JP2018148873A - 改変型フコース結合性レクチン、およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を含む糖鎖への選択的な結合性を有する改変型フコース結合性レクチン、およびその製造方法を提供すること。【解決手段】フコース結合性レクチンを構成するアミノ酸のうち、特定の位置にあるアミノ酸を他の特定のアミノ酸に置換すること、さらに、大腸菌を用いて当該フコース結合性レクチンを製造することにより、前記課題を解決する。【選択図】なし

Description

本発明は、糖鎖に対する結合性を改変したフコース結合性レクチンに関する。より詳しくは、遺伝子工学的手法を用い、結合する糖鎖の選択性が向上したフコース結合性レクチンに関する。

フコース結合性レクチンの１種であるＢＣ２ＬＣＮは、グラム陰性細菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）が産生するＢＣ２Ｌ−Ｃタンパク質のＮ末端ドメイン（ＹＰ＿００２２３２８１８）に由来するレクチンであり（非特許文献１）、このレクチンを形質転換大腸菌で発現させたものが組換えＢＣ２ＬＣＮである（非特許文献２）。

組換えＢＣ２ＬＣＮは、例えば、非特許文献２および特許文献１に記載の未分化糖鎖マーカーとして知られているＨタイプ１型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）およびＨタイプ３型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ）以外に、ルイスＸ型糖鎖（Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ）やルイスＹ型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃ）などのフコースを含む複数種の糖鎖に高い結合性を有することが知られている（非特許文献１）。また、組換えＢＣ２ＬＣＮは、Ｈタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖が高発現している未分化状態のヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞には結合するが、ヒト体細胞には結合しないことが知られている（非特許文献３）。さらに、組換えＢＣ２ＬＣＮは前記未分化糖鎖マーカーに結合性を有することから、例えば、未分化糖鎖マーカーを含む複合糖質の検出やヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの未分化細胞の検出に使用されている（特許文献１）。

しかしながら、組換えＢＣ２ＬＣＮは前記未分化糖鎖マーカー以外にもフコースを含む複数種の糖鎖に結合性を有しており、類似構造を有する糖鎖、例えば、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌの共通構造を有するＨタイプ１型糖鎖とＨタイプ３型糖鎖、あるいは、Ｇａｌβ１−４（Ｆｕｃα１−３）ＧｌｃＮＡｃの共通構造を有するルイスＸ型糖鎖とルイスＹ型糖鎖を区別して認識することができなかった。また、組換えＢＣ２ＬＣＮを前記の未分化糖鎖マーカーを含む複合糖質の検出やヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの未分化細胞の検出に用いる場合には、例えば、ルイスＸ型糖鎖やルイスＹ型糖鎖を含む複合糖質や、表面にルイスＸ型糖鎖やルイスＹ型糖鎖が発現している細胞が混在する場合には、未分化糖鎖マーカーとルイスＸ型糖鎖やルイスＹ型糖鎖を区別することができないため、使用できないことが問題であった。

国際公開第２０１３／０６５３０２号パンフレット

Ｓｕｌａｋ Ｏ， Ｃｉｏｃｉ Ｇ， Ｄｅｌｉａ Ｍ， ＬａｈｍａｎｎＭ， Ｖａｒｒｏｔ Ａ， Ｉｍｂｅｒｔｙ Ａ， Ｗｉｍｍｅｒｏｖａ Ｍ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．２０１０，１８（１）：５９−７２． Ｔａｔｅｎｏ Ｈ， Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ Ａ， Ｈｉｅｍｏｒｉ Ｋ， Ｏｎｕｍａ Ｙ， Ｉｔｏ Ｙ， Ｈａｓｅｈｉｒａ Ｋ， Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ Ｋ， Ｏｈｔａｋａ Ｍ， Ｔａｋａｙａｓｕ Ｓ， Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｍ， Ｉｋｅｈａｒａ Ｙ， Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｍ， Ｏｈｎｕｍａ Ｋ， Ｃｈａｎ Ｔ， Ｔｏｙｏｄａ Ｍ， Ａｋｕｔｓｕ Ｈ， Ｕｍｅｚａｗａ Ａ， Ａｓａｓｈｉｍａ Ｍ， Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ Ｊ．， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１３，２（４）：２６５−７３． Ｔａｔｅｎｏ Ｈ， Ｔｏｙｏｔａ Ｍ， Ｓａｉｔｏ Ｓ， ＯｎｕｍａＹ， Ｉｔｏ Ｙ， Ｈｉｅｍｏｒｉ Ｋ， Ｆｕｋｕｍｕｒａ Ｍ， Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ Ａ， Ｎａｋａｎｉｓｈｉ Ｍ， Ｏｈｎｕｍａ Ｋ， Ａｋｕｔｓｕ Ｈ，Ｕｍｅｚａｗａ Ａ， Ｈｏｒｉｍｏｔｏ Ｋ， Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ Ｊ， Ａｓａｓｈｉｍａ Ｍ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２０１１， ２８６（２３）：２０３４５−５３．

本発明の課題は、遺伝子工学的手法を用いて組換えＢＣ２ＬＣＮにアミノ酸変異を導入し、結合する糖鎖の選択性が向上した改変型フコース結合性レクチン、およびその製造方法を提供することである。

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、配列番号１で示した組換えＢＣ２ＬＣＮを構成するアミノ酸のうち、７７番目のセリンをプロリンまたはスレオニンに、８１番目のグルタミン酸をヒスチジンに置換することにより、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を含む糖鎖への結合性を有し、且つ、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ構造を含む糖鎖への結合性を有さない、配列番号２および配列番号３で示した改変型フコース結合性レクチンが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、以下の（１）から（６）に記載した発明を提供するものである。

（１）以下の（ａ）又は（ｂ）の改変型フコース結合性レクチン。
（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、以下の（ｉ）および（ｉｉ）に記載のアミノ酸置換のいずれか１つ以上を含むアミノ酸配列からなる改変型フコース結合性レクチン
（ｉ）配列番号１の７７番目のセリンのプロリンまたはスレオニンへの置換
（ｉｉ）配列番号１の８１番目のグルタミン酸のヒスチジンへの置換
（ｂ）（ａ）の改変型フコース結合性レクチンのアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃの構造を含む糖鎖を認識する改変型フコース結合性レクチン。

（２）（１）に記載の改変型フコース結合性レクチンをコードするＤＮＡ。

（３）（２）に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。

（４）（３）に記載の組換えベクターで宿主を形質転換した、（１）に記載の
改変型フコース結合性レクチンを生産可能な形質転換体。

（５）宿主が大腸菌である、（４）に記載の形質転換体。

（６）（４）または（５）に記載の形質転換体を培養することにより改変型フコース結合性レクチンを生産する工程、得られた培養物から生産された改変型フコース結合性レクチンを回収する工程、の２つの工程を含む、（１）に記載の改変型フコース結合性レクチンの製造方法。

以下に本発明をさらに詳細に説明する。

本発明の改変型フコース結合性レクチンは、フコース結合性レクチンの１種であるＢＣ２ＬＣＮの糖鎖結合領域周辺のアミノ酸残基に変異を導入したものであり、具体的には、配列番号１で示したＢＣ２ＬＣＮのアミノ酸配列のうち、７７番目のセリンをプロリンまたはスレオニンに、８１番目のグルタミン酸をヒスチジンに置換し、形質転換大腸菌で発現させたものである。本発明の改変型フコース結合性レクチンは、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃの構造を含む糖鎖への結合性を有している限り、前記７７番目と８１番目のアミノ酸置換以外の１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加してもよく、例えば２０個以下、好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加してもよい。

また、本発明の改変型フコース結合性レクチンは、そのＮ末端側またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から分離する際に有用なタンパク質タグを付加してもよい。前記タンパク質タグとしては、ポリヒスチジン、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼや、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、セルロース結合性ドメイン（ＣＢＤ）、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグなどがあげられる。また本発明の改変型フコース結合性レクチンをクロマトグラフィー用の支持体等の固相に固定化する際に有用な、システインを含むオリゴペプチドを、本発明の改変型フコース結合性レクチンのＮ末端側またはＣ末端側にさらに付加してもよい。Ｎ末端側またはＣ末端側に付加するオリゴペプチドの長さは、本発明の改変型フコース結合性レクチンがＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃの構造を含む糖鎖への結合性を有している限り、制限はない。さらに本発明の改変型フコース結合性レクチンのＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌の場合における前記シグナルペプチドの例としては、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ、ＴｏｒＴなどといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる。

本発明のＤＮＡおよび組換えベクターの作製方法は公知の方法を用いることができる。アミノ酸変異を導入する前の組換えＢＣ２ＬＣＮのアミノ酸配列（配列番号１）を塩基配列に変換し、化学合成することにより組換えＢＣ２ＬＣＮのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡを作製することができる。なお、アミノ酸配列から塩基配列に変換する際、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えばかずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／、アクセス日：２０１６年６月２７日）を利用することによっても可能である。また、変異導入操作を簡便に行うため、変異導入部位周辺にアミノ酸配列を変えずに適当な制限酵素認識配列を導入してもよい。得られたＤＮＡを一般的なプラスミドやコスミド、バクテリオファージに挿入して、野生型組換えＢＣ２ＬＣＮをコードする塩基配列を含む組換えベクターを作製することができる。

本発明の改変型フコース結合性レクチンの組換えベクターは、得られた組換えＢＣ２ＬＣＮをコードする塩基配列に特定の変異を導入することによって得られる。すなわち本発明の組換えベクターの作製は図１に示す縮重プライマーを用いたＰＣＲ法により行うことができる。縮重プライマーによるＰＣＲ産物を、適当な制限酵素を用いて、組換えＢＣ２ＬＣＮをコードする塩基配列を含む組換えベクターの対応する領域に挿入することにより、本発明の組換えベクターおよびＤＮＡを作製することができる。なお、本発明の変異をコードした塩基配列を本発明の組換えベクターがもつことを確認するための方法としては、当業者が通常用いる方法で塩基配列解析を行うことができる。例えば、変異導入領域を増幅するシーケンス用プライマーを用い、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）にて塩基配列を解析することができる。

本発明の組換えベクターを用いて宿主を形質転換するには、形質転換する宿主内で安定に存在しできる発現ベクターを用いて組換えベクターを作製し、宿主に対応した形質転換法により形質転換体を得ることができる。本発明の宿主が大腸菌であった場合は、発現ベクターとしては、ｐＥＴ系発現ベクター、ｐＵＣ発現ベクター、ｐＴｒｃ発現ベクター、ｐＣＤＦ発現ベクター、ｐＢＢＲ発現ベクターが例示できる。宿主は発現ベクターに対応しているものであれば当業者が通常用いるものでよく、例えば大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＢＬ２１株、ＪＭ１０９株などが挙げられる。また、形質転換体は当業者が通常用いる方法で行なえばよく、公知の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５６，１９９２）に記載の方法等により形質転換すればよい。

本発明の改変型フコース結合性レクチンを調製するには、本発明の形質転換体を用いて当該技術分野において周知の条件で行えばよい。温度や誘導剤の種類およびその濃度など発現培養条件は、宿主や発現ベクターなど発現の形態に応じて実施すればよい。例えば、宿主が大腸菌で発現ベクターがｐＥＴ系であった場合、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地またはＴＢ（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）培地を用い、温度は１０℃から４０℃、好ましくは２５℃から３５℃、より好ましくは３０℃前後であり、発現誘導剤はＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を用いればよい。本発明の形質転換体を培養して得られた培養混合物から本発明の改変型フコース結合性レクチンを回収するには、発現の形態に応じて当業者が通常用いる方法の中から適宜選択して行えばよい。培養上清に発現する場合は、菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から改変型フコース結合性レクチンを抽出すればよい。細胞内（原核生物においてはペリプラズムも含む）に発現する場合は、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することにより菌体を破砕し、菌体破砕液から改変型フコース結合性レクチンを抽出すればよい。前述した方法で得られた抽出物の中から改変型フコース結合性レクチンを分離精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、その一例として、液体クロマトグラフィーを用いた分離精製があげられる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があり、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製を行なうことで、改変型フコース結合性レクチンを高純度に調製することができる。

なお、本発明の改変型フコース結合性レクチンの糖鎖結合性の評価は、Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）法や表面プラズモン共鳴法（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ法：ＳＰＲ法）などにより評価することができる。表面プラズモン共鳴法について説明する。表面プラズモン共鳴法による結合性評価は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００機器（ＧＥヘルスケア社製）などのビアコアシステムを用い、アナライトを組換えタンパク質、固相を糖鎖として測定することができる。糖鎖を固定したセンサーチップの作製は、ビオチン標識糖鎖を利用して、ストレプトアビジンをコートしたセンサーチップＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＳＡ（ＧＥヘルスケア社製）や、デキストランがコートされたセンサーチップＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥヘルスケア社製）にあらかじめストレプトアビジンを固定したものを利用して行うことができる。結合性評価はビアコアシステムのカイネティクス解析プログラムを利用して行うことができる。

本発明の改変型フコース結合性レクチンは、Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ構造を含む糖鎖、例えば、Ｈタイプ１型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）に対して良好な結合性を有している。そのため、本発明の改変型フコース結合性レクチンを、組換えＢＣ２ＬＣＮとともに使用することで、ヒトＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などのＨタイプ１型糖鎖とＨタイプ３型糖鎖が共に高発現している細胞上での両糖鎖の含有量を比較することが可能となる。具体的には、蛍光色素等で標識した改変型フコース結合性レクチンおよび組換えＢＣ２ＬＣＮを用いて細胞を染色したのち、その蛍光強度を測定し、本発明の改変型フコース結合性レクチンおよび組換えＢＣ２ＬＣＮの細胞表面への結合量を比較することにより、細胞表面におけるＨタイプ１型糖鎖とＨタイプ３型糖鎖の発現量を比較することができる。

また、本発明の改変型フコース結合性レクチンは、Ｈタイプ１型糖鎖に対して高い結合性をもつことから、Ｈタイプ１型糖鎖を含む複合糖質や、Ｈタイプ１型糖鎖を含む複合糖質を細胞表面に発現している細胞の検出に使用することができる。

組換えＢＣ２ＬＣＮへの変異導入法の概要である。 改変型フコース結合性レクチン（Ｓ７７Ｐ／Ｅ８１Ｈ）のカイネティクス解析結果である。

以下、作製例、実施例および比較例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

作製例１ 改変型フコース結合性レクチンの作製
（１）ＢＣ２ＬＣＮの組換えベクター（ｐＥＴＢＣ２ＬＣＮ）の作製
ＢＣ２ＬＣＮの組換えベクターの作製は、ＢＣ２ＬＣＮのアミノ酸配列を塩基配列に変換し、塩基配列を含むＤＮＡを作製し、それらを適当な発現ベクターに導入して行った。具体的には、配列番号１に示したＢＣ２ＬＣＮのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＷＰ＿００６４９０８２８の２番目から１５６番目の領域のアミノ酸）をＤＮＡｗｏｒｋｓ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，３０，ｅ４３頁，２００２年）を用いてコドンを大腸菌型に変換し、配列番号４に示すＢＣ２ＬＣＮのアミノ酸配列をコードする塩基配列を設計した。さらに、配列番号４のＤＮＡをＰＣＲ法により作製するため、ＤＮＡｗｏｒｋｓ法によりオリゴヌクレオチドを設計し、ＰＣＲ法により連結し、配列番号４の塩基配列を含むＤＮＡを作製した。得られたＤＮＡを発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）（メルクミリポア製）に制限酵素認識配列を利用して導入し、ＢＣ２ＬＣＮ組換えベクターであるｐＥＴＢＣ２ＬＣＮを作製した。組換えベクターは、挿入したＤＮＡがコードする組換えＢＣ２ＬＣＮが発現し、さらにＮ末端側に発現ベクター上の塩基配列がコードするポリヒスチジンが連結するよう最適化した。
（２）組換えＢＣ２ＬＣＮへの変異導入（８１番目グルタミン酸のアミノ酸置換）
変異導入法の概要を図１に示した。糖鎖結合部位周辺の８１番目のグルタミン酸に対して、縮重プライマーを用いたＰＣＲにより行った。配列番号５に示した縮重プライマーは、８１番目のグルタミン酸に対応する塩基配列をＮＮＢ（Ｎ＝Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔいずれか、Ｂ＝Ｃ，Ｇ，Ｔいずれか）とし、８１番目のアミノ酸が全２０種類のアミノ酸に置換されるよう設計した。変異導入のためのＰＣＲは、鋳型は前記（１）の発現ベクターｐＥＴＢＣ２ＬＣＮを用い、プライマーは、配列番号５に示した８１番目の縮重配列を含み、３‘末端に制限酵素ＫｐｎＩをもつ縮重プライマーと、配列番号６に示したｐＥＴベクターのターミネーター領域のプライマーを用いた。ＰＣＲ反応はＥｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社製）やＰｒｉｍｅＳｔａｒＨＳ（タカラバイオ社製）などの一般的なＤＮＡポリメラーゼを用い、メーカー推奨の通常の条件に従い行った。得られた８１番目のグルタミン酸をコードする塩基配列に変異を含むＰＣＲ産物は、縮重プライマー上の制限酵素ＫｐｎＩと、８１番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む領域を置き換えるのにＰｓｔＩなどの適当な制限酵素により消化し、ＢＣ２ＬＣＮ組換えベクターｐＥＴＢＣ２ＬＣＮの対応する領域と置き換えて、８１番目のアミノ酸配列に一重変異をもつ発現ベクターｐＥＴＢＣ２ＬＣＮ（Ｅ８１Ｘ）を作製した。８１番目のアミノ酸を特定は塩基配列解析により行った。
（３）組換えＢＣ２ＬＣＮおよび改変型フコース結合性レクチン（Ｅ８１Ｘ）の製造
ｐＥＴＢＣ２ＬＣＮまたはｐＥＴＢＣ２ＬＣＮ（Ｅ８１Ｘ）により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ｐＥＴベクターの一般的な発現培養条件により培養を行い、組換えＢＣ２ＬＣＮまたは改変型フコース結合性レクチンを生産させた。菌体からのタンパク質抽出は超音波破砕またはＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（メルクミリポア社製）を用いて、一般的な方法により菌体から、組換えＢＣ２ＬＣＮまたは改変型フコース結合性レクチンを含む可溶性タンパク質抽出液を回収した。可溶性タンパク質抽出液中の組換えＢＣ２ＬＣＮまたは改変型フコース結合性レクチンの単離は、組換えＢＣ２ＬＣＮおよび改変型フコース結合性レクチンのＮ末端側に連結したポリヒスチジンを利用し、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ Ｒｅｓｉｎ（メルクミリポア社製）を用いたニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーにより行った。
（４）組換えＢＣ２ＬＣＮおよび改変型フコース結合性レクチン（Ｅ８１Ｘ）の糖鎖結合性評価
前記（３）で得られた組換えＢＣ２ＬＣＮおよび改変型フコース結合性レクチン（Ｅ８１Ｘ）のＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する結合性評価は、ビアコアを用いた表面プラズモン共鳴法により行った。具体的には、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００機器（ＧＥヘルスケア社製）を用い、アナライトを組換えＢＣ２ＬＣＮまたは改変型フコース結合性レクチン、固相をＨタイプ１型糖鎖、Ｈタイプ３型糖鎖としてカイネティクス解析を行った。センサーチップはデキストランがコートされたＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥヘルスケア社製）を使用し、デキストランにストレプトアビジン（和光純薬）をアミンカップリング法により固定した後、ビオチン標識されたＨタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ社製）を添加し、ビオチンとストレプトアビジンの反応により糖鎖をセンサーチップ上に固定して作製した。
糖鎖親和性の測定はカイネティクス解析により行った。緩衝液はＨＢＳ−ＥＰ＋を用い、結合反応は流速３０μｌ／分、結合時間は６分間、解離時間は３分間とした。センサーチップの再生は２５ ｍＭの水酸化ナトリウムを用い、流速３０μｌ／分、再生時間１５秒で行った。アナライトタンパク質の濃度は１〜１００ ｎＭで行った。解析は解析ソフト（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｖｅｒｓｉｏｎ １．１．１）を用いて行い、１：１ Ｂｉｎｄｉｎｇのフィッティングにより解離定数（Ｋ_Ｄ）を算出した。糖鎖結合性評価の結果から、Ｈタイプ１型糖鎖への結合性を維持した８１番目のグルタミン酸がヒスチジンに置換された変異を含む発現ベクターｐＥＴＢＣ２ＬＣＮ（Ｅ８１Ｈ）を含む、８１番目のグルタミン酸が他のアミノ酸に置換された変異を含む発現ベクターｐＥＴＢＣ２ＬＣＮ（Ｅ８１Ｘ）を選択した。
（５）改変型フコース結合性レクチン（Ｅ８１Ｘ）への変異導入（７７番目セリンのアミノ酸置換）
変異導入法の概要を図１に示した。糖鎖結合部位周辺の７７番目のセリンに対して、縮重プライマーを用いたＰＣＲにより行った。配列番号７に示した縮重プライマーは、７７番目のセリンに対応する塩基配列をＮＮＢ（Ｎ＝Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔいずれか、Ｂ＝Ｃ，Ｇ，Ｔいずれか）とし、７７番目のアミノ酸が全２０種類のアミノ酸に置換されるよう設計した。変異導入のためのＰＣＲは、鋳型は前記（１）の発現ベクターｐＥＴＢＣ２ＬＣＮを用い、プライマーは、配列番号７に示した７７番目の縮重配列を含み、３‘末端に制限酵素ＫｐｎＩをもつ縮重プライマーと、配列番号８に示したｐＥＴベクターのプロモーター領域のプライマーを用いた。ＰＣＲ反応は前記（２）と同様に行った。得られた７７番目のセリンをコードする塩基配列に変異を含むＰＣＲ産物は、縮重プライマー上の制限酵素ＫｐｎＩと、７７番目のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む領域を置き換えるのにＰｓｔＩなどの適当な制限酵素により消化し、前記（２）で作製した８１番目のアミノ酸配列に一重変異をもつ発現ベクターＢＣ２ＬＣＮ組換えベクターｐＥＴＢＣ２ＬＣＮ（Ｅ８１Ｘ）のうち、前記（４）でＨタイプ１型糖鎖への親和性が確認された変異をもつ発現ベクターの対応する領域と置き換えて、８１番目と７７番目のアミノ酸に二重変異をもつ発現ベクターｐＥＴＢＣ２ＬＣＮ（Ｓ７７Ｘ／Ｅ８１Ｘ）を作製した。７７番目と８１番目のアミノ酸の特定は塩基配列解析により行った。作製できた１０種類の発現ベクターｐＥＴＢＣ２ＬＣＮ（Ｓ７７Ｘ／Ｅ８１Ｘ）を表１に示した。

（６）改変型フコース結合性レクチン（Ｓ７７Ｘ／Ｅ８１Ｘ）の製造
表１に示した１０種類の発現ベクターｐＥＴＢＣ２ＬＣＮ（Ｓ７７Ｘ／Ｅ８１Ｘ）の大腸菌発現と改変型フコース結合性レクチンの製造は、前記（３）と同様の方法で行った。改変型フコース結合性レクチンの発現量は、配列番号１で示したアミノ酸配列からなる組換えＢＣ２ＬＣＮと大差なかった。
（７）改変型フコース結合性レクチン（Ｓ７７Ｘ／Ｅ８１Ｘ）の糖鎖結合性評価
前記（６）で得られた改変型フコース結合性レクチン（Ｓ７７Ｘ／Ｅ８１Ｘ）のＨタイプ１型糖鎖（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）とＨタイプ３型糖鎖に対する結合性評価は、前記（４）と同様に行った。

表２に、実施例１と２および比較例１から９として、前記（３）で作製した組換えＢＣ２ＬＣＮと、前記（６）で製造した改変型フコース結合性レクチンの、Ｈタイプ１型糖鎖およびＨタイプ３型糖鎖に対する解離定数を示した。改変型フコース結合性レクチン（Ｓ７７Ｘ／Ｅ８１Ｘ）のうち、Ｈタイプ１型糖鎖に対して良好な結合性を有し、かつ、Ｈタイプ３型糖鎖に対する結合性が著しく低下した変異として、配列番号２で示した改変型フコース結合性レクチン（Ｓ７７Ｐ／Ｅ８１Ｈ、実施例１）および配列番号３で示した改変型フコース結合性レクチン（Ｓ７７Ｔ／Ｅ８１Ｈ、実施例２）を得ることができた。改変型フコース結合性レクチン（Ｓ７７Ｐ／Ｅ８１Ｈ、実施例１）のカイネティクス解析結果を図２に示した。

Claims (6)

1. 以下の（ａ）又は（ｂ）の改変型フコース結合性レクチン。
   （ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列において、以下の（ｉ）および（ｉｉ）に記載のアミノ酸置換のいずれか１つ以上を含むアミノ酸配列からなる改変型フコース結合性レクチン
   （ｉ）配列番号１の７７番目のセリンのプロリンまたはスレオニンへの置換
   （ｉｉ）配列番号１の８１番目のグルタミン酸のヒスチジンへの置換
   （ｂ）上記（ａ）の改変型フコース結合性レクチンのアミノ酸配列において、１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＦｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃの構造を含む糖鎖を認識する改変型フコース結合性レクチン。
2. 請求項１に記載の改変型フコース結合性レクチンをコードするＤＮＡ。
3. 請求項２に記載のＤＮＡを含有する組換えベクター。
4. 請求項３に記載の組換えベクターで宿主を形質転換した、請求項１に記載の改変型フコース結合性レクチンを生産可能な形質転換体。
5. 宿主が大腸菌である、請求項４に記載の形質転換体。
6. 請求項４または５に記載の形質転換体を培養することにより改変型フコース結合性レクチンを生産する工程、得られた培養物から生産された改変型フコース結合性レクチンを回収する工程、の２つの工程を含む、請求項１に記載の改変型フコース結合性レクチンの製造方法。

Images