JP5846599B2 - ガラクトース６硫酸結合性タンパク質 - Google Patents
ガラクトース６硫酸結合性タンパク質 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5846599B2 JP5846599B2 JP2011176232A JP2011176232A JP5846599B2 JP 5846599 B2 JP5846599 B2 JP 5846599B2 JP 2011176232 A JP2011176232 A JP 2011176232A JP 2011176232 A JP2011176232 A JP 2011176232A JP 5846599 B2 JP5846599 B2 JP 5846599B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- ew29ch
- seq
- galactose
- acid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- BCUVLMCXSDWQQC-KCDKBNATSA-N Galactose 6-sulfate Chemical compound OS(=O)(=O)OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O BCUVLMCXSDWQQC-KCDKBNATSA-N 0.000 title claims description 80
- 101710188371 Sulfate-binding protein Proteins 0.000 title description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 115
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 106
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 89
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 82
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 52
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 51
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 46
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 45
- 239000002523 lectin Substances 0.000 claims description 39
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 claims description 38
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 claims description 38
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 34
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 31
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 24
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 20
- 101001089025 Mytilus galloprovincialis Alpha-D-galactose-binding lectin Proteins 0.000 claims description 14
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 14
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 9
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 241000361919 Metaphire sieboldi Species 0.000 claims description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 6
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 4
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 claims description 4
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 2
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 claims description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 37
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 102220066023 rs76776637 Human genes 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 8
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N keratan Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@H]3[C@H]([C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H](O)[C@@H]3O)O)[C@H](NC(C)=O)[C@H]2O)COS(O)(=O)=O)O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@@H]1O KXCLCNHUUKTANI-RBIYJLQWSA-N 0.000 description 8
- 229920000288 Keratan sulfate Polymers 0.000 description 7
- 238000002702 ribosome display Methods 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 241000243818 Annelida Species 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 3
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- ICSNLGPSRYBMBD-UHFFFAOYSA-N 2-aminopyridine Chemical compound NC1=CC=CC=N1 ICSNLGPSRYBMBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102100028681 C-type lectin domain family 4 member K Human genes 0.000 description 2
- 101710183165 C-type lectin domain family 4 member K Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101000749843 Clitocybe nebularis Ricin B-like lectin Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 2
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 2
- 241001277610 Oligochaeta <Asteraceae> Species 0.000 description 2
- 240000000528 Ricinus communis Species 0.000 description 2
- 108010013180 Sambucus nigra lectins Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000003930 C-Type Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090000342 C-Type Lectins Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000034342 Calnexin Human genes 0.000 description 1
- 108010056891 Calnexin Proteins 0.000 description 1
- 102000004082 Calreticulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000549 Calreticulin Proteins 0.000 description 1
- 102100038782 Carbohydrate sulfotransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 235000004035 Cryptotaenia japonica Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 101710121765 Endo-1,4-beta-xylanase Proteins 0.000 description 1
- 235000014066 European mistletoe Nutrition 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 102000007563 Galectins Human genes 0.000 description 1
- 108010046569 Galectins Proteins 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 102000051366 Glycosyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 101000883008 Homo sapiens Carbohydrate sulfotransferase 1 Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 240000005995 Laetiporus sulphureus Species 0.000 description 1
- 235000007714 Laetiporus sulphureus Nutrition 0.000 description 1
- 241000243662 Lumbricus terrestris Species 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 244000028178 Marasmius oreades Species 0.000 description 1
- 235000017233 Marasmius oreades Nutrition 0.000 description 1
- 244000302512 Momordica charantia Species 0.000 description 1
- 235000009811 Momordica charantia Nutrition 0.000 description 1
- 241000243820 Polychaeta Species 0.000 description 1
- 241000222640 Polyporus Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 244000152640 Rhipsalis cassutha Species 0.000 description 1
- 235000012300 Rhipsalis cassutha Nutrition 0.000 description 1
- 240000006028 Sambucus nigra Species 0.000 description 1
- 235000003142 Sambucus nigra Nutrition 0.000 description 1
- 102000007073 Sialic Acid Binding Immunoglobulin-like Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108010047827 Sialic Acid Binding Immunoglobulin-like Lectins Proteins 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001406921 Squamosa Species 0.000 description 1
- 241000187413 Streptomyces olivaceoviridis Species 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 102000007641 Trefoil Factors Human genes 0.000 description 1
- 235000015724 Trifolium pratense Nutrition 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 241001233061 earthworms Species 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 235000008995 european elder Nutrition 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 150000002256 galaktoses Chemical class 0.000 description 1
- 150000002307 glutamic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000000111 isothermal titration calorimetry Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000000206 photolithography Methods 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000004401 podocalyxin Human genes 0.000 description 1
- 108090000917 podocalyxin Proteins 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920006254 polymer film Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
本発明は、ガラクトース６硫酸に結合する新規なタンパク質に関する。
ガラクトースの６位に硫酸基を転移する酵素であるケラタン硫酸ガラクトース６硫酸転移酵素（CHST1）の遺伝子、並びにその産物であるガラクトース６硫酸を含有するケラタン硫酸は、脳腫瘍の悪性化にともなって、発現が増加することが知られている（非特許文献１、非特許文献２）。
一方、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞など多分化能を有する未分化細胞表面で発現し、細胞分化と共に失われるTra-1-60及びTra-1-81抗原は、多能性幹細胞を判別する際の未分化マーカーとして広く用いられているが、その際に用いられるTra-1-60抗体及びTra-1-81抗体はいずれも糖タンパク質ポドカリキシン（podocalyxin）上のケラタン硫酸化を糖鎖エピトープとして認識していることが明らかになっている（非特許文献３）。ケラタン硫酸は、６位炭素が硫酸化されたガラクトース（Gal）とＮ-アセチルグルコサミン（GlcNAc）の繰り返しで構成され、硫酸基はGal及びGlcNAcの両方又は片方の６位の炭素に結合している構造を有している（-3[6S]Galβ1-4[6S]GlcNAcβ1-）。Tra-1-60抗体及びTra-1-81抗体が、ケラタン硫酸中のどの位置の硫酸結合糖鎖構造部分を認識しているのかは解明されていないが、細胞分化に関してもケラタン硫酸化の役割の重要性が指摘されたことから、さらにガラクトース６硫酸の指標としての重要性が高まってきている（非特許文献３）。
このように、ガラクトース６硫酸は癌などの疾患の悪性化を示す重要な指標であるのみならず、細胞の分化の過程で重要な役割を果たしている可能性も高いことが考えられるため、ガラクトース６硫酸含有糖鎖エピトープを検出することができるプローブとなる糖結合タンパク質を開発することができれば、細胞の分化度や癌などの疾患の進行度を調べるための診断技術の開発が期待できる。
一方、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞など多分化能を有する未分化細胞表面で発現し、細胞分化と共に失われるTra-1-60及びTra-1-81抗原は、多能性幹細胞を判別する際の未分化マーカーとして広く用いられているが、その際に用いられるTra-1-60抗体及びTra-1-81抗体はいずれも糖タンパク質ポドカリキシン（podocalyxin）上のケラタン硫酸化を糖鎖エピトープとして認識していることが明らかになっている（非特許文献３）。ケラタン硫酸は、６位炭素が硫酸化されたガラクトース（Gal）とＮ-アセチルグルコサミン（GlcNAc）の繰り返しで構成され、硫酸基はGal及びGlcNAcの両方又は片方の６位の炭素に結合している構造を有している（-3[6S]Galβ1-4[6S]GlcNAcβ1-）。Tra-1-60抗体及びTra-1-81抗体が、ケラタン硫酸中のどの位置の硫酸結合糖鎖構造部分を認識しているのかは解明されていないが、細胞分化に関してもケラタン硫酸化の役割の重要性が指摘されたことから、さらにガラクトース６硫酸の指標としての重要性が高まってきている（非特許文献３）。
このように、ガラクトース６硫酸は癌などの疾患の悪性化を示す重要な指標であるのみならず、細胞の分化の過程で重要な役割を果たしている可能性も高いことが考えられるため、ガラクトース６硫酸含有糖鎖エピトープを検出することができるプローブとなる糖結合タンパク質を開発することができれば、細胞の分化度や癌などの疾患の進行度を調べるための診断技術の開発が期待できる。
しかしながら、ガラクトースの３位やＮ-アセチルグルコサミンの６位に硫酸が転移された硫酸化糖鎖に対する各種抗体は作製されているものの、ガラクトース６硫酸に対する抗体は報告されておらず、上述のTra-1-60抗体及びTra-1-81抗体は、ケラタン硫酸を認識しているとはいえるものの、特異的にガラクトース６硫酸を認識しているとは限らない。
糖結合タンパク質の代表的な分子として、抗体の他にレクチンがある。
レクチンは糖に結合するタンパク質であり、ヒトからウイルスまで全ての生物に存在する。レクチンは、進化的に保存された糖結合ドメイン（ＣＲＤ）の構造に応じてファミリーに分類されている。例えば、Ｌ型、Ｃ型、Ｒ型、Ｐ型、シグレック、ガレクチン、カルネキシン／カルレティキュリンなどがある。
このうち、ヒトのＣ型レクチンの１種であるランゲリンはカルシウム依存的にガラクトース６硫酸含有糖鎖に結合することが報告されている（非特許文献４）。しかしランゲリンは高マンノース型糖鎖にも強く結合することから、ガラクトース６硫酸特異的なプローブとはいえない。また、親和性も非常に低く、ガラクトース６硫酸を検出するためのプローブとして産業的に使用することは困難である。
以上のように、ガラクトース６硫酸を検出可能なプローブについての開発は強く望まれていたが、未だに有効なプローブが提供されないため、その組織分布もほとんど明らかにされておらず、機能解明も進んでいない状況下にあった。
糖結合タンパク質の代表的な分子として、抗体の他にレクチンがある。
レクチンは糖に結合するタンパク質であり、ヒトからウイルスまで全ての生物に存在する。レクチンは、進化的に保存された糖結合ドメイン（ＣＲＤ）の構造に応じてファミリーに分類されている。例えば、Ｌ型、Ｃ型、Ｒ型、Ｐ型、シグレック、ガレクチン、カルネキシン／カルレティキュリンなどがある。
このうち、ヒトのＣ型レクチンの１種であるランゲリンはカルシウム依存的にガラクトース６硫酸含有糖鎖に結合することが報告されている（非特許文献４）。しかしランゲリンは高マンノース型糖鎖にも強く結合することから、ガラクトース６硫酸特異的なプローブとはいえない。また、親和性も非常に低く、ガラクトース６硫酸を検出するためのプローブとして産業的に使用することは困難である。
以上のように、ガラクトース６硫酸を検出可能なプローブについての開発は強く望まれていたが、未だに有効なプローブが提供されないため、その組織分布もほとんど明らかにされておらず、機能解明も進んでいない状況下にあった。
Hayatsu N, Ogasawara S, Kaneko MK, Kato Y, Narimatsu H., Biochem Biophys Res Commun. 2008 Apr 4;368(2):217-22.
Kato Y, Hayatsu N, Kaneko MK, Ogasawara S, Hamano T, Takahashi S, Nishikawa R, Matsutani M, Mishima K, Narimatsu H., Biochem Biophys Res Commun. 2008 May 16;369(4):1041-6.
Badcock G, Pigott C, Goepel J, Andrews PW., Cancer Res. 1999 Sep 15;59(18):4715-9.
Tateno H, Ohnishi K, Yabe R, Hayatsu N, Sato T, Takeya M, Narimatsu H, Hirabayashi J.J Biol Chem. 2010 Feb 26;285(9):6390-400.
Yabe R, Suzuki R, Kuno A, Fujimoto Z, Jigami Y, Hirabayashi J. J Biochem (Tokyo). 2007 Mar;141(3):389-399.
Hemmi H, Kuno A, Ito S, Suzuki R, Hasegawa T, Hirabayashi J. FEBS J. 2009 Apr;276(7):2095-105.
Suzuki R, Kuno A, Hasegawa T, Hirabayashi J, Kasai KI, Momma M, Fujimoto Z. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2009 Jan;65(Pt.1):49-57.
本発明の課題は、癌などの悪性化や細胞分化に対して重要な役割を果たしていると考えられるガラクトース６硫酸に結合する新規なタンパク質を提供することである。
本発明者らは、各種レクチンのうちでヒトからバクテリアまで広く生物に存在している唯一のタンパク質ファミリーであるＲ型レクチンがガラクトース特異的に結合することに着目し、そのうちでアミノ酸配列が既知で、Ｒ型レクチン固有のβ-トレフォイル構造が確認されているミミズ由来レクチンEW29（GenBank登録番号：AB010783）のＣ末端ドメイン（EW29Ch：配列番号１）を出発材料とし、糖認識ドメイン遺伝子を改変することで、６硫酸化ガラクトースを認識する新規タンパク質を提供できないかと考えた。
EW29Chの改変体としては、最近、エラー導入PCR/リボソームディスプレイ法の改法を用い、ガラクトース特異性を、α２−６シアル酸特異的に改変することに成功した例が報告されている（非特許文献５）。
しかし、従来のエラー導入PCR/リボソームディスプレイ法では、目的のクローンの糖結合特異性を迅速にスクリーニングすることができず、そのために有効なガラクトース６硫酸に結合するプローブを取得するのは容易ではなかった。
本発明者らは、本発明者らの研究グループで以前開発したエラー導入PCR/リボソームディスプレイ法（非特許文献５）をもとに、さらにスクリーニング効率を高める工夫を加えて、EW29のＣ末端側機能ドメイン（EW29Ch）にランダム変異を導入してスクリーニングすることで２０クローンを選択し、各クローン由来の変異EW29Chのアミノ酸配列を詳細に検討すると、糖との結合に必須で糖骨格中の水酸基との水素結合に関与していることが知られているドメイン内で最初のアスパラギン酸(D)（非特許文献６、７）、即ち１８位のアスパラギン酸(D)は全てのαドメインで保存されていた。また、糖結合に関与するといわれている３３位のトリプトファン（W）、３６位のリジン（K）及び４３位のアスパラギン（N）のいずれにも変異の導入はなかったが、一方で２０クローン中１４クローンという高確率で２０位のグルタミン酸（E）がリジン（K）に変異していた。そこで、E20K変異を有する１４クローンから任意に８クローンを選択し、E20が保存されている他の８クローンから４クローン選択し、それぞれを大腸菌で発現させて糖結合活性を測定したところ、E20K変異を有するクローンは全てガラクトース６硫酸との結合が強くなっていたものの、E20が保存されているクローンはいずれもガラクトース６硫酸への結合活性に変化は見られなかった。次いで、野生型EW29Chのαドメイン中でE20Kのみに変異を有するEW29Ch変異体を作製して、当該EW29Ch変異体もまたガラクトース６硫酸への結合活性があることを確認した。
以上のことから、EW29のＣ末端側機能ドメイン（EW29Ch）においてαサブドメインの２０位のグルタミン酸（E）がリジン（K）に変更されることがガラクトース６硫酸に結合するために必須であることを確定することができた。これらの知見を得たことで本発明を完成するに至った。
EW29Chの改変体としては、最近、エラー導入PCR/リボソームディスプレイ法の改法を用い、ガラクトース特異性を、α２−６シアル酸特異的に改変することに成功した例が報告されている（非特許文献５）。
しかし、従来のエラー導入PCR/リボソームディスプレイ法では、目的のクローンの糖結合特異性を迅速にスクリーニングすることができず、そのために有効なガラクトース６硫酸に結合するプローブを取得するのは容易ではなかった。
本発明者らは、本発明者らの研究グループで以前開発したエラー導入PCR/リボソームディスプレイ法（非特許文献５）をもとに、さらにスクリーニング効率を高める工夫を加えて、EW29のＣ末端側機能ドメイン（EW29Ch）にランダム変異を導入してスクリーニングすることで２０クローンを選択し、各クローン由来の変異EW29Chのアミノ酸配列を詳細に検討すると、糖との結合に必須で糖骨格中の水酸基との水素結合に関与していることが知られているドメイン内で最初のアスパラギン酸(D)（非特許文献６、７）、即ち１８位のアスパラギン酸(D)は全てのαドメインで保存されていた。また、糖結合に関与するといわれている３３位のトリプトファン（W）、３６位のリジン（K）及び４３位のアスパラギン（N）のいずれにも変異の導入はなかったが、一方で２０クローン中１４クローンという高確率で２０位のグルタミン酸（E）がリジン（K）に変異していた。そこで、E20K変異を有する１４クローンから任意に８クローンを選択し、E20が保存されている他の８クローンから４クローン選択し、それぞれを大腸菌で発現させて糖結合活性を測定したところ、E20K変異を有するクローンは全てガラクトース６硫酸との結合が強くなっていたものの、E20が保存されているクローンはいずれもガラクトース６硫酸への結合活性に変化は見られなかった。次いで、野生型EW29Chのαドメイン中でE20Kのみに変異を有するEW29Ch変異体を作製して、当該EW29Ch変異体もまたガラクトース６硫酸への結合活性があることを確認した。
以上のことから、EW29のＣ末端側機能ドメイン（EW29Ch）においてαサブドメインの２０位のグルタミン酸（E）がリジン（K）に変更されることがガラクトース６硫酸に結合するために必須であることを確定することができた。これらの知見を得たことで本発明を完成するに至った。
即ち，本発明は以下の発明を包含する。
〔１〕 下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列において、２０位が塩基性アミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含む糖認識ドメインを有することを特徴とする、ガラクトース６硫酸に結合活性を有するタンパク質；
（ａ）配列番号２〜１６又は１８に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２〜１６又は１８に示されるアミノ酸配列において、１８位のアスパラギン酸以外のアミノ酸のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号５９〜７４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつその５４〜５６位の塩基配列がコードするコドンがアスパラギン酸である塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。
〔２〕 前記（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列が、３３位のトリプトファン、３６位のリジン及び４３位のアスパラギンの少なくとも１つのアミノ酸が保存されていることを特徴とする、前記〔１〕に記載のタンパク質。
〔３〕 前記サブドメインのアミノ酸配列が、配列番号３〜１６及び１８から選択されたいずれか１つのアミノ酸配列である、前記〔２〕に記載のタンパク質。
〔４〕 さらに、ミミズ由来レクチンEW29のＣ末端ドメイン（EW29Ch）のβもしくはγサブドメイン、又は他のＲ型レクチンの糖認識ドメインを少なくとも１つ含むことを特徴とする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載のタンパク質。
〔５〕 β-トレフォイル構造を有していることを特徴とする、前記〔４〕に記載のタンパク質。
〔６〕 配列番号１７及び配列番号３０〜４３から選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む、前記〔５〕に記載のタンパク質。
〔７〕 Ｒ型レクチンのβ-トレフォイル構造を形成する糖認識ドメイン中の少なくとも１つのサブドメインのアミノ酸配列において、EW29Chのαドメイン（EW29Ch-α）のアミノ酸配列（配列番号２）の１８位に対応するガラクトース結合部位であるアスパラギン酸を変更することなく、当該アスパラギン酸に続くループ内に存在し、かつアスパラギン酸の下流１〜４アミノ酸のいずれかの位置に存在する、EW29Ch-αのアミノ酸配列の２０位のグルタミン酸に対応する酸性又は中性アミノ酸が、塩基性アミノ酸に変異していることを特徴とする、ガラクトース６硫酸に結合活性を有するタンパク質。
〔８〕 前記サブドメインのアミノ酸配列が、配列番号２及び配列番号１９〜２８から選択されたいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、前記〔７〕に記載のタンパク質。
〔９〕 前記〔１〕〜〔８〕のいずれか１つに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
〔１０〕 前記〔１〕〜〔８〕のいずれか１つに記載のタンパク質を有効成分として含む、ガラクトース６硫酸含有糖鎖検出用試薬。
〔１１〕 ビーズ又は基板表面に固定化された、前記〔１０〕に記載の試薬。
〔１２〕 前記〔１〕〜〔８〕のいずれか１つに記載のタンパク質を用いることを特徴とする、生物学的試料中に含まれるガラクトース６硫酸含有糖鎖を検出する方法。
〔１３〕ビーズ又は基板表面に固定化された、前記〔１〕〜〔８〕のいずれか１つに記載のタンパク質を用いることを特徴とする、ガラクトース６硫酸含有糖鎖を有する化合物を捕獲する方法。
〔１〕 下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列において、２０位が塩基性アミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含む糖認識ドメインを有することを特徴とする、ガラクトース６硫酸に結合活性を有するタンパク質；
（ａ）配列番号２〜１６又は１８に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２〜１６又は１８に示されるアミノ酸配列において、１８位のアスパラギン酸以外のアミノ酸のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号５９〜７４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつその５４〜５６位の塩基配列がコードするコドンがアスパラギン酸である塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。
〔２〕 前記（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列が、３３位のトリプトファン、３６位のリジン及び４３位のアスパラギンの少なくとも１つのアミノ酸が保存されていることを特徴とする、前記〔１〕に記載のタンパク質。
〔３〕 前記サブドメインのアミノ酸配列が、配列番号３〜１６及び１８から選択されたいずれか１つのアミノ酸配列である、前記〔２〕に記載のタンパク質。
〔４〕 さらに、ミミズ由来レクチンEW29のＣ末端ドメイン（EW29Ch）のβもしくはγサブドメイン、又は他のＲ型レクチンの糖認識ドメインを少なくとも１つ含むことを特徴とする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１つに記載のタンパク質。
〔５〕 β-トレフォイル構造を有していることを特徴とする、前記〔４〕に記載のタンパク質。
〔６〕 配列番号１７及び配列番号３０〜４３から選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む、前記〔５〕に記載のタンパク質。
〔７〕 Ｒ型レクチンのβ-トレフォイル構造を形成する糖認識ドメイン中の少なくとも１つのサブドメインのアミノ酸配列において、EW29Chのαドメイン（EW29Ch-α）のアミノ酸配列（配列番号２）の１８位に対応するガラクトース結合部位であるアスパラギン酸を変更することなく、当該アスパラギン酸に続くループ内に存在し、かつアスパラギン酸の下流１〜４アミノ酸のいずれかの位置に存在する、EW29Ch-αのアミノ酸配列の２０位のグルタミン酸に対応する酸性又は中性アミノ酸が、塩基性アミノ酸に変異していることを特徴とする、ガラクトース６硫酸に結合活性を有するタンパク質。
〔８〕 前記サブドメインのアミノ酸配列が、配列番号２及び配列番号１９〜２８から選択されたいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、前記〔７〕に記載のタンパク質。
〔９〕 前記〔１〕〜〔８〕のいずれか１つに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
〔１０〕 前記〔１〕〜〔８〕のいずれか１つに記載のタンパク質を有効成分として含む、ガラクトース６硫酸含有糖鎖検出用試薬。
〔１１〕 ビーズ又は基板表面に固定化された、前記〔１０〕に記載の試薬。
〔１２〕 前記〔１〕〜〔８〕のいずれか１つに記載のタンパク質を用いることを特徴とする、生物学的試料中に含まれるガラクトース６硫酸含有糖鎖を検出する方法。
〔１３〕ビーズ又は基板表面に固定化された、前記〔１〕〜〔８〕のいずれか１つに記載のタンパク質を用いることを特徴とする、ガラクトース６硫酸含有糖鎖を有する化合物を捕獲する方法。
本発明によって提供できた新規なEW29Ch変異体タンパク質などのＲ型レクチン由来変異体は、ガラクトース６硫酸を認識することができる優れたプローブとして用いることができる。当該プローブは、細胞の分化度の評価や癌などの疾患の進行度を調べるための診断に用いることができるから、再生医療技術や癌など各種疾患の診断技術におけるさらなる向上が期待できる。
１．Ｒ型レクチンについて
Ｒ型レクチンはβ-トレフォイルと呼ばれる三つ葉のクローバー様の構造を有しており、β-トレフォイル構造を介してガラクトースを特異的に認識する。この三つ葉はサブドメインα、β、γで構成され、３回対称軸で配置されている。いずれのサブドメインも糖結合部位となりうるが、多くのＲ型レクチンではそのうちの１つ、もしくは２つにだけ糖結合に必須なアミノ酸が保存されている。特に各ドメインのＮ末端側に位置する進化的に保存されたアスバラギン酸（D）は糖との結合に必須であることが知られており、ガラクトースなど糖骨格中の水酸基との水素結合に関与しているといわれている（非特許文献６、７）。
本発明の出発原料として用いたミミズ由来レクチンEW29のＣ末端ドメイン（EW29Ch）のαサブドメイン、γサブドメインと共に、他の代表的Ｒ型レクチンの糖結合性ドメインを並べて示す（図１）。図１のRicin-B1（AAB22582）、Ricin-B2（AAB22582）はトウゴマ（ヒマ）の種子から抽出したレクチンRicinのＢ鎖であり、SoCBM13（1XYF_A）は放線菌Streptomyces olivaceoviridisE-86由来のキシラナーゼの基質認識ドメインであり、ML1-B1(1OQL_B)、ML1-B2(1OQL_B)はヤドリギから抽出したレクチンMLのＢ鎖であり、pp-GalNAcT-１(XP_687472)は、ムチンなどのＯ型糖鎖の生合成に関連する糖転移酵素である。いずれのＲ型レクチンにおいてもEW29Chのαサブドメインの１８位に相当する位置の糖結合部位であるアスパラギン酸(D)は保存されている。結晶構造解析がなされているEW29Chのαサブドメインを図２として示す。図１及び図２に示されるように、アスパラギン酸（D）及びそれに続く１〜４アミノ酸まではβ-シートで囲まれて形成されたループ内に存在している。当該ループ構造全体が結合対象の糖を包み込む構造をとり、アスパラギン酸（D）の位置で糖と水素結合するが、その１〜４下流のアミノ酸位置の電荷などが結合対象の糖の種類を決定づけていると考えられる。本発明の結果によれば、EW29Ch-αの場合は、Dの２アミノ酸下流のEがガラクトースを対象に選んでいたのが、E→Kの変異導入によって電荷が（−）→（＋）へとプラス側に変更され、マイナス電荷を有するガラクトース６硫酸への認識能を獲得したと説明できる。このことは、リジン（K）以外のアルギニン（R）への変異でも同様のガラクトース６硫酸認識性のレクチンに変更できると考えられる。また、図１に示されるように、他のＲ型レクチンの糖結合性ドメインにおいても、アスパラギン酸（D）の１〜４下流のアミノ酸のうちで、ループ構造を構造的に見たときにEW29Ch-αのEに対応する位置が、ガラクトース６硫酸結合活性獲得に重要な変異導入候補位置であり、この位置のアミノ酸を、電荷が＋側の方向にシフトさせるアミノ酸への変異導入により、ガラクトース６硫酸結合レクチンを作製することができると期待できる。
反対に、Ricin毒素のRicin-B1αサブドメインもしくはγサブドメイン又はML1-B1αサブドメインなどで、すでにEW29Ch-αにおけるE20の位置は塩基性アミノ酸であるアルギニン（R）を有していることからみて、毒性が高くて取り扱いにくいレクチンであるため確認はなされていないが、本来のガラクトース結合活性と共に、ガラクトース６硫酸への結合活性も有しているものと解される。
Ｒ型レクチンはβ-トレフォイルと呼ばれる三つ葉のクローバー様の構造を有しており、β-トレフォイル構造を介してガラクトースを特異的に認識する。この三つ葉はサブドメインα、β、γで構成され、３回対称軸で配置されている。いずれのサブドメインも糖結合部位となりうるが、多くのＲ型レクチンではそのうちの１つ、もしくは２つにだけ糖結合に必須なアミノ酸が保存されている。特に各ドメインのＮ末端側に位置する進化的に保存されたアスバラギン酸（D）は糖との結合に必須であることが知られており、ガラクトースなど糖骨格中の水酸基との水素結合に関与しているといわれている（非特許文献６、７）。
本発明の出発原料として用いたミミズ由来レクチンEW29のＣ末端ドメイン（EW29Ch）のαサブドメイン、γサブドメインと共に、他の代表的Ｒ型レクチンの糖結合性ドメインを並べて示す（図１）。図１のRicin-B1（AAB22582）、Ricin-B2（AAB22582）はトウゴマ（ヒマ）の種子から抽出したレクチンRicinのＢ鎖であり、SoCBM13（1XYF_A）は放線菌Streptomyces olivaceoviridisE-86由来のキシラナーゼの基質認識ドメインであり、ML1-B1(1OQL_B)、ML1-B2(1OQL_B)はヤドリギから抽出したレクチンMLのＢ鎖であり、pp-GalNAcT-１(XP_687472)は、ムチンなどのＯ型糖鎖の生合成に関連する糖転移酵素である。いずれのＲ型レクチンにおいてもEW29Chのαサブドメインの１８位に相当する位置の糖結合部位であるアスパラギン酸(D)は保存されている。結晶構造解析がなされているEW29Chのαサブドメインを図２として示す。図１及び図２に示されるように、アスパラギン酸（D）及びそれに続く１〜４アミノ酸まではβ-シートで囲まれて形成されたループ内に存在している。当該ループ構造全体が結合対象の糖を包み込む構造をとり、アスパラギン酸（D）の位置で糖と水素結合するが、その１〜４下流のアミノ酸位置の電荷などが結合対象の糖の種類を決定づけていると考えられる。本発明の結果によれば、EW29Ch-αの場合は、Dの２アミノ酸下流のEがガラクトースを対象に選んでいたのが、E→Kの変異導入によって電荷が（−）→（＋）へとプラス側に変更され、マイナス電荷を有するガラクトース６硫酸への認識能を獲得したと説明できる。このことは、リジン（K）以外のアルギニン（R）への変異でも同様のガラクトース６硫酸認識性のレクチンに変更できると考えられる。また、図１に示されるように、他のＲ型レクチンの糖結合性ドメインにおいても、アスパラギン酸（D）の１〜４下流のアミノ酸のうちで、ループ構造を構造的に見たときにEW29Ch-αのEに対応する位置が、ガラクトース６硫酸結合活性獲得に重要な変異導入候補位置であり、この位置のアミノ酸を、電荷が＋側の方向にシフトさせるアミノ酸への変異導入により、ガラクトース６硫酸結合レクチンを作製することができると期待できる。
反対に、Ricin毒素のRicin-B1αサブドメインもしくはγサブドメイン又はML1-B1αサブドメインなどで、すでにEW29Ch-αにおけるE20の位置は塩基性アミノ酸であるアルギニン（R）を有していることからみて、毒性が高くて取り扱いにくいレクチンであるため確認はなされていないが、本来のガラクトース結合活性と共に、ガラクトース６硫酸への結合活性も有しているものと解される。
２．本発明のガラクトース６硫酸結合タンパク質について
本発明では、ガラクトースに結合するＲ型レクチンのうちで、Ｘ線解析により立体構造が明らかとなっているミミズ由来のレクチンのＣ末端ドメインEW29Chを出発原料としたが、他のＲ型レクチンのガラクトース結合ドメインについても、ガラクトース結合部位のアスパラギン酸(D)の１〜４下流のアミノ酸のうちで、ループ構造を構造的に見たときにEW29Ch-αのEに対応する位置のアミノ酸の電荷を＋側の方向にシフトさせるアミノ酸への改変によっても、同様のガラクトース６硫酸結合タンパク質を得ることができる。
そのようなタンパク質は、具体的には、以下のように記載することができる。
Ｒ型レクチンのβ-トレフォイル構造を形成する糖認識ドメインの少なくとも１つのサブドメインのアミノ酸配列において、EW29Chのαドメイン（EW29Ch-α）のアミノ酸配列（配列番号２）の１８位に対応するガラクトース結合部位であるアスパラギン酸を変更することなく、当該アスパラギン酸に続くループ内に存在し、かつアスパラギン酸の下流１〜４アミノ酸のいずれかの位置に存在する、EW29Ch-αのアミノ酸配列の２０位のグルタミン酸に対応する酸性又は中性アミノ酸が、塩基性アミノ酸に変異していることを特徴とする、ガラクトース６硫酸を認識する糖認識ドメインを含むタンパク質。
特に、本発明の実施例において実際にガラクトース６硫酸に結合することが確認できたEW29Chの、少なくとも変異αサブドメインを含むタンパク質が好ましく、具体的には、
「下記（ａ）〜（ｃ）いずれかのアミノ酸配列において、２０位が塩基性アミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなる糖認識ドメインを含む、ガラクトース６硫酸に結合活性を有するタンパク質；
（ａ）配列番号２〜１６又は１８に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２〜１６又は１８に示されるアミノ酸配列において、１８位のアスパラギン酸以外のアミノ酸のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号５９〜７４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつその５４〜５６位の塩基配列がコードするコドンがアスパラギン酸である塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。」
と表記することができる。
ここで、配列番号２〜１６又は１８には、天然のEW29Chのαサブドメインのアミノ酸配列のＮ末端にMet（M）が付加されている。このMetは天然EW29Ch-αには含まれておらず、大腸菌で発現させるために付加されたものであるから他の宿主細胞で発現させる場合、又は化学的に合成する場合は不要である。以下の配列番号１７、３０〜４３も同様である。対応する塩基配列（配列番号２９，４４〜７４）における５’末端の「ATG」コドンも同様である。
ここで、２０位の塩基性アミノ酸としては、リジン、アルギニンが好ましく、特にリジンが好ましい。
また、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列のうち、アミノ酸配列中の１８位がアスパラギン酸（D）であって、かつ３３位のトリプトファン（W）、３６位のリジン（K）及び４３位のアスパラギン（N）のうち、少なくとも１つが保存されているアミノ酸配列であることが好ましく、いずれも保存されていることがさらに好ましい。
なお、１もしくは数個が欠失、置換、付加する場合の変異の数は１〜２０個でもよいが、１〜１０個であることが好ましく、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個である。
また、ここでストリンジェントな条件というとき、ミスマッチ配列が１５％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下のハイブリダイズ条件を指し、例えば0.5％SDS、5×デンハルツ［Denhardt’s、0.1％ウシ血清アルブミン(BSA)、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％フィコール400］及び100μg/mlサケ精子DNAを含む6×SSC(1×SSCは0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウム、pH7.0）中で、50℃で4時間〜一晩保温を行う条件をいう（Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd ed.(2001）Cold Spring Harbor Laboratoryなど)。
さらに具体的なアミノ酸配列としては、配列番号３〜１６又は１８に示されるアミノ酸配列をαドメインとして有するβ-トレフォイル構造含有タンパク質である。
ガラクトース６硫酸結合活性に関わる領域はαサブドメインであるので、本願発明のタンパク質と機能的に同等な変異体としては、αサブドメインを構成するアミノ酸配列においては、ガラクトース６硫酸結合活性を保持するために、通常はアミノ酸配列として９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性(同一性)を有するが、他のβ及びγサブドメインについては、β-トレフォイル構造を形成してαサブドメインを安定化させるための機能が保持されていればよい。
典型的には、配列番号１７及び配列番号３０〜４３から選択されたいずれか１つのアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列において、２０位のリジン(K)、１８位のアスパラギン酸（D）以外のアミノ酸が１もしくは数個が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列を有し、かつβ-トレフォイル構造を保持した、ガラクトース６硫酸に結合活性を有するタンパク質が含まれる。全長のアミノ酸配列の相同性（同一性）は、通常、８０％以上、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上保持されている。
ここで、好ましくはさらに３３位のトリプトファン（W）、３６位のリジン（K）及び４３位のアスパラギン（N）の１つ以上も変異されていないことが好ましい。
しかし、上述のように、β及びγサブドメインの役割としてはβ-トレフォイル構造を形成できればよいため、EW29Ch由来のアミノ酸配列である必要もなく、他の公知のＲ型レクチンのβ-トレフォイル構造を形成する糖認識ドメイン中のサブドメインを代替できる。また、公知の安定なタンパク質との融合タンパク質を形成させたり、薬理学的に許容される担体と化学的に結合させて用いることもできる。
以上のように、本発明のガラクトース６硫酸結合性タンパク質は、EW29Chに由来する変異蛋白質には限られないが、本願発明の典型的なタンパク質であるので、その取得方法、特性などについては、以下、EW29Ch由来変異タンパク質について述べる。
本発明では、ガラクトースに結合するＲ型レクチンのうちで、Ｘ線解析により立体構造が明らかとなっているミミズ由来のレクチンのＣ末端ドメインEW29Chを出発原料としたが、他のＲ型レクチンのガラクトース結合ドメインについても、ガラクトース結合部位のアスパラギン酸(D)の１〜４下流のアミノ酸のうちで、ループ構造を構造的に見たときにEW29Ch-αのEに対応する位置のアミノ酸の電荷を＋側の方向にシフトさせるアミノ酸への改変によっても、同様のガラクトース６硫酸結合タンパク質を得ることができる。
そのようなタンパク質は、具体的には、以下のように記載することができる。
Ｒ型レクチンのβ-トレフォイル構造を形成する糖認識ドメインの少なくとも１つのサブドメインのアミノ酸配列において、EW29Chのαドメイン（EW29Ch-α）のアミノ酸配列（配列番号２）の１８位に対応するガラクトース結合部位であるアスパラギン酸を変更することなく、当該アスパラギン酸に続くループ内に存在し、かつアスパラギン酸の下流１〜４アミノ酸のいずれかの位置に存在する、EW29Ch-αのアミノ酸配列の２０位のグルタミン酸に対応する酸性又は中性アミノ酸が、塩基性アミノ酸に変異していることを特徴とする、ガラクトース６硫酸を認識する糖認識ドメインを含むタンパク質。
特に、本発明の実施例において実際にガラクトース６硫酸に結合することが確認できたEW29Chの、少なくとも変異αサブドメインを含むタンパク質が好ましく、具体的には、
「下記（ａ）〜（ｃ）いずれかのアミノ酸配列において、２０位が塩基性アミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなる糖認識ドメインを含む、ガラクトース６硫酸に結合活性を有するタンパク質；
（ａ）配列番号２〜１６又は１８に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２〜１６又は１８に示されるアミノ酸配列において、１８位のアスパラギン酸以外のアミノ酸のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号５９〜７４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつその５４〜５６位の塩基配列がコードするコドンがアスパラギン酸である塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。」
と表記することができる。
ここで、配列番号２〜１６又は１８には、天然のEW29Chのαサブドメインのアミノ酸配列のＮ末端にMet（M）が付加されている。このMetは天然EW29Ch-αには含まれておらず、大腸菌で発現させるために付加されたものであるから他の宿主細胞で発現させる場合、又は化学的に合成する場合は不要である。以下の配列番号１７、３０〜４３も同様である。対応する塩基配列（配列番号２９，４４〜７４）における５’末端の「ATG」コドンも同様である。
ここで、２０位の塩基性アミノ酸としては、リジン、アルギニンが好ましく、特にリジンが好ましい。
また、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列のうち、アミノ酸配列中の１８位がアスパラギン酸（D）であって、かつ３３位のトリプトファン（W）、３６位のリジン（K）及び４３位のアスパラギン（N）のうち、少なくとも１つが保存されているアミノ酸配列であることが好ましく、いずれも保存されていることがさらに好ましい。
なお、１もしくは数個が欠失、置換、付加する場合の変異の数は１〜２０個でもよいが、１〜１０個であることが好ましく、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜２個である。
また、ここでストリンジェントな条件というとき、ミスマッチ配列が１５％以下、好ましくは１０％以下、より好ましくは５％以下のハイブリダイズ条件を指し、例えば0.5％SDS、5×デンハルツ［Denhardt’s、0.1％ウシ血清アルブミン(BSA)、0.1％ポリビニルピロリドン、0.1％フィコール400］及び100μg/mlサケ精子DNAを含む6×SSC(1×SSCは0.15M NaCl、0.015M クエン酸ナトリウム、pH7.0）中で、50℃で4時間〜一晩保温を行う条件をいう（Sambrook and Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd ed.(2001）Cold Spring Harbor Laboratoryなど)。
さらに具体的なアミノ酸配列としては、配列番号３〜１６又は１８に示されるアミノ酸配列をαドメインとして有するβ-トレフォイル構造含有タンパク質である。
ガラクトース６硫酸結合活性に関わる領域はαサブドメインであるので、本願発明のタンパク質と機能的に同等な変異体としては、αサブドメインを構成するアミノ酸配列においては、ガラクトース６硫酸結合活性を保持するために、通常はアミノ酸配列として９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性(同一性)を有するが、他のβ及びγサブドメインについては、β-トレフォイル構造を形成してαサブドメインを安定化させるための機能が保持されていればよい。
典型的には、配列番号１７及び配列番号３０〜４３から選択されたいずれか１つのアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列において、２０位のリジン(K)、１８位のアスパラギン酸（D）以外のアミノ酸が１もしくは数個が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列を有し、かつβ-トレフォイル構造を保持した、ガラクトース６硫酸に結合活性を有するタンパク質が含まれる。全長のアミノ酸配列の相同性（同一性）は、通常、８０％以上、好ましくは９０％、より好ましくは９５％以上保持されている。
ここで、好ましくはさらに３３位のトリプトファン（W）、３６位のリジン（K）及び４３位のアスパラギン（N）の１つ以上も変異されていないことが好ましい。
しかし、上述のように、β及びγサブドメインの役割としてはβ-トレフォイル構造を形成できればよいため、EW29Ch由来のアミノ酸配列である必要もなく、他の公知のＲ型レクチンのβ-トレフォイル構造を形成する糖認識ドメイン中のサブドメインを代替できる。また、公知の安定なタンパク質との融合タンパク質を形成させたり、薬理学的に許容される担体と化学的に結合させて用いることもできる。
以上のように、本発明のガラクトース６硫酸結合性タンパク質は、EW29Chに由来する変異蛋白質には限られないが、本願発明の典型的なタンパク質であるので、その取得方法、特性などについては、以下、EW29Ch由来変異タンパク質について述べる。
３．EW29Ch由来ガラクトース６硫酸結合性変異タンパク質
（１）EW29Ch由来変異タンパク質の取得方法
（１−１）エラー導入PCR/リボソームディスプレイ法によるスクリーニング
鋳型となる野生型のEW29Ch遺伝子を含むプラスミドを用い、矢部らの方法（非特許文献８）の方法に従い、エラー導入PCRを行う。具体的には、PCRによりランダム変異を導入したEW29Chの全コード領域、及びアンカーの繊維状ファージ由来の遺伝子geneIII部分を増幅し、両者をオーバーラップPCRで融合する。このPCR産物の精製物を、変異DNAライブラリーとしてリボソーム提示法を適用する。
その後、選択されてきたcDNAを用いて大腸菌を形質転換して得られる複数のクローンの配列を解析する。
これらのランダム変異導入EW29Ch遺伝子の塩基配列に対応するアミノ酸配列において、αサブドメインにおける１８位のアスパラギン酸が変異されておらず、かつ２０位のグルタミン酸が塩基性アミノ酸に、好ましくはリジンに変更されていたものであって、αサブドメイン全体のアミノ酸変異数が数個以内であるものを選択することで、新たにガラクトース６硫酸結合活性を有する変異EW29Chを取得することができる。
必要に応じて、下記４．の方法に従って、ガラクトース６硫酸との結合活性を確認する。
（１）EW29Ch由来変異タンパク質の取得方法
（１−１）エラー導入PCR/リボソームディスプレイ法によるスクリーニング
鋳型となる野生型のEW29Ch遺伝子を含むプラスミドを用い、矢部らの方法（非特許文献８）の方法に従い、エラー導入PCRを行う。具体的には、PCRによりランダム変異を導入したEW29Chの全コード領域、及びアンカーの繊維状ファージ由来の遺伝子geneIII部分を増幅し、両者をオーバーラップPCRで融合する。このPCR産物の精製物を、変異DNAライブラリーとしてリボソーム提示法を適用する。
その後、選択されてきたcDNAを用いて大腸菌を形質転換して得られる複数のクローンの配列を解析する。
これらのランダム変異導入EW29Ch遺伝子の塩基配列に対応するアミノ酸配列において、αサブドメインにおける１８位のアスパラギン酸が変異されておらず、かつ２０位のグルタミン酸が塩基性アミノ酸に、好ましくはリジンに変更されていたものであって、αサブドメイン全体のアミノ酸変異数が数個以内であるものを選択することで、新たにガラクトース６硫酸結合活性を有する変異EW29Chを取得することができる。
必要に応じて、下記４．の方法に従って、ガラクトース６硫酸との結合活性を確認する。
（１−２）遺伝子工学的な変異の導入法
本発明の変異EW29Ch-α遺伝子は、野生型の塩基配列（配列番号５９）、又はすでに変異が導入されているEW29Ch-mutant＃１〜１４及び（E20K)-α遺伝子(以下、EW29Ch(m)-α遺伝子という。配列番号６０〜７４)に対して、例えば部位突然変異法などにより遺伝子工学的な改変を行うことができる。
また、EW29Ch-α遺伝子を含む糖認識ドメイン全体の野生型EW29Ch遺伝子(配列番号２９)、又は既に変異が導入されているEW29Ch(m)遺伝子（配列番号４４〜５８）に対して、同様に遺伝子工学的な改変を行ってもよい。
その際には、αサブドメインにおける１８位のアスパラギン酸には変異を導入することなく、好ましくは、３３位のトリプトファン（W）、３６位のリジン（K）及び４３位のアスパラギン（N）の１つ以上も変異させず、かつ２０位のグルタミン酸を塩基性アミノ酸に、好ましくはリジンに変更する変異を導入すると共に、その他の任意の位置に、αサブドメイン全体のアミノ酸変異数が数個以内となるように変異を導入する。
適宜、下記４．の方法に従って、ガラクトース６硫酸との結合活性を確認しながら、最適な変異導入位置を探ることができる。
本発明の変異EW29Ch-α遺伝子は、野生型の塩基配列（配列番号５９）、又はすでに変異が導入されているEW29Ch-mutant＃１〜１４及び（E20K)-α遺伝子(以下、EW29Ch(m)-α遺伝子という。配列番号６０〜７４)に対して、例えば部位突然変異法などにより遺伝子工学的な改変を行うことができる。
また、EW29Ch-α遺伝子を含む糖認識ドメイン全体の野生型EW29Ch遺伝子(配列番号２９)、又は既に変異が導入されているEW29Ch(m)遺伝子（配列番号４４〜５８）に対して、同様に遺伝子工学的な改変を行ってもよい。
その際には、αサブドメインにおける１８位のアスパラギン酸には変異を導入することなく、好ましくは、３３位のトリプトファン（W）、３６位のリジン（K）及び４３位のアスパラギン（N）の１つ以上も変異させず、かつ２０位のグルタミン酸を塩基性アミノ酸に、好ましくはリジンに変更する変異を導入すると共に、その他の任意の位置に、αサブドメイン全体のアミノ酸変異数が数個以内となるように変異を導入する。
適宜、下記４．の方法に従って、ガラクトース６硫酸との結合活性を確認しながら、最適な変異導入位置を探ることができる。
（１−３）その他
EW29Ch遺伝子はミミズのうちでも環形動物門（Annelida）の一つの綱である貧毛類に属するフツウミミズ（Lumbricus terrestris）であるので、環形動物門（Annelida）の一つの綱である貧毛類、又は多毛類、蛭類などのDNAライブラリーを用いることで、ミミズ由来の野生型EW29Ch-α遺伝子（配列番号５９）もしくはその変異遺伝子であるEW29Ch(m)-α遺伝子の塩基配列(配列番号６０〜７４)、またはEW29Ch遺伝子(配列番号２９)もしくは変異が導入されたEW29Ch(m)遺伝子の塩基配列（配列番号４４〜５８）をもとにプライマー、プローブを設計することができるから、これらプライマー、プローブを用いたPCR法、ハイブリダイゼーション法でも取得することができる。得られた遺伝子に対して、さらに上記（１−２）の方法を適用することで、よりガラクトース６硫酸との結合活性の高い変異αサブドメインを有するEW29Ch(m)-α遺伝子、又はEW29Ch(m)遺伝子を取得することが可能である。
このようにして得られるガラクトース６硫酸との結合活性の高い変異EW29Ch-αをコードするEW29Ch(m)-α遺伝子は、配列番号５９における５４〜５６位に対応するコドンがアスパラギン酸であり、同６０〜６２位に対応するコドンが塩基性アミノ酸である塩基配列であって、かつ、配列番号５９〜７４に示される塩基配列、又は当該配列番号５９〜７４の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む塩基配列として表現される。
そして、ガラクトース６硫酸との結合活性の高い変異EW29ChをコードするEW29Ch(m)遺伝子は、上記EW29Ch(m)-α遺伝子を含む遺伝子であり、また、配列番号２９における５４〜５６位に対応するコドンがアスパラギン酸であり、同６０〜６２位に対応するコドンが塩基性アミノ酸である塩基配列であって、かつ、配列番号２９もしくは４４〜５８に示される塩基配列、又は当該配列番号２９もしくは４４〜５８の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む塩基配列として表現される。
上記した方法で得られた変異EW29Chのαサブドメイン領域を、他のＲ型レクチン由来のサブドメイン、Ricinus communisレクチン（RCA120）、Sambucus nigraレクチン（SNA）、Polyporus squamosasレクチン（PSL）、Marasmius oreadesレクチン（MOA）、Laetiporus sulphureusレクチン（LSL）、Momordica charantiaレクチン（MCL）、Sambucus sieboldianaレクチン（SSA）、Clitocybe nebularisレクチン（CNL）などと化学的に結合する方法も採用できる。また、これらの遺伝子配列は公知であるから、遺伝子工学的な周知の手法により適宜の宿主細胞から融合蛋白として発現させることができる。
EW29Ch遺伝子はミミズのうちでも環形動物門（Annelida）の一つの綱である貧毛類に属するフツウミミズ（Lumbricus terrestris）であるので、環形動物門（Annelida）の一つの綱である貧毛類、又は多毛類、蛭類などのDNAライブラリーを用いることで、ミミズ由来の野生型EW29Ch-α遺伝子（配列番号５９）もしくはその変異遺伝子であるEW29Ch(m)-α遺伝子の塩基配列(配列番号６０〜７４)、またはEW29Ch遺伝子(配列番号２９)もしくは変異が導入されたEW29Ch(m)遺伝子の塩基配列（配列番号４４〜５８）をもとにプライマー、プローブを設計することができるから、これらプライマー、プローブを用いたPCR法、ハイブリダイゼーション法でも取得することができる。得られた遺伝子に対して、さらに上記（１−２）の方法を適用することで、よりガラクトース６硫酸との結合活性の高い変異αサブドメインを有するEW29Ch(m)-α遺伝子、又はEW29Ch(m)遺伝子を取得することが可能である。
このようにして得られるガラクトース６硫酸との結合活性の高い変異EW29Ch-αをコードするEW29Ch(m)-α遺伝子は、配列番号５９における５４〜５６位に対応するコドンがアスパラギン酸であり、同６０〜６２位に対応するコドンが塩基性アミノ酸である塩基配列であって、かつ、配列番号５９〜７４に示される塩基配列、又は当該配列番号５９〜７４の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む塩基配列として表現される。
そして、ガラクトース６硫酸との結合活性の高い変異EW29ChをコードするEW29Ch(m)遺伝子は、上記EW29Ch(m)-α遺伝子を含む遺伝子であり、また、配列番号２９における５４〜５６位に対応するコドンがアスパラギン酸であり、同６０〜６２位に対応するコドンが塩基性アミノ酸である塩基配列であって、かつ、配列番号２９もしくは４４〜５８に示される塩基配列、又は当該配列番号２９もしくは４４〜５８の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含む塩基配列として表現される。
上記した方法で得られた変異EW29Chのαサブドメイン領域を、他のＲ型レクチン由来のサブドメイン、Ricinus communisレクチン（RCA120）、Sambucus nigraレクチン（SNA）、Polyporus squamosasレクチン（PSL）、Marasmius oreadesレクチン（MOA）、Laetiporus sulphureusレクチン（LSL）、Momordica charantiaレクチン（MCL）、Sambucus sieboldianaレクチン（SSA）、Clitocybe nebularisレクチン（CNL）などと化学的に結合する方法も採用できる。また、これらの遺伝子配列は公知であるから、遺伝子工学的な周知の手法により適宜の宿主細胞から融合蛋白として発現させることができる。
（２）EW29Ch由来変異タンパク質の特性
EW29Chのαドメインとラクトース複合体の立体構造図を図２に示す。糖結合に関連する４つのアミノ酸（D18、W33、K36、N43)はLine表示法で、変異が導入されたE20はStick表示法で示される位置である。進化的に保存されたアスパラギン酸の下流の１〜４アミノ酸のループ部分は糖結合特異性の決定に関係していることが知られている。ガラクトース６硫酸との結合活性を獲得した変異EW29Chは、このループ部分に塩基性アミノ酸であるリジンもしくはアルギニンが導入されることにより、ガラクトースの６位の負に荷電している硫酸基と電荷−電荷相互作用を形成することが可能となり、結果として結合親和性が格段に強くなったものと推測される。
本発明のガラクトース６硫酸結合性タンパク質は、図４及び図５に示されるように、特に糖鎖非還元末端のガラクトースの６位が硫酸基で修飾された糖鎖を認識するので、「糖鎖非還元末端のガラクトース６硫酸結合活性を有するタンパク質」と表現することもできる。
本発明のタンパク質において、「ガラクトース６硫酸結合活性」に寄与している領域は、EW29Chのβ-トレフォイル構造を形成する３つのサブドメイン中、αサブドメインに相当する領域であるため、配列番号２に示されるアミノ酸配列又はその２０位グルタミン酸の塩基性アミノ酸（リジン）置換を必須とする改変アミノ酸配列を含んでさえいれば「ガラクトース６硫酸結合活性」を有するタンパク質としての性質を有する。
しかしながら、レクチンアレイなど実用的な用途を考慮すると、EW29Chのβ-トレフォイル構造を形成する他のサブドメインであるβもしくはγサブドメイン、又は他のＲ型レクチンの糖認識ドメインを少なくとも１つ以上さらに含むことがタンパク質の安定性のためには重要である。特に、３つのサブドメインによりβ-トレフォイル構造を形成させることが望ましい。その際のサブドメインとして、EW29Chのαサブドメイン、又は変異EW29Chのαサブドメインを選択することもできる。
EW29Chのαドメインとラクトース複合体の立体構造図を図２に示す。糖結合に関連する４つのアミノ酸（D18、W33、K36、N43)はLine表示法で、変異が導入されたE20はStick表示法で示される位置である。進化的に保存されたアスパラギン酸の下流の１〜４アミノ酸のループ部分は糖結合特異性の決定に関係していることが知られている。ガラクトース６硫酸との結合活性を獲得した変異EW29Chは、このループ部分に塩基性アミノ酸であるリジンもしくはアルギニンが導入されることにより、ガラクトースの６位の負に荷電している硫酸基と電荷−電荷相互作用を形成することが可能となり、結果として結合親和性が格段に強くなったものと推測される。
本発明のガラクトース６硫酸結合性タンパク質は、図４及び図５に示されるように、特に糖鎖非還元末端のガラクトースの６位が硫酸基で修飾された糖鎖を認識するので、「糖鎖非還元末端のガラクトース６硫酸結合活性を有するタンパク質」と表現することもできる。
本発明のタンパク質において、「ガラクトース６硫酸結合活性」に寄与している領域は、EW29Chのβ-トレフォイル構造を形成する３つのサブドメイン中、αサブドメインに相当する領域であるため、配列番号２に示されるアミノ酸配列又はその２０位グルタミン酸の塩基性アミノ酸（リジン）置換を必須とする改変アミノ酸配列を含んでさえいれば「ガラクトース６硫酸結合活性」を有するタンパク質としての性質を有する。
しかしながら、レクチンアレイなど実用的な用途を考慮すると、EW29Chのβ-トレフォイル構造を形成する他のサブドメインであるβもしくはγサブドメイン、又は他のＲ型レクチンの糖認識ドメインを少なくとも１つ以上さらに含むことがタンパク質の安定性のためには重要である。特に、３つのサブドメインによりβ-トレフォイル構造を形成させることが望ましい。その際のサブドメインとして、EW29Chのαサブドメイン、又は変異EW29Chのαサブドメインを選択することもできる。
４．ガラクトース６硫酸との結合親和性の解析
ガラクトース６硫酸はガラクトースの６位に硫酸が付加された単糖で、ケラタン硫酸などのグリコサミノグリカンの構成糖になっている。
本発明では、舘野らの方法（Tateno et al.,Glycobiology. 2008;18(10):789-98）に従って糖鎖複合体アレイを用いて糖結合活性を査定した。
具体的には、レクチンを含む溶液に、レクチンもしくはレクチンのタグに対する１次抗体と、蛍光ラベル化された２次抗体を混合し、その混合液を９８種類の糖鎖複合体がスライドガラス上に固定化されたアレイと反応させる。結合はエバネッセント波励起蛍光型スキャナーで検出する。
しかし、当該方法に限定されることはなく、ELISA、表面プラズモン共鳴センサ、平衡透析法、滴定カロリメトリー、水晶発振子センサ検出法などの方法によっても結合活性の測定をすることができる。
ガラクトース６硫酸はガラクトースの６位に硫酸が付加された単糖で、ケラタン硫酸などのグリコサミノグリカンの構成糖になっている。
本発明では、舘野らの方法（Tateno et al.,Glycobiology. 2008;18(10):789-98）に従って糖鎖複合体アレイを用いて糖結合活性を査定した。
具体的には、レクチンを含む溶液に、レクチンもしくはレクチンのタグに対する１次抗体と、蛍光ラベル化された２次抗体を混合し、その混合液を９８種類の糖鎖複合体がスライドガラス上に固定化されたアレイと反応させる。結合はエバネッセント波励起蛍光型スキャナーで検出する。
しかし、当該方法に限定されることはなく、ELISA、表面プラズモン共鳴センサ、平衡透析法、滴定カロリメトリー、水晶発振子センサ検出法などの方法によっても結合活性の測定をすることができる。
５．ガラクトース６硫酸結合性変異タンパク質のプローブとしての用途
本発明のガラクトース６硫酸結合性タンパク質は、常法により蛍光や酵素、ビオチン等でラベル化して、蛍光染色、フローサイトメトリー、ELISA、レクチンブロッティングなどに、ガラクトース６硫酸含有糖鎖検出用プローブとして用いることができる。また、ビーズなどに固定化してガラクトース６硫酸含有糖タンパク質、複合糖質又は糖脂質などの濃縮、精製に活用することができる。また、スライドガラスなど基板上に固定化して、レクチンマイクロアレイを用いた糖鎖プロファイリングに用いることもできる。
すなわち、本願発明のガラクトース６硫酸結合性変異タンパク質を標識し、緩衝液に安定剤などと共に溶解して、ガラクトース６硫酸含有糖鎖検出用試薬として、患者血液等の被検体に対して適用することができる。典型的には、被検体中のガラクトース６硫酸含有糖鎖の検出及び定量に用いる。
また、基板表面に通常の方法で固定化してマイクロアレイ用のプローブなどとして用いることができる。
ここで、基板材料としては、好ましくは通常のマイクロアレイで使用される物質であり、シリコンウエハー、ガラス、ポリカーボネート、膜、ポリスチレンまたはポリウレタンのような高分子フィルム及び多孔性物質が用いられる。プローブの固定には、通常のマイクロアレイ製造方法で使用する方法を用いることができ、例えば、フォトリソグラフィ法、圧電印刷法、マイクロピペッティングまたはスポッティングなどの方法を用いてスポットの作成を行うことができる。
また、アレイの測定に関しては、通常の抗体アレイ、レクチンアレイで用いる通常の方法、例えば上記４．に示した測定法がいずれも適用できる。
被検体中に、ガラクトース６硫酸含有糖鎖が存在するか否かの検出と共にその存在量を定量することができる。被検体として、癌又は他の重篤な疾患でガラクトース６硫酸含有糖鎖が関連している疾病に罹患した患者、またはそれら疾病を疑う被験者などから採取した細胞、組織、又は血液、尿、唾液などの体液などに適用することで、診断用キットとして用いることができる。
また、固定化する対象の基板はスライドガラスなど平面状には限られず、どのような形状でも良い。例えば、ビーズ状のシリカもしくはポリマー担体など公知の担体、又は磁気ビーズ表面に浸積、噴霧、塗布などの通常の固定化方法により固定化することができる。これらビーズをそのまま溶液中に懸濁するか、又はカラムに充填して、ガラクトース６硫酸含有糖鎖を有するタンパク質、脂質、又は複合糖質などの化合物を捕獲するために用いることができる。典型的には、ガラクトース６硫酸含有糖鎖を有する化合物の濃縮もしくは精製のために用いる。
本発明のガラクトース６硫酸結合性タンパク質は、常法により蛍光や酵素、ビオチン等でラベル化して、蛍光染色、フローサイトメトリー、ELISA、レクチンブロッティングなどに、ガラクトース６硫酸含有糖鎖検出用プローブとして用いることができる。また、ビーズなどに固定化してガラクトース６硫酸含有糖タンパク質、複合糖質又は糖脂質などの濃縮、精製に活用することができる。また、スライドガラスなど基板上に固定化して、レクチンマイクロアレイを用いた糖鎖プロファイリングに用いることもできる。
すなわち、本願発明のガラクトース６硫酸結合性変異タンパク質を標識し、緩衝液に安定剤などと共に溶解して、ガラクトース６硫酸含有糖鎖検出用試薬として、患者血液等の被検体に対して適用することができる。典型的には、被検体中のガラクトース６硫酸含有糖鎖の検出及び定量に用いる。
また、基板表面に通常の方法で固定化してマイクロアレイ用のプローブなどとして用いることができる。
ここで、基板材料としては、好ましくは通常のマイクロアレイで使用される物質であり、シリコンウエハー、ガラス、ポリカーボネート、膜、ポリスチレンまたはポリウレタンのような高分子フィルム及び多孔性物質が用いられる。プローブの固定には、通常のマイクロアレイ製造方法で使用する方法を用いることができ、例えば、フォトリソグラフィ法、圧電印刷法、マイクロピペッティングまたはスポッティングなどの方法を用いてスポットの作成を行うことができる。
また、アレイの測定に関しては、通常の抗体アレイ、レクチンアレイで用いる通常の方法、例えば上記４．に示した測定法がいずれも適用できる。
被検体中に、ガラクトース６硫酸含有糖鎖が存在するか否かの検出と共にその存在量を定量することができる。被検体として、癌又は他の重篤な疾患でガラクトース６硫酸含有糖鎖が関連している疾病に罹患した患者、またはそれら疾病を疑う被験者などから採取した細胞、組織、又は血液、尿、唾液などの体液などに適用することで、診断用キットとして用いることができる。
また、固定化する対象の基板はスライドガラスなど平面状には限られず、どのような形状でも良い。例えば、ビーズ状のシリカもしくはポリマー担体など公知の担体、又は磁気ビーズ表面に浸積、噴霧、塗布などの通常の固定化方法により固定化することができる。これらビーズをそのまま溶液中に懸濁するか、又はカラムに充填して、ガラクトース６硫酸含有糖鎖を有するタンパク質、脂質、又は複合糖質などの化合物を捕獲するために用いることができる。典型的には、ガラクトース６硫酸含有糖鎖を有する化合物の濃縮もしくは精製のために用いる。
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
（実施例１）リボソーム提示法によるガラクトース６硫酸結合変異体の選出。
EW29Chはミミズ由来のレクチンでＲ型レクチン固有のβ-トレフォイル構造をとっている。このレクチンは大腸菌で大量に発現でき、また、アミノ酸配列や立体構造がすでにわかっているため、ガラクトース６硫酸結合レクチン創出に理想な鋳型として用いた。矢部らの方法（非特許文献５）に従ってEW29Ch変異ライブラリーの作製を行った。プラスミドpRARE_EW29Chをテンプレートにエラー導入を行いEW29Chの全コード領域にランダム変異を導入した。同時にpRARE_EW29ChをテンプレートとしてPCRでアンカーのgeneIII部分を増やした。この二つのPCR産物を精製しオーバーラップPCRで融合した。このPCR産物を精製し、変異DNAライブラリーとしてリボソーム提示法に用いた。
変異DNAライブラリーをin vitroで転写させ、RNAを精製した。精製したmRNAを翻訳させ、結合緩衝液中で冷却後遠心した上清をBlockingした後、6’-sulfo-LN（6’HSO3-Galb1-4GlcNAc）糖鎖ポリマーを固定化したマグネティックビーズと混合して反応させた。洗浄後に溶出緩衝液を添加しビーズから結合したmRNAを溶出した。溶出液からmRNAを精製した。その後、精製したmRNAをcDNAに変換した。
選択工程後、選択されてきたcDNAを制限酵素NdeIとXhoIで処理しタンパク質のＮ末端にFlagタグを付けるようにデザインされたベクターに挿入した。大腸菌DH5aを形質転換し２０クローンをランダムに選択後それぞれの配列を解析した（図３）。
図３は２０クローンの変異体と変異導入前の野生型EW29Chのアミノ酸配列をアライメントした結果を示したものである。この２０クローンの全てのαドメインで、糖結合に関与する４つのアミノ酸（D18、W33、K36、N43）のいずれのアミノ酸には変異の導入はなかった。特に顕著な変異がαサブドメインのD18に続くループ内の２０位のグルタミン酸（E）のリジン（K）への変異（E20の１４／２０がKに変異している）であったので、E20Kの変異を有している配列を＃１〜＃１４（配列番号３０〜４３、それぞれのα-サブドメインのアミノ酸配列が配列番号３〜１６に対応する。）として並べ、変異を有さずE20のままのものを＃１５〜＃２０として並べた。図３では、野生型（EW29Ch）のアミノ酸配列（配列番号１）を併記した。実施例では、E20がKに変異しているクローンのうちの＃１〜＃８、E20の変異のないクローンのうちの＃１５〜＃１８について，大腸菌で発現させて糖結合特性を測定したところ、ガラクトース６硫酸への結合親和性を獲得したものは全てグルタミン酸（E）がリジン（K）に変換されていた。
二か所（矢印で示したE20とE68）に集中して同じ傾向の変異（E→K）が入っており、２０位のEのK変異（E20K）を有している８クローン（＃１〜８）は全て6'-sulfo-LNに対して親和性を有していた。逆に、２０位のEが野生型のEのままに保存されていた４クローンは、いずれも6'-sulfo-LNへの親和性はほとんどなかった。
なお、ここでの親和性の値は、6'-sulfo-LN親和性を有する１２クローンを大腸菌で発現させて、大腸菌抽出液に抗Flag抗体と蛍光ラベリングした二次抗体と逐次反応させ、舘野らの方法（Tateno et al., Glycobiology. 2008;18(10):789-98）に従って糖鎖複合体アレイで糖結合活性を査定した結果を示している。１２クローン中の８クローン（＃１〜８）での6'-sulfo-LNに対する結合活性の正確な定量的比較は難しいが、いずれのクローンでも野生型の6'-sulfo-LNへの結合活性と比較して少なくとも１０倍以上の活性は確認されている。
以上のことから、αサブドメインの２０位のEがKに変わることが6'-sulfo-LNとの結合に重要であると示唆された。
EW29Chはミミズ由来のレクチンでＲ型レクチン固有のβ-トレフォイル構造をとっている。このレクチンは大腸菌で大量に発現でき、また、アミノ酸配列や立体構造がすでにわかっているため、ガラクトース６硫酸結合レクチン創出に理想な鋳型として用いた。矢部らの方法（非特許文献５）に従ってEW29Ch変異ライブラリーの作製を行った。プラスミドpRARE_EW29Chをテンプレートにエラー導入を行いEW29Chの全コード領域にランダム変異を導入した。同時にpRARE_EW29ChをテンプレートとしてPCRでアンカーのgeneIII部分を増やした。この二つのPCR産物を精製しオーバーラップPCRで融合した。このPCR産物を精製し、変異DNAライブラリーとしてリボソーム提示法に用いた。
変異DNAライブラリーをin vitroで転写させ、RNAを精製した。精製したmRNAを翻訳させ、結合緩衝液中で冷却後遠心した上清をBlockingした後、6’-sulfo-LN（6’HSO3-Galb1-4GlcNAc）糖鎖ポリマーを固定化したマグネティックビーズと混合して反応させた。洗浄後に溶出緩衝液を添加しビーズから結合したmRNAを溶出した。溶出液からmRNAを精製した。その後、精製したmRNAをcDNAに変換した。
選択工程後、選択されてきたcDNAを制限酵素NdeIとXhoIで処理しタンパク質のＮ末端にFlagタグを付けるようにデザインされたベクターに挿入した。大腸菌DH5aを形質転換し２０クローンをランダムに選択後それぞれの配列を解析した（図３）。
図３は２０クローンの変異体と変異導入前の野生型EW29Chのアミノ酸配列をアライメントした結果を示したものである。この２０クローンの全てのαドメインで、糖結合に関与する４つのアミノ酸（D18、W33、K36、N43）のいずれのアミノ酸には変異の導入はなかった。特に顕著な変異がαサブドメインのD18に続くループ内の２０位のグルタミン酸（E）のリジン（K）への変異（E20の１４／２０がKに変異している）であったので、E20Kの変異を有している配列を＃１〜＃１４（配列番号３０〜４３、それぞれのα-サブドメインのアミノ酸配列が配列番号３〜１６に対応する。）として並べ、変異を有さずE20のままのものを＃１５〜＃２０として並べた。図３では、野生型（EW29Ch）のアミノ酸配列（配列番号１）を併記した。実施例では、E20がKに変異しているクローンのうちの＃１〜＃８、E20の変異のないクローンのうちの＃１５〜＃１８について，大腸菌で発現させて糖結合特性を測定したところ、ガラクトース６硫酸への結合親和性を獲得したものは全てグルタミン酸（E）がリジン（K）に変換されていた。
二か所（矢印で示したE20とE68）に集中して同じ傾向の変異（E→K）が入っており、２０位のEのK変異（E20K）を有している８クローン（＃１〜８）は全て6'-sulfo-LNに対して親和性を有していた。逆に、２０位のEが野生型のEのままに保存されていた４クローンは、いずれも6'-sulfo-LNへの親和性はほとんどなかった。
なお、ここでの親和性の値は、6'-sulfo-LN親和性を有する１２クローンを大腸菌で発現させて、大腸菌抽出液に抗Flag抗体と蛍光ラベリングした二次抗体と逐次反応させ、舘野らの方法（Tateno et al., Glycobiology. 2008;18(10):789-98）に従って糖鎖複合体アレイで糖結合活性を査定した結果を示している。１２クローン中の８クローン（＃１〜８）での6'-sulfo-LNに対する結合活性の正確な定量的比較は難しいが、いずれのクローンでも野生型の6'-sulfo-LNへの結合活性と比較して少なくとも１０倍以上の活性は確認されている。
以上のことから、αサブドメインの２０位のEがKに変わることが6'-sulfo-LNとの結合に重要であると示唆された。
（実施例２）ガラクトース６硫酸含有糖鎖への各種変異体の結合親和性の解析
上記配列番号３〜１０に示される変異体のガラクトース６硫酸含有糖鎖への結合親和性をフロンタル・アフィニティークロマトグラフィー（FAC）で解析し結合定数を算定した。上記８クローンのうち代表的な二つのクローン（＃１，＃４）を大腸菌で発現させ、Lactose-Sepharoseで糖結合活性が均一な分子群として精製した。精製したタンパク質をNHS-Sepharoseビーズに固定化後、FAC解析に供するため専用のミニチュアカラム（内径2mm、長さ10mm）に充填した。作製したレクチンカラムをFAC自動分析装置に接続してカラム体積（31.4μL）に対し過剰容積のPA化糖鎖を連続注入した。PA糖鎖の溶出液の蛍光強度をモニターして相互作用強度（非結合標準糖鎖に対する溶出液の差V-V0）を測定した。舘野らの方法（Tateno et al., Nat Protoc. 2007;2(10):2529-37）に基づき、相互作用強度および有効リガンド量から結合定数Ka（Kdの逆数で単位はM-1）を求めた（図４）。野生型（EW29Ch）と二つの変異体（＃１，＃４）は末端Galを有する糖鎖（901、902）に対する結合力はほとんど変わっていないが、非還元末端ガラクトースの６位に硫酸基を有する糖鎖（922）に対して結合親和性が顕著に強くなっていることが明らかである。一方、非還元末端のガラクトースの３位に硫酸を有する糖鎖（918）や６位にシアル酸を持つ糖鎖（704）には結合しなかったことから、得られた変異体は野生型と比べガラクトース６硫酸を有する糖鎖に強く結合することがわかった。
上記配列番号３〜１０に示される変異体のガラクトース６硫酸含有糖鎖への結合親和性をフロンタル・アフィニティークロマトグラフィー（FAC）で解析し結合定数を算定した。上記８クローンのうち代表的な二つのクローン（＃１，＃４）を大腸菌で発現させ、Lactose-Sepharoseで糖結合活性が均一な分子群として精製した。精製したタンパク質をNHS-Sepharoseビーズに固定化後、FAC解析に供するため専用のミニチュアカラム（内径2mm、長さ10mm）に充填した。作製したレクチンカラムをFAC自動分析装置に接続してカラム体積（31.4μL）に対し過剰容積のPA化糖鎖を連続注入した。PA糖鎖の溶出液の蛍光強度をモニターして相互作用強度（非結合標準糖鎖に対する溶出液の差V-V0）を測定した。舘野らの方法（Tateno et al., Nat Protoc. 2007;2(10):2529-37）に基づき、相互作用強度および有効リガンド量から結合定数Ka（Kdの逆数で単位はM-1）を求めた（図４）。野生型（EW29Ch）と二つの変異体（＃１，＃４）は末端Galを有する糖鎖（901、902）に対する結合力はほとんど変わっていないが、非還元末端ガラクトースの６位に硫酸基を有する糖鎖（922）に対して結合親和性が顕著に強くなっていることが明らかである。一方、非還元末端のガラクトースの３位に硫酸を有する糖鎖（918）や６位にシアル酸を持つ糖鎖（704）には結合しなかったことから、得られた変異体は野生型と比べガラクトース６硫酸を有する糖鎖に強く結合することがわかった。
（実施例３）ガラクトース６硫酸との結合に重要なアミノ酸の同定
ガラクトース６硫酸に結合する活性を獲得した変異体は全て２０番目のEがKに置換されていたことから、この変異がガラクトース６硫酸への結合に重要であると考えられた。そこで、野生型のEW29Chに部位特異的変異導入法で２０番目のEをKに置換した変異体E20K（配列番号１７）を作製した。実施例２と同様の手順で該変異体を大腸菌で発現して、Lactose-Sepharoseで精製した。精製したタンパク質がガラクトース６硫酸を持つ糖鎖への結合定数をフロンタル・アフィニティークロマトグラフィーで測定した（図５）。
野生型にE20Kを導入した場合でも、非還元末端Galを有する糖鎖（901,902）に対して結合の変化はほとんどないが、非還元末端ガラクトース６硫酸を有する糖鎖（922）に対しては結合が顕著に増強した。一方、E20Kは非還元末端のガラクトースの３位に硫酸を有する糖鎖（918）には結合しなかったことから、得られた変異体E20Kは野生型と比べガラクトース６硫酸を有する糖鎖を強く結合することがわかり、この結合にK20の存在が非常に重要であることが示された。
ガラクトース６硫酸に結合する活性を獲得した変異体は全て２０番目のEがKに置換されていたことから、この変異がガラクトース６硫酸への結合に重要であると考えられた。そこで、野生型のEW29Chに部位特異的変異導入法で２０番目のEをKに置換した変異体E20K（配列番号１７）を作製した。実施例２と同様の手順で該変異体を大腸菌で発現して、Lactose-Sepharoseで精製した。精製したタンパク質がガラクトース６硫酸を持つ糖鎖への結合定数をフロンタル・アフィニティークロマトグラフィーで測定した（図５）。
野生型にE20Kを導入した場合でも、非還元末端Galを有する糖鎖（901,902）に対して結合の変化はほとんどないが、非還元末端ガラクトース６硫酸を有する糖鎖（922）に対しては結合が顕著に増強した。一方、E20Kは非還元末端のガラクトースの３位に硫酸を有する糖鎖（918）には結合しなかったことから、得られた変異体E20Kは野生型と比べガラクトース６硫酸を有する糖鎖を強く結合することがわかり、この結合にK20の存在が非常に重要であることが示された。
［配列表フリーテキスト］
配列番号１：EW29Ch（ミミズ由来レクチンEW29のC末端ドメイン）
配列番号２：EW29Ch-α
配列番号３：EW29Ch-mutant＃1-α
配列番号４：EW29Ch-mutant＃2-α
配列番号５：EW29Ch-mutant＃3-α
配列番号６：EW29Ch-mutant＃4-α
配列番号７：EW29Ch-mutant＃5-α
配列番号８：EW29Ch-mutant＃6-α
配列番号９：EW29Ch-mutant＃7-α
配列番号１０：EW29Ch-mutant＃8-α
配列番号１１：EW29Ch-mutant＃9-α
配列番号１２：EW29Ch-mutant＃10-α
配列番号１３：EW29Ch-mutant＃11-α
配列番号１４：EW29Ch-mutant＃12-α
配列番号１５：EW29Ch-mutant＃13-α
配列番号１６：EW29Ch-mutant＃14-α
配列番号１７：EW29Ch-mutant（E20K）
配列番号１８：E20K-α
配列番号１９：EW29ch-α’
配列番号２０：EW29ch-γ
配列番号２１：Ricin-B1-α
配列番号２２：Ricin-B2-γ
配列番号２３：SoCBM13-α
配列番号２４：SoCBM13-β
配列番号２５：SoCBM13-γ
配列番号２６：ML1-B1-α
配列番号２７：ML1-B2-γ
配列番号２８：pp-GalNAcTase1-α
配列番号２９：EW29Ch(gene)
配列番号３０：EW29Ch-mutant＃1
配列番号３１：EW29Ch-mutant＃2
配列番号３２：EW29Ch-mutant＃3
配列番号３３：EW29Ch-mutant＃4
配列番号３４：EW29Ch-mutant＃5
配列番号３５：EW29Ch-mutant＃6
配列番号３６：EW29Ch-mutant＃7
配列番号３７：EW29Ch-mutant＃8
配列番号３８：EW29Ch-mutant＃9
配列番号３９：EW29Ch-mutant＃10
配列番号４０：EW29Ch-mutant＃11
配列番号４１：EW29Ch-mutant＃12
配列番号４２：EW29Ch-mutant＃13
配列番号４３：EW29Ch-mutant＃14
配列番号４４：EW29Ch-mutant＃1(gene)
配列番号４５：EW29Ch-mutant＃2(gene)
配列番号４６：EW29Ch-mutant＃3(gene)
配列番号４７：EW29Ch-mutant＃4(gene)
配列番号４８：EW29Ch-mutant＃5(gene)
配列番号４９：EW29Ch-mutant＃6(gene)
配列番号５０：EW29Ch-mutant＃7(gene)
配列番号５１：EW29Ch-mutant＃8(gene)
配列番号５２：EW29Ch-mutant＃9(gene)
配列番号５３：EW29Ch-mutant＃10(gene)
配列番号５４：EW29Ch-mutant＃11(gene)
配列番号５５：EW29Ch-mutant＃12(gene)
配列番号５６：EW29Ch-mutant＃13(gene)
配列番号５７：EW29Ch-mutant＃14(gene)
配列番号５８：EW29Ch-mutant E20K（gene）
配列番号５９：EW29Ch-α（gene）
配列番号６０：EW29Ch-(m)-α＃1(gene)
配列番号６１：EW29Ch-(m)-α＃2(gene)
配列番号６２：EW29Ch-(m)-α＃3(gene)
配列番号６３：EW29Ch-(m)-α＃4(gene)
配列番号６４：EW29Ch-(m)-α＃5(gene)
配列番号６５：EW29Ch-(m)-α＃6(gene)
配列番号６６：EW29Ch-(m)-α＃7(gene)
配列番号６７：EW29Ch-(m)-α＃8(gene)
配列番号６８：EW29Ch-(m)-α＃9(gene)
配列番号６９：EW29Ch-(m)-α＃10(gene)
配列番号７０：EW29Ch-(m)-α＃11(gene)
配列番号７１：EW29Ch-(m)-α＃12(gene)
配列番号７２：EW29Ch-(m)-α＃13(gene)
配列番号７３：EW29Ch-(m)-α＃14(gene)
配列番号７４：EW29Ch-(m)-α E20K（gene）
配列番号１：EW29Ch（ミミズ由来レクチンEW29のC末端ドメイン）
配列番号２：EW29Ch-α
配列番号３：EW29Ch-mutant＃1-α
配列番号４：EW29Ch-mutant＃2-α
配列番号５：EW29Ch-mutant＃3-α
配列番号６：EW29Ch-mutant＃4-α
配列番号７：EW29Ch-mutant＃5-α
配列番号８：EW29Ch-mutant＃6-α
配列番号９：EW29Ch-mutant＃7-α
配列番号１０：EW29Ch-mutant＃8-α
配列番号１１：EW29Ch-mutant＃9-α
配列番号１２：EW29Ch-mutant＃10-α
配列番号１３：EW29Ch-mutant＃11-α
配列番号１４：EW29Ch-mutant＃12-α
配列番号１５：EW29Ch-mutant＃13-α
配列番号１６：EW29Ch-mutant＃14-α
配列番号１７：EW29Ch-mutant（E20K）
配列番号１８：E20K-α
配列番号１９：EW29ch-α’
配列番号２０：EW29ch-γ
配列番号２１：Ricin-B1-α
配列番号２２：Ricin-B2-γ
配列番号２３：SoCBM13-α
配列番号２４：SoCBM13-β
配列番号２５：SoCBM13-γ
配列番号２６：ML1-B1-α
配列番号２７：ML1-B2-γ
配列番号２８：pp-GalNAcTase1-α
配列番号２９：EW29Ch(gene)
配列番号３０：EW29Ch-mutant＃1
配列番号３１：EW29Ch-mutant＃2
配列番号３２：EW29Ch-mutant＃3
配列番号３３：EW29Ch-mutant＃4
配列番号３４：EW29Ch-mutant＃5
配列番号３５：EW29Ch-mutant＃6
配列番号３６：EW29Ch-mutant＃7
配列番号３７：EW29Ch-mutant＃8
配列番号３８：EW29Ch-mutant＃9
配列番号３９：EW29Ch-mutant＃10
配列番号４０：EW29Ch-mutant＃11
配列番号４１：EW29Ch-mutant＃12
配列番号４２：EW29Ch-mutant＃13
配列番号４３：EW29Ch-mutant＃14
配列番号４４：EW29Ch-mutant＃1(gene)
配列番号４５：EW29Ch-mutant＃2(gene)
配列番号４６：EW29Ch-mutant＃3(gene)
配列番号４７：EW29Ch-mutant＃4(gene)
配列番号４８：EW29Ch-mutant＃5(gene)
配列番号４９：EW29Ch-mutant＃6(gene)
配列番号５０：EW29Ch-mutant＃7(gene)
配列番号５１：EW29Ch-mutant＃8(gene)
配列番号５２：EW29Ch-mutant＃9(gene)
配列番号５３：EW29Ch-mutant＃10(gene)
配列番号５４：EW29Ch-mutant＃11(gene)
配列番号５５：EW29Ch-mutant＃12(gene)
配列番号５６：EW29Ch-mutant＃13(gene)
配列番号５７：EW29Ch-mutant＃14(gene)
配列番号５８：EW29Ch-mutant E20K（gene）
配列番号５９：EW29Ch-α（gene）
配列番号６０：EW29Ch-(m)-α＃1(gene)
配列番号６１：EW29Ch-(m)-α＃2(gene)
配列番号６２：EW29Ch-(m)-α＃3(gene)
配列番号６３：EW29Ch-(m)-α＃4(gene)
配列番号６４：EW29Ch-(m)-α＃5(gene)
配列番号６５：EW29Ch-(m)-α＃6(gene)
配列番号６６：EW29Ch-(m)-α＃7(gene)
配列番号６７：EW29Ch-(m)-α＃8(gene)
配列番号６８：EW29Ch-(m)-α＃9(gene)
配列番号６９：EW29Ch-(m)-α＃10(gene)
配列番号７０：EW29Ch-(m)-α＃11(gene)
配列番号７１：EW29Ch-(m)-α＃12(gene)
配列番号７２：EW29Ch-(m)-α＃13(gene)
配列番号７３：EW29Ch-(m)-α＃14(gene)
配列番号７４：EW29Ch-(m)-α E20K（gene）
Claims (13)
- 下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列において、２０位が塩基性アミノ酸に置換されているアミノ酸配列を含む糖認識ドメインを有することを特徴とする、ガラクトース６硫酸に結合活性を有するタンパク質；
（ａ）配列番号２〜１６又は１８に示されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２〜１６又は１８に示されるアミノ酸配列において、１８位のアスパラギン酸以外のアミノ酸のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号５９〜７４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつその５４〜５６位の塩基配列がコードするコドンがアスパラギン酸である塩基配列によりコードされたアミノ酸配列。 - 前記（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列が、３３位のトリプトファン、３６位のリジン及び４３位のアスパラギンの少なくとも１つのアミノ酸が保存されていることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質。
- 前記（ｂ）又は（ｃ）のアミノ酸配列が、配列番号３〜１６及び１８から選択されたいずれか１つのアミノ酸配列において、１８位のアスパラギン酸以外のアミノ酸のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列、又は、配列番号６０〜７４に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつその５４〜５６位の塩基配列がコードするコドンがアスパラギン酸である塩基配列によりコードされたアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項２に記載のタンパク質。
- さらに、ミミズ由来レクチンEW29のＣ末端ドメイン（EW29Ch）のβもしくはγサブドメイン、又は他のＲ型レクチンの糖認識ドメインを少なくとも１つ含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質。
- β-トレフォイル構造を有していることを特徴とする、請求項４に記載のタンパク質。
- 配列番号１７及び配列番号３０〜４３から選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のタンパク質。
- Ｒ型レクチンのβ-トレフォイル構造を形成する糖認識ドメイン中の少なくとも１つのサブドメインのアミノ酸配列において、EW29Chのαドメイン（EW29Ch-α）のアミノ酸配列（配列番号２）の１８位に対応するガラクトース結合部位であるアスパラギン酸を変更することなく、当該アスパラギン酸に続くループ内に存在する、EW29Ch-αのアミノ酸配列の２０位のグルタミン酸に対応する酸性又は中性アミノ酸が、塩基性アミノ酸に変異していることを特徴とする、ガラクトース６硫酸に結合活性を有するタンパク質。
- 前記サブドメインのアミノ酸配列が、配列番号２及び配列番号１９、２０、２３〜２５、２７および２８から選択されたいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のタンパク質。
- 請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
- 請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質を有効成分として含む、ガラクトース６硫酸含有糖鎖検出用試薬。
- ビーズ又は基板表面に固定化された、請求項１０に記載の試薬。
- 請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質を用いることを特徴とする、生物学的試料中に含まれるガラクトース６硫酸含有糖鎖を検出する方法。
- ビーズ又は基板表面に固定化された、請求項１〜８のいずれか１項に記載のタンパク質を用いることを特徴とする、ガラクトース６硫酸含有糖鎖を有する化合物を捕獲する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011176232A JP5846599B2 (ja) | 2011-08-11 | 2011-08-11 | ガラクトース６硫酸結合性タンパク質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2011176232A JP5846599B2 (ja) | 2011-08-11 | 2011-08-11 | ガラクトース６硫酸結合性タンパク質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2013039043A JP2013039043A (ja) | 2013-02-28 |
| JP5846599B2 true JP5846599B2 (ja) | 2016-01-20 |
Family
ID=47888083
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2011176232A Active JP5846599B2 (ja) | 2011-08-11 | 2011-08-11 | ガラクトース６硫酸結合性タンパク質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5846599B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016147514A1 (ja) * | 2015-03-17 | 2016-09-22 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 幹細胞を検出するための方法及びキット |
-
2011
- 2011-08-11 JP JP2011176232A patent/JP5846599B2/ja active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2013039043A (ja) | 2013-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6083649B2 (ja) | 未分化細胞検出方法及び複合糖質検出方法 | |
| Hwang et al. | Expression of functional recombinant mussel adhesive protein type 3A in Escherichia coli | |
| JP6360462B2 (ja) | グリカン特異的分析ツール | |
| EP3059250A1 (en) | Fusion protein for protein detection, and method for detecting protein | |
| JP6814043B2 (ja) | 炭水化物結合タンパク質 | |
| WO2010079739A1 (ja) | 全インフルエンザ菌の測定方法 | |
| JP2023011764A (ja) | レクチンの固定化方法 | |
| JP7270141B2 (ja) | シアル酸結合性ポリペプチド | |
| US20070243562A1 (en) | Lectins for Analyzing Sugar Chains and Method of Using the Same | |
| JP2010540953A (ja) | 膵炎、敗血症および膵臓癌のためのグリコシル化マーカー | |
| JP5669081B2 (ja) | 生体分子固定化担体および生体分子担体固定化方法 | |
| JP5846599B2 (ja) | ガラクトース６硫酸結合性タンパク質 | |
| JP6236864B2 (ja) | 癌の検出方法及び膵臓特異的リボヌクレアーゼ１を認識する抗体 | |
| JP2007502112A (ja) | ヘパリン結合タンパク質：ヘパリン検出のためのセンサー | |
| CN114524871B (zh) | 与含酪氨酸硫酸化修饰的肽具有高亲和力的变体sh2结构域 | |
| Li et al. | Recent advances in the fabrication and detection of lectin microarrays and their application in glycobiology analysis | |
| KR20170128457A (ko) | 줄기 세포를 검출하기 위한 방법 및 키트 | |
| US7329739B2 (en) | Use of lectin library for distinguishing glycoproteins or cells, diagnosing serum or cells, or fractionating glycoproteins or cells | |
| CN116359504B (zh) | Akap4截断蛋白在肺癌筛查中的应用 | |
| KR101871802B1 (ko) | 스테레움 힐슈튬 버섯 유래의 다중 퓨코실화 n-결합 글라이칸에 특이적으로 결합하는 렉틴 및 이의 용도 | |
| CN117701577A (zh) | 抗CLDN18.2全人源单克隆抗体Fab2片段的抗体对、试剂盒和应用 | |
| JP2004016227A (ja) | レクチンの固定化方法及び固定化されたレクチンを含むツール |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140312 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150602 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150730 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20151117 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20151118 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5846599 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |