JP6814043B2 - 炭水化物結合タンパク質 - Google Patents
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Description
グリコシル化及び炭水化物認識は、真核生物学の欠くことのできない必須の特徴である。生物中に存在する多数のグリカン(グライコーム)は、細胞局在及び一時的状態を含む多くの特徴に依存する動的特徴であり、かつ疾患状態、例えば、癌で不安定になる、又は病原体による接着に利用され得る。グリコシル化の変化は、疾患バイオマーカーとして機能し得るだけではなく、組換え治療用生物製剤の薬理学的特性に影響を与え得る。グリカンの不均質性は、ロット間の一貫性、免疫原性、薬物動態、活性、及びクリアランスに影響を与え得る。タンパク質及び核酸の場合とは異なり、グリカンの配列決定及び構造の特徴付けは、骨の折れる多段階プロセスであり、典型的には、サンプルの濃縮、酵素消化、及び質量分光分析、リアルタイム監視ができないプロセスを必要とする。3分の2を超える治療用生物製剤が、グリコシル化されており、バッチの許容には、グリコシル化パターンが設定範囲内である必要がある。
本発明は、グリカン特異的な分析、診断、及び治療のツール及び試薬、これらの使用方法、並びにグリカン特異的な分析、診断、及び治療のツール及び試薬の調製プロセスに関する。N−グリカンプロセシング酵素、ペプチド−N4−(N−アセチルβ−D−グルコサミニル)アスパラギンアミダーゼ(また、一般的にはペプチド:Nグリカナーゼ又はPNGase Fとして知られている)は、突然変異によって触媒的に不活性化される。さらなる突然変異により、特定のグリカンに対する高い親和性かつ特異性を含むレクチン様の性質を有する触媒的に不活性な炭水化物結合タンパク質が得られる。一実施形態では、触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質は、N結合型グリカンに対する親和性及び特異性を示し;別の実施形態では、触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質は、O結合型グリカン、例えば、O結合型N−アセチルグルコサミン(O結合型GlcNAc)又はO結合型N−アセチルガラクトサミン(O結合型GalNAc)に対する親和性及び特異性を示し;さらに別の実施形態では、触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質は、N結合型グリカン及びO結合型グリカンの両方に対する親和性及び特異性を示す。触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質は、ペプチドまたはタンパク質に共有結合したグリカンに結合する;任意選択的に、触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質は、遊離グリカンにも結合する。
(a)D57R、D60A、Y62G、E118A、S155D、I156T、G192C、及びE206S
(b)D57C、D60A、Y62W、E118A、S155Q、I156T、G192T、及びE206R
(c)D57L、D60C、I156L、G192I、E206S、及びR248W
(d)D57W、D60C、I156M、G192I、E206W、及びR248S
(e)D60C、I156L、G192I、E206S、及びR248W
(f)D57L、D60A、I156L、G192I、E206S、及びR248W
(g)D57L、I156L、G192I、E206S、及びR248W
(h)D57L、D60C、E118Q、I156L、G192I、E206S、及びR248W
(i)D57L、D60C、W120X、I156L、G192I、E206S、及びR248W
(j)D57L、D60C、W120X、S155X、I156L、G192I、E206S、及びR248W
(k)D57L、D60C、K153X、I156L、G192I、E206S、及びR248W
(l)D57L、D60C、S154X、I156L、G192I、E206S、及びR248W
(m)D57L、D60C、S155X、I156L、G192I、E206S、及びR248W
(n)D57L、D60C、I156X、G192I、E206S、及びR248W
(o)D57L、D60C、G192I、E206S、及びR248W
(p)D57L、D60C、G192I、及びR248W
(q)D57L、D60C、I156L、D157X、G192I、E206S、及びR248W
(r)D57L、D60C、I156L、E206S、及びR248W
(s)D57L、D60C、I156L、G192I、及びR248W
(t)D57L、D60C、I156L、G192I、及びE206S。
[本発明1001]
触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質であって、対応する野生型PNGase Fタンパク質と比べて複数のアミノ酸突然変異を有し、前記複数の突然変異が、
(a)前記PNGase Fタンパク質の触媒活性を低下又は消失させる少なくとも1つの第1の突然変異;及び
(b)結合親和性又は結合特異性に影響を与える少なくとも1つの第2の突然変異
を含む、触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1002]
前記第2の突然変異が、
(i)N結合型グリカンに対する結合親和性を高め;かつ/又は
(ii)O結合型グリカンに対する結合特異性及び親和性を増加させる
突然変異を含む、本発明1002の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1003]
前記O結合型グリカンがO結合型GlcNAcを含む、本発明1002の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1004]
前記O結合型グリカンがO結合型GalNAcを含む、本発明1002の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1005]
前記対応する野生型タンパク質が、F.メニンゴセプチカム(F.meningosepticum)からのPNGase F(配列番号1)、F.メニンゴセプチカム(F.meningosepticum)からのPNGase F−II(配列番号3)、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)からのPNGase F(配列番号4)、及びフラボバクテリウム・ミリコラ(Flavobacterium miricola)からのPNGase F(配列番号5)からなる群から選択されるタンパク質を含む、本発明1001〜1004のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1006]
前記対応する野生型タンパク質が、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム(Flavobacterium meningosepticum)PNGase F(配列番号1)を含む、本発明1005の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1007]
前記第1の突然変異が、F.メニンゴセプチカム(F.meningosepticum)PNGase F(配列番号1)におけるアミノ酸位置60、118、206、若しくは248、又は相同PNGase F配列における対応する位置に突然変異を含む、前記の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1008]
前記第2の突然変異が、F.メニンゴセプチカム(F.meningosepticum)PNGase F(配列番号1)におけるアミノ酸位置57、60、62、118、119、120、123、125、153、154、155、156、157、192、206、若しくは248、又は相同PNGase F配列における対応する位置に突然変異を含む、前記の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1009]
配列番号1のD57位、又は相同PNGase F配列の対応する位置にロイシン、アラニン、メチオニン、アルギニン、リジン、システイン、若しくはトリプトファンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1008のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1010]
配列番号1のD60位、又は相同PNGase F配列の対応する位置にアラニン、システイン、バリン、セリン、グリシン、若しくはトリプトファンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1009のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1011]
配列番号1のY62位、又は相同PNGase F配列の対応する位置にグリシン、トリプトファン、セリン、若しくはトレオニンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1010のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1012]
配列番号1のE118位、又は相同PNGase F配列の対応する位置にアラニン、グルタミン、トレオニン、若しくはシステインでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1011のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1013]
配列番号1のT119位、又は相同PNGase F配列の対応する位置にアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、若しくはバリンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1012のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1014]
配列番号1のW120位、又は相同PNGase F配列の対応する位置にチロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、トレオニン、若しくはセリンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1013のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1015]
配列番号1のK123位、又は相同PNGase F配列の対応する位置にアスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、若しくはトリプトファンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1014のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1016]
配列番号1のR125位、又は相同PNGase F配列の対応する位置にチロシン、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、若しくはトリプトファンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1015のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1017]
配列番号1のK153位、又は相同PNGase F配列の対応する位置にヒスチジン、アルギニン、グルタミン、トリプトファン、若しくはチロシンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1016のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1018]
配列番号1のS154位、又は相同PNGase F配列の対応する位置にトレオニン、アスパラギン、リジン、グルタミン、トリプトファン、若しくはチロシンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1017のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1019]
配列番号1のS155位、又は相同PNGase F配列の対応する位置にアルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン、トリプトファン、若しくはチロシンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1018のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1020]
配列番号1のI156位、又は相同PNGase F配列の対応する位置にロイシン、トレオニン、メチオニン、グリシン、トリプトファン、若しくはヒスチジンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1019のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1021]
配列番号1のD157位、又は相同PNGase F配列の対応する位置にアスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、トリプトファン、若しくはチロシンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1020のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1022]
配列番号1のG192位、又は相同PNGase F配列の対応する位置にイソロイシン、トリプトファン、アラニン、ヒスチジン、トレオニン、システイン、若しくはセリンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1021のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1023]
配列番号1のE206位、又は相同PNGase F配列の対応する位置にセリン、トリプトファン、ヒスチジン、システイン、若しくはアルギニンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1022のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1024]
配列番号1のR248位、又は相同PNGase F配列の対応する位置にトリプトファン、セリン、プロリン、バリン、アスパラギン酸、チロシン、フェニルアラニン、若しくはリジンでのアミノ酸置換を含む、本発明1001〜1023のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1025]
D57位、D60位、I156位、G192位、及びE206位に突然変異を含む、本発明1001〜1024のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1026]
Y62位、E118位、S155位、R248W位、又はこれらの任意の組合せの位置に突然変異をさらに含む、本発明1025の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1027]
(a)D57R、D60A、Y62G、E118A、S155D、I156T、G192C、及びE206S
(b)D57C、D60A、Y62W、E118A、S155Q、I156T、G192T、及びE206R
(c)D57L、D60C、I156L、G192I、E206S、及びR248W
(d)D57W、D60C、I156M、G192I、E206W、及びR248S
(e)D60C、I156L、G192I、E206S、及びR248W
(f)D57L、D60A、I156L、G192I、E206S、及びR248W
(g)D57L、I156L、G192I、E206S、及びR248W
(h)D57L、D60C、E118Q、I156L、G192I、E206S、及びR248W
(i)D57L、D60C、W120X、I156L、G192I、E206S、及びR248W
(j)D57L、D60C、W120X、S155X、I156L、G192I、E206S、及びR248W
(k)D57L、D60C、K153X、I156L、G192I、E206S、及びR248W
(l)D57L、D60C、S154X、I156L、G192I、E206S、及びR248W
(m)D57L、D60C、S155X、I156L、G192I、E206S、及びR248W
(n)D57L、D60C、I156X、G192I、E206S、及びR248W
(o)D57L、D60C、G192I、E206S、及びR248W
(p)D57L、D60C、G192I、及びR248W
(q)D57L、D60C、I156L、D157X、G192I、E206S、及びR248W
(r)D57L、D60C、I156L、E206S、及びR248W
(s)D57L、D60C、I156L、G192I、及びR248W
(t)D57L、D60C、I156L、G192I、及びE206S
から選択される複数の突然変異を含む、本発明1001〜1026のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1028]
クローンD60A、R617、R6113、R911、R9113、又はR911C60Aによって発現される、本発明1001〜1027のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1029]
O結合型GlcNAc、O結合型GalNAc、又はO結合型GlcNAc及びO結合型GalNAcの両方に対する結合特異性及び親和性を増加させる第2の突然変異を含む、本発明1001〜1028のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1030]
N結合型グリカン、N結合型複合糖質、N結合型糖ペプチド、N結合型糖タンパク質、又は遊離N−グリカンに結合する、本発明1001〜1029のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1031]
O結合型グリカン、O結合型複合糖質、O結合型糖ペプチド、O結合型糖タンパク質、又は遊離O−グリカンに結合する、本発明1001〜1030のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質。
[本発明1032]
第2の成分に共有結合する、本発明1001〜1031のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質を含む第1の成分を含むコンジュゲート。
[本発明1033]
前記第2の成分がタンパク様成分である、本発明1032のコンジュゲート。
[本発明1034]
前記第2の成分が非タンパク様成分である、本発明1032のコンジュゲート。
[本発明1035]
前記第2の成分が治療薬又は診断薬である、本発明1032〜1034のいずれかのコンジュゲート。
[本発明1036]
本発明1001〜1031のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質を含む融合タンパク質。
[本発明1037]
本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質を含むアフィニティーマトリックス。
[本発明1038]
固形支持体、表面、カラム、樹脂、ビーズ、粒子、及びナノ粒子からなる群から選択される、本発明1037のアフィニティーマトリックス。
[本発明1039]
本発明1001〜1038のいずれかの、触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質、コンジュゲート、融合タンパク質、又はアフィニティーマトリックスと、使用説明書とを含むキット。
[本発明1040]
本発明1001〜1033のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質又はコンジュゲート、又は本発明1036の融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド。
[本発明1041]
本発明1040のポリヌクレオチドを含むベクター。
[本発明1042]
発現ベクターである、本発明1041のベクター。
[本発明1043]
本発明1041又は1042のベクターを含む宿主細胞。
[本発明1044]
細菌細胞である、本発明1043の宿主細胞。
[本発明1045]
大腸菌(Escherichia coli)細胞又は酵母細胞である、本発明1043の宿主細胞。
[本発明1046]
触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質を作製するための方法であって、本発明1001〜1033のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質又はコンジュゲート、又は本発明1036の融合タンパク質を、単離ポリヌクレオチド、発現ベクター、又は宿主細胞から発現させるステップを含む、方法。
[本発明1047]
N結合型グリカンを検出するための方法であって:
生物学的又は実験室サンプルを、PNGase Fタンパク質のN−グリカンへの結合を可能にする条件下で本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させるステップ;及び
前記N結合型グリカンを検出するステップ
を含む、方法。
[本発明1048]
前記検出されたN結合型グリカンを特徴付けるステップをさらに含む、本発明1047の方法。
[本発明1049]
前記N結合型グリカンを特徴付けるステップが、
前記グリカンの構成糖を特定すること、
前記グリカンの糖組成を決定すること、
前記グリカン内の結合位置を決定すること、又は
前記グリカンの立体化学を決定すること
を含む、本発明1048の方法。
[本発明1050]
O結合型グリカンを検出するための方法であって:
生物学的又は実験室サンプルを、PNGase Fタンパク質のO結合型グリカンへの結合を可能にする条件下で本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させるステップ;及び
O結合型グリカンを検出するステップ
を含む、方法。
[本発明1051]
前記検出されたO結合型グリカンを特徴付けるステップをさらに含む、本発明1050の方法。
[本発明1052]
前記O結合型グリカンを特徴付けるステップが、
前記グリカンの構成糖を特定すること、
前記グリカンの糖組成を決定すること、
前記グリカン内の結合位置を決定すること、又は
前記グリカンの立体化学を決定すること
を含む、本発明1051の方法。
[本発明1053]
前記O結合型グリカンが、O結合型GlcNAc又はO結合型GalNAcを含む、本発明1050〜1052のいずれかの方法。
[本発明1054]
遊離N−グリカンを検出するための方法であって:
生物学的又は実験室サンプルを、PNGase Fタンパク質の遊離N−グリカンへの結合を可能にする条件下で本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させるステップ;及び
前記遊離N−グリカンを検出するステップ
を含む、方法。
[本発明1055]
遊離O−グリカンを検出するための方法であって:
生物学的又は実験室サンプルを、PNGase Fタンパク質の遊離O−グリカンへの結合を可能にする条件下で本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させるステップ;及び
前記遊離O−グリカンを検出するステップ
を含む、方法。
[本発明1056]
前記遊離O−グリカンが、O−GlcNAc又はO−GalNAcを含む、本発明1055項の方法。
[本発明1057]
N結合型グリカン又は遊離N−グリカンを濃縮する、単離する、又は精製するための方法であって:
生物学的又は実験室サンプルを、PNGase Fタンパク質のN−グリカンへの結合を可能にする条件下で本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させて、濃縮された、単離された、又は精製されたN結合型グリカン又は遊離N−グリカンを得るステップ
を含む、方法。
[本発明1058]
O結合型グリカン又は遊離O−グリカンを濃縮する、単離する、又は精製するための方法であって:
生物学的又は実験室サンプルを、PNGase Fタンパク質のN−グリカンへの結合を可能にする条件下で本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質に接触させて、濃縮された、単離された、又は精製されたO結合型グリカン又は遊離O−グリカンを得るステップ
を含む、方法。
[本発明1059]
本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質を含む診断組成物又は治療組成物。
[本発明1060]
前記PNGase Fタンパク質、前記コンジュゲート、又は前記融合タンパク質が検出可能に標識される、本発明1059の診断組成物又は治療組成物。
[本発明1061]
前記検出可能な標識が、放射性標識、蛍光標識、りん光標識、比色標識、酵素標識、免疫標識、磁気標識、常磁性標識、反磁性標識、又は電磁標識を含む、本発明1060の診断組成物又は治療組成物。
[本発明1062]
本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の、治療薬としての使用。
[本発明1063]
本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の、診断薬としての使用。
[本発明1064]
標的薬物送達のための、本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の使用。
[本発明1065]
生物学的又は実験室サンプル中のN結合型グリカン又は遊離N−グリカンの存在又は量の検出のための、本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の使用。
[本発明1066]
生物学的又は実験室サンプル中のO結合型グリカン又は遊離O−グリカンの存在又は量の検出のための、本発明1001〜1036のいずれかの触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質、コンジュゲート、又は融合タンパク質の使用。
[本発明1067]
前記O結合型グリカンが、O結合型GlcNAc又はO結合型GalNAcを含む、本発明1066の使用。
[本発明1068]
前記遊離O−グリカンが、O−GlcNAc又はO−GalNAcを含む、本発明1066の使用。
本発明は、酵素ペプチド−N4−(N−アセチル−β−D−グルコサミニル)アスパラギンアミダーゼ(PNGase F)に由来する触媒的に不活性な炭水化物結合タンパク質、及び本明細書に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質の作製及び使用法方法を提供する。好ましいPNGase F酵素及びコード配列は、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム(Flavobacterium meningosepticum)から得られるPNGase Fである。本発明は、F.メニンゴセプチカム(F.meningosepticum)からのPNGase Fについて主に説明するが、PNGase Fの他の供給源も利用できることを理解されたい。
野生型PNGase Fにおける少なくとも1つのアミノ酸は、突然変異体PNGase Fを触媒的に不活性にするために突然変異される。触媒活性を低下又は消失させる1つ以上の突然変異は、本明細書では「第1の」(不活性化させる)突然変異と呼ばれる。一実施形態では、酵素活性は、PNGase Fのアミノ酸残基60、又は別の生物から得たPNGase Fの対応する位置を突然変異させることによって低下又は消失される。F.メニンゴセプチカム(F.meningosepticum)PNGase Fのアミノ酸位置を本明細書で言及するときは必ず、このアミノ酸位置が、他の生物から得られるPNGase F酵素の対応する位置を包含することをここで理解されたい。F.メニンゴセプチカム(F.meningosepticum)PNGase Fでは、60位の野生型残基はアスパラギン酸(D)である。この残基は、突然変異が触媒活性を低下又は消失させるのであれば、その他のアミノ酸に突然変異させることができる。60位で利用できるアミノ酸の例としては、限定されるものではないが、アラニン、アルギニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、又はバリン、及び触媒活性を低下又は消失させるその他のアミノ酸、例えば、セレノシステインが挙げられる。PNGase Fの60位の好ましい突然変異としては、アラニン、アスパラギン、システイン、バリン、セリン、又はグリシンが挙げられる。一実施形態では、60位の突然変異は、アラニン、システイン、又はアスパラギン、即ち、D60A、D60C、又はD60Nである。別の実施形態では、60位の突然変異は、アラニン(A)、システイン(C)、又はアスパラギン(N)以外の、触媒活性を低下又は消失させる任意のアミノ酸である。別の実施形態では、D60を欠失させることができる。
野生型PNGase Fにおける少なくとも1つのアミノ酸が、(i)第1の活性を阻害する突然変異のみを有する対応する突然変異体PNGase Fの結合親和性と比較して、N結合型グリカンに対する触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fの結合親和性を高めるため、又は(ii)1つ以上の(非天然の基質である)O結合型グリカンに対する結合特異性及び親和性を高めるためにPNGase Fの結合特異性を変更するため、又は(i)及び(ii)の両方のために突然変異される。結合特異性又は親和性を高める又は変更する1つ以上の突然変異は、本明細書では「第2の」突然変異と呼ばれる。
N結合型グリカンに対する結合親和性の増加、又はO結合型グリカンに対する結合親和性を高めるためのリガンド特異性の変更は、PNGase Fの57位、60位、62位、118位、119位、120位、123位、125位、153位、154位、155位、156位、157位、192位、206位、及び248位、又は別の生物から得たPNGase Fの対応する位置におけるいずれか1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、又は13全部のアミノ酸残基の突然変異によって達成することができる。好ましい触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質は、これらの位置の少なくとも3つ、これらの位置の少なくとも4つ、これらの位置の少なくとも5つ、又はこれらの位置の少なくとも6つに突然変異を含み得る。好ましくは、残基60、118、又は206の少なくとも1つが突然変異される。
D57:ロイシン、アラニン、メチオニン、アルギニン、リジン、システイン、トリプトファン
D60:アラニン、システイン、バリン、セリン、グリシン、トリプトファン
Y62:グリシン、トリプトファン、セリン、トレオニン
E118:アラニン、グルタミン、トレオニン、システイン
T119:アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン
W120:チロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、トレオニン、セリン
K123:アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン
R125:チロシン、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン
K153:ヒスチジン、アルギニン、グルタミン、トリプトファン、チロシン
S154:トレオニン、アスパラギン、リジン、グルタミン、トリプトファン、チロシン
S155:アルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン、トリプトファン、チロシン
I156:ロイシン、トレオニン、メチオニン、グリシン、トリプトファン、ヒスチジン
D157:アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、トリプトファン、チロシン
G192:イソロイシン、トリプトファン、アラニン、ヒスチジン、トレオニン、システイン、セリン
E206:セリン、トリプトファン、ヒスチジン、システイン、アルギニン
R248:トリプトファン、セリン、プロリン、バリン、アスパラギン酸、チロシン、フェニルアラニン、リジン
が挙げられる。
突然変異体1:D57R、D60A、Y62G、E118A、S155D、I156T、G192C、及びE206S
突然変異体2:D57C、D60A、Y62W、E118A、S155Q、I156T、G192T、及びE206R
突然変異体3:D57L、D60C、I156L、G192I、E206S、及びR248W
突然変異体4:D57W、D60C、I156M、G192I、E206W、及びR248S
突然変異体5:D60C、I156L、G192I、E206S、及びR248W
突然変異体6:D57L、D60A、I156L、G192I、E206S、及びR248W
突然変異体7:D57L、I156L、G192I、E206S、及びR248W
突然変異体8:D57L、D60C、E118Q、I156L、G192I、E206S、及びR248W
突然変異体9:D57L、D60C、W120X、I156L、G192I、E206S、及びR248W
突然変異体10:D57L、D60C、W120X、S155X、I156L、G192I、E206S、及びR248W
突然変異体11:D57L、D60C、K153X、I156L、G192I、E206S、及びR248W
突然変異体12:D57L、D60C、S154X、I156L、G192I、E206S、及びR248W
突然変異体13:D57L、D60C、S155X、I156L、G192I、E206S、及びR248W
突然変異体14:D57L、D60C、I156X、G192I、E206S、及びR248W
突然変異体15:D57L、D60C、G192I、E206S、及びR248W
突然変異体16:D57L、D60C、G192I、及びR248W
突然変異体17:D57L、D60C、I156L、D157X、G192I、E206S、及びR248W
突然変異体18:D57L、D60C、I156L、E206S、及びR248W
突然変異体19:D57L、D60C、I156L、G192I、及びR248W
突然変異体20:D57L、D60C、I156L、G192I、及びE206S。
本発明はまた、触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F突然変異体のコンジュゲートを含む。コンジュゲートは、第1の成分として、触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F突然変異体を含み、この突然変異体は、少なくとも1つの第2の成分に共有結合し、この第2の成分は、タンパク様成分又は非タンパク様成分であり得る。一部の実施形態では、タンパク様成分を含むコンジュゲートは、周知の組換えDNA法を用いて融合タンパク質として合成することができる。一部の実施形態では、コンジュゲートは、触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F突然変異体に化学的又は酵素的にコンジュゲートするタンパク様成分又は非タンパク様成分を含む。
触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質のレクチン様の性質のために、このPNGase Fタンパク質の非常に多数の潜在的な用途は、当業者であればすぐに分かるであろう。一般に、触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F突然変異体又はそのコンジュゲートは、抗グリカン抗体が現在使用されている目的と同じあらゆる目的に使用することができる。従って、本発明の化合物は、有利なことに、診断方法、分析方法、及び治療方法を含む様々な医療方法及び実験方法において、抗グリカン抗体の代用とすることができる。同様に、触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F突然変異体又はそのコンジュゲートは、レクチンが現在使用されている目的と同じ目的に使用することができる。従って、本発明の化合物は、有利なことに、様々な診断方法及び分析実験方法において、レクチンの代用とすることができる。
触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F突然変異体又はそのコンジュゲートを使用して、生物学的サンプル又は合成サンプルにおいて、N結合型グリカン、O結合型グリカン、又は両方を検出することができる。例えば、生物学的サンプル、例えば、組織又は体液をPNGase F突然変異体又はそのコンジュゲートに接触させて、生物学的サンプルのグリコシル化及び/又は糖化のレベル又は型を検出し、かつ/又は特徴付けることができる。このグリカンの特徴付けは、このグリカンの構成糖を特定すること、このグリカンの糖組成を決定すること、このグリカン内の連結位置を決定すること、又はこのグリカンの立体化学を決定することを含み得る。別の例として、触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F突然変異体又はそのコンジュゲートは、グリコシル化のレベル又は型を監視するために、例えば、治療用抗生物質の合成において、治療用生物製剤の合成における品質管理に使用することができる。2012年9月7日に公開されたPCT国際公開第2012/118928号パンフレットを参照されたい。触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F突然変異体又はそのコンジュゲートは、親和性試薬として、又はアフィニティーマトリックスの一部として利用することができ;例えば、固体支持体、例えば、表面、カラム、樹脂、ビーズ、粒子、及びナノ粒子に取り付けて、生物学的サンプル又は合成サンプル中、又はこれらのサンプルからO結合型及び/又はN結合型化合物を検出又は濃縮するための方法で使用することができる。取り付けられたPNGase F突然変異体は、合成グリコシル化化合物の単離及び/又は精製にも使用することができる。
特定の実施形態では、本発明の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質を、治療薬として使用しても良いし、又は活性治療薬の送達のために修飾しても良い。本発明の触媒的に不活性なPNGase F誘導体は、定義されたグリカン特異性を有しているため、治療薬の送達は、生体分子、例えば、PNGase Fによって認識されるグリカン構造を有する糖タンパク質又は糖脂質を提示する細胞、組織、又は器官のみを標的とすることができる。
本発明の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase Fタンパク質は、遺伝子エンジニアリング技術を用いて宿主細胞で発現させることができる。「細胞」という語は、あらゆる型の生物細胞を包含する。宿主細胞は、真核細胞又は原核細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞は、原核細胞、例えば、細菌細胞であるが:単細胞真核生物、例えば、原生生物又は酵母も、宿主細胞として有用である。好ましい宿主細胞は、微生物細胞、好ましくは、単細胞微生物の細胞、例えば、細菌細胞又は酵母細胞である。細菌及び/又は微生物細胞の上記の選択にもかかわらず、PNGase突然変異体を、動物、植物、昆虫、酵母、原生生物、細菌、又は古細菌の細胞に限定されずに発現させることができることを理解されたい。本発明の触媒的に不活性なPNGase F誘導体を発現するようにエンジニアリングすることができる微生物細胞の例としては、大腸菌(E.coli)に加えて、広範な細菌及び酵母が挙げられ、このような細菌及び酵母には、エシェリキア属(Escherichia)、サルモネラ属(Salmonella)、クロストリジウム属(Clostridium)、ザイモモナス属(Zymomonas)、シュードモナス属(Pseudomonas)、バシラス属(Bacillus)、ロドコッカス属(Rhodococcus)、アルカリゲネス属(Alcaligenes)、クレブシエラ属(Klebsiella)、パエニバシラス属(Paenibacillus)、ラクトバシラス属(Lactobacillus)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、アルスロバクター属(Arthrobacter)、ブレビバクテリウム属(Brevibacterium)、コリネバクテリウム・カンジダ属(Corynebacterium Candida)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、ピチア属(Pichia)、及びサッカロミセス属(Saccharomyces)のメンバーが挙げられる。好ましい微生物細胞としては、限定されるものではないが、大腸菌(Escherichia coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、バシラス・リシェニフォルミス(Bacillus licheniformis)、アルカリゲネス・ユートロフス(Alcaligenes eutrophus)、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)、パエニバチルス・マセランス(Paenibacillus macerans)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)、ラクトバシラス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、エンテロコッカス・ガリナラム(Enterococcus gallinarium)、及びエンテロコッカス・フェカーリス(Enterococcus faecalis)挙げられる。
コンピューターガイド定方向進化によってエンジニアリングされた炭水化物認識バイオセンサー
この実施例では、全てのN結合型グリカンに共通のコア糖ペプチド成分を検出するための新規な試薬が開発された。コンピューターガイドバイオコンビナトリアル設計及びin vitro定方向進化の組み合わせによって、N−グリカンプロセシング酵素、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム(Flavobacterium meningosepticum)からのPNGase Fが、野生型酵素の基質に対する親和性が高い触媒的に不活性なタンパク質に変換された。レクチン様炭水化物認識生体分子の炭水化物プロセシング酵素(LECTENZ)からのエンジニアリングが、分子動力学シミュレーションを用いて最適な炭水化物−酵素相互作用を決定するためにコンピューター内で開始された。コンピューター内での構造/機能分析を、LECTENZ候補のin vitro定方向進化、選択、及び下流特徴付け(downstream characterization)のための集中的なバイオコンビナトリアルライブラリーを作製することによって検証した。表面プラズモン共鳴を利用して結合反応速度を決定した。さらに、N−グリカン保持糖タンパク質、リボヌクレアーゼB、及びN−糖ペプチドの濃縮をアフィニティークロマトグラフィーによって実証した。MCF7細胞抽出物からのN−糖タンパク質の濃縮を実証した。
炭水化物認識は、生物学的プロセスの重要な部分である。炭水化物認識は、宿主−病原体相互作用、生物学的発達に不可欠であり、疾患状態バイオマーカー検出にとって益々重要になっている82。多くの腫瘍抗原は、糖タンパク質又は糖脂質であり、疾患状態で上方制御される様々な炭水化物エピトープが同定された83。現在承認されている炭水化物腫瘍マーカーとして84、以下が挙げられる:癌胎児性抗原(CEA)、大腸癌、胃癌、膵臓癌、肺癌、及び乳癌、並びに発育中の胎児に関連した、50〜80%の炭水化物を含む糖タンパク質85;膵臓癌患者に見られる糖脂質中に存在する炭水化物抗原19−9(CA19−9)又はシアル化ルイスA抗原;及び炭水化物抗原15−3(CA15−3)、乳癌に最も広く使用される血清マーカーであり、ムチンタンパク質1(MUC1)に由来の糖タンパク質断片である86。炭水化物認識の重要性及び宿主グリコシル化の多様性により、グリカンは、検出、診断、及び治療への応用のための明確な標的である87〜92。
グリカンの新生タンパク質への共有結合は、非鋳型駆動プロセスであり、かつ約1,000の遺伝子産物を必要とし、従って、オリゴ糖の生合成には、細胞資源の莫大な投資が必要であり、グリコシル化に必要な細胞機構の欠陥は致命的であり得る91、96〜99。哺乳動物タンパク質のグリコシル化の主な型は、N結合型及びO結合型グリコシル化である。
グリカンは、レクチン、抗体、及び酵素を含むタンパク質のいくつかのクラスによって認識される。レクチン、グリカン結合タンパク質(その多くが、機能のために金属イオンを必要とする)は、多価相互作用が親和性を高めるため、ミリモルからマイクロモルの親和性及び高い結合活性効果を高頻度で有する80、109。一部のレクチンは、異なる構造間で区別することができるが、殆どのレクチンは、類似の炭水化物構造に対して非常に広範な特異性を示す110〜112。従来、レクチンは、植物起源又は真菌起源から同定されているが、動物で同定される数も増加している。レクチンアフィニティークロマトグラフィーは、最も広く適用されるグリカン、糖ペプチド、又は糖タンパク質単離技術である。しかしながら、全グリコプロテオーム(whole glycoproteome)の研究では、このアプローチの制限は、グリカンの検出を、レクチンカラム(複数可)の選択に基づいて糖タンパク質のサブセットに偏らせることである80。
ペプチド:N−グリカナーゼ(PNGase)酵素(表2)は、ポリペプチドのアスパラギン側鎖とN−グリカンの近接N−アセチル−β−D−グリコサミン(GlcNAc)との間のアミド結合の切断を触媒するN−グリカン放出酵素のクラスである。加水分解反応により、グリカン及び遊離アンモニアが放出され、アスパラギンがアスパラギン酸に変換される(図3)。
N−グリカンプロセシング酵素、ペプチド−N4−(N−アセチル−β−D−グルコサミニル)アスパラギンアミダーゼ(PNGase F)は、1984年にPlummerらによってグラム陰性土壌細菌フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム(Flavobacterium meningosepticum)(以前は、クリセオバクテリウム・メニンゴセプチカム(Chryseobacterium meningosepticum)及びエリザベスキンギア・メニンゴセプチカム(Elizabethkingia meningosepticum)として知られていた)から同定された124。PNGase酵素は、植物、動物、及び真菌の全ての様々な種から同定されたが;PNGase Fは、その最初の発見から30年経過しても確認された唯一の細菌PNGase酵素であるため、これらの他のPNGase酵素とは対照的である。近年、N−グリカナーゼ活性が変更された新規なPNGase F−IIが、同じ生物、F.メニンゴセプチカム(F.meningosepticum)から同定された。
キトビオースリガンド、N,N'−ジアセチルキトビオース、(PBD ID 1PNF)と共結晶化されたPNGase Fの第1の構造が、1995年にKuhnらによって2.0Åの解像度で公表された133。結晶化PNGase F酵素の注釈付き配列が図4に示されている。非複合体化構造(PDB IDs 1PNG&1PGS)に一致して、複合体化PNGase Fのコンフォメーション:キトビオース構造に著しい変化が見られず、このコンフォメーションがキトビオースリガンドの結合による影響を受けていないことを示している。折り畳まれたタンパク質は、2つのドメインからなり、これらのドメインはそれぞれ、残基1〜137及び143〜314から構成される。両方のドメインは、境界面が広範な水素結合接触部を有するβシートの全長に延びるように、互いに近接して位置する8本鎖逆平行βサンドイッチを有する。非複合体化構造の3つの溝に基づいて、3つの結合部位が可能であると仮定した132。分子の一面にあるボウル上の第1の溝が、L−アスパラギナーゼの活性部位に類似した残基を含んでいた132。多数の酸性残基及びトレオニン残基を含む反対面にある浅いS字状の溝が、第2の可能な結合部位として仮定された132。分子の一端における2つのドメイン間の境界の深い溝が、第3の結合部位として仮定された。いくつかの酸性残基及びセリンを含むこの溝は、5つのトリプトファン残基を有するというユニークな特性を有していた132。
PNGase Fの活性部位の残基の点突然変異試験により、D60が最初の触媒残基として確認され、E206が、反応中間状態の安定性に関与する可能性が高いことが確認された133。キトビオースリガンドの位置に基づくと、D60及びE206は、酵素が切断し得るアミン結合の両側に亘るであろう。しかしながら、糖ペプチドと複合体を形成したPNGase Fの構造は委託されておらず、従って機構は未だ確認されていない。E118の突然変異試験は、第2のGlcNAcのO6と相互作用するリガンドの反対側の末端にあり、E118が、D60及びE206によって媒介される可能性が高い触媒活性に必要な基質認識に重要であることを示している。D60A、E206、及びR248によって促進される反応機構のモデルが提案され、D60が最初の触媒残基である132、134。このモデルでは、R248は、N−グリコシド結合のカルボニル酸素と水素結合を形成すると仮定され、従って水酸化イオンによってAsn−カルボニル炭素が求核攻撃を受けやすくなる。この求核攻撃は、Wat346(PDB ID 1PGSではWat422)によって促進される可能性があり、このWat346は、複合体化構造及び非複合体化構造の両方に存在し、かつD60、E206、及びR248に近接して位置する。水酸化イオンは、Wat346からD60へのプロトンの移動によって形成され得る。Asn−カルボニル炭素は、水酸化イオンから求核攻撃を受ける可能性があり、遷移中間状態を形成する。D60は、そのプロトンをアミン結合の窒素に供与し、アミド結合の切断が完了する。この提案されるモデルでは、D60のpKaを、反応の最適pHである4.5から8.0に引き上げる必要があろう。このような活性部位の局所環境の変化は、E206及びD60を取り囲む近傍の芳香族残基(Y85、W251、W207、及びW191)によって引き起こされる疎水性環境によって実現可能であろう。
30年前のPNGase Fの発見以来、特徴付けの前にN結合型グリカンを放出するための標準的なツールになった。PNGase Fは、キトビオースコア及びN−グリカンペプチドとタンパク質のコンジュゲートに共通のアスパラギン結合ペプチドモチーフの両方を認識するため、N−グリカン保持糖タンパク質に対して広範な特異性を有する。基質特異性試験により、触媒活性に必要な最小グリカンモチーフがキトビオースコアであることが確認された135。加えて、認識される最小ペプチドモチーフは、全てのN結合型グリカンに共通のAsn−X−Ser/Thrグリコシル化モチーフである135。興味深いことに、最適な酵素活性は、キトビオース結合ペンタペプチド、Tyr−Ile−Asn−Ala−Ser(配列番号21)で観察され、酵素が、グリカン結合アスパラギンの上流及び下流の両方の残基を認識することを示唆している135。
理論的アプローチ及び実験的アプローチの両方における近年の進展は、糖鎖生物学の分野を進展させる特有の機会を提供する。具体的には、高スループット定方向進化戦略を用いる計算化学及び構造生物学ツールを利用することにより、所望の機能を有するクローンの同定に集中した新規なタンパク質ライブラリーの合理的なコンピューター内での設計を実現可能にする8〜15。計算によるドッキング及び分子動力学は、非常に複雑かつ柔軟な性質のタンパク質−グリカン相互作用を調べるための不可欠なツールとなってきている9、70。さらに、結合相互作用を駆動する熱力学的寄与を評価するための結合自由エネルギーの決定は、その他の方法では決定することができない、アミノ酸によって破壊されるタンパク質−リガンド相互作用の洞察を提供する強力な計算技術である8、10、12。これらの計算ツールは、生体分子の相互作用の理解を深める役割を果たし、かつ新規な機能を有する生体分子の進展をガイドする。コンピューター内での結合の構造分析、分子動力学(MD)、及びin vitro定方向進化を用いる結合自由エネルギーの分解戦略は、両方の分野を進展させるだけではなく、糖鎖生物学の分野に関連した新規な生体分子の進展も促進する知識ベースのタンパク質エンジニアリングを可能にする3、31、40。
バイオコンビナトリアルライブラリーのコンピューターガイド設計
コンピューターガイドライブラリー設計
野生型F.メニンゴセプチカム(F.meningosepticum)N−グリカンプロセシング酵素、wtPNGase Fは既に、2.0Åの解像度で、活性部位でキトビオース二糖と共結晶化されている(PDB ID:1PNF)1。この1PNF X線結晶構造モデルを用いて、PNGase F−N、N'−ジアセチルキトビオース(GlcNAcβ1−4GlcNAc)複合体の5ナノ秒の完全溶媒和MDシミュレーションを、AMBER−GLYCAMタンパク質−炭水化物力場を利用する圧力及び室温で、水中で行った2〜4。実験的構造に対する、Cα原子の位置における二乗平均差(RMSD)を、シミュレーション時間の関数として決定し、比較的低い1.5Åの平均(RMSD)(図8)は、このシミュレーションにより実験的構造が再現されたことを示した。加えて、複合体は、二糖リガンドとタンパク質との間の実験的に観察された水素結合相互作用を維持した(表3)。複合体のシミュレーションが安定であり、かつ実験的構造データに一致しているようであることを考慮して、相互作用エネルギーを計算した。加熱及び平衡前の期間(1ナノ秒)からのデータは、次の分析には含めなかった。AMBERで実施されるMM−GBSAプロトコルを用いて、結合エネルギーに対する残基当たりの分子力学的(MM)寄与を、2〜5ナノ秒の間、PNGase Fの314の各アミノ酸に対して計算した;一般化Born(GB)連続溶媒モデルを利用して、脱溶媒和エネルギーを推定した5。加えて、MDデータを、コンピューターアラニンスキャニングに利用した。図9は、リガンドの4.5Åの範囲の残基を示している。
2つの酵母表面ディスプレイ・バイオコンビナトリアル・ライブラリーが設計され、これらのライブラリーは、表4に示されている最適化のためのいくつかの計算上の予測残基を含む。ライブラリー1(GenScript,Piscataway,NJ)が、NNKコドン縮重を用いて合成され、このライブラリー1は、全てのクローンに固定D60A突然変異体を含めた。NNKコドン縮重は、ランダム停止コドンの導入の可能性を低下させると共に、NNNコドン縮重に対するコドンバイアスも最小限にする6。GenScriptライブラリー1の配列及び突然変異部位が図10に示されている。ライブラリー2(GeneArt AG,Regensburg,Germany)が、全てのアミノ酸を等モル分布させるカセット突然変異誘発を用いて合成され、このライブラリー2は、19のアミノ酸(即ち、Dを除く)を用いてランダム化D60位を含めた。GeneArtライブラリー2の配列及び突然変異の部位は、図11に示されている。
構築した酵母ディスプレイPNGase Fライブラリーを、標的N−グリカンに対する親和性が高いクローンの選択に利用した。酵母ライブラリーを、約24時間、30℃の振盪インキュベーターで、選択増殖培地で一晩増殖させた。酵母細胞表面上のAga2p−PNGase F融合タンパク質の発現及びディスプレイが、Gal1−10プロモーターの下であり(図12及び図13)、従って酵母ライブラリーを、20℃の振盪インキュベーターで、ガラクトース含有培地で一晩誘導した。誘導効率を、一次抗c−myc抗体を用いたフローサイトメトリーによって、完全に発現されたAga−2p−PNGase F融合タンパク質のC末端c−mycタグを検出して決定した(データは不図示)。少なくとも60%の誘導クローンを含む誘導酵母ディスプレイライブラリーを、N−グリカン標的に対する親和性の高いクローンの選択に使用した。
分子動力学及び残基当たりの結合自由エネルギー分解
PNGase F−N,N'−ジアセチルキトビオース(GlcNAcβ1−4GlcNAc)複合体の5ナノ秒の完全溶媒和MDシミュレーションを、AMBER−GLYCAMタンパク質−炭水化物力場を利用する圧力及び室温で、水中で行った。AMBERで実施される一般化Born(GB)連続溶媒モデルを利用して、結合エネルギーに対する残基当たりの寄与を、PNGase Fの313の各アミノ酸について計算した5。典型的なMM−GB/PB計算では、MD軌道から抽出された各構造「スナップ写真」のタンパク質(ΔGPROTEIN)、リガンド(ΔGLIGAND)、及び複合体(ΔGCOMPLEX)について自由エネルギーを計算する。5ナノ秒の軌道から、最初の1ナノ秒を捨て、分子力学的(MM)結合エネルギー分析のために残りの4ナノ秒から2000のスナップ写真を(2ピコ秒の間隔で)選択した。次いで、結合自由エネルギー(ΔGBINDING)を減算によって求めた。式1に示されているように、全軌道の平均化により、最終的な平均相互作用エネルギー(<ΔGBINDING>)が得られ、この平均化はMDスナップ写真に対してである。
式1
<ΔGBINDING>=<ΔGCOMPLEX>―<ΔGPROTEIN>−<ΔGLIGAND>
式2
<ΔG>=<ΔEMM>―T<ΔSMM>+<ΔGSOLVATION>
Kollman groupで提案され、AMBERで実施される単一軌道突然変異プロトコルに従って、野生型複合体のスナップ写真のセットを、式1及び2のエネルギー項のそれぞれの突然変異体の計算に利用した9。突然変異体の側鎖を切断し、Cγを水素原子で置換し、そしてCβ−H結合の長さ及び方向を野生型Cβ−Cγの残基の長さ及び方向に合わせる。単一軌道突然変異プロトコルの基本的な近似は、突然変異体及び野生型が、非結合状態から結合状態への類似のコンフォメーション変化を受けること、及び局所側鎖の再編成が、アラニン突然変異自体に対する小さい摂動であることである9。野生型及び突然変異体種の別の軌道を移動することができるが、これは、(内部エネルギー成分が取り消されないため)かなりのノイズを導入し、かつ計算負荷が高い。別個のシミュレーションは、大きい残基又は荷電残基への突然変異の場合には妥当であろう。
GenScriptライブラリーを、NNKコドン縮重を用いて合成した(GenScript,Piscataway,NJ)。このライブラリーは、表4のライブラリー1の下に示されている突然変異誘発部位を含む。GeneArtライブラリーを、ヌクレオチド混合物を用いて合成し(Life Technologies,Carlsbad,CA)、全てのアミノ酸の等モル分布が得られ、このライブラリーは、表4のライブラリー2の下に示されている19のアミノ酸(即ち、Dを除く)を用いるランダム化D60位を含む。合成ライブラリーを、pPNL6ベクターにクローニングした(図12)。
PNGase F−pPNL6ベクターのクローンライブラリーにより、推奨プロコルに従って表面ディスプレイ(図13及び表6)のためにEBY100酵母細胞を形質転換した8。
酵母ライブラリーを、Pacific Northwest National Laboratory (Richland,WA)によって提供される酵母ディスプレイscFv抗体ライブラリーのユーザーマニュアル(Rev:MF031112)(sysbio.org/dataresources/index.stm)の推奨プロトコルに従って導入した。EBY100形質転換酵母ライブラリーを、ガラクトース含有培地に導入して、表面ディスプレイされたAga2p−PNGase Fクローンを発現させる(図13)。酵母細胞の少なくとも60%がC末端c−mycタグを確実に発現するように、誘導効率をフローサイトメトリーによって決定する(データは不図示)。
N−グリカン保持糖タンパク質、RNase B(Sigma R7884)、及びアシアロフェチュイン(Sigma A4781)を選択標的として使用した9、18。両方の糖タンパク質を変性させて、N−グリカン及び糖ペプチド領域が酵母表面ディスプレイPNGase Fクローンに最大限暴露されるようにした。
各3回目の選択からの約50コロニーを取り出して、20μLの分子生物学グレードの水(Thermo Scientific SH30538.02)中、0.1%SDSで混合し、95℃で5分間加熱し、そして氷温で保管した。2μLの溶解酵母細胞混合物を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅のための鋳型DNAを提供した。PCRマスターミックスを、製造者の推奨プロトコルに従って、1反応当たり50μLの最終量で、Taq DNAポリメラーゼ(Life Technologies 10966−034)及びdNTPミックス(Life Technologies 18427−013)を用いて調製した。フォワードプライマー及びリバースプライマー(図17)を、0.2μMの最終濃度でPCRマスターミックスで混合した。PCRを、図18に示されているようにプログラムされた熱サイクルで、Mastercycler EP(Eppendorf)を用いて行った。PCR産物(1163塩基対長)を、0.7%アガロースゲルを用いて検証し、Multiimage Light Cabinet (Alpha Innotech,Inc.)を用いて画像化し、そしてフォワード配列決定プライマー(図17)を用いて配列決定するためにMWG Operonに提出した。
Lectenz(登録商標)候補の実験的特徴付け
コンピューターガイド酵母ディスプレイライブラリー選択から選択された4つのLectenz(登録商標)候補(R617、R6113、R911、及びR9113)を、大腸菌(E.coli)発現系で発現させて、固定金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)によって精製し、続くサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって純タンパク質を得た。精製タンパク質を使用して、そのN−糖ペプチド親和性試薬としての実用性を、表面プラズモン共鳴(SPR)、グリカンアレイスクリーニング、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて調べた。
pOPH6細菌発現ベクターを用いた大腸菌(E.coli)でのフラボバクテリウム・メニンゴセプチカム(Flavobacterium meningosepticum)PNGase Fの高い収率及び可溶性の発現が、Looらによって報告された1。pOPH6ベクターは、PNGase Fをペリプラズムに誘導するためにN末端OmpAペリプラズム分泌タグを含む。この構築物はまた、発現PNGase FのIMAC精製のためのC末端ヒスチジンタグも含む。このベクターを用いて、部位特異的突然変異誘発によってD60A点突然変異体を作製した(Dr.Loretta Yang)。
元のpOPH6ベクターを用いた酵母ディスプレイ選択PNGase Fクローンの発現に、既に公表されたプロトコルを用いて成功した1、2。しかしながら、発現及び精製は、Filitchevaらによって開発されたプロトコルを用いてPNGase F−pOPH6 IIベクターで無事成功した2。このプロトコルは、PNGase Fクローンの発現及び精製を最適化するために採用した。
wtPNGase F酵素を高親和性Lectenz(登録商標)試薬に変換するために、触媒活性を無くし、同時に親和性を高める必要がある。PNGase F D60A単一点突然変異体は、3つの理由から特に興味深かった:(1)残基D60は、この突然変異が酵素を触媒的に不活性することを実証したD60N点突然変異体の研究に基づくと触媒活性を必要とする4、(2)コンピューターアラニンスキャニングデータ(表5)が、基質親和性に有利な相互作用エネルギーを予測した、及び(3)D60A単一点突然変異体が、定方向進化によって親和性が向上しなかったことから、D60Aを、親和性が向上したR911クローンとの比較のための触媒的に不活性な親和性が向上しない対照として使用することが適切であった。
レクチンアフィニティークロマトグラフィーは、グリカン及び複合糖質の単離及び濃縮に最も広く利用されている技術である14。抗体及びレクチンのような現在の炭水化物検出試薬の固有の制限にもかかわらず、多数の親和性ベースのグリカン及び複合糖質の濃縮方式が開発され、この適用例の強い必要性を示している。一般的な濃縮技術は、遠心分離機、スピン又は低圧LCカラム、及び高圧/高流量レクチンクロマトグラフィーを可能にするHPLC互換性マトリックスに詰め込まれたアガロース/セファロースに結合したレクチン、並びにピペット先端部に埋め込まれたレクチン修飾金ナノ粒子を含む14、15。近年、連続レクチンアフィニティークロマトグラフィーが、血清及び癌細胞溶解物のような複合サンプルから目的の糖タンパク質を濃縮するために利用されている16、17。しかしながら、このため、サンプルの濃縮又は単離に使用される試薬の選択は、糖鎖生物学的分析の結果を、レクチン又は抗体の結合特性に基づいて複合糖質のサブセットに偏らせ得る18。
対照D60Aのアフィニティークロマトグラフィーの結果は、N−グリコシル化RNase BがRNase Aに対して濃縮されないことを示している(図32)。1.25mLの保持容量での通過ピークは、最初のロード(0〜5mLの保持容量)の際にRNase B及びRNase Aの両方がカラムを通過し、D60Aとの相互作用によって保持されなかったことを示している。溶出緩衝液(5〜10mLの保持容量)を通したときにRNase Bでは溶出ピークが観察されなかった。小さい溶出ピークが、7.22mLの保持容量で、RNase Aで見られる。これは、RNase Aサンプルが90%の純度であるためこのサンプル中の不純物によるものであり得、そして混入物としていくらかのRNase Bを含む可能性がある。加えて、wtPNGase Fは、キトビオースコア、及びペプチド主鎖のペプチドグリコシル化配列sequone(Asn−X(−Pro)−Ser/Thr)の両方を認識することが知られ、従って、RNase AのAsn−Leu−Thrグリコシル化sequoneが、D60A単一点突然変異体によってなんとか認識される可能性がある。しかしながら、RNase Aから観察される小さい溶出ピークの相対量は最小限である。
R911を用いてN−糖ペプチドからのペプチドの分離を調べるために、RNase A及びRNase Bをトリプシンで消化した。トリプシン消化物をR911カラムにロードした。RNase Aトリプシン消化ペプチドをカラムに通すと、RNase Bトリプシン消化サンプルの一部がカラムに保持され、これを溶出緩衝液で溶出させた(図35)。通過及び溶出サンプルをLC−MS/MSによって分析して、一部のN−糖ペプチドが濃縮されたことを確認した。
R911結合RNase Bのキトビオースでの競合溶出を行って、N−グリカン構造のキトビオースコアのR911との特異的な相互作用をさらに確認した。まず、RNase BをR911アフィニティーマトリックスにロードし、次いで、標準溶出緩衝液の代わりの結合緩衝液中、遊離キトビオースで競合的に溶出させた(図36)。溶出サンプルのLC−MS/MS分析により、RNase Bがキトビオースで競合的に溶出されたことを確認した。
R911のN−糖タンパク質親和性濃縮試薬としての適用を、MCF7全細胞抽出物を用いて実証した。細胞抽出物(100μg)を、R911アフィニティーカラムにロードし、次いで、標準溶出緩衝液の代わりの結合緩衝液中、遊離キトビオースで競合的に溶出させた(図37)。1.19mLの保持容量で観察されたピークに一致する細胞抽出タンパク質の大部分をカラムに通し、約6.6μgのタンパク質がカラムに保持され、これを、6.63mLの保持容量でのピークに一致する遊離キトビオースで競合的に溶出させた。
Consortium for Functional Glycomics(CFG)によって開発されたグリカンアレイは、610のユニークな哺乳動物グリカンからなり(バージョン5.1)、かつグリカン結合タンパク質の特異性の決定における非常に貴重なツールであることが証明された27、28。天然及び合成グリカンのライブラリーは、スペーサーを含むアミノリンカーで修飾される。グリカンは、アミノ修飾スペーサーリンカーによってNHS活性化ガラス表面に共有結合する。各グリカンは、アレイに6つの複製でプリントされる。表面に固定されたグリカンは殆どが、ペプチドグリコシル化sequone(Asn−X(−Pro)−Ser/Thr)を含まない;ただし、2つのリンカーSp22(ペプチドNST)及びSp24(ペプチドKVANKT(配列番号22))を除く。ペプチドsequoneの欠如は、グリカン相互作用の正常な生物学的背景から逸脱している。末端グリカン構造を認識する多くの炭水化物認識タンパク質では、これは、大きな問題ではない(例えば:末端シアル酸を認識するレクチン)。しかしながら、これは、様々なトランスフェラーゼの場合のように、グリカンが提示される又はグリカンが移送されるタンパク質の関連でグリカン構造を認識する炭水化物プロセシング酵素では大きな問題である。wtPNGase F酵素が、sequone及びアスパラギン結合キトビオースコアからなる糖ペプチドを認識することが知られていることから、固定されたグリカンにおけるペプチドsequoneの欠如は制限である。
PNGase Fクローンの発現
PNGase F−pOPH6 II(D60A、R617、R6113、R911、及びR9113)プラスミドで、発現のためにAgilent Technologies(230132)から入手した大腸菌(E.coli)BL21−Gold(DE3)コンピテント細胞を形質転換した。各クローンに対して、Luria Bertani(LB)寒天プレート(100μg/ml カルベニシリン)から採取した単一コロニーを、シェーカー(250〜300RPM)で、100μg/ml カルベニシリンを含む50mLのLB培地で、37℃で一晩培養した。翌日、培養物を、100μg/ml カルベニシリンを含む37℃に予熱された1LのLB培地で増殖させた。OD600が0.4〜0.5の間に、温度が37℃から22℃に低下し、1mM IPTGで誘導し、培養物を一晩誘導した(約20時間)。4℃のAvanti JA10ローターを用いて4500×g(30分間)で細胞ペレットを回収した。R911の培養では、1LのLB培地から約8gの細胞ペレットが得られた。この細胞ペレットを、20mLの氷冷IMAC結合緩衝液(0.1M EPPS、0.5M NaCl、0.01M イミダゾール、pH8.50)で再懸濁した。RocheのEDTA−フリープロテアーゼ阻害合タブレット(05892791001)を1mLの結合緩衝液又は分子グレードの水に溶解し、混合して再懸濁細胞ペレットにした。フレンチプレスを用いて6,000psiで細胞を3回、機械的に溶解した。細胞溶解物を、4℃のAvanti JA10ローターで、30,000×g(45分間)で遠心分離して、ペリプラズム画分を含む上清から不溶性細胞デブリを分離した。上清を収集して、0.8μmのフィルターで上清を5mLずつろ過した。
濾過したペリプラズム画分をIMACカラムにロードして、AKTA Purifier UPC 10を用いてPNGase Fクローンをイミダゾール勾配で溶出させた。IMAC結合緩衝液(A)は、0.1M EPPS、0.5M NaCl、0.01M イミダゾール、pH8.50から構成され、IMAC溶出緩衝液(B)は、0.1M EPPS、0.5M NaCl、0.5M イミダゾール、pH8.50から構成された。製造者の推奨プロコルに従って、GE Healthcare HisTrap HPカラム(17−5247−01)を洗浄し、Ni2+で帯電させ、そして平衡化した。プログラムされた方法(Unicorn 5.1)を、全ての精製で使用した。要約すると、ニッケル荷電HisTrapカラムを、5CVの結合緩衝液、3.5mL/分の流量で平衡化した。ペリプラズム画分(約20ml)を、P−960サンプルポンプを用いて2mL/分の流量でカラムにロードした。ロードされたカラムを、2mL/分の流量で、9CVの結合緩衝液(100%A)で洗浄した。非特異的に結合したタンパク質を、2mL/分の流量で、8.3%B(50mM イミダゾールに等しい)の10CVの段階溶出で溶出させた。2mL/分の流量で、18CVを超える43%B勾配溶出を使用して、Ni結合ヒスチジン標識PNGase Fクローンを溶出させ、溶出タンパク質の2.5mL画分を収集した。カラムを、2mL/分の流量で、100%Bの8CVの段階溶出で洗浄し、続いて、3.5mL/分の流量で、5CVを超える100%Aで再平衡化した。Vivaspin 20(10kDaカットオフ)濃縮器を用いて、溶出タンパク質含有画分をプールし、SECによるさらなる精製のために約250μLの最終容量まで濃縮した。
約250μLの濃縮IMACサンプルを、SuperDex 75 10/300 GL又はSuperose 12 10/300 GLカラムを用いてSEC精製のために500μL注入ループにロードした。Superose 12カラムは、SuperDex 75カラムに対してR911の精製を向上させた。従来通り、自動化法(Unicorn 5.1)を、AKTA Purifier UPC 10での精製のために使用した。カラムを、0.4mL/分の流量で、1.5CVの泳動緩衝液(50mM EPPS、pH8.00)で平衡化した。0.5mLのループを2.5mLの泳動緩衝液でフラッシュしてサンプルをカラムに注入し、次いで流量を0.2mL/分に下げた。画分収集(0.5mL)を6.75mLの保持容量で開始した。溶出ピークに一致する画分をプールし、10kDaカットオフVivaspin 20濃縮器を用いて濃縮し、UV280吸光度(A280)によってタンパク質収量を決定した。0.5LのLB培地からのD60A対照クローンのSEC精製後の典型的な収量は約3.0mgであった。比較として、2LのLB培地からのR911及びR911 C60Aクローンの典型的な収量は約0.3mgであった。
Bio−Rad 4−20% TGXゲル(456−1093及び456−1094)及び推奨緩衝液を、タンパク質サンプルのSDS−PAGEに使用した。全てのサンプルを、製造者の推奨するLaemmliサンプル緩衝液レシピを用いて、β−メルカプトエタノールを含む6倍のストック濃度で変性し、ゲルに移す前に95℃で5分間インキュベートした。ゲルを200V(最大150mA)で35分間泳動させた。推奨される高速マイクロ波染色及び脱染手順によって、Life Technologies'SimplyBlue SafeStain(LC6060)を用いてゲルをクマーシー染色した。
以下の緩衝液、試薬、及び溶液を、修正された製造者のプロトコルを用いてウェスタンブロット法に使用した:
1.10倍の転写緩衝液(1L):250mM Tris(30.28g/L)、1.92M グリシン(144.1g/L)、0.05% SDS(5g/L)、HClによってpH8.3に調整
2.10倍のTBS(1L):1.4M NaCl(81.82g/L)、250mM Tris系(30.28g/L)、HClによってpH7.4に調整
3.10倍のBLOTTO(100mL):Bio−Radの10% 脱脂粉乳(10g)(170−6404XTU)、90% NANOpure water(90mL)
4.1倍のブロッキング緩衝液(500mL):0.5mL(500μL)Tween 20、50mLの10倍のBLOTTO、50mLの10倍のTBS、400mLのNANOpure water
5.5% ブロッキング緩衝液(2つの膜に100mL):5% 脱脂粉乳(4g)、96mLの1倍のブロッキング緩衝液
6.1倍のTBS(100mL):10mLの10倍のTBS、90mLのNANOpure water
7.メタノールを含む1倍の転写緩衝液(1L) pH8.3:100mLの10倍の転写緩衝液、150mLのメタノール、750mLのNANOpure water
8.GE HealthcareのPVDF Hybond−P膜(RPN303F)
9.Alpha Diagnosticの西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合マウス抗ヒスチジン抗体(HISP12−HRP)
10.Thermo Scientific Pierce Metal Enhanced DAB基質溶液(34065)。
ゲルシフトアッセイを用いて、wtPNGase F酵素に対するPNGase Fクローンの脱グリコシル化活性を決定した。それぞれ50ngのwtPNGase F、D60A、及びR911を、50μLの反応容量で、50mM EPPS、pH8.0中、50μgの変性RNase Bと共に37℃で一晩インキュベートした。サンプルを、SDS−PAGEゲルで分析し、脱グリコシル化RNase B産物のRNase Bに対する移動の変化を観察した。スキャンしたゲル画像をImageJソフトウェアで分析して、RNase B基質に対する脱グリコシル化産物を定量化した(附表4)7。脱グリコシル化産物を、MALDI TOF−TOF質量分析によって確認した。
Sigmaから購入した5mgの0.113μモル アシアロフェチュイン(44,189g/モル)(A4781−50MG)を、6M グアニジンHCl(95.53g/mol)(1mL中、573mg)を含む1mlの0.1M Tris−HCl(pH8.0)で溶解し、28mgの182μモル DTT(154.25g/mol)の添加によって55℃で1時間還元し、続いて128mgの692μモル ヨードアセトアミド(184.96g/mol)を添加して室温で30分間維持した。0.5mLの混合物をThermo Scientific Pierce D−Salt Polyacrylamide Desalting Columnsで脱塩し、1.75mLの移動相体積(void volume)の後に0.5mLの画分を収集した。
質量分析を、ABI 5800 MALDI TOF−TOF高解像度質量分析計を用いて行った。1mlの容量の30% アセトニトリル(ACN)及び0.3% TFA中に約10mgのシナピン酸を再懸濁することによってシナピン酸マトリックスを用意した。マトリックスとタンパク質サンプルを30:1の比率で混合して、合計4ピコモルのタンパク質にした。サンプルをMALDIプレートにスポットし(1μL)、このプレートをABI5800にロードする前に空気乾燥させた。
8μLの40mM NH4HCO3を10μLのD60Aサンプル(10μg)に添加して18μLの総容量にしてタンパク質サンプルを用意した。このサンプルを、2μLの1M DTTを用いて56℃1時間還元し、暗所で45分間、20μLの55mM ヨードアセトアミドでカルボキシアミドメチル化した。トリプシン(20μg)を80μLの40mM NH4HCO3に溶解し、10μL(2.5μg)をサンプルに添加してタンパク質を37℃で一晩消化した。消化後、ペプチドを、5μLの1% トリフルオロ酢酸(TFA)で酸性化した。C18スピンカラムで脱塩を行い、そしてサンプルを真空遠心分離機で乾燥させた。ペプチドを、19μLの移動相A(水中、0.1% ギ酸)及び1μLの移動相B(水中、80% アセトニトリル及び0.1% ギ酸)で再懸濁した。サンプルを、各回1000psiで10分間、高圧窒素ボンベによってC18逆相樹脂が自己充填されたナノスプレーテーパー型キャピラリーカラム/エミッターにロードした。各回は、1分当たり約200nLの流量での、160分間の増加する移動相Bの勾配から構成された。最初のタンパク質の同定では、LC−MS/MS分析を、ナノエレクトロスプレーイオン源を備えたFinnigan LTQ−XLで行った。機器による方法を用いて全MSスペクトルを収集し、30秒間隔の動的排除セットを用いる衝突誘起解離(38%正規化衝突エネルギー)で8つの最も強いピークのMS/MSスペクトルを作製した。得られたデータを、Sequest Algorithmを用いて、D60A配列を含む大腸菌(E.coli)データベース、及び標的のみのデータベースを検索した。Sequestパラメーターを変更して、メチオニンの酸化及びシステインのアルキル化を可能にする修飾について調べた。ペプチドの質量の許容量を1000ppmに設定し、断片イオンの許容量を1ダルトンに設定した。結果を、1%の擬陽性率(FDR)でフィルタリングした。
リガンド、変性RNase B、天然RNase B、及びRNase Bと同じペプチド配列を有するがN−グリコシル化を有していない変性RNase Aを、アミン結合化学を用いてCM−5チップに共有結合させた。最適な結合条件を、Biacoreの推奨プロトコルに従って酢酸緩衝液のpHスカウティングによって決定した(図31)。3000RUの計算RMAXを得るために十分なリガンド結合で高密度表面領域を用意した。リガンド固定のために、10mM 酢酸緩衝液、pH5.5から構成される結合緩衝液を使用した。分析物として使用するPNGase Fクローンは、10μM〜72.5nMの範囲の段階希釈濃度のD60A、R911、及びR911 C60Aとした。泳動緩衝液は、10mM HEPES、10mM NaCl、pH7.4から構成されていた。生体分子相互作用モデルを用いる定常状態の結合反応速度を、Scrubber 2.0cを用いて決定した(表10及び図32)。
D60A及びR911クローンを、グリカンアレイスクリーニングのためにConsortium for Functional Glycomics'Protein−Glycan Interaction Core (旧名Core H)に提出した29。精製D60Aを、DyLight 488で標識し、そして色素:タンパク質標識比を2.1:1に決定した。精製R911も同様に標識し、そして色素:タンパク質標識比を8.2:1に決定した。クローンを、0.1% BSAを含む10mM HEPES、10mM NaCl、pH7.4からなる緩衝液中、200μg/mLの最終濃度で、アレイでインキュベートした。インキュベーションの1時間後に、アレイを、0.1% BSAを含まない同じ緩衝液で4回洗浄した。スライドを、窒素気流で乾燥させ、そして標準グリカンアレイデータ収集及び分析プロトコルを用いて処理した。最後の洗浄後にスライドを乾燥させたら、スライドをPerkinElmer ScanArrayスキャナーに配置し、そして検出に使用した波長ごとにデータを取得する(DyLight 488)。使用したPMT設定は70%であり、使用したレーザー出力は90%である。保存後、画像をImageneソフトウェアで開き、グリッドを使用して、ビオチン対照スポットを用いてスライドのスポットに整合させる。整合したら、各スポットに結合した量を定量化する。マイクロソフト社のエクセルでデータを分析し、この分析では、6つの複製の内の最も高いスポットと最も低いスポットが除去され、残りの4つのスポットの平均が、適切な統計資料と共に図及び表に示される。
GE Healthcareによって製造された1mL HiTrap NHS活性化HPカラム(17−0716−01)を用いて、精製PNGase F D60A及びR911クローンをカラムマトリックスに共有結合させて、アフィニティークロマトグラフィーを用いるN−糖ペプチド及びN−糖タンパク質の濃縮を評価した。製造者の推奨プロトコルを用いて、PNGase FクローンのNHS活性化カラムへの結合効率は、全てのNHS活性化カラム結合反応で一貫して80%〜87%の範囲であった。標準結合緩衝液は、10mM HEPES、10mM NaCl、pH7.4から構成され、標準溶出緩衝液は、10mM HEPES、150mM NaCl、pH7.4から構成されていた。競合溶出実験では、溶出緩衝液は、10mM HEPES、10mM NaCl、235.6μM(100μg/mL) キトビオース、pH7.4から構成されていた。キトビオースは、Sigmaから入手した(D1523−10)。再生緩衝液は、10mM HEPES、500mM NaCl、pH7.4から構成されていた。AKTA Purifier UPC 10(GE Healthcare)を、100μLサンプル注入ループ、1mL HiTrap NHS活性化カラム、UV280検出で構成された全てのクロマトグラフィー実験に使用した。全てのクロマトグラフィーの実験では、0.4mL/分の一定の流量とした。カラムを、10mL又は10カラム容量(CV)の結合緩衝液で平衡化し、続いて100μLのサンプルを注入した。5CVを超える結合緩衝液を用いてサンプルをカラムに通して、非結合サンプルを洗浄した。結合サンプルを5CVを超える溶出緩衝液で溶出させた。結合及び溶出の際に、0.5mLの画分を収集した。5CVの再生緩衝液でカラムを再生し、5CVの結合緩衝液で再平衡化した。
ヒト乳癌MCF7細胞を、10%ウシ胎仔血清が添加されたDMEM培地で培養した。細胞を継代し、トリプシンフリー細胞遊離を用いて回収した。約2.3×107の細胞を回収し、5分間の1000×gでの遠心分離によって4℃の10mLのリン酸緩衝生理食塩水で3回洗浄した。細胞ペレットを、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)を含む1.5mLのフィルター滅菌された細胞溶解緩衝液(10mM Tris−HCl、pH7.5、150mM NaCl、1% v/v Nonidet P−40)で再懸濁し、そして氷上で30分間インキュベートした17。この細胞を、処理間に15秒間の停止(30%の振幅)がある、15秒の間隔で合計2分間超音波処理(Misonix Ultrasonic Liquid Processor Model S−4000)した。溶解した細胞を、4℃のEppendorf 5430Rで17,000×gで1時間遠心分離した。MCF7細胞抽出物を含む上清を、50μLのアリコートにして−80℃で保管した。MCF7細胞抽出物のタンパク質濃度を、Thermo Scientific Pierce BCAタンパク質アッセイキット(23277)を用いて10.67mg/mLと決定した。アリコートにしたMCF7細胞抽出物ストックを氷上で解凍し、10mM HEPES、10mM NaCl、pH7.4を用いて1mg/mLに希釈した。100μLサンプルループを用いて、100μgの1mg/mL MCF7細胞抽出物を、糖タンパク質濃縮用のR911 Lectenz(登録商標)アフィニティーカラムに注入した。
R911 Lectenz(登録商標)アフィニティーカラムから溶出されたMCF7細胞抽出物及びタンパク質を、標準の溶液中消化プロトコルを用いて還元し、アルキル化し、そして配列グレードトリプシン(sequence grade trypsin)(Promega)で消化した30。サンプルを1% トリフルオロ酢酸で酸性化し、そしてC18スピンカラム(Silica C18,The Nest Group,Inc.)を用いて脱塩を行った。ペプチドを乾燥させ、そして39μLの緩衝液A(0.1% ギ酸)及び1μLの緩衝液B(80% アセトニトリル及び0.1% ギ酸)で再懸濁した。サンプルを、オートサンプラーチューブにロードしてUltimate 3000 LC System(Thermo Scientific−Dionex)に入れる前に、0.2μmフィルター(Nanosep,Pall Corp)によって回転濾過した。
UniProtは、ストックMCF7サンプルのLC−MS/MS分析から作成されたタンパク質同定リストを検証し、R911 Lectenz(登録商標)アフィニティークロマトグラフィー溶出MCF7サンプルをUniPepデータベースで処理して、実験的に確認されたN−糖ペプチドを有するタンパク質を同定した20。加えて、N結合型糖化部位(N−linked glycosite)を有する潜在的な糖タンパク質も、N−グリコシル化sequone(Asn−X−Ser/Thr)の存在に基づいてUniPepによって同定した。N−及O−糖タンパク質の最終リストには、UniPep、UniProt、及び文献報告によって糖タンパク質として確認されたタンパク質のみを含めた19、20、25、26、32。加えて、N−グリコシル化部位を有すると推定されたタンパク質は、UniProt細胞内局在化の記述が、グリコシル化タンパク質で予想される細胞内局在化(ゴルジ、分泌、小胞エキソソーム、細胞外空間、及びヒストン)に一致する場合にのみ最終リストに含めた。
PNGase Fクローンの分子動力学シミュレーション
PNGase FクローンD60A、R911、及びR911 C60AのwtPNGase F酵素に対するコンフォメーション分析をMDシミュレーションによって研究して、この研究から残基当たりの相互作用エネルギーを計算した。2.0Åの解像度での、活性部位にN,N'−ジアセチルキトビオース二糖を有するwtPNGase F酵素のX線結晶学ベースの構造モデルは、既に報告されている(PDB ID:1PNF)1。1PNFモデルを使用して、D60A、R911、及びR911 C60Aクローンの突然変異モデルを構築した。加えて、wtPNGase Fの結合ポケットの共結晶化N,N'−ジアセチルキトビオース二糖リガンドは、修飾N−グリカン構造をPNGase Fクローンの構造モデルの結合ポケットに配置するガイドとして機能する。
結合モデルのための回転異性体の選択
wtPNGase Fモデル、1PNFを鋳型として使用して、PNGaseクローンD60A、R911、及びR911 C60Aのモデルを構築した。2つの回転異性体ライブラリーを使用して、R911突然変異の側鎖回転異性体を選択した。X線結晶学ベースの主鎖依存性Dunbrackライブラリーを使用して回転異性体を選択し、モデルR911 Dun及びR911 C60A Dunを構築した2。加えて、MDベースの主鎖依存性Dynameomicsライブラリーを使用して、モデルR911 Dyn及びR911 C60A Dynも構築した3。立体衝突の最も少ない、可能性が最も高い回転異性体を選択した。R911 Dun及びR911 C60A Dunモデルの構築のために評価されて選択されたDunbrack回転異性体が表16に列記されている。同様に、R911 Dyn及びR911 C60A DynのDynameomics回転異性体が表17に列記されている。D57L、D60C、I156L、G192I、及びR248W突然変異の回転異性体が、隣接残基との関連で示されている。E206Sの回転異性体は、衝突が予測されなかったとしては示されていない。MDシミュレーション及び遊離エネルギー分解を計算して、どの回転異性体が実験相互作用エネルギーを最良に近似したかを評価した。最良に近似した回転異性体モデルは、全ての後のコンピューターでの研究に有用である。
wtPNGase F、D60A、及び4つ全ての回転異性体モデルのMDシミュレーション(100ナノ秒)を、N,N'−ジアセチルキトビオース二糖(GlcNAcβ1−4GlcNAc−αOH)で行った。wtPNGase F実験的構造(1PNF)に対する、Cα原子の位置における二乗平均平方根差(RMSD)を、シミュレーション時間の関数として決定した。100ナノ秒のシミュレーションの間の6つのモデルのそれぞれの平均RMSDは、低く安定し、1.2Å〜1.3Åの範囲であり、構造的平衡性を示している。回転異性体の分析に使用される6つの構造モデル及び各MDシミュレーションの平均RMSD値のリストが表18に列記されている。
複合体のMDシミュレーションが安定して、実験構造データに一致していることを確認してから、相互作用エネルギーを、100ナノ秒のMD軌道期間に亘って1ナノ秒の間隔で計算した。図40は、100ナノ秒のMDシミュレーション中の1PNFのMDシミュレーションのエネルギー収束を示す、軌道時間に亘る安定した相互作用エネルギーを示している。これに対して、図41は、R911 DunのMDシミュレーションの最初の54ナノ秒間のエネルギー収束の欠如を示している。R911 DunのMDシミュレーションとは異なり、R911 DynのMDシミュレーションは、100ナノ秒のシミュレーションの間中、安定した相互作用エネルギーを有していた。54ナノ秒での10kcal/モルの相互作用エネルギー遷移の前後のR911 Dunのコンフォメーション分析は、シミュレーションの後半のコンフォメーションが、R911 Dynのシミュレーションに類似していることを示唆した。これは、R61の第2のGlcNAcのN−アセチル基との水素結合を不安定化させるR911 D57L突然変異の向きで特に観察される。R911 Dynameomicsモデルは、エネルギーの最小化及び平衡化の間、このコンフォメーションをとり、100ナノ秒の工程中、このコンフォメーションで安定したままである。しかしながら、R911 Dunbrackモデルは、シミュレーションの広範の変更されたR61の向きのみをとる。これは、Dunbrackモデルが、R911 dynameomicsモデルに対して変更されたR61の向きを長時間とることを示唆すると考えられる。従って、分子力学一般化Born表面積(MM−GBSA)分析のためのR911 DunのMDシミュレーションの後半の選択は、R911 Dunbrack及びR911 Dynameomics軌道の両方の軌道に一致したR61の変更されたコンフォメーションによってある程度合理的に説明される。これはまた、エネルギー収束に到達させるサンプリング要件に適合した、この試験で利用される長いシミュレーションの重要性も実証する。キトビオース(GlcNAcβ1−4GlcNAc−αOH)リガンドを用いる他のMDシミュレーションのエネルギー収束分析は、全てのシミュレーションが、最初の60ナノ秒後に構造が集束したことを示唆した。従って、軌道の収束部分(最後の40ナノ秒)からのMD工程データを、MM−GBSAエネルギー分析した。
R911 DynのMDシミュレーションからの突然変異残基の回転異性体の二面角を、軌道のエネルギー的に収束した部分(最後の40ナノ秒)から導出した。二面角頻度ヒストグラムをプロットして、6つ全ての突然変異残基の好ましい二面角を同定した(図42〜図47)。好ましい回転異性体のコンフォメーションが特定され、表21に列記されている。4つの回転異性体は、複数の好ましいコンフォメーション(D57L Chi2、E206S Chi1、G192I Chi1、及びG192I Chi2)を有していた。従って、回転異性体の最も好ましい組み合わせが、収束軌道の最後の40ナノ秒から抽出されたフレームにおける発生頻度に基づいて特定された(表22)。回転異性体の組み合わせの最も高頻度のセットが、リガンド相互作用の最も好ましい向きを表すと考えられた。R911 DynのMDシミュレーションからの回転異性体のコンフォメーションの最も好ましいセットを示す軌道からのスナップ写真が図48に示されている。
既に評価したR911及びR911 C60AのDynameomics構造モデル及び1PNF及びD60Aモデルを用いて、100ナノ秒のMDシミュレーションを修飾リガンドで行った。オリゴ糖部分のアスパラギンのNδへの付着がβ−配置中に存在すると考えて、1つのセットの4つのシミュレーションを、β−キトビオースリガンド(GlcNAcβ1−4GlcNAc−βOH)を用いて行った。たとえ溶液中で、還元末端のO1ヒドロキシル基のα−及びβ−アノマー配置の両方の混合物を含む平衡状態が存在しても、wtPNGase F酵素の1PNF構造は、α―キトビオースリガンドと共結晶化した1。第2のセットの4つのシミュレーションを、wtPNGase Fによって認識される、アスパラギン結合糖ペプチドモチーフ、GlcNAcβ1−4GlcNAc−β−Asn−X[−P]−Thrを用いて行った。PNGase Fを用いた基質要求性試験により、これが最適な触媒活性に必要な必須モチーフであることが裏付けられた7。RNase Bを、実験的研究のN−グリカン含有タンパク質標的として使用したため、RNase Bペプチド配列を、必須糖ペプチドリガンド(GlcNAcβ1−4GlcNAc−β−Asn−Leu−Thr)に使用した。加えて、1PNF及びD60Aモデルの残基E206は、カルボキシル基のプロトン化状態を反映するように修飾された(GLH206)。wtPNGase Fの最適な触媒活性は、約pH8.0〜8.5と報告され、従ってグルタミン酸のプロトン化(pKaが約4.1)は、通常は起きないであろう。しかしながら、隣接疎水性トリプトファン残基207及び251の点突然変異の研究は、疎水性環境が触媒活性に重要であり、そしてこの疎水性環境がE206のpKaを約8.5に上昇させる可能性があることを示している8、9。
全てのモデルの安定したシミュレーション軌道が、RMSD分析によって確認され、続いてエネルギー収束分析によって安定した相互作用エネルギーが確認された。従来の回転異性体モデルの研究と同様に、軌道の収束部分からのデータを、MM−GBSAエネルギー分析した。表23は、MDシミュレーションに使用されるβ−キトビオースリガンドと複合体を形成したPNGase Fクローンのモデル、計算した平均RMSD、及び推定相対結合エネルギーの要約である。
一般的なN−結合糖トリペプチド(GlcNAcβ1−4GlcNAc−β−Asn−Leu−Thr)と複合体を形成したクローンを用いたMDシミュレーションを行って、結合相互作用をより正確にモデル化し、かつ相互作用エネルギーを推定した。末端電荷(N末端ではNH3+及びC末端ではCOO−)を中和するために、糖トリペプチドリガンドのペプチド部分を、AMBER Tools 13の構成要素であるxleapで定義される、N末端ACE[−C(=O)−CH3]保護基及びC末端NME[−C(=O)−NH−CH3]保護基を用いてモデル化した10。表29は、MDシミュレーションに使用される糖トリペプチドリガンドと複合体を形成したPNGase Fクローンのモデル、計算平均RMSD、及び推定相対結合エネルギーの要約である。
R911 Lectenz(登録商標)アフィニティークロマトグラフィーによる0−GlcNアセチル化糖タンパク質の濃縮は、R911が、コアN−糖ペプチドに対して明確な基質特異性を有するN−グリカンプロセシング酵素PNGase Fに由来することを考えると予想外であった1、7、13〜15。1PNF、D60A、及びR911の構造モデルを、結合ポケットにおける共通O−GlcNAcモチーフ(GlcNAc−β−Ser)を用いて作成し、50ナノ秒のMDシミュレーション及びMM−GBSA分析に利用した(表36)。末端電荷(N末端ではNH3 +、C末端ではCOO−)を中和するために、GlcNAc−β−Serリガンドのセリン残基を、AMBER Tools 13の構成要素であるxleapで定義される、N末端ACE[−C(=O)−CH3]保護基及びC末端NME[−C(=O)−NH−CH3]保護基を用いてモデル化した10。
1PNFからのD60A及びR911構造の構築
1PNF X線構造モデルをベースモデルとして使用し、このベースモデルから、他の全ての突然変異PNGase FモデルをUSCF Chimera v1.8.1を用いて構築した1、16。Dunbrack及びDynameomics回転異性体のライブラリーを利用して、USCF Chimeraの回転異性体の選択及びねじれ角ツールを用いたモデル化及びモデルへの編集に好ましい回転異性体を選択した2、3。表18に列記されている、α−キトビオースリガンド(GlcNAcβ1−4GlcNAc−αOH)を用いたPNGase Fの6つのモデルを構築した。表23に列記されている、β−キトビオースリガンド(GlcNAcβ1−4GlcNAc−βOH)を用いたPNGase Fの4つのモデルを構築した。表29に列記されている、糖トリペプチドリガンド(GlcNAcβ1−4GlcNAc−β−Asn−Leu−Thr)を用いたPNGase Fの4つのモデルを構築した。表36に列記されている、GlcNAc−β−Serリガンドを用いた3つのモデルを作製した。末端電荷(N末端ではNH3 +、C末端ではCOO−)を中和するために、全ての糖ペプチドリガンドのペプチド部分を、AMBER Tools 13の構成要素であるxleapで定義される、N末端ACE[−C(=O)−CH3]保護基及びC末端NME[−C(=O)−NH−CH3]保護基を用いてモデル化した10。
PNGase F−リガンド複合体の100ナノ秒の十分に溶媒和されたMDシミュレーションを、AMBER−GLYCAMタンパク質−炭水化物力場を利用する圧力(NPT)及び室温で、水中で行った。系は、全てのモデル化回転異性体がエネルギー最小化コンフォメーションとなるように系制限マスク(system restraint mask)(タンパク質Cα及びリガンド環原子)を用いる陰溶媒(5000ステップ)で最小化した。tleapを用いて、系を、TIP3P水モデルで陽溶媒和した。次いで、陽溶媒和系を、系制限マスクを用いてエネルギーを最小化した(2000ステップ、NVT)。同様に系制限マスクを用いて30ピコ秒の加熱ステップを行い(NVT)、続いてリガンド制限のみ(リガンド環原子)を用いて1ナノ秒の平衡化(NPT)を行った。100ナノ秒の生産工程を行い(50,000,000ステップ、NPT)、データを0.002ピコ秒ごとに保存し、これは、データのナノ秒ごとの500フレームの保存に一致する。軌道分析を、AMBER Tools13で実施されるtleap、ptraj、及びcpptrajを用いて行った10、17。USCF Chimera 1.8.1を用いてデータを視覚化した16。
結合エネルギーへの残基当たりの寄与を、軌道のエネルギー収束部分に対して実施例2で既に説明された、AMBERで実施される一般化Born(GB)連続溶媒モデルを利用して、PNGase Fの314の各アミノ酸に対して計算した18。
バイオコンビナトリアルライブラリーの構築及びスクリーニング
バイオコンビナトリアルライブラリーの効率的な構築及びスクリーニングのためには、ライブラリーを約109クローンに制限することが重要であり1、これは、7つのランダム化位置(207=1×109クローン)に一致する。どの残基が変化するべきかが即座にわからない場合は、ライブラリーの設計は困難であり得る。ここで、計算シミュレーションからの入力が、適切なアミノ酸の特定に役立ち、これによりライブラリーの設計に集中できる。計算ガイダンス、特に潜在的なクローンの数の削減に関する利点が記載されている2。Barakat及びLoveによる近年の再考察での観察されたように3、in vivoでのスクリーンと一体化された計算アルゴリズムは、タンパク質の設計の分野において卓越した迅速な成功もたらす。
O−GlcNアセチル化糖タンパク質及び糖ペプチドの濃縮のためのエンジニアリングされたLECTENZバイオセンサー
エンジニアリングされたR911 Lectenzの特徴付けは、N−グリコシル化及びO−GlcNアセチル化糖タンパク質及び糖ペプチドの両方に対する特異性を示した。この二重特異性は、N−グリコシル化及びO−GlcNアセチル化の両方に共通の還元GlcNAc構造モチーフの認識に基づいている(実施例4)。本明細書に提示される研究は、変異R911 Lectenzの調査及び開発を継続する:1つは、N−糖ペプチド及びN−糖タンパク質に対するさらに高められた特異性を有し、第2のLectenz変異体は、O−GlcNアセチル化糖ペプチド及びN−糖タンパク質に特異的である(実施例5)。さらに、O−GalNアセチル化に対して特異的な第3のLectenz変異体も調べられる。O−GalNAc特異性の原理は、GalNAcがGlcNAcのC4エピマー(wtPNGase F及びエンジニアリングされたR911 Lectenzによって認識される重要な構造モチーフ)であるという観察に基づいている。
R911の8つの突然変異体を作製した(表40)。これらの突然変異体の内の7つは、R911アミノ酸をwtPNGase F配列に戻す。グルタミン酸118をグルタミン(E118Q)に変換する8番目の突然変異体を作製し、これは、PNGase F及びそのD60A突然変異体にも存在する。これらの突然変異のそれぞれは、特定のグリコシル化部位とのユニークな相互作用を調整することができる重要な課題に対応する。
R911のO−グリカン親和性が野生型PNGase Fから「引き継がれる」可能性を明確に排除するために、本出願人は、サイズは同様であるが構造及び/又はコンフォメーションが異なる4つのO−グリカン基質に対して酵素活性アッセイを行った。これらは:O−グリカナーゼの基質として知られるp−ニトロフェニルN−アセチル−β−D−グルコサミニダーゼ(β−GlcNAc)、オセアニコーラ・グラヌローサス(Oceanicola granulosus)(ogOGA)からのβ−N−アセチルグルコサミニダーゼ、p−ニトロフェニルN,N'−ジアセチル−β−D−キトビオース(キトビオース)、p−ニトロフェニル2−アセトアミド−2−デオキシ−α−D−ガラクトピラノシド(α−GalNAc)、及びp−ニトロフェニル2−アセトアミド−2−デオキシ−β−D−ガラクトピラノシド(β−GalNAc)である。
Claims (29)
- 配列番号3を含むエリザベスキンギア・メニンゴセプチカム(Elizabethkingia meningosepticum)由来の野生型PNGase F−IIタンパク質に対して複数のアミノ酸突然変異を含む、触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F−IIタンパク質であって、
前記複数の突然変異が、
(a)前記PNGase F−IIタンパク質の触媒活性を消失させる少なくとも1つの第1の突然変異;及び
(b)N結合型グリカンに対する結合親和性を高め;かつ/又はO結合型グリカンに対する結合特異性及び親和性を増加させる、少なくとも1つの第2の突然変異
を含み、
前記複数のアミノ酸突然変異が、配列番号1のD57位、D60位、I156位、G192位、およびE206位に対応する配列番号3のアミノ酸残基での突然変異を含む、
前記触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F−IIタンパク質。 - エリザベスキンギア・メニンゴセプチカムPNGase F(配列番号1)のアミノ酸位置248に対応する配列番号3のアミノ酸残基での突然変異をさらに含む、請求項1に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F−IIタンパク質。
- エリザベスキンギア・メニンゴセプチカムPNGase F(配列番号1)のアミノ酸位置59、61、62、82、85、118、119、120、123、125、153、154、155、157、190、191、193、207、若しくは251に対応する配列番号3のアミノ酸残基での突然変異をさらに含む、請求項1又は2に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F−IIタンパク質。
- (a)配列番号1のD57位に対応する配列番号3のアミノ酸残基でロイシン、アラニン、メチオニン、アルギニン、リジン、システイン、若しくはトリプトファンでのアミノ酸置換を含む;
(b)配列番号1のD60位に対応する配列番号3のアミノ酸残基でアラニン、システイン、バリン、セリン、グリシン、若しくはトリプトファンでのアミノ酸置換を含む;
(c)配列番号1のY62位に対応する配列番号3のアミノ酸残基でグリシン、トリプトファン、セリン、若しくはトレオニンでのアミノ酸置換を含む;
(d)配列番号1のE118位に対応する配列番号3のアミノ酸残基でアラニン、グルタミン、トレオニン、若しくはシステインでのアミノ酸置換を含む;
(e)配列番号1のT119位に対応する配列番号3のアミノ酸残基でアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、若しくはバリンでのアミノ酸置換を含む;
(f)配列番号1のW120位に対応する配列番号3のアミノ酸残基でチロシン、ヒスチジン、グルタミン、アスパラギン、トレオニン、若しくはセリンでのアミノ酸置換を含む;
(g)配列番号1のK123位に対応する配列番号3のアミノ酸残基でアスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、若しくはトリプトファンでのアミノ酸置換を含む;
(h)配列番号1のR125位に対応する配列番号3のアミノ酸残基でチロシン、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、若しくはトリプトファンでのアミノ酸置換を含む;
(i)配列番号1のK153位に対応する配列番号3のアミノ酸残基でヒスチジン、アルギニン、グルタミン、トリプトファン、若しくはチロシンでのアミノ酸置換を含む;
(j)配列番号1のS154位に対応する配列番号3のアミノ酸残基でトレオニン、アスパラギン、リジン、グルタミン、トリプトファン、若しくはチロシンでのアミノ酸置換を含む;
(k)配列番号1のS155位に対応する配列番号3のアミノ酸残基でアルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン、トリプトファン、若しくはチロシンでのアミノ酸置換を含む;
(l)配列番号1のI156位に対応する配列番号3のアミノ酸残基でロイシン、トレオニン、メチオニン、グリシン、トリプトファン、若しくはヒスチジンでのアミノ酸置換を含む;
(m)配列番号1のD157位に対応する配列番号3のアミノ酸残基でアスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リジン、トリプトファン、若しくはチロシンでのアミノ酸置換を含む;
(n)配列番号1のG192位に対応する配列番号3のアミノ酸残基でイソロイシン、トリプトファン、アラニン、ヒスチジン、トレオニン、システイン、若しくはセリンでのアミノ酸置換を含む;
(o)配列番号1のE206位に対応する配列番号3のアミノ酸残基でセリン、トリプトファン、ヒスチジン、システイン、若しくはアルギニンでのアミノ酸置換を含む;ならびに/又は
(p)配列番号1のR248位に対応する配列番号3のアミノ酸残基でトリプトファン、セリン、プロリン、バリン、アスパラギン酸、チロシン、フェニルアラニン、若しくはリジンでのアミノ酸置換を含む、
請求項1〜3のいずれか1項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F−IIタンパク質。 - (a)配列番号1のD57R、D60A、Y62G、E118A、S155D、I156T、G192C、及びE206S、
(b)配列番号1のD57C、D60A、Y62W、E118A、S155Q、I156T、G192T、及びE206R、
(c)配列番号1のD57L、D60C、I156L、G192I、E206S、及びR248W、
(d)配列番号1のD57W、D60C、I156M、G192I、E206W、及びR248S、
(e)配列番号1のD60C、I156L、G192I、E206S、及びR248W、
(f)配列番号1のD57L、D60A、I156L、G192I、E206S、及びR248W、
(g)配列番号1のD57L、I156L、G192I、E206S、及びR248W、
(h)配列番号1のD57L、D60C、E118Q、I156L、G192I、E206S、及びR248W、
(i)配列番号1のD57L、D60C、W120X、I156L、G192I、E206S、及びR248W、
(j)配列番号1のD57L、D60C、W120X、S155X、I156L、G192I、E206S、及びR248W、
(k)配列番号1のD57L、D60C、K153X、I156L、G192I、E206S、及びR248W、
(l)配列番号1のD57L、D60C、S154X、I156L、G192I、E206S、及びR248W、
(m)配列番号1のD57L、D60C、S155X、I156L、G192I、E206S、及びR248W、
(n)配列番号1のD57L、D60C、I156X、G192I、E206S、及びR248W、
(o)配列番号1のD57L、D60C、G192I、E206S、及びR248W、
(p)配列番号1のD57L、D60C、G192I、及びR248W、
(q)配列番号1のD57L、D60C、I156L、D157X、G192I、E206S、及びR248W、
(r)配列番号1のD57L、D60C、I156L、E206S、及びR248W、
(s)配列番号1のD57L、D60C、I156L、G192I、及びR248W、又は
(t)配列番号1のD57L、D60C、I156L、G192I、及びE206S
から選択される位置に対応する配列番号3のアミノ酸残基での複数の突然変異を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F−IIタンパク質。 - 前記第2の突然変異が、O結合型GlcNAc、O結合型GalNAc、又はO結合型GlcNAc及びO結合型GalNAcの両方に対する結合特異性及び親和性を増加させる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F−IIタンパク質。
- N結合型グリカン、N結合型複合糖質、N結合型糖ペプチド、N結合型糖タンパク質、若しくは遊離N−グリカンに結合する;ならびに/又は
O結合型グリカン、O結合型複合糖質、O結合型糖ペプチド、O結合型糖タンパク質、若しくは遊離O−グリカンに結合する、
請求項1〜6のいずれか1項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F−IIタンパク質。 - タンパク様の第2の成分又は非タンパク様の第2の成分に共有結合する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F−IIタンパク質を含む第1の成分を含む、コンジュゲート。
- 前記第2の成分が治療薬又は診断薬である、請求項8に記載のコンジュゲート。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F−IIタンパク質を含む、融合タンパク質。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F−IIタンパク質、請求項8若しくは9に記載のコンジュゲート、又は請求項10に記載の融合タンパク質を含む、アフィニティーマトリックス。
- 固形支持体、表面、カラム、樹脂、ビーズ、粒子、及びナノ粒子からなる群から選択される、請求項11に記載のアフィニティーマトリックス。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F−IIタンパク質、請求項8若しくは9に記載のコンジュゲート、請求項10に記載の融合タンパク質、又は請求項11若しくは12に記載のアフィニティーマトリックスと、使用説明書とを含む、キット。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F−IIタンパク質、請求項8若しくは9に記載のコンジュゲート、又は請求項10に記載の融合タンパク質をコードする、単離ポリヌクレオチド。
- 請求項14に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
- 発現ベクターである、請求項15に記載のベクター。
- 請求項15又は16に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 細菌細胞又は酵母細胞である、請求項17に記載の宿主細胞。
- 触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F−IIタンパク質を作製するための方法であって、請求項1〜7のいずれか1項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F−IIタンパク質、又は請求項10に記載の融合タンパク質を、単離ポリヌクレオチド、発現ベクター、又は宿主細胞から発現させるステップを含む、前記方法。
- N結合型グリカン又はO結合型グリカンを検出するための方法であって:
生物学的又は実験室サンプルを、PNGase F−IIタンパク質のN−グリカン又はO−グリカンへの結合を可能にする条件下で、請求項1〜7のいずれか1項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F−IIタンパク質、請求項8若しくは9に記載のコンジュゲート、又は請求項10に記載の融合タンパク質に接触させるステップ;及び
前記N結合型グリカン又はO結合型グリカンを検出するステップ
を含む、前記方法。 - 前記検出されたN結合型グリカン又はO結合型グリカンを特徴付けるステップをさらに含む、請求項20に記載の方法。
- 前記N結合型グリカン又はO結合型グリカンを特徴付けるステップが、
前記グリカンの構成糖を特定すること、
前記グリカンの糖組成を決定すること、
前記グリカン内の結合位置を決定すること、又は
前記グリカンの立体化学を決定すること
を含む、請求項21に記載の方法。 - 遊離N−グリカン又は遊離O−グリカンを検出するための方法であって:
生物学的又は実験室サンプルを、PNGase F−IIタンパク質の遊離N−グリカン又は遊離O−グリカンへの結合を可能にする条件下で、請求項1〜7のいずれか1項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F−IIタンパク質、請求項8若しくは9に記載のコンジュゲート、又は請求項10に記載の融合タンパク質に接触させるステップ;及び
前記遊離N−グリカン又は遊離O−グリカンを検出するステップ
を含む、前記方法。 - N結合型グリカン、O結合型グリカン、遊離N−グリカン、又は遊離O−グリカンを濃縮する、単離する、又は精製するための方法であって:
生物学的又は実験室サンプルを、PNGase F−IIタンパク質のN−グリカン又はO−グリカンへの結合を可能にする条件下で、請求項1〜7のいずれか1項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F−IIタンパク質、請求項8若しくは9に記載のコンジュゲート、又は請求項10に記載の融合タンパク質に接触させて、濃縮された、単離された、又は精製されたN結合型グリカン、O結合型グリカン、遊離N−グリカン、又は遊離O−グリカンを得るステップ
を含む、前記方法。 - 請求項1〜7のいずれか1項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F−IIタンパク質、請求項8若しくは9に記載のコンジュゲート、又は請求項10に記載の融合タンパク質を含む、診断組成物又は治療組成物。
- 前記PNGase F−IIタンパク質、前記コンジュゲート、又は前記融合タンパク質が、検出可能に標識される、請求項25に記載の診断組成物又は治療組成物。
- 前記検出可能な標識が、放射性標識、蛍光標識、りん光標識、比色標識、酵素標識、免疫標識、磁気標識、常磁性標識、反磁性標識、又は電磁標識を含む、請求項26に記載の診断組成物又は治療組成物。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載の触媒的に不活性な炭水化物結合PNGase F−IIタンパク質、請求項8若しくは9に記載のコンジュゲート、又は請求項10に記載の融合タンパク質の、(a)治療薬を製造するための使用;(b)診断薬を製造するための使用;(c)標的薬物送達用の剤を製造するための使用;(d)生物学的若しくは実験室サンプル中のN結合型グリカン若しくは遊離N−グリカンの存在若しくは量の検出のための使用;又は(e)生物学的若しくは実験室サンプル中のO結合型グリカン若しくは遊離O−グリカンの存在若しくは量の検出のための使用。
- (e)において、前記O結合型グリカンが、O結合型GlcNAc若しくはO結合型GalNAcを含むか、又は前記遊離O−グリカンが、O−GlcNAc若しくはO−GalNAcを含む、請求項28に記載の使用。
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