JP5846599B2 - ガラクトース６硫酸結合性タンパク質 - Google Patents
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Description
本発明は、ガラクトース６硫酸に結合する新規なタンパク質に関する。
ガラクトースの６位に硫酸基を転移する酵素であるケラタン硫酸ガラクトース６硫酸転移酵素（CHST1）の遺伝子、並びにその産物であるガラクトース６硫酸を含有するケラタン硫酸は、脳腫瘍の悪性化にともなって、発現が増加することが知られている（非特許文献１、非特許文献２）。
一方、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞など多分化能を有する未分化細胞表面で発現し、細胞分化と共に失われるTra-1-60及びTra-1-81抗原は、多能性幹細胞を判別する際の未分化マーカーとして広く用いられているが、その際に用いられるTra-1-60抗体及びTra-1-81抗体はいずれも糖タンパク質ポドカリキシン（podocalyxin）上のケラタン硫酸化を糖鎖エピトープとして認識していることが明らかになっている（非特許文献３）。ケラタン硫酸は、６位炭素が硫酸化されたガラクトース（Gal）とＮ-アセチルグルコサミン（GlcNAc）の繰り返しで構成され、硫酸基はGal及びGlcNAcの両方又は片方の６位の炭素に結合している構造を有している（-3[6S]Galβ1-4[6S]GlcNAcβ1-）。Tra-1-60抗体及びTra-1-81抗体が、ケラタン硫酸中のどの位置の硫酸結合糖鎖構造部分を認識しているのかは解明されていないが、細胞分化に関してもケラタン硫酸化の役割の重要性が指摘されたことから、さらにガラクトース６硫酸の指標としての重要性が高まってきている（非特許文献３）。
このように、ガラクトース６硫酸は癌などの疾患の悪性化を示す重要な指標であるのみならず、細胞の分化の過程で重要な役割を果たしている可能性も高いことが考えられるため、ガラクトース６硫酸含有糖鎖エピトープを検出することができるプローブとなる糖結合タンパク質を開発することができれば、細胞の分化度や癌などの疾患の進行度を調べるための診断技術の開発が期待できる。
一方、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞など多分化能を有する未分化細胞表面で発現し、細胞分化と共に失われるTra-1-60及びTra-1-81抗原は、多能性幹細胞を判別する際の未分化マーカーとして広く用いられているが、その際に用いられるTra-1-60抗体及びTra-1-81抗体はいずれも糖タンパク質ポドカリキシン（podocalyxin）上のケラタン硫酸化を糖鎖エピトープとして認識していることが明らかになっている（非特許文献３）。ケラタン硫酸は、６位炭素が硫酸化されたガラクトース（Gal）とＮ-アセチルグルコサミン（GlcNAc）の繰り返しで構成され、硫酸基はGal及びGlcNAcの両方又は片方の６位の炭素に結合している構造を有している（-3[6S]Galβ1-4[6S]GlcNAcβ1-）。Tra-1-60抗体及びTra-1-81抗体が、ケラタン硫酸中のどの位置の硫酸結合糖鎖構造部分を認識しているのかは解明されていないが、細胞分化に関してもケラタン硫酸化の役割の重要性が指摘されたことから、さらにガラクトース６硫酸の指標としての重要性が高まってきている（非特許文献３）。
このように、ガラクトース６硫酸は癌などの疾患の悪性化を示す重要な指標であるのみならず、細胞の分化の過程で重要な役割を果たしている可能性も高いことが考えられるため、ガラクトース６硫酸含有糖鎖エピトープを検出することができるプローブとなる糖結合タンパク質を開発することができれば、細胞の分化度や癌などの疾患の進行度を調べるための診断技術の開発が期待できる。
しかしながら、ガラクトースの３位やＮ-アセチルグルコサミンの６位に硫酸が転移された硫酸化糖鎖に対する各種抗体は作製されているものの、ガラクトース６硫酸に対する抗体は報告されておらず、上述のTra-1-60抗体及びTra-1-81抗体は、ケラタン硫酸を認識しているとはいえるものの、特異的にガラクトース６硫酸を認識しているとは限らない。
糖結合タンパク質の代表的な分子として、抗体の他にレクチンがある。
レクチンは糖に結合するタンパク質であり、ヒトからウイルスまで全ての生物に存在する。レクチンは、進化的に保存された糖結合ドメイン（ＣＲＤ）の構造に応じてファミリーに分類されている。例えば、Ｌ型、Ｃ型、Ｒ型、Ｐ型、シグレック、ガレクチン、カルネキシン／カルレティキュリンなどがある。
このうち、ヒトのＣ型レクチンの１種であるランゲリンはカルシウム依存的にガラクトース６硫酸含有糖鎖に結合することが報告されている（非特許文献４）。しかしランゲリンは高マンノース型糖鎖にも強く結合することから、ガラクトース６硫酸特異的なプローブとはいえない。また、親和性も非常に低く、ガラクトース６硫酸を検出するためのプローブとして産業的に使用することは困難である。
以上のように、ガラクトース６硫酸を検出可能なプローブについての開発は強く望まれていたが、未だに有効なプローブが提供されないため、その組織分布もほとんど明らかにされておらず、機能解明も進んでいない状況下にあった。
糖結合タンパク質の代表的な分子として、抗体の他にレクチンがある。
レクチンは糖に結合するタンパク質であり、ヒトからウイルスまで全ての生物に存在する。レクチンは、進化的に保存された糖結合ドメイン（ＣＲＤ）の構造に応じてファミリーに分類されている。例えば、Ｌ型、Ｃ型、Ｒ型、Ｐ型、シグレック、ガレクチン、カルネキシン／カルレティキュリンなどがある。
このうち、ヒトのＣ型レクチンの１種であるランゲリンはカルシウム依存的にガラクトース６硫酸含有糖鎖に結合することが報告されている（非特許文献４）。しかしランゲリンは高マンノース型糖鎖にも強く結合することから、ガラクトース６硫酸特異的なプローブとはいえない。また、親和性も非常に低く、ガラクトース６硫酸を検出するためのプローブとして産業的に使用することは困難である。
以上のように、ガラクトース６硫酸を検出可能なプローブについての開発は強く望まれていたが、未だに有効なプローブが提供されないため、その組織分布もほとんど明らかにされておらず、機能解明も進んでいない状況下にあった。
Hayatsu N, Ogasawara S, Kaneko MK, Kato Y, Narimatsu H., Biochem Biophys Res Commun. 2008 Apr 4;368(2):217-22.
Kato Y, Hayatsu N, Kaneko MK, Ogasawara S, Hamano T, Takahashi S, Nishikawa R, Matsutani M, Mishima K, Narimatsu H., Biochem Biophys Res Commun. 2008 May 16;369(4):1041-6.
Badcock G, Pigott C, Goepel J, Andrews PW., Cancer Res. 1999 Sep 15;59(18):4715-9.
Tateno H, Ohnishi K, Yabe R, Hayatsu N, Sato T, Takeya M, Narimatsu H, Hirabayashi J.J Biol Chem. 2010 Feb 26;285(9):6390-400.
Yabe R, Suzuki R, Kuno A, Fujimoto Z, Jigami Y, Hirabayashi J. J Biochem (Tokyo). 2007 Mar;141(3):389-399.
Hemmi H, Kuno A, Ito S, Suzuki R, Hasegawa T, Hirabayashi J. FEBS J. 2009 Apr;276(7):2095-105.
Suzuki R, Kuno A, Hasegawa T, Hirabayashi J, Kasai KI, Momma M, Fujimoto Z. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2009 Jan;65(Pt.1):49-57.
本発明の課題は、癌などの悪性化や細胞分化に対して重要な役割を果たしていると考えられるガラクトース６硫酸に結合する新規なタンパク質を提供することである。
本発明者らは、各種レクチンのうちでヒトからバクテリアまで広く生物に存在している唯一のタンパク質ファミリーであるＲ型レクチンがガラクトース特異的に結合することに着目し、そのうちでアミノ酸配列が既知で、Ｒ型レクチン固有のβ-トレフォイル構造が確認されているミミズ由来レクチンEW29（GenBank登録番号：AB010783）のＣ末端ドメイン（EW29Ch：配列番号１）を出発材料とし、糖認識ドメイン遺伝子を改変することで、６硫酸化ガラクトースを認識する新規タンパク質を提供できないかと考えた。
EW29Chの改変体としては、最近、エラー導入PCR/リボソームディスプレイ法の改法を用い、ガラクトース特異性を、α２−６シアル酸特異的に改変することに成功した例が報告されている（非特許文献５）。
しかし、従来のエラー導入PCR/リボソームディスプレイ法では、目的のクローンの糖結合特異性を迅速にスクリーニングすることができず、そのために有効なガラクトース６硫酸に結合するプローブを取得するのは容易ではなかった。
本発明者らは、本発明者らの研究グループで以前開発したエラー導入PCR/リボソームディスプレイ法（非特許文献５）をもとに、さらにスクリーニング効率を高める工夫を加えて、EW29のＣ末端側機能ドメイン（EW29Ch）にランダム変異を導入してスクリーニングすることで２０クローンを選択し、各クローン由来の変異EW29Chのアミノ酸配列を詳細に検討すると、糖との結合に必須で糖骨格中の水酸基との水素結合に関与していることが知られているドメイン内で最初のアスパラギン酸(D)（非特許文献６、７）、即ち１８位のアスパラギン酸(D)は全てのαドメインで保存されていた。また、糖結合に関与するといわれている３３位のトリプトファン（W）、３６位のリジン（K）及び４３位のアスパラギン（N）のいずれにも変異の導入はなかったが、一方で２０クローン中１４クローンという高確率で２０位のグルタミン酸（E）がリジン（K）に変異していた。そこで、E20K変異を有する１４クローンから任意に８クローンを選択し、E20が保存されている他の８クローンから４クローン選択し、それぞれを大腸菌で発現させて糖結合活性を測定したところ、E20K変異を有するクローンは全てガラクトース６硫酸との結合が強くなっていたものの、E20が保存されているクローンはいずれもガラクトース６硫酸への結合活性に変化は見られなかった。次いで、野生型EW29Chのαドメイン中でE20Kのみに変異を有するEW29Ch変異体を作製して、当該EW29Ch変異体もまたガラクトース６硫酸への結合活性があることを確認した。
以上のことから、EW29のＣ末端側機能ドメイン（EW29Ch）においてαサブドメインの２０位のグルタミン酸（E）がリジン（K）に変更されることがガラクトース６硫酸に結合するために必須であることを確定することができた。これらの知見を得たことで本発明を完成するに至った。
EW29Chの改変体としては、最近、エラー導入PCR/リボソームディスプレイ法の改法を用い、ガラクトース特異性を、α２−６シアル酸特異的に改変することに成功した例が報告されている（非特許文献５）。
しかし、従来のエラー導入PCR/リボソームディスプレイ法では、目的のクローンの糖結合特異性を迅速にスクリーニングすることができず、そのために有効なガラクトース６硫酸に結合するプローブを取得するのは容易ではなかった。
本発明者らは、本発明者らの研究グループで以前開発したエラー導入PCR/リボソームディスプレイ法（非特許文献５）をもとに、さらにスクリーニング効率を高める工夫を加えて、EW29のＣ末端側機能ドメイン（EW29Ch）にランダム変異を導入してスクリーニングすることで２０クローンを選択し、各クローン由来の変異EW29Chのアミノ酸配列を詳細に検討すると、糖との結合に必須で糖骨格中の水酸基との水素結合に関与していることが知られているドメイン内で最初のアスパラギン酸(D)（非特許文献６、７）、即ち１８位のアスパラギン酸(D)は全てのαドメインで保存されていた。また、糖結合に関与するといわれている３３位のトリプトファン（W）、３６位のリジン（K）及び４３位のアスパラギン（N）のいずれにも変異の導入はなかったが、一方で２０クローン中１４クローンという高確率で２０位のグルタミン酸（E）がリジン（K）に変異していた。そこで、E20K変異を有する１４クローンから任意に８クローンを選択し、E20が保存されている他の８クローンから４クローン選択し、それぞれを大腸菌で発現させて糖結合活性を測定したところ、E20K変異を有するクローンは全てガラクトース６硫酸との結合が強くなっていたものの、E20が保存されているクローンはいずれもガラクトース６硫酸への結合活性に変化は見られなかった。次いで、野生型EW29Chのαドメイン中でE20Kのみに変異を有するEW29Ch変異体を作製して、当該EW29Ch変異体もまたガラクトース６硫酸への結合活性があることを確認した。
以上のことから、EW29のＣ末端側機能ドメイン（EW29Ch）においてαサブドメインの２０位のグルタミン酸（E）がリジン（K）に変更されることがガラクトース６硫酸に結合するために必須であることを確定することができた。これらの知見を得たことで本発明を完成するに至った。
即ち，本発明は以下の発明を包含する。
〔１〕 下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列において、２０位が塩基性アミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含む糖認識ドメインを有することを特徴とする、ガラクトース６硫酸に結合活性を有するタンパク質；
（ａ）配列番号２〜１６又は１８に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２〜１６又は１８に示されるアミノ酸配列において、１８位のアスパラギン酸以外のアミノ酸のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号５９〜７４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつその５４〜５６位の塩基配列がコードするコドンがアスパラギン酸である塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。
〔２〕 前記（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列が、３３位のトリプトファン、３６位のリジン及び４３位のアスパラギンの少なくとも１つのアミノ酸が保存されていることを特徴とする、前記〔１〕に記載のタンパク質。
〔３〕 前記サブドメインのアミノ酸配列が、配列番号３〜１６及び１８から選択されたいずれか１つのアミノ酸配列である、前記〔２〕に記載のタンパク質。
〔４〕 さらに、ミミズ由来レクチンEW29のＣ末端ドメイン（EW29Ch）のβもしくはγサブドメイン、又は他のＲ型レクチンの糖認識ドメインを少なくとも１つ含むことを特徴とする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載のタンパク質。
〔５〕 β-トレフォイル構造を有していることを特徴とする、前記〔４〕に記載のタンパク質。
〔６〕 配列番号１７及び配列番号３０〜４３から選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む、前記〔５〕に記載のタンパク質。
〔７〕 Ｒ型レクチンのβ-トレフォイル構造を形成する糖認識ドメイン中の少なくとも１つのサブドメインのアミノ酸配列において、EW29Chのαドメイン（EW29Ch-α）のアミノ酸配列（配列番号２）の１８位に対応するガラクトース結合部位であるアスパラギン酸を変更することなく、当該アスパラギン酸に続くループ内に存在し、かつアスパラギン酸の下流１〜４アミノ酸のいずれかの位置に存在する、EW29Ch-αのアミノ酸配列の２０位のグルタミン酸に対応する酸性又は中性アミノ酸が、塩基性アミノ酸に変異していることを特徴とする、ガラクトース６硫酸に結合活性を有するタンパク質。
〔８〕 前記サブドメインのアミノ酸配列が、配列番号２及び配列番号１９〜２８から選択されたいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、前記〔７〕に記載のタンパク質。
〔９〕 前記〔１〕〜〔８〕のいずれか１つに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
〔１０〕 前記〔１〕〜〔８〕のいずれか１つに記載のタンパク質を有効成分として含む、ガラクトース６硫酸含有糖鎖検出用試薬。
〔１１〕 ビーズ又は基板表面に固定化された、前記〔１０〕に記載の試薬。
〔１２〕 前記〔１〕〜〔８〕のいずれか１つに記載のタンパク質を用いることを特徴とする、生物学的試料中に含まれるガラクトース６硫酸含有糖鎖を検出する方法。
〔１３〕ビーズ又は基板表面に固定化された、前記〔１〕〜〔８〕のいずれか１つに記載のタンパク質を用いることを特徴とする、ガラクトース６硫酸含有糖鎖を有する化合物を捕獲する方法。
〔１〕 下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列において、２０位が塩基性アミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含む糖認識ドメインを有することを特徴とする、ガラクトース６硫酸に結合活性を有するタンパク質；
（ａ）配列番号２〜１６又は１８に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２〜１６又は１８に示されるアミノ酸配列において、１８位のアスパラギン酸以外のアミノ酸のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号５９〜７４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつその５４〜５６位の塩基配列がコードするコドンがアスパラギン酸である塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。
〔２〕 前記（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列が、３３位のトリプトファン、３６位のリジン及び４３位のアスパラギンの少なくとも１つのアミノ酸が保存されていることを特徴とする、前記〔１〕に記載のタンパク質。
〔３〕 前記サブドメインのアミノ酸配列が、配列番号３〜１６及び１８から選択されたいずれか１つのアミノ酸配列である、前記〔２〕に記載のタンパク質。
〔４〕 さらに、ミミズ由来レクチンEW29のＣ末端ドメイン（EW29Ch）のβもしくはγサブドメイン、又は他のＲ型レクチンの糖認識ドメインを少なくとも１つ含むことを特徴とする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載のタンパク質。
〔５〕 β-トレフォイル構造を有していることを特徴とする、前記〔４〕に記載のタンパク質。
〔６〕 配列番号１７及び配列番号３０〜４３から選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む、前記〔５〕に記載のタンパク質。
〔７〕 Ｒ型レクチンのβ-トレフォイル構造を形成する糖認識ドメイン中の少なくとも１つのサブドメインのアミノ酸配列において、EW29Chのαドメイン（EW29Ch-α）のアミノ酸配列（配列番号２）の１８位に対応するガラクトース結合部位であるアスパラギン酸を変更することなく、当該アスパラギン酸に続くループ内に存在し、かつアスパラギン酸の下流１〜４アミノ酸のいずれかの位置に存在する、EW29Ch-αのアミノ酸配列の２０位のグルタミン酸に対応する酸性又は中性アミノ酸が、塩基性アミノ酸に変異していることを特徴とする、ガラクトース６硫酸に結合活性を有するタンパク質。
〔８〕 前記サブドメインのアミノ酸配列が、配列番号２及び配列番号１９〜２８から選択されたいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、前記〔７〕に記載のタンパク質。
〔９〕 前記〔１〕〜〔８〕のいずれか１つに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
〔１０〕 前記〔１〕〜〔８〕のいずれか１つに記載のタンパク質を有効成分として含む、ガラクトース６硫酸含有糖鎖検出用試薬。
〔１１〕 ビーズ又は基板表面に固定化された、前記〔１０〕に記載の試薬。
〔１２〕 前記〔１〕〜〔８〕のいずれか１つに記載のタンパク質を用いることを特徴とする、生物学的試料中に含まれるガラクトース６硫酸含有糖鎖を検出する方法。
〔１３〕ビーズ又は基板表面に固定化された、前記〔１〕〜〔８〕のいずれか１つに記載のタンパク質を用いることを特徴とする、ガラクトース６硫酸含有糖鎖を有する化合物を捕獲する方法。
本発明によって提供できた新規なEW29Ch変異体タンパク質などのＲ型レクチン由来変異体は、ガラクトース６硫酸を認識することができる優れたプローブとして用いることができる。当該プローブは、細胞の分化度の評価や癌などの疾患の進行度を調べるための診断に用いることができるから、再生医療技術や癌など各種疾患の診断技術におけるさらなる向上が期待できる。
１．Ｒ型レクチンについて
Ｒ型レクチンはβ-トレフォイルと呼ばれる三つ葉のクローバー様の構造を有しており、β-トレフォイル構造を介してガラクトースを特異的に認識する。この三つ葉はサブドメインα、β、γで構成され、３回対称軸で配置されている。いずれのサブドメインも糖結合部位となりうるが、多くのＲ型レクチンではそのうちの１つ、もしくは２つにだけ糖結合に必須なアミノ酸が保存されている。特に各ドメインのＮ末端側に位置する進化的に保存されたアスバラギン酸（D）は糖との結合に必須であることが知られており、ガラクトースなど糖骨格中の水酸基との水素結合に関与しているといわれている（非特許文献６、７）。
本発明の出発原料として用いたミミズ由来レクチンEW29のＣ末端ドメイン（EW29Ch）のαサブドメイン、γサブドメインと共に、他の代表的Ｒ型レクチンの糖結合性ドメインを並べて示す（図１）。図１のRicin-B1（AAB22582）、Ricin-B2（AAB22582）はトウゴマ（ヒマ）の種子から抽出したレクチンRicinのＢ鎖であり、SoCBM13（1XYF_A）は放線菌Streptomyces olivaceoviridisE-86由来のキシラナーゼの基質認識ドメインであり、ML1-B1(1OQL_B)、ML1-B2(1OQL_B)はヤドリギから抽出したレクチンMLのＢ鎖であり、pp-GalNAcT-１(XP_687472)は、ムチンなどのＯ型糖鎖の生合成に関連する糖転移酵素である。いずれのＲ型レクチンにおいてもEW29Chのαサブドメインの１８位に相当する位置の糖結合部位であるアスパラギン酸(D)は保存されている。結晶構造解析がなされているEW29Chのαサブドメインを図２として示す。図１及び図２に示されるように、アスパラギン酸（D）及びそれに続く１〜４アミノ酸まではβ-シートで囲まれて形成されたループ内に存在している。当該ループ構造全体が結合対象の糖を包み込む構造をとり、アスパラギン酸（D）の位置で糖と水素結合するが、その１〜４下流のアミノ酸位置の電荷などが結合対象の糖の種類を決定づけていると考えられる。本発明の結果によれば、EW29Ch-αの場合は、Dの２アミノ酸下流のEがガラクトースを対象に選んでいたのが、E→Kの変異導入によって電荷が（−）→（＋）へとプラス側に変更され、マイナス電荷を有するガラクトース６硫酸への認識能を獲得したと説明できる。このことは、リジン（K）以外のアルギニン（R）への変異でも同様のガラクトース６硫酸認識性のレクチンに変更できると考えられる。また、図１に示されるように、他のＲ型レクチンの糖結合性ドメインにおいても、アスパラギン酸（D）の１〜４下流のアミノ酸のうちで、ループ構造を構造的に見たときにEW29Ch-αのEに対応する位置が、ガラクトース６硫酸結合活性獲得に重要な変異導入候補位置であり、この位置のアミノ酸を、電荷が＋側の方向にシフトさせるアミノ酸への変異導入により、ガラクトース６硫酸結合レクチンを作製することができると期待できる。
反対に、Ricin毒素のRicin-B1αサブドメインもしくはγサブドメイン又はML1-B1αサブドメインなどで、すでにEW29Ch-αにおけるE20の位置は塩基性アミノ酸であるアルギニン（R）を有していることからみて、毒性が高くて取り扱いにくいレクチンであるため確認はなされていないが、本来のガラクトース結合活性と共に、ガラクトース６硫酸への結合活性も有しているものと解される。
Ｒ型レクチンはβ-トレフォイルと呼ばれる三つ葉のクローバー様の構造を有しており、β-トレフォイル構造を介してガラクトースを特異的に認識する。この三つ葉はサブドメインα、β、γで構成され、３回対称軸で配置されている。いずれのサブドメインも糖結合部位となりうるが、多くのＲ型レクチンではそのうちの１つ、もしくは２つにだけ糖結合に必須なアミノ酸が保存されている。特に各ドメインのＮ末端側に位置する進化的に保存されたアスバラギン酸（D）は糖との結合に必須であることが知られており、ガラクトースなど糖骨格中の水酸基との水素結合に関与しているといわれている（非特許文献６、７）。
本発明の出発原料として用いたミミズ由来レクチンEW29のＣ末端ドメイン（EW29Ch）のαサブドメイン、γサブドメインと共に、他の代表的Ｒ型レクチンの糖結合性ドメインを並べて示す（図１）。図１のRicin-B1（AAB22582）、Ricin-B2（AAB22582）はトウゴマ（ヒマ）の種子から抽出したレクチンRicinのＢ鎖であり、SoCBM13（1XYF_A）は放線菌Streptomyces olivaceoviridisE-86由来のキシラナーゼの基質認識ドメインであり、ML1-B1(1OQL_B)、ML1-B2(1OQL_B)はヤドリギから抽出したレクチンMLのＢ鎖であり、pp-GalNAcT-１(XP_687472)は、ムチンなどのＯ型糖鎖の生合成に関連する糖転移酵素である。いずれのＲ型レクチンにおいてもEW29Chのαサブドメインの１８位に相当する位置の糖結合部位であるアスパラギン酸(D)は保存されている。結晶構造解析がなされているEW29Chのαサブドメインを図２として示す。図１及び図２に示されるように、アスパラギン酸（D）及びそれに続く１〜４アミノ酸まではβ-シートで囲まれて形成されたループ内に存在している。当該ループ構造全体が結合対象の糖を包み込む構造をとり、アスパラギン酸（D）の位置で糖と水素結合するが、その１〜４下流のアミノ酸位置の電荷などが結合対象の糖の種類を決定づけていると考えられる。本発明の結果によれば、EW29Ch-αの場合は、Dの２アミノ酸下流のEがガラクトースを対象に選んでいたのが、E→Kの変異導入によって電荷が（−）→（＋）へとプラス側に変更され、マイナス電荷を有するガラクトース６硫酸への認識能を獲得したと説明できる。このことは、リジン（K）以外のアルギニン（R）への変異でも同様のガラクトース６硫酸認識性のレクチンに変更できると考えられる。また、図１に示されるように、他のＲ型レクチンの糖結合性ドメインにおいても、アスパラギン酸（D）の１〜４下流のアミノ酸のうちで、ループ構造を構造的に見たときにEW29Ch-αのEに対応する位置が、ガラクトース６硫酸結合活性獲得に重要な変異導入候補位置であり、この位置のアミノ酸を、電荷が＋側の方向にシフトさせるアミノ酸への変異導入により、ガラクトース６硫酸結合レクチンを作製することができると期待できる。
反対に、Ricin毒素のRicin-B1αサブドメインもしくはγサブドメイン又はML1-B1αサブドメインなどで、すでにEW29Ch-αにおけるE20の位置は塩基性アミノ酸であるアルギニン（R）を有していることからみて、毒性が高くて取り扱いにくいレクチンであるため確認はなされていないが、本来のガラクトース結合活性と共に、ガラクトース６硫酸への結合活性も有しているものと解される。
２．本発明のガラクトース６硫酸結合タンパク質について
本発明では、ガラクトースに結合するＲ型レクチンのうちで、Ｘ線解析により立体構造が明らかとなっているミミズ由来のレクチンのＣ末端ドメインEW29Chを出発原料としたが、他のＲ型レクチンのガラクトース結合ドメインについても、ガラクトース結合部位のアスパラギン酸(D)の１〜４下流のアミノ酸のうちで、ループ構造を構造的に見たときにEW29Ch-αのEに対応する位置のアミノ酸の電荷を＋側の方向にシフトさせるアミノ酸への改変によっても、同様のガラクトース６硫酸結合タンパク質を得ることができる。
そのようなタンパク質は、具体的には、以下のように記載することができる。
Ｒ型レクチンのβ-トレフォイル構造を形成する糖認識ドメインの少なくとも１つのサブドメインのアミノ酸配列において、EW29Chのαドメイン（EW29Ch-α）のアミノ酸配列（配列番号２）の１８位に対応するガラクトース結合部位であるアスパラギン酸を変更することなく、当該アスパラギン酸に続くループ内に存在し、かつアスパラギン酸の下流１〜４アミノ酸のいずれかの位置に存在する、EW29Ch-αのアミノ酸配列の２０位のグルタミン酸に対応する酸性又は中性アミノ酸が、塩基性アミノ酸に変異していることを特徴とする、ガラクトース６硫酸を認識する糖認識ドメインを含むタンパク質。
特に、本発明の実施例において実際にガラクトース６硫酸に結合することが確認できたEW29Chの、少なくとも変異αサブドメインを含むタンパク質が好ましく、具体的には、
「下記（ａ）〜（ｃ）いずれかのアミノ酸配列において、２０位が塩基性アミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなる糖認識ドメインを含む、ガラクトース６硫酸に結合活性を有するタンパク質；
（ａ）配列番号２〜１６又は１８に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２〜１６又は１８に示されるアミノ酸配列において、１８位のアスパラギン酸以外のアミノ酸のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号５９〜７４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつその５４〜５６位の塩基配列がコードするコドンがアスパラギン酸である塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。」
と表記することができる。
ここで、配列番号２〜１６又は１８には、天然のEW29Chのαサブドメインのアミノ酸配列のＮ末端にMet（M）が付加されている。このMetは天然EW29Ch-αには含まれておらず、大腸菌で発現させるために付加されたものであるから他の宿主細胞で発現させる場合、又は化学的に合成する場合は不要である。以下の配列番号１７、３０〜４３も同様である。対応する塩基配列（配列番号２９，４４〜７４）における５’末端の「ATG」コドンも同様である。
ここで、２０位の塩基性アミノ酸としては、リジン、アルギニンが好ましく、特にリジンが好ましい。
また、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列のうち、アミノ酸配列中の１８位がアスパラギン酸（D）であって、かつ３３位のトリプトファン（W）、３６位のリジン（K）及び４３位のアスパラギン（N）のうち、少なくとも１つが保存されているアミノ酸配列であることが好ましく、いずれも保存されていることがさらに好ましい。
なお、１もしくは数個が欠失、置換、付加する場合の変異の数は１〜２０個でもよいが、１〜１０個であることが好ましく、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個である。
また、ここでストリンジェントな条件というとき、ミスマッチ配列が１５％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下のハイブリダイズ条件を指し、例えば0.5％SDS、5×デンハルツ［Denhardt’s、0.1％ウシ血清アルブミン(BSA)、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％フィコール400］及び100μg/mlサケ精子DNAを含む6×SSC(1×SSCは0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウム、pH7.0）中で、50℃で4時間〜一晩保温を行う条件をいう（Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd ed.(2001）Cold Spring Harbor Laboratoryなど)。
さらに具体的なアミノ酸配列としては、配列番号３〜１６又は１８に示されるアミノ酸配列をαドメインとして有するβ-トレフォイル構造含有タンパク質である。
ガラクトース６硫酸結合活性に関わる領域はαサブドメインであるので、本願発明のタンパク質と機能的に同等な変異体としては、αサブドメインを構成するアミノ酸配列においては、ガラクトース６硫酸結合活性を保持するために、通常はアミノ酸配列として９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性(同一性)を有するが、他のβ及びγサブドメインについては、β-トレフォイル構造を形成してαサブドメインを安定化させるための機能が保持されていればよい。
典型的には、配列番号１７及び配列番号３０〜４３から選択されたいずれか１つのアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列において、２０位のリジン(K)、１８位のアスパラギン酸（D）以外のアミノ酸が１もしくは数個が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列を有し、かつβ-トレフォイル構造を保持した、ガラクトース６硫酸に結合活性を有するタンパク質が含まれる。全長のアミノ酸配列の相同性（同一性）は、通常、８０％以上、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上保持されている。
ここで、好ましくはさらに３３位のトリプトファン（W）、３６位のリジン（K）及び４３位のアスパラギン（N）の１つ以上も変異されていないことが好ましい。
しかし、上述のように、β及びγサブドメインの役割としてはβ-トレフォイル構造を形成できればよいため、EW29Ch由来のアミノ酸配列である必要もなく、他の公知のＲ型レクチンのβ-トレフォイル構造を形成する糖認識ドメイン中のサブドメインを代替できる。また、公知の安定なタンパク質との融合タンパク質を形成させたり、薬理学的に許容される担体と化学的に結合させて用いることもできる。
以上のように、本発明のガラクトース６硫酸結合性タンパク質は、EW29Chに由来する変異蛋白質には限られないが、本願発明の典型的なタンパク質であるので、その取得方法、特性などについては、以下、EW29Ch由来変異タンパク質について述べる。
本発明では、ガラクトースに結合するＲ型レクチンのうちで、Ｘ線解析により立体構造が明らかとなっているミミズ由来のレクチンのＣ末端ドメインEW29Chを出発原料としたが、他のＲ型レクチンのガラクトース結合ドメインについても、ガラクトース結合部位のアスパラギン酸(D)の１〜４下流のアミノ酸のうちで、ループ構造を構造的に見たときにEW29Ch-αのEに対応する位置のアミノ酸の電荷を＋側の方向にシフトさせるアミノ酸への改変によっても、同様のガラクトース６硫酸結合タンパク質を得ることができる。
そのようなタンパク質は、具体的には、以下のように記載することができる。
Ｒ型レクチンのβ-トレフォイル構造を形成する糖認識ドメインの少なくとも１つのサブドメインのアミノ酸配列において、EW29Chのαドメイン（EW29Ch-α）のアミノ酸配列（配列番号２）の１８位に対応するガラクトース結合部位であるアスパラギン酸を変更することなく、当該アスパラギン酸に続くループ内に存在し、かつアスパラギン酸の下流１〜４アミノ酸のいずれかの位置に存在する、EW29Ch-αのアミノ酸配列の２０位のグルタミン酸に対応する酸性又は中性アミノ酸が、塩基性アミノ酸に変異していることを特徴とする、ガラクトース６硫酸を認識する糖認識ドメインを含むタンパク質。
特に、本発明の実施例において実際にガラクトース６硫酸に結合することが確認できたEW29Chの、少なくとも変異αサブドメインを含むタンパク質が好ましく、具体的には、
「下記（ａ）〜（ｃ）いずれかのアミノ酸配列において、２０位が塩基性アミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなる糖認識ドメインを含む、ガラクトース６硫酸に結合活性を有するタンパク質；
（ａ）配列番号２〜１６又は１８に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２〜１６又は１８に示されるアミノ酸配列において、１８位のアスパラギン酸以外のアミノ酸のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号５９〜７４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつその５４〜５６位の塩基配列がコードするコドンがアスパラギン酸である塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。」
と表記することができる。
ここで、配列番号２〜１６又は１８には、天然のEW29Chのαサブドメインのアミノ酸配列のＮ末端にMet（M）が付加されている。このMetは天然EW29Ch-αには含まれておらず、大腸菌で発現させるために付加されたものであるから他の宿主細胞で発現させる場合、又は化学的に合成する場合は不要である。以下の配列番号１７、３０〜４３も同様である。対応する塩基配列（配列番号２９，４４〜７４）における５’末端の「ATG」コドンも同様である。
ここで、２０位の塩基性アミノ酸としては、リジン、アルギニンが好ましく、特にリジンが好ましい。
また、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列のうち、アミノ酸配列中の１８位がアスパラギン酸（D）であって、かつ３３位のトリプトファン（W）、３６位のリジン（K）及び４３位のアスパラギン（N）のうち、少なくとも１つが保存されているアミノ酸配列であることが好ましく、いずれも保存されていることがさらに好ましい。
なお、１もしくは数個が欠失、置換、付加する場合の変異の数は１〜２０個でもよいが、１〜１０個であることが好ましく、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個である。
また、ここでストリンジェントな条件というとき、ミスマッチ配列が１５％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下のハイブリダイズ条件を指し、例えば0.5％SDS、5×デンハルツ［Denhardt’s、0.1％ウシ血清アルブミン(BSA)、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％フィコール400］及び100μg/mlサケ精子DNAを含む6×SSC(1×SSCは0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウム、pH7.0）中で、50℃で4時間〜一晩保温を行う条件をいう（Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd ed.(2001）Cold Spring Harbor Laboratoryなど)。
さらに具体的なアミノ酸配列としては、配列番号３〜１６又は１８に示されるアミノ酸配列をαドメインとして有するβ-トレフォイル構造含有タンパク質である。
ガラクトース６硫酸結合活性に関わる領域はαサブドメインであるので、本願発明のタンパク質と機能的に同等な変異体としては、αサブドメインを構成するアミノ酸配列においては、ガラクトース６硫酸結合活性を保持するために、通常はアミノ酸配列として９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性(同一性)を有するが、他のβ及びγサブドメインについては、β-トレフォイル構造を形成してαサブドメインを安定化させるための機能が保持されていればよい。
典型的には、配列番号１７及び配列番号３０〜４３から選択されたいずれか１つのアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列において、２０位のリジン(K)、１８位のアスパラギン酸（D）以外のアミノ酸が１もしくは数個が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列を有し、かつβ-トレフォイル構造を保持した、ガラクトース６硫酸に結合活性を有するタンパク質が含まれる。全長のアミノ酸配列の相同性（同一性）は、通常、８０％以上、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上保持されている。
ここで、好ましくはさらに３３位のトリプトファン（W）、３６位のリジン（K）及び４３位のアスパラギン（N）の１つ以上も変異されていないことが好ましい。
しかし、上述のように、β及びγサブドメインの役割としてはβ-トレフォイル構造を形成できればよいため、EW29Ch由来のアミノ酸配列である必要もなく、他の公知のＲ型レクチンのβ-トレフォイル構造を形成する糖認識ドメイン中のサブドメインを代替できる。また、公知の安定なタンパク質との融合タンパク質を形成させたり、薬理学的に許容される担体と化学的に結合させて用いることもできる。
以上のように、本発明のガラクトース６硫酸結合性タンパク質は、EW29Chに由来する変異蛋白質には限られないが、本願発明の典型的なタンパク質であるので、その取得方法、特性などについては、以下、EW29Ch由来変異タンパク質について述べる。
３．EW29Ch由来ガラクトース６硫酸結合性変異タンパク質
（１）EW29Ch由来変異タンパク質の取得方法
（１−１）エラー導入PCR/リボソームディスプレイ法によるスクリーニング
鋳型となる野生型のEW29Ch遺伝子を含むプラスミドを用い、矢部らの方法（非特許文献８）の方法に従い、エラー導入PCRを行う。具体的には、PCRによりランダム変異を導入したEW29Chの全コード領域、及びアンカーの繊維状ファージ由来の遺伝子geneIII部分を増幅し、両者をオーバーラップPCRで融合する。このPCR産物の精製物を、変異DNAライブラリーとしてリボソーム提示法を適用する。
その後、選択されてきたcDNAを用いて大腸菌を形質転換して得られる複数のクローンの配列を解析する。
これらのランダム変異導入EW29Ch遺伝子の塩基配列に対応するアミノ酸配列において、αサブドメインにおける１８位のアスパラギン酸が変異されておらず、かつ２０位のグルタミン酸が塩基性アミノ酸に、好ましくはリジンに変更されていたものであって、αサブドメイン全体のアミノ酸変異数が数個以内であるものを選択することで、新たにガラクトース６硫酸結合活性を有する変異EW29Chを取得することができる。
必要に応じて、下記４．の方法に従って、ガラクトース６硫酸との結合活性を確認する。
（１）EW29Ch由来変異タンパク質の取得方法
（１−１）エラー導入PCR/リボソームディスプレイ法によるスクリーニング
鋳型となる野生型のEW29Ch遺伝子を含むプラスミドを用い、矢部らの方法（非特許文献８）の方法に従い、エラー導入PCRを行う。具体的には、PCRによりランダム変異を導入したEW29Chの全コード領域、及びアンカーの繊維状ファージ由来の遺伝子geneIII部分を増幅し、両者をオーバーラップPCRで融合する。このPCR産物の精製物を、変異DNAライブラリーとしてリボソーム提示法を適用する。
その後、選択されてきたcDNAを用いて大腸菌を形質転換して得られる複数のクローンの配列を解析する。
これらのランダム変異導入EW29Ch遺伝子の塩基配列に対応するアミノ酸配列において、αサブドメインにおける１８位のアスパラギン酸が変異されておらず、かつ２０位のグルタミン酸が塩基性アミノ酸に、好ましくはリジンに変更されていたものであって、αサブドメイン全体のアミノ酸変異数が数個以内であるものを選択することで、新たにガラクトース６硫酸結合活性を有する変異EW29Chを取得することができる。
必要に応じて、下記４．の方法に従って、ガラクトース６硫酸との結合活性を確認する。
（１−２）遺伝子工学的な変異の導入法
本発明の変異EW29Ch-α遺伝子は、野生型の塩基配列（配列番号５９）、又はすでに変異が導入されているEW29Ch-mutant＃１〜１４及び（E20K)-α遺伝子(以下、EW29Ch(m)-α遺伝子という。配列番号６０〜７４)に対して、例えば部位突然変異法などにより遺伝子工学的な改変を行うことができる。
また、EW29Ch-α遺伝子を含む糖認識ドメイン全体の野生型EW29Ch遺伝子(配列番号２９)、又は既に変異が導入されているEW29Ch(m)遺伝子（配列番号４４〜５８）に対して、同様に遺伝子工学的な改変を行ってもよい。
その際には、αサブドメインにおける１８位のアスパラギン酸には変異を導入することなく、好ましくは、３３位のトリプトファン（W）、３６位のリジン（K）及び４３位のアスパラギン（N）の１つ以上も変異させず、かつ２０位のグルタミン酸を塩基性アミノ酸に、好ましくはリジンに変更する変異を導入すると共に、その他の任意の位置に、αサブドメイン全体のアミノ酸変異数が数個以内となるように変異を導入する。
適宜、下記４．の方法に従って、ガラクトース６硫酸との結合活性を確認しながら、最適な変異導入位置を探ることができる。
本発明の変異EW29Ch-α遺伝子は、野生型の塩基配列（配列番号５９）、又はすでに変異が導入されているEW29Ch-mutant＃１〜１４及び（E20K)-α遺伝子(以下、EW29Ch(m)-α遺伝子という。配列番号６０〜７４)に対して、例えば部位突然変異法などにより遺伝子工学的な改変を行うことができる。
また、EW29Ch-α遺伝子を含む糖認識ドメイン全体の野生型EW29Ch遺伝子(配列番号２９)、又は既に変異が導入されているEW29Ch(m)遺伝子（配列番号４４〜５８）に対して、同様に遺伝子工学的な改変を行ってもよい。
その際には、αサブドメインにおける１８位のアスパラギン酸には変異を導入することなく、好ましくは、３３位のトリプトファン（W）、３６位のリジン（K）及び４３位のアスパラギン（N）の１つ以上も変異させず、かつ２０位のグルタミン酸を塩基性アミノ酸に、好ましくはリジンに変更する変異を導入すると共に、その他の任意の位置に、αサブドメイン全体のアミノ酸変異数が数個以内となるように変異を導入する。
適宜、下記４．の方法に従って、ガラクトース６硫酸との結合活性を確認しながら、最適な変異導入位置を探ることができる。
（１−３）その他
EW29Ch遺伝子はミミズのうちでも環形動物門（Annelida）の一つの綱である貧毛類に属するフツウミミズ（Lumbricus terrestris）であるので、環形動物門（Annelida）の一つの綱である貧毛類、又は多毛類、蛭類などのDNAライブラリーを用いることで、ミミズ由来の野生型EW29Ch-α遺伝子（配列番号５９）もしくはその変異遺伝子であるEW29Ch(m)-α遺伝子の塩基配列(配列番号６０〜７４)、またはEW29Ch遺伝子(配列番号２９)もしくは変異が導入されたEW29Ch(m)遺伝子の塩基配列（配列番号４４〜５８）をもとにプライマー、プローブを設計することができるから、これらプライマー、プローブを用いたPCR法、ハイブリダイゼーション法でも取得することができる。得られた遺伝子に対して、さらに上記（１−２）の方法を適用することで、よりガラクトース６硫酸との結合活性の高い変異αサブドメインを有するEW29Ch(m)-α遺伝子、又はEW29Ch(m)遺伝子を取得することが可能である。
このようにして得られるガラクトース６硫酸との結合活性の高い変異EW29Ch-αをコードするEW29Ch(m)-α遺伝子は、配列番号５９における５４〜５６位に対応するコドンがアスパラギン酸であり、同６０〜６２位に対応するコドンが塩基性アミノ酸である塩基配列であって、かつ、配列番号５９〜７４に示される塩基配列、又は当該配列番号５９〜７４の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む塩基配列として表現される。
そして、ガラクトース６硫酸との結合活性の高い変異EW29ChをコードするEW29Ch(m)遺伝子は、上記EW29Ch(m)-α遺伝子を含む遺伝子であり、また、配列番号２９における５４〜５６位に対応するコドンがアスパラギン酸であり、同６０〜６２位に対応するコドンが塩基性アミノ酸である塩基配列であって、かつ、配列番号２９もしくは４４〜５８に示される塩基配列、又は当該配列番号２９もしくは４４〜５８の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む塩基配列として表現される。
上記した方法で得られた変異EW29Chのαサブドメイン領域を、他のＲ型レクチン由来のサブドメイン、Ricinus communisレクチン（RCA120）、Sambucus nigraレクチン（SNA）、Polyporus squamosasレクチン（PSL）、Marasmius oreadesレクチン（MOA）、Laetiporus sulphureusレクチン（LSL）、Momordica charantiaレクチン（MCL）、Sambucus sieboldianaレクチン（SSA）、Clitocybe nebularisレクチン（CNL）などと化学的に結合する方法も採用できる。また、これらの遺伝子配列は公知であるから、遺伝子工学的な周知の手法により適宜の宿主細胞から融合蛋白として発現させることができる。
EW29Ch遺伝子はミミズのうちでも環形動物門（Annelida）の一つの綱である貧毛類に属するフツウミミズ（Lumbricus terrestris）であるので、環形動物門（Annelida）の一つの綱である貧毛類、又は多毛類、蛭類などのDNAライブラリーを用いることで、ミミズ由来の野生型EW29Ch-α遺伝子（配列番号５９）もしくはその変異遺伝子であるEW29Ch(m)-α遺伝子の塩基配列(配列番号６０〜７４)、またはEW29Ch遺伝子(配列番号２９)もしくは変異が導入されたEW29Ch(m)遺伝子の塩基配列（配列番号４４〜５８）をもとにプライマー、プローブを設計することができるから、これらプライマー、プローブを用いたPCR法、ハイブリダイゼーション法でも取得することができる。得られた遺伝子に対して、さらに上記（１−２）の方法を適用することで、よりガラクトース６硫酸との結合活性の高い変異αサブドメインを有するEW29Ch(m)-α遺伝子、又はEW29Ch(m)遺伝子を取得することが可能である。
このようにして得られるガラクトース６硫酸との結合活性の高い変異EW29Ch-αをコードするEW29Ch(m)-α遺伝子は、配列番号５９における５４〜５６位に対応するコドンがアスパラギン酸であり、同６０〜６２位に対応するコドンが塩基性アミノ酸である塩基配列であって、かつ、配列番号５９〜７４に示される塩基配列、又は当該配列番号５９〜７４の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む塩基配列として表現される。
そして、ガラクトース６硫酸との結合活性の高い変異EW29ChをコードするEW29Ch(m)遺伝子は、上記EW29Ch(m)-α遺伝子を含む遺伝子であり、また、配列番号２９における５４〜５６位に対応するコドンがアスパラギン酸であり、同６０〜６２位に対応するコドンが塩基性アミノ酸である塩基配列であって、かつ、配列番号２９もしくは４４〜５８に示される塩基配列、又は当該配列番号２９もしくは４４〜５８の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む塩基配列として表現される。
上記した方法で得られた変異EW29Chのαサブドメイン領域を、他のＲ型レクチン由来のサブドメイン、Ricinus communisレクチン（RCA120）、Sambucus nigraレクチン（SNA）、Polyporus squamosasレクチン（PSL）、Marasmius oreadesレクチン（MOA）、Laetiporus sulphureusレクチン（LSL）、Momordica charantiaレクチン（MCL）、Sambucus sieboldianaレクチン（SSA）、Clitocybe nebularisレクチン（CNL）などと化学的に結合する方法も採用できる。また、これらの遺伝子配列は公知であるから、遺伝子工学的な周知の手法により適宜の宿主細胞から融合蛋白として発現させることができる。
（２）EW29Ch由来変異タンパク質の特性
EW29Chのαドメインとラクトース複合体の立体構造図を図２に示す。糖結合に関連する４つのアミノ酸（D18、W33、K36、N43)はLine表示法で、変異が導入されたE20はStick表示法で示される位置である。進化的に保存されたアスパラギン酸の下流の１〜４アミノ酸のループ部分は糖結合特異性の決定に関係していることが知られている。ガラクトース６硫酸との結合活性を獲得した変異EW29Chは、このループ部分に塩基性アミノ酸であるリジンもしくはアルギニンが導入されることにより、ガラクトースの６位の負に荷電している硫酸基と電荷−電荷相互作用を形成することが可能となり、結果として結合親和性が格段に強くなったものと推測される。
本発明のガラクトース６硫酸結合性タンパク質は、図４及び図５に示されるように、特に糖鎖非還元末端のガラクトースの６位が硫酸基で修飾された糖鎖を認識するので、「糖鎖非還元末端のガラクトース６硫酸結合活性を有するタンパク質」と表現することもできる。
本発明のタンパク質において、「ガラクトース６硫酸結合活性」に寄与している領域は、EW29Chのβ-トレフォイル構造を形成する３つのサブドメイン中、αサブドメインに相当する領域であるため、配列番号２に示されるアミノ酸配列又はその２０位グルタミン酸の塩基性アミノ酸（リジン）置換を必須とする改変アミノ酸配列を含んでさえいれば「ガラクトース６硫酸結合活性」を有するタンパク質としての性質を有する。
しかしながら、レクチンアレイなど実用的な用途を考慮すると、EW29Chのβ-トレフォイル構造を形成する他のサブドメインであるβもしくはγサブドメイン、又は他のＲ型レクチンの糖認識ドメインを少なくとも１つ以上さらに含むことがタンパク質の安定性のためには重要である。特に、３つのサブドメインによりβ-トレフォイル構造を形成させることが望ましい。その際のサブドメインとして、EW29Chのαサブドメイン、又は変異EW29Chのαサブドメインを選択することもできる。
EW29Chのαドメインとラクトース複合体の立体構造図を図２に示す。糖結合に関連する４つのアミノ酸（D18、W33、K36、N43)はLine表示法で、変異が導入されたE20はStick表示法で示される位置である。進化的に保存されたアスパラギン酸の下流の１〜４アミノ酸のループ部分は糖結合特異性の決定に関係していることが知られている。ガラクトース６硫酸との結合活性を獲得した変異EW29Chは、このループ部分に塩基性アミノ酸であるリジンもしくはアルギニンが導入されることにより、ガラクトースの６位の負に荷電している硫酸基と電荷−電荷相互作用を形成することが可能となり、結果として結合親和性が格段に強くなったものと推測される。
本発明のガラクトース６硫酸結合性タンパク質は、図４及び図５に示されるように、特に糖鎖非還元末端のガラクトースの６位が硫酸基で修飾された糖鎖を認識するので、「糖鎖非還元末端のガラクトース６硫酸結合活性を有するタンパク質」と表現することもできる。
本発明のタンパク質において、「ガラクトース６硫酸結合活性」に寄与している領域は、EW29Chのβ-トレフォイル構造を形成する３つのサブドメイン中、αサブドメインに相当する領域であるため、配列番号２に示されるアミノ酸配列又はその２０位グルタミン酸の塩基性アミノ酸（リジン）置換を必須とする改変アミノ酸配列を含んでさえいれば「ガラクトース６硫酸結合活性」を有するタンパク質としての性質を有する。
しかしながら、レクチンアレイなど実用的な用途を考慮すると、EW29Chのβ-トレフォイル構造を形成する他のサブドメインであるβもしくはγサブドメイン、又は他のＲ型レクチンの糖認識ドメインを少なくとも１つ以上さらに含むことがタンパク質の安定性のためには重要である。特に、３つのサブドメインによりβ-トレフォイル構造を形成させることが望ましい。その際のサブドメインとして、EW29Chのαサブドメイン、又は変異EW29Chのαサブドメインを選択することもできる。
４．ガラクトース６硫酸との結合親和性の解析
ガラクトース６硫酸はガラクトースの６位に硫酸が付加された単糖で、ケラタン硫酸などのグリコサミノグリカンの構成糖になっている。
本発明では、舘野らの方法（Tateno et al.,Glycobiology. 2008;18(10):789-98）に従って糖鎖複合体アレイを用いて糖結合活性を査定した。
具体的には、レクチンを含む溶液に、レクチンもしくはレクチンのタグに対する１次抗体と、蛍光ラベル化された２次抗体を混合し、その混合液を９８種類の糖鎖複合体がスライドガラス上に固定化されたアレイと反応させる。結合はエバネッセント波励起蛍光型スキャナーで検出する。
しかし、当該方法に限定されることはなく、ELISA、表面プラズモン共鳴センサ、平衡透析法、滴定カロリメトリー、水晶発振子センサ検出法などの方法によっても結合活性の測定をすることができる。
ガラクトース６硫酸はガラクトースの６位に硫酸が付加された単糖で、ケラタン硫酸などのグリコサミノグリカンの構成糖になっている。
本発明では、舘野らの方法（Tateno et al.,Glycobiology. 2008;18(10):789-98）に従って糖鎖複合体アレイを用いて糖結合活性を査定した。
具体的には、レクチンを含む溶液に、レクチンもしくはレクチンのタグに対する１次抗体と、蛍光ラベル化された２次抗体を混合し、その混合液を９８種類の糖鎖複合体がスライドガラス上に固定化されたアレイと反応させる。結合はエバネッセント波励起蛍光型スキャナーで検出する。
しかし、当該方法に限定されることはなく、ELISA、表面プラズモン共鳴センサ、平衡透析法、滴定カロリメトリー、水晶発振子センサ検出法などの方法によっても結合活性の測定をすることができる。
５．ガラクトース６硫酸結合性変異タンパク質のプローブとしての用途
本発明のガラクトース６硫酸結合性タンパク質は、常法により蛍光や酵素、ビオチン等でラベル化して、蛍光染色、フローサイトメトリー、ELISA、レクチンブロッティングなどに、ガラクトース６硫酸含有糖鎖検出用プローブとして用いることができる。また、ビーズなどに固定化してガラクトース６硫酸含有糖タンパク質、複合糖質又は糖脂質などの濃縮、精製に活用することができる。また、スライドガラスなど基板上に固定化して、レクチンマイクロアレイを用いた糖鎖プロファイリングに用いることもできる。
すなわち、本願発明のガラクトース６硫酸結合性変異タンパク質を標識し、緩衝液に安定剤などと共に溶解して、ガラクトース６硫酸含有糖鎖検出用試薬として、患者血液等の被検体に対して適用することができる。典型的には、被検体中のガラクトース６硫酸含有糖鎖の検出及び定量に用いる。
また、基板表面に通常の方法で固定化してマイクロアレイ用のプローブなどとして用いることができる。
ここで、基板材料としては、好ましくは通常のマイクロアレイで使用される物質であり、シリコンウエハー、ガラス、ポリカーボネート、膜、ポリスチレンまたはポリウレタンのような高分子フィルム及び多孔性物質が用いられる。プローブの固定には、通常のマイクロアレイ製造方法で使用する方法を用いることができ、例えば、フォトリソグラフィ法、圧電印刷法、マイクロピペッティングまたはスポッティングなどの方法を用いてスポットの作成を行うことができる。
また、アレイの測定に関しては、通常の抗体アレイ、レクチンアレイで用いる通常の方法、例えば上記４．に示した測定法がいずれも適用できる。
被検体中に、ガラクトース６硫酸含有糖鎖が存在するか否かの検出と共にその存在量を定量することができる。被検体として、癌又は他の重篤な疾患でガラクトース６硫酸含有糖鎖が関連している疾病に罹患した患者、またはそれら疾病を疑う被験者などから採取した細胞、組織、又は血液、尿、唾液などの体液などに適用することで、診断用キットとして用いることができる。
また、固定化する対象の基板はスライドガラスなど平面状には限られず、どのような形状でも良い。例えば、ビーズ状のシリカもしくはポリマー担体など公知の担体、又は磁気ビーズ表面に浸積、噴霧、塗布などの通常の固定化方法により固定化することができる。これらビーズをそのまま溶液中に懸濁するか、又はカラムに充填して、ガラクトース６硫酸含有糖鎖を有するタンパク質、脂質、又は複合糖質などの化合物を捕獲するために用いることができる。典型的には、ガラクトース６硫酸含有糖鎖を有する化合物の濃縮もしくは精製のために用いる。
本発明のガラクトース６硫酸結合性タンパク質は、常法により蛍光や酵素、ビオチン等でラベル化して、蛍光染色、フローサイトメトリー、ELISA、レクチンブロッティングなどに、ガラクトース６硫酸含有糖鎖検出用プローブとして用いることができる。また、ビーズなどに固定化してガラクトース６硫酸含有糖タンパク質、複合糖質又は糖脂質などの濃縮、精製に活用することができる。また、スライドガラスなど基板上に固定化して、レクチンマイクロアレイを用いた糖鎖プロファイリングに用いることもできる。
すなわち、本願発明のガラクトース６硫酸結合性変異タンパク質を標識し、緩衝液に安定剤などと共に溶解して、ガラクトース６硫酸含有糖鎖検出用試薬として、患者血液等の被検体に対して適用することができる。典型的には、被検体中のガラクトース６硫酸含有糖鎖の検出及び定量に用いる。
また、基板表面に通常の方法で固定化してマイクロアレイ用のプローブなどとして用いることができる。
ここで、基板材料としては、好ましくは通常のマイクロアレイで使用される物質であり、シリコンウエハー、ガラス、ポリカーボネート、膜、ポリスチレンまたはポリウレタンのような高分子フィルム及び多孔性物質が用いられる。プローブの固定には、通常のマイクロアレイ製造方法で使用する方法を用いることができ、例えば、フォトリソグラフィ法、圧電印刷法、マイクロピペッティングまたはスポッティングなどの方法を用いてスポットの作成を行うことができる。
また、アレイの測定に関しては、通常の抗体アレイ、レクチンアレイで用いる通常の方法、例えば上記４．に示した測定法がいずれも適用できる。
被検体中に、ガラクトース６硫酸含有糖鎖が存在するか否かの検出と共にその存在量を定量することができる。被検体として、癌又は他の重篤な疾患でガラクトース６硫酸含有糖鎖が関連している疾病に罹患した患者、またはそれら疾病を疑う被験者などから採取した細胞、組織、又は血液、尿、唾液などの体液などに適用することで、診断用キットとして用いることができる。
また、固定化する対象の基板はスライドガラスなど平面状には限られず、どのような形状でも良い。例えば、ビーズ状のシリカもしくはポリマー担体など公知の担体、又は磁気ビーズ表面に浸積、噴霧、塗布などの通常の固定化方法により固定化することができる。これらビーズをそのまま溶液中に懸濁するか、又はカラムに充填して、ガラクトース６硫酸含有糖鎖を有するタンパク質、脂質、又は複合糖質などの化合物を捕獲するために用いることができる。典型的には、ガラクトース６硫酸含有糖鎖を有する化合物の濃縮もしくは精製のために用いる。
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
（実施例１）リボソーム提示法によるガラクトース６硫酸結合変異体の選出。
EW29Chはミミズ由来のレクチンでＲ型レクチン固有のβ-トレフォイル構造をとっている。このレクチンは大腸菌で大量に発現でき、また、アミノ酸配列や立体構造がすでにわかっているため、ガラクトース６硫酸結合レクチン創出に理想な鋳型として用いた。矢部らの方法（非特許文献５）に従ってEW29Ch変異ライブラリーの作製を行った。プラスミドpRARE_EW29Chをテンプレートにエラー導入を行いEW29Chの全コード領域にランダム変異を導入した。同時にpRARE_EW29ChをテンプレートとしてPCRでアンカーのgeneIII部分を増やした。この二つのPCR産物を精製しオーバーラップPCRで融合した。このPCR産物を精製し、変異DNAライブラリーとしてリボソーム提示法に用いた。
変異DNAライブラリーをin vitroで転写させ、RNAを精製した。精製したmRNAを翻訳させ、結合緩衝液中で冷却後遠心した上清をBlockingした後、6’-sulfo-LN（6’HSO3-Galb1-4GlcNAc）糖鎖ポリマーを固定化したマグネティックビーズと混合して反応させた。洗浄後に溶出緩衝液を添加しビーズから結合したmRNAを溶出した。溶出液からmRNAを精製した。その後、精製したmRNAをcDNAに変換した。
選択工程後、選択されてきたcDNAを制限酵素NdeIとXhoIで処理しタンパク質のＮ末端にFlagタグを付けるようにデザインされたベクターに挿入した。大腸菌DH5aを形質転換し２０クローンをランダムに選択後それぞれの配列を解析した（図３）。
図３は２０クローンの変異体と変異導入前の野生型EW29Chのアミノ酸配列をアライメントした結果を示したものである。この２０クローンの全てのαドメインで、糖結合に関与する４つのアミノ酸（D18、W33、K36、N43）のいずれのアミノ酸には変異の導入はなかった。特に顕著な変異がαサブドメインのD18に続くループ内の２０位のグルタミン酸（E）のリジン（K）への変異（E20の１４／２０がKに変異している）であったので、E20Kの変異を有している配列を＃１〜＃１４（配列番号３０〜４３、それぞれのα-サブドメインのアミノ酸配列が配列番号３〜１６に対応する。）として並べ、変異を有さずE20のままのものを＃１５〜＃２０として並べた。図３では、野生型（EW29Ch）のアミノ酸配列（配列番号１）を併記した。実施例では、E20がKに変異しているクローンのうちの＃１〜＃８、E20の変異のないクローンのうちの＃１５〜＃１８について，大腸菌で発現させて糖結合特性を測定したところ、ガラクトース６硫酸への結合親和性を獲得したものは全てグルタミン酸（E）がリジン（K）に変換されていた。
二か所（矢印で示したE20とE68）に集中して同じ傾向の変異（E→K）が入っており、２０位のEのK変異（E20K）を有している８クローン（＃１〜８）は全て6'-sulfo-LNに対して親和性を有していた。逆に、２０位のEが野生型のEのままに保存されていた４クローンは、いずれも6'-sulfo-LNへの親和性はほとんどなかった。
なお、ここでの親和性の値は、6'-sulfo-LN親和性を有する１２クローンを大腸菌で発現させて、大腸菌抽出液に抗Flag抗体と蛍光ラベリングした二次抗体と逐次反応させ、舘野らの方法（Tateno et al., Glycobiology. 2008;18(10):789-98）に従って糖鎖複合体アレイで糖結合活性を査定した結果を示している。１２クローン中の８クローン（＃１〜８）での6'-sulfo-LNに対する結合活性の正確な定量的比較は難しいが、いずれのクローンでも野生型の6'-sulfo-LNへの結合活性と比較して少なくとも１０倍以上の活性は確認されている。
以上のことから、αサブドメインの２０位のEがKに変わることが6'-sulfo-LNとの結合に重要であると示唆された。
EW29Chはミミズ由来のレクチンでＲ型レクチン固有のβ-トレフォイル構造をとっている。このレクチンは大腸菌で大量に発現でき、また、アミノ酸配列や立体構造がすでにわかっているため、ガラクトース６硫酸結合レクチン創出に理想な鋳型として用いた。矢部らの方法（非特許文献５）に従ってEW29Ch変異ライブラリーの作製を行った。プラスミドpRARE_EW29Chをテンプレートにエラー導入を行いEW29Chの全コード領域にランダム変異を導入した。同時にpRARE_EW29ChをテンプレートとしてPCRでアンカーのgeneIII部分を増やした。この二つのPCR産物を精製しオーバーラップPCRで融合した。このPCR産物を精製し、変異DNAライブラリーとしてリボソーム提示法に用いた。
変異DNAライブラリーをin vitroで転写させ、RNAを精製した。精製したmRNAを翻訳させ、結合緩衝液中で冷却後遠心した上清をBlockingした後、6’-sulfo-LN（6’HSO3-Galb1-4GlcNAc）糖鎖ポリマーを固定化したマグネティックビーズと混合して反応させた。洗浄後に溶出緩衝液を添加しビーズから結合したmRNAを溶出した。溶出液からmRNAを精製した。その後、精製したmRNAをcDNAに変換した。
選択工程後、選択されてきたcDNAを制限酵素NdeIとXhoIで処理しタンパク質のＮ末端にFlagタグを付けるようにデザインされたベクターに挿入した。大腸菌DH5aを形質転換し２０クローンをランダムに選択後それぞれの配列を解析した（図３）。
図３は２０クローンの変異体と変異導入前の野生型EW29Chのアミノ酸配列をアライメントした結果を示したものである。この２０クローンの全てのαドメインで、糖結合に関与する４つのアミノ酸（D18、W33、K36、N43）のいずれのアミノ酸には変異の導入はなかった。特に顕著な変異がαサブドメインのD18に続くループ内の２０位のグルタミン酸（E）のリジン（K）への変異（E20の１４／２０がKに変異している）であったので、E20Kの変異を有している配列を＃１〜＃１４（配列番号３０〜４３、それぞれのα-サブドメインのアミノ酸配列が配列番号３〜１６に対応する。）として並べ、変異を有さずE20のままのものを＃１５〜＃２０として並べた。図３では、野生型（EW29Ch）のアミノ酸配列（配列番号１）を併記した。実施例では、E20がKに変異しているクローンのうちの＃１〜＃８、E20の変異のないクローンのうちの＃１５〜＃１８について，大腸菌で発現させて糖結合特性を測定したところ、ガラクトース６硫酸への結合親和性を獲得したものは全てグルタミン酸（E）がリジン（K）に変換されていた。
二か所（矢印で示したE20とE68）に集中して同じ傾向の変異（E→K）が入っており、２０位のEのK変異（E20K）を有している８クローン（＃１〜８）は全て6'-sulfo-LNに対して親和性を有していた。逆に、２０位のEが野生型のEのままに保存されていた４クローンは、いずれも6'-sulfo-LNへの親和性はほとんどなかった。
なお、ここでの親和性の値は、6'-sulfo-LN親和性を有する１２クローンを大腸菌で発現させて、大腸菌抽出液に抗Flag抗体と蛍光ラベリングした二次抗体と逐次反応させ、舘野らの方法（Tateno et al., Glycobiology. 2008;18(10):789-98）に従って糖鎖複合体アレイで糖結合活性を査定した結果を示している。１２クローン中の８クローン（＃１〜８）での6'-sulfo-LNに対する結合活性の正確な定量的比較は難しいが、いずれのクローンでも野生型の6'-sulfo-LNへの結合活性と比較して少なくとも１０倍以上の活性は確認されている。
以上のことから、αサブドメインの２０位のEがKに変わることが6'-sulfo-LNとの結合に重要であると示唆された。
（実施例２）ガラクトース６硫酸含有糖鎖への各種変異体の結合親和性の解析
上記配列番号３〜１０に示される変異体のガラクトース６硫酸含有糖鎖への結合親和性をフロンタル・アフィニティークロマトグラフィー（FAC）で解析し結合定数を算定した。上記８クローンのうち代表的な二つのクローン（＃１，＃４）を大腸菌で発現させ、Lactose-Sepharoseで糖結合活性が均一な分子群として精製した。精製したタンパク質をNHS-Sepharoseビーズに固定化後、FAC解析に供するため専用のミニチュアカラム（内径2mm、長さ10mm）に充填した。作製したレクチンカラムをFAC自動分析装置に接続してカラム体積（31.4μL）に対し過剰容積のPA化糖鎖を連続注入した。PA糖鎖の溶出液の蛍光強度をモニターして相互作用強度（非結合標準糖鎖に対する溶出液の差V-V0）を測定した。舘野らの方法（Tateno et al., Nat Protoc. 2007;2(10):2529-37）に基づき、相互作用強度および有効リガンド量から結合定数Ka（Kdの逆数で単位はM-1）を求めた（図４）。野生型（EW29Ch）と二つの変異体（＃１，＃４）は末端Galを有する糖鎖（901、902）に対する結合力はほとんど変わっていないが、非還元末端ガラクトースの６位に硫酸基を有する糖鎖（922）に対して結合親和性が顕著に強くなっていることが明らかである。一方、非還元末端のガラクトースの３位に硫酸を有する糖鎖（918）や６位にシアル酸を持つ糖鎖（704）には結合しなかったことから、得られた変異体は野生型と比べガラクトース６硫酸を有する糖鎖に強く結合することがわかった。
上記配列番号３〜１０に示される変異体のガラクトース６硫酸含有糖鎖への結合親和性をフロンタル・アフィニティークロマトグラフィー（FAC）で解析し結合定数を算定した。上記８クローンのうち代表的な二つのクローン（＃１，＃４）を大腸菌で発現させ、Lactose-Sepharoseで糖結合活性が均一な分子群として精製した。精製したタンパク質をNHS-Sepharoseビーズに固定化後、FAC解析に供するため専用のミニチュアカラム（内径2mm、長さ10mm）に充填した。作製したレクチンカラムをFAC自動分析装置に接続してカラム体積（31.4μL）に対し過剰容積のPA化糖鎖を連続注入した。PA糖鎖の溶出液の蛍光強度をモニターして相互作用強度（非結合標準糖鎖に対する溶出液の差V-V0）を測定した。舘野らの方法（Tateno et al., Nat Protoc. 2007;2(10):2529-37）に基づき、相互作用強度および有効リガンド量から結合定数Ka（Kdの逆数で単位はM-1）を求めた（図４）。野生型（EW29Ch）と二つの変異体（＃１，＃４）は末端Galを有する糖鎖（901、902）に対する結合力はほとんど変わっていないが、非還元末端ガラクトースの６位に硫酸基を有する糖鎖（922）に対して結合親和性が顕著に強くなっていることが明らかである。一方、非還元末端のガラクトースの３位に硫酸を有する糖鎖（918）や６位にシアル酸を持つ糖鎖（704）には結合しなかったことから、得られた変異体は野生型と比べガラクトース６硫酸を有する糖鎖に強く結合することがわかった。
（実施例３）ガラクトース６硫酸との結合に重要なアミノ酸の同定
ガラクトース６硫酸に結合する活性を獲得した変異体は全て２０番目のEがKに置換されていたことから、この変異がガラクトース６硫酸への結合に重要であると考えられた。そこで、野生型のEW29Chに部位特異的変異導入法で２０番目のEをKに置換した変異体E20K（配列番号１７）を作製した。実施例２と同様の手順で該変異体を大腸菌で発現して、Lactose-Sepharoseで精製した。精製したタンパク質がガラクトース６硫酸を持つ糖鎖への結合定数をフロンタル・アフィニティークロマトグラフィーで測定した（図５）。
野生型にE20Kを導入した場合でも、非還元末端Galを有する糖鎖（901,902）に対して結合の変化はほとんどないが、非還元末端ガラクトース６硫酸を有する糖鎖（922）に対しては結合が顕著に増強した。一方、E20Kは非還元末端のガラクトースの３位に硫酸を有する糖鎖（918）には結合しなかったことから、得られた変異体E20Kは野生型と比べガラクトース６硫酸を有する糖鎖を強く結合することがわかり、この結合にK20の存在が非常に重要であることが示された。
ガラクトース６硫酸に結合する活性を獲得した変異体は全て２０番目のEがKに置換されていたことから、この変異がガラクトース６硫酸への結合に重要であると考えられた。そこで、野生型のEW29Chに部位特異的変異導入法で２０番目のEをKに置換した変異体E20K（配列番号１７）を作製した。実施例２と同様の手順で該変異体を大腸菌で発現して、Lactose-Sepharoseで精製した。精製したタンパク質がガラクトース６硫酸を持つ糖鎖への結合定数をフロンタル・アフィニティークロマトグラフィーで測定した（図５）。
野生型にE20Kを導入した場合でも、非還元末端Galを有する糖鎖（901,902）に対して結合の変化はほとんどないが、非還元末端ガラクトース６硫酸を有する糖鎖（922）に対しては結合が顕著に増強した。一方、E20Kは非還元末端のガラクトースの３位に硫酸を有する糖鎖（918）には結合しなかったことから、得られた変異体E20Kは野生型と比べガラクトース６硫酸を有する糖鎖を強く結合することがわかり、この結合にK20の存在が非常に重要であることが示された。
［配列表フリーテキスト］
配列番号１：EW29Ch（ミミズ由来レクチンEW29のC末端ドメイン）
配列番号２：EW29Ch-α
配列番号３：EW29Ch-mutant＃1-α
配列番号４：EW29Ch-mutant＃2-α
配列番号５：EW29Ch-mutant＃3-α
配列番号６：EW29Ch-mutant＃4-α
配列番号７：EW29Ch-mutant＃5-α
配列番号８：EW29Ch-mutant＃6-α
配列番号９：EW29Ch-mutant＃7-α
配列番号１０：EW29Ch-mutant＃8-α
配列番号１１：EW29Ch-mutant＃9-α
配列番号１２：EW29Ch-mutant＃10-α
配列番号１３：EW29Ch-mutant＃11-α
配列番号１４：EW29Ch-mutant＃12-α
配列番号１５：EW29Ch-mutant＃13-α
配列番号１６：EW29Ch-mutant＃14-α
配列番号１７：EW29Ch-mutant（E20K）
配列番号１８：E20K-α
配列番号１９：EW29ch-α’
配列番号２０：EW29ch-γ
配列番号２１：Ricin-B1-α
配列番号２２：Ricin-B2-γ
配列番号２３：SoCBM13-α
配列番号２４：SoCBM13-β
配列番号２５：SoCBM13-γ
配列番号２６：ML1-B1-α
配列番号２７：ML1-B2-γ
配列番号２８：pp-GalNAcTase1-α
配列番号２９：EW29Ch(gene)
配列番号３０：EW29Ch-mutant＃1
配列番号３１：EW29Ch-mutant＃2
配列番号３２：EW29Ch-mutant＃3
配列番号３３：EW29Ch-mutant＃4
配列番号３４：EW29Ch-mutant＃5
配列番号３５：EW29Ch-mutant＃6
配列番号３６：EW29Ch-mutant＃7
配列番号３７：EW29Ch-mutant＃8
配列番号３８：EW29Ch-mutant＃9
配列番号３９：EW29Ch-mutant＃10
配列番号４０：EW29Ch-mutant＃11
配列番号４１：EW29Ch-mutant＃12
配列番号４２：EW29Ch-mutant＃13
配列番号４３：EW29Ch-mutant＃14
配列番号４４：EW29Ch-mutant＃1(gene)
配列番号４５：EW29Ch-mutant＃2(gene)
配列番号４６：EW29Ch-mutant＃3(gene)
配列番号４７：EW29Ch-mutant＃4(gene)
配列番号４８：EW29Ch-mutant＃5(gene)
配列番号４９：EW29Ch-mutant＃6(gene)
配列番号５０：EW29Ch-mutant＃7(gene)
配列番号５１：EW29Ch-mutant＃8(gene)
配列番号５２：EW29Ch-mutant＃9(gene)
配列番号５３：EW29Ch-mutant＃10(gene)
配列番号５４：EW29Ch-mutant＃11(gene)
配列番号５５：EW29Ch-mutant＃12(gene)
配列番号５６：EW29Ch-mutant＃13(gene)
配列番号５７：EW29Ch-mutant＃14(gene)
配列番号５８：EW29Ch-mutant E20K（gene）
配列番号５９：EW29Ch-α（gene）
配列番号６０：EW29Ch-(m)-α＃1(gene)
配列番号６１：EW29Ch-(m)-α＃2(gene)
配列番号６２：EW29Ch-(m)-α＃3(gene)
配列番号６３：EW29Ch-(m)-α＃4(gene)
配列番号６４：EW29Ch-(m)-α＃5(gene)
配列番号６５：EW29Ch-(m)-α＃6(gene)
配列番号６６：EW29Ch-(m)-α＃7(gene)
配列番号６７：EW29Ch-(m)-α＃8(gene)
配列番号６８：EW29Ch-(m)-α＃9(gene)
配列番号６９：EW29Ch-(m)-α＃10(gene)
配列番号７０：EW29Ch-(m)-α＃11(gene)
配列番号７１：EW29Ch-(m)-α＃12(gene)
配列番号７２：EW29Ch-(m)-α＃13(gene)
配列番号７３：EW29Ch-(m)-α＃14(gene)
配列番号７４：EW29Ch-(m)-α E20K（gene）
配列番号１：EW29Ch（ミミズ由来レクチンEW29のC末端ドメイン）
配列番号２：EW29Ch-α
配列番号３：EW29Ch-mutant＃1-α
配列番号４：EW29Ch-mutant＃2-α
配列番号５：EW29Ch-mutant＃3-α
配列番号６：EW29Ch-mutant＃4-α
配列番号７：EW29Ch-mutant＃5-α
配列番号８：EW29Ch-mutant＃6-α
配列番号９：EW29Ch-mutant＃7-α
配列番号１０：EW29Ch-mutant＃8-α
配列番号１１：EW29Ch-mutant＃9-α
配列番号１２：EW29Ch-mutant＃10-α
配列番号１３：EW29Ch-mutant＃11-α
配列番号１４：EW29Ch-mutant＃12-α
配列番号１５：EW29Ch-mutant＃13-α
配列番号１６：EW29Ch-mutant＃14-α
配列番号１７：EW29Ch-mutant（E20K）
配列番号１８：E20K-α
配列番号１９：EW29ch-α’
配列番号２０：EW29ch-γ
配列番号２１：Ricin-B1-α
配列番号２２：Ricin-B2-γ
配列番号２３：SoCBM13-α
配列番号２４：SoCBM13-β
配列番号２５：SoCBM13-γ
配列番号２６：ML1-B1-α
配列番号２７：ML1-B2-γ
配列番号２８：pp-GalNAcTase1-α
配列番号２９：EW29Ch(gene)
配列番号３０：EW29Ch-mutant＃1
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配列番号７２：EW29Ch-(m)-α＃13(gene)
配列番号７３：EW29Ch-(m)-α＃14(gene)
配列番号７４：EW29Ch-(m)-α E20K（gene）
Claims (13)
- 下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列において、２０位が塩基性アミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含む糖認識ドメインを有することを特徴とする、ガラクトース６硫酸に結合活性を有するタンパク質；
（ａ）配列番号２〜１６又は１８に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２〜１６又は１８に示されるアミノ酸配列において、１８位のアスパラギン酸以外のアミノ酸のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号５９〜７４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつその５４〜５６位の塩基配列がコードするコドンがアスパラギン酸である塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。 - 前記（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列が、３３位のトリプトファン、３６位のリジン及び４３位のアスパラギンの少なくとも１つのアミノ酸が保存されていることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質。
- 前記（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列が、配列番号３〜１６及び１８から選択されたいずれか１つのアミノ酸配列において、１８位のアスパラギン酸以外のアミノ酸のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列、又は、配列番号６０〜７４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつその５４〜５６位の塩基配列がコードするコドンがアスパラギン酸である塩基配列によりコードされたアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項２に記載のタンパク質。
- さらに、ミミズ由来レクチンEW29のＣ末端ドメイン（EW29Ch）のβもしくはγサブドメイン、又は他のＲ型レクチンの糖認識ドメインを少なくとも１つ含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
- β-トレフォイル構造を有していることを特徴とする、請求項４に記載のタンパク質。
- 配列番号１７及び配列番号３０〜４３から選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のタンパク質。
- Ｒ型レクチンのβ-トレフォイル構造を形成する糖認識ドメイン中の少なくとも１つのサブドメインのアミノ酸配列において、EW29Chのαドメイン（EW29Ch-α）のアミノ酸配列（配列番号２）の１８位に対応するガラクトース結合部位であるアスパラギン酸を変更することなく、当該アスパラギン酸に続くループ内に存在する、EW29Ch-αのアミノ酸配列の２０位のグルタミン酸に対応する酸性又は中性アミノ酸が、塩基性アミノ酸に変異していることを特徴とする、ガラクトース６硫酸に結合活性を有するタンパク質。
- 前記サブドメインのアミノ酸配列が、配列番号２及び配列番号１９、２０、２３〜２５、２７および２８から選択されたいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のタンパク質。
- 請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
- 請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質を有効成分として含む、ガラクトース６硫酸含有糖鎖検出用試薬。
- ビーズ又は基板表面に固定化された、請求項１０に記載の試薬。
- 請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質を用いることを特徴とする、生物学的試料中に含まれるガラクトース６硫酸含有糖鎖を検出する方法。
- ビーズ又は基板表面に固定化された、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質を用いることを特徴とする、ガラクトース６硫酸含有糖鎖を有する化合物を捕獲する方法。
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