ。）を有していても良い。前記担体固定化用タグの長さは、本発明のフコース結合性タンパク質がＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃおよび/またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃおよび/またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖への結合親和性を有している限り、特に制限はない。担体固定化用タグとしては、不溶性担体への固定化が高選択的かつ高効率に行える点で、システイン残基を１つ以上含む２から１０アミノ酸残基からなるオリゴペプチドが好ましく、具体的には、「Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ」の３アミノ酸残基からなるオリゴペプチド、「Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ」の５アミノ酸残基からなるオリゴペプチドおよび「Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ」の７アミノ酸残基からなるオリゴペプチドを例示することができる。前記システイン残基を１つ以上含むオリゴペプチドがフコース結合性タンパク質に付加する位置に特に制限はなく、Ｎ末端側とＣ末端側の双方、Ｎ末端側或いはＣ末端側のいずれかであってもよいが、フコース結合性タンパク質の担体への固定化が効率的に行える点で、前記システイン残基を１つ以上含むオリゴペプチドはフコース結合性タンパク質のＣ末端側に付加されていることが好ましい。
加えて、本発明のフコース結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の場合における前記シグナルペプチドとしては、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ、ＴｏｒＴ等といったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる。
次に、本発明のフコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡとする。）および本発明のＤＮＡを含有する発現ベクター（以下、本発明の発現ベクターとする。）について説明する。
本発明のＤＮＡは、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）法といったＤＮＡ増幅法を利用し、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａのゲノムＤＮＡのＢＣ２Ｌ－Ｃ遺伝子領域をもとに改変して作製する方法、組換えＢＣ２ＬＣＮのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸配列から塩基配列に変換し、当該塩基配列を含むＤＮＡを人工的に作製し、それをさらにＤＮＡ増幅法を利用し改変して作製する方法、そして例えば配列番号２から配列番号２４に記載のアミノ酸配列を塩基配列に変換し、当該塩基配列を含むＤＮＡを人工的に作製する方法等により得ることができる。これらの方法において、アミノ酸配列から塩基配列に変換する際には、本発明のフコース結合性タンパク質の生産に利用する微生物や細胞（宿主）におけるコドンの使用頻度を考慮することが好ましい。一例として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを宿主として利用する場合、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＧまたはＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないコドン（レアコドン）であるため、これらのコドン以外のコドンを選択して変換することが好ましい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／、アクセス日：２０１８年２月１日）を利用することによっても可能である。また、本発明のＤＮＡを作製する際には、アミノ酸残基置換操作を簡便に行うため、アミノ酸残基置換部位周辺のアミノ酸配列を変えずに、適当な制限酵素認識配列を導入してもよい。
本発明のＤＮＡとして、具体的には、配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号２５の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号３のアミノ酸配列をコードする配列番号２６の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号４のアミノ酸配列をコードする配列番号２７の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号５のアミノ酸配列をコードする配列番号２８の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号６のアミノ酸配列をコードする配列番号２９の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号７のアミノ酸配列をコードする配列番号３０の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号８のアミノ酸配列をコードする配列番号３１の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号９のアミノ酸配列をコードする配列番号３２の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号３３の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１１のアミノ酸配列をコードする配列番号３４の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１２のアミノ配列をコードする配列番号３５の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１３のアミノ酸配列をコードする配列番号３６の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１４のアミノ酸配列をコードする配列番号３７の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１５のアミノ酸配列をコードする配列番号３８の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１６のアミノ酸配列をコードする配列番号３９の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１７のアミノ酸配列をコードする配列番号４０の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１８のアミノ酸配列をコードする配列番号４１の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１９のアミノ酸配列をコードする配列番号４２の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号２０のアミノ酸配列をコードする配列番号４３の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号２１のアミノ酸配列をコードする配列番号４４の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号２２のアミノ酸配列をコードする配列番号４５の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号２３のアミノ酸配列をコードする配列番号４６の塩基配列からなるＤＮＡ、および配列番号２４のアミノ酸配列をコードする配列番号４７の塩基配列からなるＤＮＡを例示することができる。
本発明のＤＮＡを用いて宿主を形質転換するには、本発明のＤＮＡそのものを用いて形質転換してもよいが、例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドまたはプラスミド等を基にしたベクター中の適切な位置に本発明のＤＮＡを挿入して本発明の発現ベクターとし、それを用いて形質転換することが、安定した形質転換が実施できる点で好ましい。ここで、適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、および伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。またベクターに本発明のＤＮＡを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ＤＮＡに連結される状態でベクターに挿入することが好ましい。
本発明の発現ベクターとしては、宿主内で安定に存在し複製できるベクターであれば特に制限はなく、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを宿主とする場合、ｐＥＴベクター、ｐＵＣベクター、ｐＴｒｃベクター、ｐＣＤＦベクターおよびｐＢＢＲベクター等が例示できる。また本発明において使用するプロモータとしては、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを宿主とする場合、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータ等を挙げることができる。
本発明のフコース結合性タンパク質を生産可能な形質転換体（以下、本発明の形質転換体とする。）は、本発明の発現ベクターを用いて宿主を形質転換することで得ることができる。本発明の形質転換体として使用する宿主に特に制限はないが、遺伝子工学に関する実験が容易な点でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが好ましい。また、本発明の発現ベクターを用いて宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行えばよく、例えば、宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｗ３１１０株等を選択する場合には、公知の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５６，１９９２）に記載の方法等を使用することができる。なお、本発明の形質転換体から適当な抽出方法または市販のキット等を用いることで、本発明の発現ベクターを抽出することができる。例えば宿主がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの場合には、アルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（商品名、キアゲン製）等の市販の抽出キットを用いることができる。
次に、本発明のフコース結合性タンパク質の製造方法（以下、本発明の製造方法とする。）について説明する。本発明の製造方法は、本発明の形質転換体を培養することで本発明のフコース結合性タンパク質を生産する工程（以下、第１工程という。）、得られた培養物から本発明のフコース結合性タンパク質を回収する工程（以下、第２工程という。）の２つの工程を含む。なお本明細書において、培養物とは、培養された形質転換体の細胞自体や細胞分泌物のほか、培養に用いた培地等も含まれる。
本発明の製造方法における第１工程では、本発明の形質転換体をその培養に適した培地で培養すればよい。例えば、宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを用いた場合、必要な栄養源を補ったＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）培地、Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地等を使用することが好ましい。本発明の発現ベクターが薬剤耐性遺伝子を含む場合、その遺伝子に対応した薬剤を培地に添加して第１工程を実施すれば、形質転換体の選択的増殖が可能となり、例えば、当該発現ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加することが好ましい。培養温度は利用する宿主に関して一般的に知られた温度であればよく、例えば宿主がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである場合、１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃であり、本発明のフコース結合性タンパク質の製造量等を勘案しつつ、適宜決定すればよい。また、培地のｐＨは、利用する宿主に関して一般的に知られたｐＨ範囲とすればよく、例えば宿主がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４の範囲、好ましくはｐＨ７．０前後であり、本発明のフコース結合性タンパク質の製造量等を勘案しつつ、適宜決定すればよい。
本発明の発現ベクターに誘導性のプロモータを導入した場合は、本発明のフコース結合性タンパク質が良好に製造可能な条件下で培地に誘導剤を添加してその発現を誘導すればよい。好ましい誘導剤としてはｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を例示することができ、その添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲、好ましくは０．０１から０．５ｍＭの範囲である。ＩＰＴＧ添加による発現誘導は、利用する宿主に関して一般的に知られた条件で行なえばよい。また、本発明の発現ベクターに誘導性のプロモータを導入した場合であっても、本発明のフコース結合性タンパク質が良好に製造可能であれば誘導剤を添加しなくてもよい。
本発明の製造方法における第２工程では、第１工程で得られた培養物から一般的に知られた回収方法によって本発明のフコース結合性タンパク質を回収する。例えば本発明のフコース結合性タンパク質が培養液中に分泌生産される場合は細胞を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明のフコース結合性タンパク質を回収すればよく、細胞内（原核生物においてはペリプラズムも含む）に発現する場合は、遠心分離操作により細胞を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加する等により細胞を破砕し、細胞破砕液から回収すればよい。
本発明の製造方法により回収された本発明のフコース結合性タンパク質の純度を向上させたい場合には、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として、液体クロマトグラフィーを用いた分離精製法を挙げることができる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を使用することが好ましく、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて行なうことがより好ましい。また、前記クロマトグラフィーにより精製した本発明のフコース結合性タンパク質の純度は当該技術分野において公知の方法を用いて調べればよく、一例として、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）法やゲルろ過クロマトグラフィー法を挙げることができる。
本発明のフコース結合性タンパク質の糖鎖への結合親和性の評価は、Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ法や表面プラズモン共鳴法等により評価することができる。一例として、表面プラズモン共鳴法について説明する。表面プラズモン共鳴法による結合親和性評価は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器（ＧＥヘルスケア製）を用い、アナライトを組換えタンパク質、固相を糖鎖として測定することができる。糖鎖を固定したセンサーチップの作製は、ビオチン標識糖鎖を利用して、ストレプトアビジンをコートしたセンサーチップ（Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＳＡ、ＧＥヘルスケア製）や、デキストランがコートされたセンサーチップ（Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５、ＧＥヘルスケア製）にあらかじめストレプトアビジンを固定したものを利用して行うことができる。また、結合親和性評価は当該機器に付属のカイネティクス解析プログラムを利用して行うことができる。
本発明のフコース結合性タンパク質の熱に対する安定性の評価は、Ｔｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ法や示差走査熱量計による測定法で、加熱処理前後の糖鎖への結合親和性は、Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ法や表面プラズモン共鳴法で比較することにより評価することができる。一例として、Ｔｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ法と示差走査熱量計による方法について説明する。Ｔｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ法も示差走査熱量計による方法もタンパク質溶液の温度を一定速度で上昇させ、タンパク質の半分が変性する変性中点温度を測定する方法として利用される。Ｔｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ法ではＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅなどのタンパク質の疎水面に結合する蛍光色素をタンパク質溶液にあらかじめ添加し、熱により高次構造が崩れたタンパク質の疎水面に結合した蛍光色素の蛍光強度を測定することによりタンパク質の構造変化を測定する。一方、示差走査熱量計による測定は、タンパク質の熱変性によって生じる熱量変化を測定する方法である。
本発明により、アミノ酸残基置換前のフコース結合性タンパク質に比べて熱に対する安定性が向上し、かつ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃからなる構造を持つＨタイプ１型糖鎖および／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃからなる構造を持つＨタイプ３型糖鎖および／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃからなる構造を持つルイスＹ型糖鎖および／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を持つルイスｂ型糖鎖への結合親和性を維持したフコース結合性タンパク質、およびそれらの製造方法が提供される。
Ｈタイプ１型糖鎖やＨタイプ３型糖鎖はヒトｉＰＳ細胞やＥＳ細胞等の未分化細胞に特異的に存在する未分化マーカーとして知られており、また、Ｈタイプ１型糖鎖やルイスＹ型糖鎖は特定のがん細胞に高発現していることが知られている。ルイスｂ型糖鎖は赤血球で血液型抗原であるほか、ヘリコバクター・ピロリ菌の感染に関わることが知られている。従って、本発明のフコース結合性タンパク質は、熱に対する安定性が向上していることから、前記未分化細胞やがん細胞など特定の細胞表面の糖鎖に、温度変化による機能低下を抑えて安定的に結合することが期待され、例えば、本発明のフコース結合性タンパク質を蛍光標識することにより、前記未分化細胞やがん細胞などの細胞を高感度に検出することができる。また、本発明のフコース結合性タンパク質を水に不溶性の担体に固定化することにより、前記未分化細胞やがん細胞などの特定の細胞を選択的に吸着可能な細胞吸着剤を作製することができる。
以下、作製例、実施例、比較例および参考例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
作製例１
（１－１）発現ベクターｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓの作製
発現ベクターｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓは、組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを発現させるための発現ベクターである。組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓのアミノ酸配列は配列番号４８であり、具体的には、配列番号４８の５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列、１５番目から１６９番目までは配列番号１のアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔ登録番号：ＷＰ＿００６４９０８２８の２番目から１５６番目の領域のアミノ酸配列）、１７０番目から１７４番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。発現ベクターｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓは、特開２０１８－００００３８号公報で開示されているプラスミドｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓと同一の塩基配列であり、当該公報に開示されている方法で作製した。次いで、発現ベクターｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを作製した。
（１－２）組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに対する配列番号１の８３番目のスレオニン残基として特定されるスレオニン残基への変異導入
組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに対して、配列番号１の８３番目のスレオニン残基として特定されるスレオニン残基への変異導入を行った。すなわち、組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓのアミノ酸配列（配列番号４８）の９７番目のスレオニン残基を他のアミノ酸残基に置換する変異導入を行った。
（１－１）発現ベクターｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓの作製
発現ベクターｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓは、組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを発現させるための発現ベクターである。組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓのアミノ酸配列は配列番号４８であり、具体的には、配列番号４８の５番目から１０番目まではポリヒスチジン配列、１５番目から１６９番目までは配列番号１のアミノ酸配列（ＧｅｎＰｅｐｔ登録番号：ＷＰ＿００６４９０８２８の２番目から１５６番目の領域のアミノ酸配列）、１７０番目から１７４番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。発現ベクターｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓは、特開２０１８－００００３８号公報で開示されているプラスミドｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓと同一の塩基配列であり、当該公報に開示されている方法で作製した。次いで、発現ベクターｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを作製した。
（１－２）組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに対する配列番号１の８３番目のスレオニン残基として特定されるスレオニン残基への変異導入
組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに対して、配列番号１の８３番目のスレオニン残基として特定されるスレオニン残基への変異導入を行った。すなわち、組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓのアミノ酸配列（配列番号４８）の９７番目のスレオニン残基を他のアミノ酸残基に置換する変異導入を行った。
前記作製例（１－１）に記載の発現ベクターｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを鋳型として、配列番号４９および配列番号５０に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、特開２０１８－００００３８号公報で開示されている方法によりＰＣＲを実施した。なお、配列番号４９に記載の配列からなるＰＣＲプライマーは縮重配列ＮＮＢ（Ｎ＝Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ、Ｂ＝Ｃ，ＧまたはＴ）を有し、配列番号４８の９７番目のスレオニン残基（配列番号１の８３番目のスレオニン残基に相当）が他のアミノ酸残基にランダムで置換されるよう設計した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化し、同様に制限酵素処理した前記（１－１）の発現ベクターｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓとライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、複数の形質転換体を得た。それぞれの形質転換体から発現ベクターを抽出し、塩基配列を解析した。その結果、表１に示す１９種類の発現ベクターとそれを有する形質転換体を得た。なお、表１における組換えタンパク質の製造は、後述する作製例（１－３）に記載した。
（１－３）組換えタンパク質の製造
前記作製例（１－１）で作製した組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび前記作製例（１－２）で作製した１９種類の形質転換体（表１）を、それぞれ３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔおよび５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行った。前培養液をそれぞれ３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した１ＬのＴＢ培地（２４ｇ／ＬＹｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、１２ｇ／Ｌ ｔｒｙｐｔｏｎｅ、９．４ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、２．２ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４および４ｍＬ／Ｌ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に接種し、３７℃で振盪培養した。培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が凡そ０．６になったところで、培養温度を３０℃に切り替え、一晩培養することで各組換えタンパク質（組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび表１に記載した１９種類の組換えタンパク質）を発現させた。超音波破砕またはＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（メルク製）を用いて、それぞれの菌体から可溶性タンパク質抽出液を回収した。可溶性タンパク質抽出液中からの組換えタンパク質の精製は、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーにより行い、限外ろ過フィルターを用いて保存用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０，１５０ｍＭ 塩化ナトリウム，２０％グリセロール）に置換した。
前記作製例（１－１）で作製した組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび前記作製例（１－２）で作製した１９種類の形質転換体（表１）を、それぞれ３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地（１０ｇ／Ｌ ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔおよび５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で一晩振盪することで前培養を行った。前培養液をそれぞれ３０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した１ＬのＴＢ培地（２４ｇ／ＬＹｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、１２ｇ／Ｌ ｔｒｙｐｔｏｎｅ、９．４ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４、２．２ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４および４ｍＬ／Ｌ Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に接種し、３７℃で振盪培養した。培養液の濁度（Ｏ．Ｄ．６００）が凡そ０．６になったところで、培養温度を３０℃に切り替え、一晩培養することで各組換えタンパク質（組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび表１に記載した１９種類の組換えタンパク質）を発現させた。超音波破砕またはＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（メルク製）を用いて、それぞれの菌体から可溶性タンパク質抽出液を回収した。可溶性タンパク質抽出液中からの組換えタンパク質の精製は、ニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーにより行い、限外ろ過フィルターを用いて保存用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０，１５０ｍＭ 塩化ナトリウム，２０％グリセロール）に置換した。
（１－４）組換えタンパク質の糖鎖結合親和性評価
前記（１－３）で製造した組換えタンパク質（組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび表１の組換えタンパク質）のＨタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖およびルイスｂ型糖鎖に対する結合親和性評価を表面プラズモン共鳴法により行った。具体的には、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（ＧＥヘルスケア製）を用い、アナライトを各組換えタンパク質、固相をＨタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖またはルイスｂ型糖鎖としてカイネティクス解析を行った。センサーチップはデキストランがコートされたＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥヘルスケア製）を使用し、デキストランにストレプトアビジンをアミンカップリング法により固定した後、ビオチン標識されたＨタイプ１型糖鎖（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ製）、Ｈタイプ３型糖鎖（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ製）、ルイスＹ型糖鎖（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ製）またはルイスｂ型糖鎖（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ製）を添加し、ビオチンとストレプトアビジンの反応により各糖鎖をセンサーチップ上に固定してＨタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖またはルイスｂ型糖鎖が固定されたセンサーチップを作製した。ストレプトアビジンの固定量は約４００ＲＵ、糖鎖の固定量は約３５ＲＵとした。
前記（１－３）で製造した組換えタンパク質（組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび表１の組換えタンパク質）のＨタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖およびルイスｂ型糖鎖に対する結合親和性評価を表面プラズモン共鳴法により行った。具体的には、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ（ＧＥヘルスケア製）を用い、アナライトを各組換えタンパク質、固相をＨタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖またはルイスｂ型糖鎖としてカイネティクス解析を行った。センサーチップはデキストランがコートされたＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥヘルスケア製）を使用し、デキストランにストレプトアビジンをアミンカップリング法により固定した後、ビオチン標識されたＨタイプ１型糖鎖（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ製）、Ｈタイプ３型糖鎖（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ製）、ルイスＹ型糖鎖（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ製）またはルイスｂ型糖鎖（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ製）を添加し、ビオチンとストレプトアビジンの反応により各糖鎖をセンサーチップ上に固定してＨタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖またはルイスｂ型糖鎖が固定されたセンサーチップを作製した。ストレプトアビジンの固定量は約４００ＲＵ、糖鎖の固定量は約３５ＲＵとした。
糖鎖結合親和性の測定には緩衝液としてＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４）を用い、測定条件は流速を３０μＬ／分、結合時間を３分間、解離時間を６分間とした。センサーチップの再生は５ｍＭの水酸化ナトリウムを用い、流速３０μＬ／分、再生時間１０秒で行った。糖鎖固定量が多いセンサーチップを使用する場合は、２０ｍＭの水酸化ナトリウムを用いた。解析はＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器に付属の解析ソフト（Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて行い、１：１ Ｂｉｎｄｉｎｇのフィッティングにより解離定数（ＫＤ）を算出した。
表２から４に、実施例１から５および比較例１から１５として、前記（１－３）で製造した組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（比較例１）および表１記載の１９種類の形質転換体を用いて作製した１９種類の組換えタンパク質のＨタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖およびルイスｂ型糖鎖に対する解離定数を示す。解離定数の値は小さいほど結合親和性が高いことを示す。なお、糖鎖結合量が明らかに低下した変異型（センサグラム形状より結合は確認できるが、センサーチップへの最大結合量Ｒｍａｘがおおよそ１０ＲＵ以下で組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓの約３分の１以下のもの）については、組換えタンパク質の多くが糖鎖結合活性を失い糖鎖結合性が低下していると判断し、解離定数は算出せず「低下」と記載した。また、糖鎖結合性を持たない変異型（センサグラム形状より糖鎖結合が確認できない）は、「×」と記載した。
表２に、後述する作製例（１－５）に記載の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（比較例１）および実施例１から５として、測定した４種類の糖鎖いずれかに対する親和性を保持し、かつ後述する作製例（１－５）に記載した熱安定性評価で組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（比較例１）と比較して熱安定性が向上したフコース結合性タンパク質の結果を示す。なお、表２における熱安定性の測定は、後述する作製例（１－５）に記載した。表２における変性中点温度の測定は、後述する作製例（１－６）に記載した。表２に示すように、実施例１として記載のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｐ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基として特定されるスレオニンがプロリンに置換）、実施例２として記載のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ａ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基として特定されるスレオニンがアラニンに置換）、実施例３として記載のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｙ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基として特定されるがチロシンに置換）、実施例４として記載のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｗ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基として特定されるスレオニンがトリプトファンに置換）、実施例５として記載のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｓ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基として特定されるスレオニンがセリンに置換）は、比較例１として記載の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（配列番号１の８３番目のスレオニンとして特定されるスレオニンは置換されていない）と同様にＨタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖およびルイスｂ型糖鎖すべてに対する結合親和性を持つ。
実施例１として記載のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｐのアミノ酸配列は配列番号５１であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号２のアミノ酸配列（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をプロリン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ－８３Ｐの配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－８３Ｐには配列番号２のアミノ酸配列をコードする配列番号２５の塩基配列が含有されることが確認された。
実施例２として記載のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ａのアミノ酸配列は配列番号５２であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号３のアミノ酸配列（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ－８３Ａの配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－８３Ａには配列番号３のアミノ酸配列をコードする配列番号２６の塩基配列が含有されることが確認された。
実施例３として記載のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｙのアミノ酸配列は配列番号５３であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号４のアミノ酸配列（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をチロシン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ－８３Ｙの配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－８３Ｙには配列番号４のアミノ酸配列をコードする配列番号２７の塩基配列が含有されることが確認された。
実施例４として記載のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｗのアミノ酸配列は配列番号５４であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号５のアミノ酸配列（配列番号１の８３番目のスレオニ残基をトリプトファン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ－８３Ｗの配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－８３Ｗには配列番号５のアミノ酸配列をコードする配列番号２８の塩基配列が含有されることが確認された。
実施例５として記載のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｓのアミノ酸配列は配列番号５５であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号６のアミノ酸配列（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ－８３Ｓの配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－８３Ｓには配列番号６のアミノ酸配列をコードする配列番号２９の塩基配列が含有されることが確認された。
実施例５として記載のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｓのアミノ酸配列は配列番号５５であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号６のアミノ酸配列（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ－８３Ｓの配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－８３Ｓには配列番号６のアミノ酸配列をコードする配列番号２９の塩基配列が含有されることが確認された。
表３に、比較例２から１１として、測定した４種類の糖鎖いずれかに対する親和性を保持し、かつ比較例１と比較して熱安定性が同等または低下したフコース結合性タンパク質の結果を示す。なお、表３における熱安定性の測定は、後述する作製例（１－５）に記載した。
表４に、比較例１２および１５として、測定した４種類の糖鎖すべてに対する結合親和性が著しく低下または喪失していた組換えタンパク質の結果を示す。なお、表４における熱安定性の測定は、後述する作製例（１－５）に記載した。
（１－５）組換えタンパク質の熱安定性評価
前記（１－３）で製造した組換えタンパク質（組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび表１の組換えタンパク質）の熱に対する安定性をＴｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ（ＴＳＡ）法により評価した。具体的にはリアルタイムＰＣＲ装置ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を使用し、反応液の組成は０．２５ ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．５％（ｖ／ｖ）ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅとし、反応条件は、昇温温度は３０℃から９８℃、昇温速度は０．５℃／ｓとした。変性中点温度の判定は、比較例１の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを同時に測定し、蛍光強度のピーク温度を比較することにより行った。
前記（１－３）で製造した組換えタンパク質（組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび表１の組換えタンパク質）の熱に対する安定性をＴｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ Ａｓｓａｙ（ＴＳＡ）法により評価した。具体的にはリアルタイムＰＣＲ装置ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を使用し、反応液の組成は０．２５ ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、０．５％（ｖ／ｖ）ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅとし、反応条件は、昇温温度は３０℃から９８℃、昇温速度は０．５℃／ｓとした。変性中点温度の判定は、比較例１の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを同時に測定し、蛍光強度のピーク温度を比較することにより行った。
表２から４にＴＳＡ法による熱安定性評価の結果を示す。表中で「向上」と記載したものは、組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（比較例１）と比較して変性中点温度を示すピークが高温側にシフトし、熱安定性が向上したフコース結合性タンパク質、もしくは変性中点温度が測定範囲より高く、ピークがみられなかったフコース結合性タンパク質である。表中で「同等」と記載したものは、組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（比較例１）と同程度の変性中点温度を示し、同等の熱安定性をもつフコース結合性タンパク質、「低下」と記載したものは、組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（比較例１）より低い変性中点温度を示し、熱安定性が低下したフコース結合性タンパク質である。
表２は組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（比較例１）と比較して、前記（１－４）の方法に従い測定した４種類の糖鎖のいずれかに対する親和性を保持し、かつ熱安定性が向上したフコース結合性タンパク質の結果を示す。表３は、前記（１－４）の方法に従い測定した４種類の糖鎖のいずれかに対する親和性を保持し、かつ熱安定性が比較例１と同等もしくは低下したフコース結合性タンパク質の結果を示す。表４は前記（１－４）で測定した糖鎖結合親和性で、４種類の糖鎖すべてに対する親和性が失われたフコース結合性タンパク質の結果を示す。
（１－６）組換えタンパク質の変性中点温度の測定
前記（１－５）において、比較例１の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓより高い熱安定性を示し、かつ前記（１－４）において４種類の糖鎖のいずれかに対する親和性を保持したフコース結合性タンパク質および組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓについて、変性中点温度の測定を示差走査熱量計により行った。具体的には、前記（１－３）で製造した組換えタンパク質を再生セルロース膜（サーモフィッシャーサイエンティフィック製、分画分子量３５００）を用いて、透析用緩衝液（５０ｍＭ 酢酸ナトリウム，１５０ｍＭ 塩化ナトリウム，ｐＨ５．５）中で緩衝液交換を行った。透析内液の組換えタンパク質の濃度を紫外吸収法により測定し、透析用緩衝液を用いて５００μｇ／ｍＬになるよう希釈し、示差走査熱量計（マルバーン・パナテリティカル製、ＭｉｃｒｏＣａｌＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ）を用いて変性中点温度を測定した。変性中点温度の測定条件は、各組換えタンパク質の溶液量を４００μＬ、昇温速度を６０℃／ｈ、加熱温度を４０℃－１２０℃とした。
前記（１－５）において、比較例１の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓより高い熱安定性を示し、かつ前記（１－４）において４種類の糖鎖のいずれかに対する親和性を保持したフコース結合性タンパク質および組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓについて、変性中点温度の測定を示差走査熱量計により行った。具体的には、前記（１－３）で製造した組換えタンパク質を再生セルロース膜（サーモフィッシャーサイエンティフィック製、分画分子量３５００）を用いて、透析用緩衝液（５０ｍＭ 酢酸ナトリウム，１５０ｍＭ 塩化ナトリウム，ｐＨ５．５）中で緩衝液交換を行った。透析内液の組換えタンパク質の濃度を紫外吸収法により測定し、透析用緩衝液を用いて５００μｇ／ｍＬになるよう希釈し、示差走査熱量計（マルバーン・パナテリティカル製、ＭｉｃｒｏＣａｌＶＰ－Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ）を用いて変性中点温度を測定した。変性中点温度の測定条件は、各組換えタンパク質の溶液量を４００μＬ、昇温速度を６０℃／ｈ、加熱温度を４０℃－１２０℃とした。
表２に、実施例１から５として、前記（１－３）で製造した組換えタンパク質の変性中点温度を示す。なお、変性中点温度はタンパク質の半分が変性する温度である。変性中点温度が高いほど熱に対する安定性が高いことを示す。表２に示すように、フコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｐ（実施例１）、フコース結合性タンパク質Ｔ８３Ａ（実施例２）、フコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｙ（実施例３）、フコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｗ（実施例４）およびフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｓ（実施例５）は、比較例１として記載の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基として特定されるスレオニン残基は置換されていない）に比べ変性中点温度が高く、熱安定性が向上したことがわかる。また、測定した４種類の糖鎖すべてに対する親和性を保持し、フコース結合性タンパク質としての機能を保持していることがわかる。
作製例２
（２－１）組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに対する配列番号１の８６番目のメチオニン残基として特定されるメチオニン残基への変異導入
組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに対して、配列番号１の８６番目のメチオニン残基として特定されるメチオニン残基への変異導入を行った。すなわち、組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓのアミノ酸配列（配列番号４８）の１００番目のメチオニン残基を他のアミノ酸残基に置換する変異導入を行った。
（２－１）組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに対する配列番号１の８６番目のメチオニン残基として特定されるメチオニン残基への変異導入
組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに対して、配列番号１の８６番目のメチオニン残基として特定されるメチオニン残基への変異導入を行った。すなわち、組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓのアミノ酸配列（配列番号４８）の１００番目のメチオニン残基を他のアミノ酸残基に置換する変異導入を行った。
前記作製例（１－１）に記載の発現ベクターｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを鋳型として、配列番号５６および配列番号５０に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、特開２０１８－００００３８号公報で開示されている方法によりＰＣＲを実施した。なお、配列番号５６に記載の配列からなるＰＣＲプライマーは縮重配列ＮＮＢ（Ｎ＝Ａ，Ｃ，ＧまたはＴ，Ｂ＝Ｃ，ＧまたはＴ）を有し、配列番号４８の８６番目のメチオニン残基（配列番号１の８６番目のメチオニン残基に相当）が他のアミノ酸残基にランダムで置換されるよう設計した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化し、同様に制限酵素処理した前記（１－２）の発現ベクターｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓとライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、複数の形質転換体を得た。それぞれの形質転換体から発現ベクターを抽出し、塩基配列を解析した。その結果、表５に示す１９種類の発現ベクターとそれを有する形質転換体を得た。なお、表５における組換えタンパク質の製造は、後述する作製例（２－２）に記載した。
（２－２）組換えタンパク質の製造
組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび前記（２－１）に記載した１９種類の組換えフコース結合性タンパク質（表５）の製造は、前記作製例（１－１）で作製した組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび前記（２－１）で作製した１９種類の形質転換体（表５）を使用して、前記作製例（１－３）に記載した方法に従い行った。
組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび前記（２－１）に記載した１９種類の組換えフコース結合性タンパク質（表５）の製造は、前記作製例（１－１）で作製した組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび前記（２－１）で作製した１９種類の形質転換体（表５）を使用して、前記作製例（１－３）に記載した方法に従い行った。
（２－３）組換えタンパク質の糖鎖結合親和性評価
前記（２－２）で製造した組換えタンパク質（組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび表５の組換えタンパク質）のＨタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖およびルイスｂ型糖鎖に対する結合親和性評価は、前記作製例（１－４）に記載した方法に従い行った。
前記（２－２）で製造した組換えタンパク質（組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび表５の組換えタンパク質）のＨタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖およびルイスｂ型糖鎖に対する結合親和性評価は、前記作製例（１－４）に記載した方法に従い行った。
表６から８に、実施例６および７、比較例１および比較例１６から３２として、前記作製例（１－３）で製造した組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（比較例１）および表５記載の１９種類の形質転換体を用いて作製した１９種類の組換えタンパク質のＨタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖およびルイスｂ型糖鎖に対する解離定数を示す。
表６に、作製例（１－５）に記載の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（比較例１）および実施例６および７として、測定した４種類の糖鎖いずれかに対する親和性を保持し、かつ後述する作製例（２－４）に記載した熱安定性評価で組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（比較例１）と比較して熱安定性が向上したフコース結合性タンパク質の結果を示す。なお、表６における熱安定性の測定は、後述する作製例（２－４）に記載した。表６における変性中点温度の測定は、後述する作製例（２－５）に記載した。表６に示すように、実施例６として記載のフコース結合性タンパク質Ｍ８６Ｉ（配列番号１の８６番目のメチオニン残基として特定されるメチオニンがイソロイシンに置換）および実施例７として記載のフコース結合性タンパク質Ｍ８６Ｖ（配列番号１の８６番目のメチオニン残基として特定されるメチオニンがバリンに置換）は、比較例１として記載の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（配列番号１の８６番目のメチオニンとして特定されるメチオニンは置換されていない）と同様にＨタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖およびルイスｂ型糖鎖すべてに対する結合親和性を持つ。
実施例６として記載のフコース結合性タンパク質Ｍ８６Ｉのアミノ酸配列は配列番号５７であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号７のアミノ酸配列（配列番号１の８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ－８６Ｉの配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－８６Ｉには配列番号７のアミノ酸配列をコードする配列番号３０の塩基配列が含有されることが確認された。
実施例７として記載のフコース結合性タンパク質Ｍ８６Ｖのアミノ酸配列は配列番号５８であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号８のアミノ酸配列（配列番号１の８６番目のメチオニン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ－８６Ｖの配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－８６Ｖには配列番号８のアミノ酸配列をコードする配列番号３１の塩基配列が含有されることが確認された。
実施例７として記載のフコース結合性タンパク質Ｍ８６Ｖのアミノ酸配列は配列番号５８であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号８のアミノ酸配列（配列番号１の８６番目のメチオニン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ－８６Ｖの配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－８６Ｖには配列番号８のアミノ酸配列をコードする配列番号３１の塩基配列が含有されることが確認された。
表７に、比較例１６から２９として、測定した４種類の糖鎖いずれかに対する親和性を保持し、かつ比較例１と比較して熱安定性が同等または低下したフコース結合性タンパク質の結果を示す。なお、表７における熱安定性の測定は、後述する作製例（２－４）に記載した。
表８に、比較例３０から３２として、測定した４種類の糖鎖すべてに対する結合親和性が著しく低下または喪失していた組換えタンパク質の結果を示す。なお、表８における熱安定性の測定は、後述する作製例（２－４）に記載した。
（２－４）組換えタンパク質の熱安定性評価
前記（２－３）で製造した組換えタンパク質（組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび表５の組換えタンパク質）の熱に対する安定性は、前記作製例（１－５）に記載したＴＳＡ法に従い行った。
前記（２－３）で製造した組換えタンパク質（組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓおよび表５の組換えタンパク質）の熱に対する安定性は、前記作製例（１－５）に記載したＴＳＡ法に従い行った。
表６から８にＴＳＡ法による熱安定性評価の結果を示す。表６は組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（比較例１）と比較して熱安定性が向上したフコース結合性タンパク質の結果を示す。表７は、前記（２－３）の方法に従い測定した４種類の糖鎖いずれかに対する親和性を保持し、かつ熱安定性が比較例１と同等もしくは低下したフコース結合性タンパク質の結果を示す。表８は前記（２－３）で測定した糖鎖結合親和性で、４種類の糖鎖すべてに対する親和性が失われたフコース結合性タンパク質の結果を示す。
（２－５）組換えタンパク質の変性中点温度の測定
前記（２－４）において、比較例１の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓより高い熱安定性を示し、かつ前記（２－３）において４種類の糖鎖のいずれかに対する親和性を保持したフコース結合性タンパク質および組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓについて、変性中点温度の測定を前記作製例（１－６）に記載の示差走査熱量計による測定法に従い行った。
表６に、実施例６および７として、前記（２－２）で製造した組換えタンパク質の変性中点温度を示す。表６に示すように、フコース結合性タンパク質Ｍ８６Ｉ（実施例６）およびフコース結合性タンパク質Ｍ８６Ｖ（実施例７）は、比較例１として記載の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（配列番号１の８６番目のメチオニン残基として特定されるメチオニン残基は置換されていない）に比べ変性中点温度が高く、熱安定性が向上したことがわかる。また、測定した４種類の糖鎖に対する親和性を保持し、フコース結合性タンパク質としての機能を保持していることがわかる。
前記（２－４）において、比較例１の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓより高い熱安定性を示し、かつ前記（２－３）において４種類の糖鎖のいずれかに対する親和性を保持したフコース結合性タンパク質および組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓについて、変性中点温度の測定を前記作製例（１－６）に記載の示差走査熱量計による測定法に従い行った。
表６に、実施例６および７として、前記（２－２）で製造した組換えタンパク質の変性中点温度を示す。表６に示すように、フコース結合性タンパク質Ｍ８６Ｉ（実施例６）およびフコース結合性タンパク質Ｍ８６Ｖ（実施例７）は、比較例１として記載の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（配列番号１の８６番目のメチオニン残基として特定されるメチオニン残基は置換されていない）に比べ変性中点温度が高く、熱安定性が向上したことがわかる。また、測定した４種類の糖鎖に対する親和性を保持し、フコース結合性タンパク質としての機能を保持していることがわかる。
作製例３
（３－１）組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに対する配列番号１の８３番目のスレオニン残基および８６番目のメチオニン残基として特定されるアミノ酸残基への変異導入
組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに対して、配列番号１の８３番目のスレオニン残基をプロリン残基、アラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基およびセリン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換および、配列番号１の８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基またはバリン残基への置換を行った。すなわち、組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓのアミノ酸配列（配列番号４８）の９７番目のメチオニン残基および１００番目のメチオニン残基を他のアミノ酸残基に置換する変異導入を行った。
（３－１）組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに対する配列番号１の８３番目のスレオニン残基および８６番目のメチオニン残基として特定されるアミノ酸残基への変異導入
組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに対して、配列番号１の８３番目のスレオニン残基をプロリン残基、アラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基およびセリン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換および、配列番号１の８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基またはバリン残基への置換を行った。すなわち、組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓのアミノ酸配列（配列番号４８）の９７番目のメチオニン残基および１００番目のメチオニン残基を他のアミノ酸残基に置換する変異導入を行った。
前記作製例（２－１）に記載の発現ベクターｐＥＴ－８６Ｉまたは発現ベクターｐＥＴ－８６Ｖを鋳型とし、配列番号５０および配列番号５９から５１に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、表９に示した鋳型ＤＮＡとＰＣＲプライマーの組み合わせで前記作製例（１－１）記載の方法によりＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化し、同様に制限酵素処理した前記（１－１）の発現ベクターｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓとライゲーション反応を行い、前記作製例（１－２）記載の方法により形質転換体を得た。それぞれの形質転換体から発現ベクターを抽出し、塩基配列解析を行い、表１０に示す１０種類の発現ベクターとそれを有する形質転換体を得た。なお、表１０における組換えタンパク質の製造は、後述する作製例（３－２）に記載した。
配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ－８３Ｐ／８６Ｉには配列番号９のアミノ酸配列をコードする配列番号３２の塩基配列が含まれ、フコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｐ／Ｍ８６Ｉのアミノ酸配列は配列番号６４であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号９のアミノ酸配列（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をプロリン残基に、８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ－８３Ａ／８６Ｉには配列番号１０のアミノ酸配列をコードする配列番号３３の塩基配列が含まれ、フコース結合性タンパク質Ｔ８３Ａ／Ｍ８６Ｉのアミノ酸配列は配列番号６５であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号１０のアミノ酸配列（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をアラニン残基に、８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ－８３Ｙ／８６Ｉには配列番号１１のアミノ酸配列をコードする配列番号３４の塩基配列が含まれ、フコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｙ／Ｍ８６Ｉのアミノ酸配列は配列番号６６であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号１１のアミノ酸配列（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をチロシン残基に、８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ－８３Ｗ／８６Ｉには配列番号１２のアミノ酸配列をコードする配列番号３５の塩基配列が含まれ、フコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｗ／Ｍ８６Ｉのアミノ酸配列は配列番号６７であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号１２のアミノ酸配列（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をトリプトファン残基に、８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ－８３Ｓ／８６Ｉには配列番号１３のアミノ酸配列をコードする配列番号３６の塩基配列が含まれ、フコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｓ／Ｍ８６Ｉのアミノ酸配列は配列番号６８であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号１３のアミノ酸配列（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をセリン残基に、８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ－８３Ｐ／８６Ｖには配列番号１４のアミノ酸配列をコードする配列番号３７の塩基配列が含まれ、フコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｐ／Ｍ８６Ｖのアミノ酸配列は配列番号６９であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号１４のアミノ酸配列（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をプロリン残基に、８６番目のメチオニン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ－８３Ａ／８６Ｖには配列番号１５のアミノ酸配列をコードする配列番号３８の塩基配列が含まれ、フコース結合性タンパク質Ｔ８３Ａ／Ｍ８６Ｖのアミノ酸配列は配列番号７０であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号１５のアミノ酸配列（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をアラニン残基に、８６番目のメチオニン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ－８３Ｙ／８６Ｖには配列番号１６のアミノ酸配列をコードする配列番号３９の塩基配列が含まれ、フコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｙ／Ｍ８６Ｖのアミノ酸配列は配列番号７１であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号１６のアミノ酸配列（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をチロシン残基に、８６番目のメチオニン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ－８３Ｗ／８６Ｖには配列番号１７のアミノ酸配列をコードする配列番号４０の塩基配列が含まれ、フコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｗ／Ｍ８６Ｖのアミノ酸配列は配列番号７２であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号１７のアミノ酸配列（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をトリプトファン残基に、８６番目のメチオニン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ－８３Ｓ／８６Ｖには配列番号１８のアミノ酸配列をコードする配列番号４１の塩基配列が含まれ、フコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｓ／Ｍ８６Ｖのアミノ酸配列は配列番号７３であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号１８のアミノ酸配列（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をセリン残基に、８６番目のメチオニン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。
（３－２）組換えタンパク質の製造
前記（３－１）に記載した１０種類の組換えフコース結合性タンパク質（表１０）の製造は、前記（３－１）で作製した１０種類の形質転換体（表１０）を使用して、前記作製例（１－３）に記載した方法に従い行った。
前記（３－１）に記載した１０種類の組換えフコース結合性タンパク質（表１０）の製造は、前記（３－１）で作製した１０種類の形質転換体（表１０）を使用して、前記作製例（１－３）に記載した方法に従い行った。
（３－３）組換えタンパク質の糖鎖結合親和性評価
前記（３－２）で製造した１０種類の組換えフコース結合性タンパク質（表１０）のＨタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖およびルイスｂ型糖鎖に対する結合親和性評価は、前記作製例（１－４）に記載した方法に従い行った。
前記（３－２）で製造した１０種類の組換えフコース結合性タンパク質（表１０）のＨタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖およびルイスｂ型糖鎖に対する結合親和性評価は、前記作製例（１－４）に記載した方法に従い行った。
表１１に、実施例８から１７として、前記（３－２）で製造した１２種類の組換えタンパク質のＨタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖およびルイスｂ型糖鎖に対する解離定数を示す。また、前記作製例（１－４）で測定した実施例１から５のフコース結合性タンパク質および前記作製例（２－３）で測定した実施例６および７のフコース結合性タンパク質の解離定数も併せて記載する。
なお、表１１における変性中点温度の測定は、後述する作製例（３－４）に記載した。表１１に示すように、作製例（１－５）に記載の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（比較例１）および実施例８から１７として、測定した４種類の糖鎖いずれかに対する親和性を保持していることがわかる。
（３－４）組換えタンパク質の変性中点温度の測定
前記（３－２）で製造した１０種類の組換えタンパク質（表１０）の組換えタンパク質の変性中点温度の測定を前記作製例（１－６）に記載の示差走査熱量計による測定法に従い行った。
前記（３－２）で製造した１０種類の組換えタンパク質（表１０）の組換えタンパク質の変性中点温度の測定を前記作製例（１－６）に記載の示差走査熱量計による測定法に従い行った。
表１１に、実施例８から１７として、前記（３－２）で製造した１０種類の組換えタンパク質の変性中点温度を示す。また、前記作製例（１－６）で測定した実施例１から５のフコース結合性タンパク質および前記作製例（２－５）で測定した実施例６および７のフコース結合性タンパク質の変性中点温度も併せて記載する。表１１に示すように、実施例８から１７として、配列番号１の８３番目のスレオニン残基をプロリン残基、アラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基およびセリン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換および、配列番号１の８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基またはバリン残基に置換したフコース結合性タンパク質は、配列番号１の８３番目のスレオニン残基または８６番目のメチオニン残基どちらか一方のアミノ酸置換であるフコース結合性タンパク質と比較して、変性中点温度が向上していることがわかる。具体的には、実施例８として記載のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｐ／Ｍ８６Ｉ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をプロリン残基に、８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列）は実施例１のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｐ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をプロリン残基に置換したアミノ酸配列）および実施例６のフコース結合性タンパク質Ｍ８６Ｉ（配列番号１の８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列）と、実施例９として記載のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ａ／Ｍ８６Ｉ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をアラニン残基に、８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列）は実施例２のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ａ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列）および実施例６のフコース結合性タンパク質Ｍ８６Ｉ（配列番号１の８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列）と、実施例１０として記載のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｙ／Ｍ８６Ｉ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をチロシン残基に、８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列）は実施例３のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｙ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をチロシン残基に置換したアミノ酸配列）および実施例６のフコース結合性タンパク質Ｍ８６Ｉ（配列番号１の８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列）と、実施例１１として記載のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｗ／Ｍ８６Ｉ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をトリプトファン残基に、８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列）は実施例４のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｗ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をトリプトファン残基に置換したアミノ酸配列）および実施例６のフコース結合性タンパク質Ｍ８６Ｉ（配列番号１の８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列）と、実施例１２として記載のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｓ／Ｍ８６Ｉ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をセリン残基に、８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列）は実施例５のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｓ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列）および実施例６のフコース結合性タンパク質Ｍ８６Ｉ（配列番号１の８６番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換したアミノ酸配列）と、実施例１３として記載のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｐ／Ｍ８６Ｖ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をプロリン残基に、８６番目メチオニン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）は実施例１のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｐ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をプロリン残基に置換したアミノ酸配列）および実施例７のフコース結合性タンパク質Ｍ８６Ｖ（配列番号１の８６番目のメチオニン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）と、実施例１４として記載のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ａ／Ｍ８６Ｖ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をアラニン残基に、８６番目メチオニン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）は実施例２のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ａ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列）および実施例７のフコース結合性タンパク質Ｍ８６Ｖ（配列番号１の８６番目のメチオニン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）と、実施例１５として記載のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｙ／Ｍ８６Ｖ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をチロシン残基に、８６番目メチオニン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）は実施例３のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｙ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をチロシン残基に置換したアミノ酸配列）および実施例７のフコース結合性タンパク質Ｍ８６Ｖ（配列番号１の８６番目のメチオニン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）と、実施例１６として記載のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｗ／Ｍ８６Ｖ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をトリプトファン残基に、８６番目メチオニン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）は実施例４のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｗ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をトリプトファン残基に置換したアミノ酸配列）および実施例７のフコース結合性タンパク質Ｍ８６Ｖ（配列番号１の８６番目のメチオニン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）と、実施例１７として記載のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｓ／Ｍ８６Ｖ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をセリン残基に、８６番目メチオニン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）は実施例５のフコース結合性タンパク質Ｔ８３Ｓ（配列番号１の８３番目のスレオニン残基をセリン残基に置換したアミノ酸配列）および実施例７のフコース結合性タンパク質Ｍ８６Ｖ（配列番号１の８６番目のメチオニン残基をバリン残基に置換したアミノ酸配列）と比較して、変性中点温度が向上していることがわかる。
作製例４
（４－１）組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに対するアミノ酸残基のアラニン置換による変異導入
組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに対して、配列番号１の１番目のプロリン残基（組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓのアミノ酸配列である配列番号４８の１５番目の残基）、３７番目のリジン残基（配列番号４８の５１番目の残基）、３９番目のグルタミン残基（配列番号４８の５３番目の残基）、４６番目のスレオニン残基（配列番号４８の６０番目の残基）、４７番目のプロリン残基（配列番号４８の６１番目の残基）および１２２番目のセリン残基（配列番号４８の１３６番目の残基）から選ばれる１種類のアミノ酸残基をアラニン残基への置換を行った。
（４－１）組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに対するアミノ酸残基のアラニン置換による変異導入
組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓに対して、配列番号１の１番目のプロリン残基（組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓのアミノ酸配列である配列番号４８の１５番目の残基）、３７番目のリジン残基（配列番号４８の５１番目の残基）、３９番目のグルタミン残基（配列番号４８の５３番目の残基）、４６番目のスレオニン残基（配列番号４８の６０番目の残基）、４７番目のプロリン残基（配列番号４８の６１番目の残基）および１２２番目のセリン残基（配列番号４８の１３６番目の残基）から選ばれる１種類のアミノ酸残基をアラニン残基への置換を行った。
作製は前記作製例（３－１）に記載の方法などと同様の一般的な方法により行い、前記作製例（１－１）の発現ベクターｐＥＴ－ＢＣ２ＬＣＮｃｙｓを鋳型として適当なＰＣＲプライマーによるＰＣＲや、目的のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを人工的に作製する方法等により、表１３に示した発現ベクターを作製し、前記作製例（１－２）記載の方記作製例（１－２）記載の方法により各発現ベクターを有する形質転換体を得た。それぞれの形質転換体から発現ベクターを抽出し、塩基配列解析を行い、表１３に示す６種類の発現ベクターとそれを有する形質転換体を得た。なお、表１３における組換えタンパク質の製造は、後述する作製例（４－２）に記載した。
配列解析により塩基配列を確認した結果、発現ベクターｐＥＴ－Ｐ１Ａには配列番号１９のアミノ酸配列をコードする配列番号４２の塩基配列が含まれ、フコース結合性タンパク質Ｐ１Ａのアミノ酸配列は配列番号７４であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号１９のアミノ酸配列（配列番号１の１番目のプロリン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ－Ｋ３７Ａには配列番号２０のアミノ酸配列をコードする配列番号４３の塩基配列が含まれ、フコース結合性タンパク質Ｋ３７Ａのアミノ酸配列は配列番号７５であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号２０のアミノ酸配列（配列番号１の３７番目のリジン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ－Ｑ３９Ａには配列番号２１のアミノ酸配列をコードする配列番号４４の塩基配列が含まれ、フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ａのアミノ酸配列は配列番号７６であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号２１のアミノ酸配列（配列番号１の３９番目のグルタミン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ－Ｔ４６Ａには配列番号２２のアミノ酸配列をコードする配列番号４５の塩基配列が含まれ、フコース結合性タンパク質Ｔ４６Ａのアミノ酸配列は配列番号７７であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号２２のアミノ酸配列（配列番号１の４６番目のスレオニン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ－Ｐ４７Ａには配列番号２３のアミノ酸配列をコードする配列番号４６の塩基配列が含まれ、フコース結合性タンパク質Ｐ４７Ａのアミノ酸配列は配列番号７８であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号２３のアミノ酸配列（配列番号１の４７番目のプロリン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。発現ベクターｐＥＴ－Ｓ１２２Ａには配列番号２４のアミノ酸配列をコードする配列番号４７の塩基配列が含まれ、フコース結合性タンパク質Ｓ１２２Ａのアミノ酸配列は配列番号７９であり、その１５番目から１６９番目までは配列番号２４のアミノ酸配列（配列番号１の１２２番目のセリン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列）に相当する。
（４－２）組換えタンパク質の製造
前記（４－１）に記載した６種類の組換えフコース結合性タンパク質（表１３）の製造は、前記（４－１）で作製した６種類の形質転換体（表１３）を使用して、前記作製例（１－３）に記載した方法に従い行った。
（４－３）組換えタンパク質の糖鎖結合親和性評価
前記（４－２）で製造した６種類の組換えフコース結合性タンパク質（表１３）のＨタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖およびルイスｂ型糖鎖に対する結合親和性評価は、前記作製例（１－４）に記載した方法に従い行った。
前記（４－１）に記載した６種類の組換えフコース結合性タンパク質（表１３）の製造は、前記（４－１）で作製した６種類の形質転換体（表１３）を使用して、前記作製例（１－３）に記載した方法に従い行った。
（４－３）組換えタンパク質の糖鎖結合親和性評価
前記（４－２）で製造した６種類の組換えフコース結合性タンパク質（表１３）のＨタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖およびルイスｂ型糖鎖に対する結合親和性評価は、前記作製例（１－４）に記載した方法に従い行った。
表１４に、実施例１８から２３として、前記（４－２）で製造した６種類の組換えタンパク質のＨタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖、ルイスＹ型糖鎖およびルイスｂ型糖鎖に対する解離定数を示す。
なお、表１４における変性中点温度の測定は、後述する作製例（４－４）に記載した。表１４に示すように、作製例（１－５）に記載の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（比較例１）および実施例１８から２３として、測定した４種類の糖鎖いずれかに対する親和性を保持していることがわかる。
（４－４）組換えタンパク質の変性中点温度の測定
前記（４－２）で製造した６種類の組換えタンパク質（表１４）の組換えタンパク質の変性中点温度の測定を前記作製例（１－６）に記載の示差走査熱量計による測定法に従い行った。
表１４に、実施例１８から２３として、前記（４－２）で製造した６種類の組換えタンパク質の変性中点温度を示す。表１４に示すように、フコース結合性タンパク質Ｐ１Ａ（実施例１８）、フコース結合性タンパク質Ｋ３７Ａ（実施例１９）、フコース結合性タンパク質Ｑ３９Ａ（実施例２０）、フコース結合性タンパク質Ｔ４６Ａ（実施例２１）、フコース結合性タンパク質Ｐ４７Ａ（実施例２２）およびフコース結合性タンパク質Ｓ１２２Ａ（実施例２３）は、比較例１として記載の組換えＢＣ２ＬＣＮｃｙｓ（配列番号１のいずれのアミノ酸残基もアラニン残基に置換されていない）に比べ変性中点温度が高く、熱安定性が向上したことがわかる。
Claims (11)
- 以下の（ａ）～（ｃ）のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、以下の（１）～（３）に記載のアミノ酸残基への置換がいずれか１個以上を含む、フコース結合性タンパク質
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列の８３番目のスレオニン残基の、スレオニン残基以外の任意のアミノ酸残基への置換
（２）配列番号１で示されるアミノ酸配列の８６番目のメチオニン残基の、メチオニン残基以外の任意のアミノ酸残基への置換
（３）配列番号１で示されるアミノ酸配列のうちアラニン残基以外の任意の１個のアミノ酸残基の、アラニン残基への置換
（ｂ）前記（ａ）に記載のフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列において、配列番号
１の８３番目、配列番号１の８６番目、および配列番号１で示されるアミノ酸配列のうちアラニンであるアミノ酸残基を含まない領域に１個若しくは複数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃおよび/またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃおよび/またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖のいずれかに対する結合親和性を有するフコース結合性タンパク質
（ｃ）前記（１）～（３）に記載のいずれか１個以上の置換が行われたアミノ酸配列に対して９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、かつ、Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃおよび／またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４（Ｆｕｃα１－３）ＧｌｃＮＡｃおよび/またはＦｕｃα１－２Ｇａｌβ１－３（Ｆｕｃα１－４）ＧａｌＮＡｃからなる構造を含む糖鎖のいずれかに対する結合親和性を有するフコース結合性タンパク質 - 前記（１）において、スレオニン残基以外の任意のアミノ酸残基が、プロリン残基、アラニン残基、チロシン残基、トリプトファン残基およびセリン残基から選ばれる１種類のアミノ酸残基への置換である、および／または、前記（２）において、メチオニン残基以外の任意のアミノ酸残基が、イソロイシン残基またはバリン残基への置換である、および／または、前記（３）において、アラニン残基へ置換される任意の１個のアミノ酸残基が、配列番号１で示されるアミノ酸配列の１番目のプロリン残基、３７番目のリジン残基、３９番目のグルタミン残基、４６番目のスレオニン残基、４７番目のプロリン残基または１２２番目のセリン残基から選ばれる１個のアミノ酸残基である、請求項１に記載のフコース結合性タンパク質。
- 配列番号２から配列番号２４のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のフコース結合性タンパク質。
- Ｎ末端および／またはＣ末端に付加的なアミノ酸配列を有する請求項１から３のいずれか1項に記載のフコース結合性タンパク質。
- Ｃ末端に付加したアミノ酸配列がシステイン残基を含むオリゴペプチドである、請求項１から４のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質。
- Ｎ末端に付加したアミノ酸配列がポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドである、請求項１から５のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質。
- 請求項１から６のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質をコードするＤＮＡ。
- 請求項７に記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。
- 請求項８に記載の発現ベクターで宿主を形質転換した形質転換体であって、請求項１から６のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質を生産可能な形質転換体。
- 宿主がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項９に記載の形質転換体。
- 請求項９または１０に記載の形質転換体を培養することによりフコース結合性タンパク質を生産する工程、得られた培養物から生産されたフコース結合性タンパク質を回収する工程、の２つの工程を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載のフコース結合性タンパク質の製造方法。
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