KR20170128457A - 줄기 세포를 검출하기 위한 방법 및 키트 - Google Patents

줄기 세포를 검출하기 위한 방법 및 키트 Download PDF

Info

Publication number
KR20170128457A
KR20170128457A KR1020177029167A KR20177029167A KR20170128457A KR 20170128457 A KR20170128457 A KR 20170128457A KR 1020177029167 A KR1020177029167 A KR 1020177029167A KR 20177029167 A KR20177029167 A KR 20177029167A KR 20170128457 A KR20170128457 A KR 20170128457A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
sugar chain
lectin
group
detecting
Prior art date
Application number
KR1020177029167A
Other languages
English (en)
Inventor
히로아키 다테노
마사키 와라시나
마사카즈 후쿠다
가즈나리 히라야스
Original Assignee
내셔날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지
와코 쥰야꾸 고교 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 내셔날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지, 와코 쥰야꾸 고교 가부시키가이샤 filed Critical 내셔날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지
Publication of KR20170128457A publication Critical patent/KR20170128457A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5073—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H5/00—Compounds containing saccharide radicals in which the hetero bonds to oxygen have been replaced by the same number of hetero bonds to halogen, nitrogen, sulfur, selenium, or tellurium
    • C07H5/04—Compounds containing saccharide radicals in which the hetero bonds to oxygen have been replaced by the same number of hetero bonds to halogen, nitrogen, sulfur, selenium, or tellurium to nitrogen
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
    • G01N33/539—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody involving precipitating reagent, e.g. ammonium sulfate
    • G01N33/541—Double or second antibody, i.e. precipitating antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4724—Lectins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)

Abstract

특정한 당쇄 구조를 갖는 미분화 당쇄 마커에 기초하여 줄기 세포를 검출하는 방법에 있어서, 렉틴과 항체의 조합에 의한, 고감도의 「렉틴-항체 샌드위치법」으로서, 세포의 배양 상청 또는 용해물에 포함되는 포도칼릭신을 검출함으로써, 줄기 세포를 검출하는 방법이며, 상기 배양 상청 또는 용해물과, 하기 (식 1)
Figure pct00022

또는 하기 (식 2)
Figure pct00023

로 표시되는 당쇄에 결합성을 갖는 렉틴과, 케라탄황산에 결합성을 갖는 항체를 접촉시켜, 상기 렉틴과 포도칼릭신과 상기 항체로 구성되는 복합체를 형성시키는 수순과, 상기 복합체를 검출하는 수순을 포함하는 방법을 제공한다.

Description

줄기 세포를 검출하기 위한 방법 및 키트
본 발명은, 줄기 세포를 검출하기 위한 방법 및 키트에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 세포의 배양 상청 또는 용해물에 포함되는 포도칼릭신을 렉틴-항체 샌드위치법에 의해 검출함으로써 줄기 세포를 검출하는 방법 등에 관한 것이다.
인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포) 및 배아 줄기 세포(ES 세포) 등의 다분화능 줄기 세포(이하, 간단히 「줄기 세포」라고도 함)를 사용하는 재생 의료 기술의 과제의 하나는, 줄기 세포를 원하는 타입의 세포로 분화시킨 후에 환자의 체 내에 이식할 때, 줄기 세포가 미분화 상태 그대로 잔존하고, 분화된 세포와 함께 환자의 체 내에 이식되어, 환자의 체 내에서 종양화 또는 암화될 위험을 어떻게 방지할 것인가이다.
조종양성을 가질 우려가 있는 미분화 줄기 세포의 혼입을 평가하기 위하여 이용 가능한 기술로서, 특허문헌 1에는, 줄기 세포에 특이적인 당쇄를, 당해 당쇄에 결합성을 갖는 렉틴을 사용하여 검출함으로써, 세포의 분화 상태를 판정하는 방법이 개시되어 있다. 이 방법은, BC2LCN 렉틴이라 칭해지는 렉틴의 재조합 단백(rBC2LCN 렉틴)을 사용하여, 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」 및/또는 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」의 당쇄 구조를 갖는 미분화 당쇄 마커를 검출하는 것이다. 또한, rBC2LCN 렉틴은, 그램 음성 세균(Burkholderia cenocepacia) 유래의 BC2L-C 단백질의 N 말단 도메인에 대응한 BC2LCN 렉틴(GenBank Accession No. YP_002232818)을 형질 전환 대장균에서 발현시킨 재조합 단백이며, 상기 당쇄 구조를 인식하는 것이다.
또한, 특허문헌 2에는, 줄기 세포의 배양 상청 중의 상기 당쇄를, rBC2LCN 렉틴을 사용하여 검출함으로써, 분화 유도 처리 후에 잔존하는 미분화나 줄기 세포를 검출하는 방법이 개시되어 있다. 특허문헌 2는, 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」 및/또는 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」의 당쇄 구조를 갖는 미분화 당쇄 마커로서, 복합 당질인 포도칼릭신(Podocalyxin)을 동정하고 있다.
국제 공개 제2013/128914호 국제 공개 제2013/065302호 국제 공개 제2012/147992호
J. Am. Soc. Nephrol., 2009, Vol.20, No.8, p.1669-1676. Structure, 2010, Vol.18, No.1, p.59-72. Glycobiology, 2013, Vol.23, No.3, p.322-336. J. Biol. Chem., 2011, Vol.286, No.23, p.20345-20353. Stem Cells, 2007, Vol.25, p.723-730. Cancer Research, 1999, Vol.59, p.4715-4719. Glycobiology, 2011, Vol.21, No.9, p.1125-1130. Scientific Reports, 2014, Vol.4, p.4069.
상기 특허문헌 2에는, 적합한 일 실시 형태로서, 줄기 세포의 배양 상청 중의 미분화 당쇄 마커를, 기판에 고정화한 렉틴(rBC2LCN 렉틴)에 의해 포착하여, 렉틴과 미분화 당쇄 마커의 복합체를 형성시키고, 이 복합체에 라벨화한 다른 렉틴 또는 항체를 반응시킴으로써 미분화 당쇄 마커의 검출을 행하는 「샌드위치법」이 개시되어 있다.
특허문헌 2는, rBC2LCN 렉틴과의 조합으로 「렉틴-렉틴 샌드위치법」에 제공되는 것이 가능한 렉틴으로서 SRL, CGL2, ABA, XCL이라 칭해지는 4개의 렉틴이 예시되어 있다.
본 발명은, 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」 및/또는 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」의 당쇄 구조를 갖는 미분화 당쇄 마커(포도칼릭신)에 기초하여 줄기 세포를 검출하는 방법에 있어서, 렉틴과 항체의 조합에 의한, 고감도의 「렉틴-항체 샌드위치법」을 제공하는 것을 주된 목적으로 한다.
상기 과제 해결을 위하여, 본 발명은, 이하의 [1] 내지 [17]을 제공한다.
[1] 세포의 배양 상청 또는 용해물에 포함되는 포도칼릭신을 검출함으로써, 줄기 세포를 검출하는 방법이며,
상기 배양 상청 또는 용해물과, 하기 (식 1):
Figure pct00001
(R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타낸다. R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타낸다.)
또는 하기 (식 2):
Figure pct00002
(R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타낸다. R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타낸다.)
로 표시되는 당쇄에 결합성을 갖는 렉틴과, 케라탄황산에 결합성을 갖는 항체를 접촉시켜, 상기 렉틴과 포도칼릭신과 상기 항체로 구성되는 복합체를 형성시키는 수순과,
상기 복합체를 검출하는 수순을 포함하는 방법.
[2] 상기 항체가 저황산화 케라탄황산에 결합성을 갖는 항체인, [1]의 방법.
[3] 상기 항체가 Gal-GlcNAc(6S) 또는 그의 탠덤 리피트를 에피토프에 포함하는, [1] 또는 [2]의 방법.
[4] 상기 항체가, 하이브리도마 R-10G(기탁 번호: FERM BP-11301)가 산생하는 항체 또는 해당 항체와 경합하는 항체인, [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 방법.
[5] 상기 세포가 혈청 함유 배지로 배양된 세포인, [1] 내지 [4] 중 어느 하나의 방법.
[6] 상기 렉틴이,
서열 번호 1에 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질, 또는 당해 아미노산 서열의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 상기 (식 1) 또는 (식 2)로 표시되는 당쇄에 결합성을 갖는 단백질인, [1] 내지 [5] 중 어느 하나의 방법.
[7] 상기 배양 상청 또는 용해물과 상기 렉틴을 접촉시켜, 해당 렉틴과 상기 배양 상청 또는 용해물에 포함되는 포도칼릭신으로 구성되는 제1 복합체를 형성시키는 수순과,
제1 복합체와 상기 항체를 접촉시켜, 상기 렉틴과 포도칼릭신과 해당 항체로 구성되는 제2 복합체를 형성시키는 수순을 포함하는, [1] 내지 [6]의 방법.
[8] 상기 렉틴이 불용성 담체에 결합되는, [7]의 방법.
[9] 세포의 배양 상청 또는 용해물에 포함되는 하기 (식 1):
Figure pct00003
(R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타낸다. R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타낸다.)
또는 하기 (식 2):
Figure pct00004
(R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타낸다. R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타낸다.)
로 표시되는 당쇄를 검출함으로써, 줄기 세포를 검출하는 방법이며,
상기 배양 상청 또는 용해물과, 상기 당쇄에 결합성을 갖는 렉틴과, 케라탄황산에 결합성을 갖는 항체를 접촉시켜, 상기 렉틴과 상기 당쇄와 상기 항체를 포함하여 이루어지는 복합체를 형성시키는 수순과,
상기 복합체를 검출하는 수순을 포함하는 방법.
[10] 상기 복합체의 유무 또는 검출량에 기초하여 상기 세포에 포함되는 줄기 세포의 유무 또는 존재량을 판정하는 수순을 더 포함하는, [1] 내지 [9] 중 어느 하나의 방법.
[11] 상기 복합체의 유무 또는 검출량에 기초하여 상기 세포의 분화 상태를 판정하는 수순을 더 포함하는, [1] 내지 [9] 중 어느 하나의 방법.
[12] 세포의 배양 상청 또는 용해물에 포함되는 포도칼릭신을 검출하는 방법이며, 상기 배양 상청 또는 용해물과, 하기 (식 1):
Figure pct00005
(R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타낸다. R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타낸다.)
또는 하기 (식 2):
Figure pct00006
(R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타낸다. R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타낸다.)
로 표시되는 당쇄에 결합성을 갖는 렉틴과, 케라탄황산에 결합성을 갖는 항체를 접촉시켜, 상기 렉틴과 포도칼릭신과 상기 항체로 구성되는 복합체를 형성시키는 수순과,
상기 복합체를 검출하는 수순을 포함하는 방법.
[13] 세포의 배양 상청 또는 용해물에 포함되는 포도칼릭신을 검출함으로써, 해당 세포에 포함되는 줄기 세포를 검출하기 위한 키트이며,
하기 (식 1):
Figure pct00007
(R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타낸다. R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타낸다.)
또는 하기 (식 2):
Figure pct00008
(R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타낸다. R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타낸다.)
로 표시되는 당쇄에 결합성을 갖는 렉틴과,
케라탄황산에 결합성을 갖는 항체를 포함하는 키트.
[14] 상기 항체가 저황산화 케라탄황산에 결합성을 갖는 항체인, [13]의 키트.
[15] 상기 항체가 Gal-GlcNAc(6S) 또는 그의 탠덤 리피트를 에피토프에 포함하는, [13] 또는 [14]의 키트.
[16] 상기 항체가, 하이브리도마 R-10G(기탁 번호: FERM BP-11301)가 산생하는 항체 또는 해당 항체와 경합하는 항체인, [13] 내지 [15] 중 어느 하나의 키트.
[17] 상기 렉틴이 불용성 담체에 결합되어 있는, [13] 내지 [16] 중 어느 하나의 키트.
포도칼릭신(Podocalyxin)은, 1형 막관통형 당단백질로, 상피성 사구체 세포(족세포)로부터 동정되고, 사구체의 기능 및 형태의 유지에 있어서 중요한 역할을 하는 것 외에, 각종 암의 발달에도 관계하고 있는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 1 참조). 본 발명에 있어서 「포도칼릭신」이라는 용어는, 상기 (식 1) 및/또는 (식 2)의 당쇄 구조를 갖는 한에 있어서, 포도칼릭신의 전체 길이 단백질 및 그의 부분 단편 중 어느 것을 포함하는 것으로 한다.
또한, 본 발명에 있어서 「당쇄」란, 단당이 글리코시드 결합에 의해 쇄상(직쇄 또는 수상(樹狀)으로 분지된 분지쇄)에 연결된 구조를 갖는 1군의 화합물을 의미한다. 당쇄를 구성하는 단당으로서는, 글루코오스(Glc), 갈락토오스(Gal), 만노오스 등의 헥소오스; L-푸코오스(Fuc) 등의 데옥시키소오스; N-아세틸글루코사민(GlcNAc), N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 등의 헥소사민; N-아세틸뉴라민산, N-글리코릴뉴라민산 등의 시알산; 크실로오스, L-아라비노오스 등의 펜토오스 등을 들 수 있다. 「당쇄」를 구성하는 단당의 수는, 특별히 한정되지 않고 2 내지 수만 정도이다.
본 발명에 있어서 「렉틴」이란, 당단백질, 당지질, 프로테오글리칸, 글리코펩티드, 리포다당, 펩티도글리칸 및 스테로이드 화합물 등의 배당체 등의 복합 당질에 결합한 당쇄의 부분 구조 또는 전체 구조를 인식하여, 결합하는 단백질을 의미한다.
본 발명에 의해, 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」 및/또는 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」의 당쇄 구조를 갖는 미분화 당쇄 마커(포도칼릭신)에 기초하여 줄기 세포를 검출하는 방법에 있어서, 렉틴과 항체의 조합에 의한, 고감도의 「렉틴-항체 샌드위치법」이 제공된다.
도 1은, 본 발명에 따른 렉틴-항체 샌드위치법에 의한 줄기 세포의 검출 방법을, 종래 기술에 관한 렉틴-렉틴 샌드위치법과 비교하여, 평가한 결과를 나타내는 그래프이다(시험예 1).
도 2는, 본 발명에 따른 렉틴-항체 샌드위치법에 의한 줄기 세포의 검출 방법을, 각종 항체를 사용한 렉틴-항체 샌드위치법과 비교하여, 평가한 결과를 나타내는 그래프이다(시험예 1).
도 3은, 본 발명에 따른 렉틴-항체 샌드위치법에 의한 줄기 세포의 검출 방법을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다(시험예 1).
도 4는, 본 발명에 따른 렉틴-항체 샌드위치법에 의해, 상이한 종류의 배지에서 배양한 줄기 세포의 검출을 행한 결과(StemSure hPSC 배지Δ)를 나타내는 그래프이다(시험예 2).
도 5는, 본 발명에 따른 렉틴-항체 샌드위치법에 의해, 상이한 종류의 배지에서 배양한 줄기 세포의 검출을 행한 결과(mTeSR1 배지)를 나타내는 그래프이다(시험예 2).
도 6은, 본 발명에 따른 렉틴-항체 샌드위치법에 의해, 상이한 종류의 배지에서 배양한 줄기 세포의 검출을 행한 결과(MEF-CM)를 나타내는 그래프이다(시험예 2).
도 7은, 본 발명에 따른 렉틴-항체 샌드위치법에 의해, 상이한 종류의 배지에서 배양한 줄기 세포의 검출을 행한 결과(TeSR-E8 배지)를 나타내는 그래프이다(시험예 2).
도 8은, 본 발명에 따른 렉틴-항체 샌드위치법에 의한 줄기 세포의 검출 방법을 평가한 결과를 나타내는 그래프이다(시험예 3).
이하, 본 발명을 실시하기 위한 적합한 형태에 대하여 설명한다. 또한, 이하에 설명하는 실시 형태는, 본 발명의 대표적인 실시 형태의 일례를 나타낸 것이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 좁게 해석되는 일은 없다.
1. 줄기 세포의 검출 방법
본 발명에 따른 줄기 세포의 검출 방법은, 세포의 배양 상청 또는 용해물에 포함되는 하기 (식 1):
Figure pct00009
(R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타낸다. R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타낸다.)
또는 하기 (식 2):
Figure pct00010
(R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타낸다. R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타낸다.)
로 표시되는 당쇄를 검출함으로써, 줄기 세포의 검출을 행하는 것이다.
구체적으로는, 상기 배양 상청 또는 용해물과, 상기 당쇄에 결합성을 갖는 렉틴과, 케라탄황산에 결합성을 갖는 항체를 접촉시켜, 상기 렉틴과 상기 당쇄와 상기 항체를 포함하여 이루어지는 복합체를 형성시키는 수순과, 상기 복합체를 검출하는 수순에 의해, 줄기 세포의 검출을 행한다.
(식 1) 및 (식 2)로 표시되는 당쇄 구조는, 미분화 세포의 세포 표면 및 배양 상청 중에 특이적으로 존재하고, 포도칼릭신에서 유래되는 것이 밝혀져 있다(특허문헌 1, 2 참조). 따라서, 본 발명에 따른 줄기 세포의 검출 방법은, 더욱 구체적으로는, 세포의 배양 상청 또는 용해물에 포함되는 포도칼릭신을 검출함으로써, 줄기 세포를 검출하는 방법이며, 상기 배양 상청 또는 용해물과, (식 1) 또는 (식 2)로 표시되는 당쇄에 결합성을 갖는 렉틴과, 케라탄황산에 결합성을 갖는 항체를 접촉시켜, 상기 렉틴과 포도칼릭신과 상기 항체로 구성되는 복합체를 형성시키는 수순과, 상기 복합체를 검출하는 수순을 포함하는 방법이다.
[당쇄 구조]
상기 (식 1)은 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」의 당쇄 구조를 나타낸다. GlcNAc의 4위의 위치의 수산기는, 단당(바람직하게는 푸코오스) 또는 분기된 또는 분기되지 않은 올리고 당쇄(바람직하게는 2 내지 5의 당을 포함하는 당쇄)로 치환되어 있어도 된다. 또한, 당해 당쇄 구조는, 줄기 세포 표면에서는, 막 구성 성분으로서, GlcNAc의 1위의 위치에서 당단백질, 당지질 및 당류 등의 비환원 말단에 결합되어 있는 당쇄이기 때문에, GlcNAc의 1위의 위치에, OH기, 또는 다른 당류, 단백질, 지질, 또는 기타 분자의 비환원 말단이 결합되어 있어도 된다.
상기 (식 2)는, 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」의 당쇄 구조를 나타낸다. GalNAc의 1위의 위치의 수산기는, 단당(바람직하게는 푸코오스) 또는 분기된 또는 분기되지 않은 올리고 당쇄(바람직하게는 2 내지 5의 당을 포함하는 당쇄)로 치환되어 있어도 된다. 또한, 당해 당쇄 구조는, 줄기 세포 표면에서는, 막 구성 성분으로서, GalNAc의 1위의 위치에서 당단백질, 당지질 및 당류 등의 비환원 말단에 결합되어 있는 당쇄이기 때문에, GalNAc의 1위의 위치에, OH기, 또는 다른 당류, 단백질, 지질, 또는 기타 분자의 비환원 말단이 결합되어 있어도 된다.
[렉틴]
(식 1) 또는 (식 2)로 표시되는 당쇄에 결합성을 갖는 렉틴에는, BC2LCN 렉틴 또는 그의 개변체가 바람직하게 사용된다. BC2LCN 렉틴의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타낸다. 렉틴에는, 서열 번호 1에 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질에 더하여, 당해 아미노산 서열의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, (식 1) 또는 (식 2)로 표시되는 당쇄에 결합성을 갖는 단백질(BC2LCN 렉틴 개변체)도 바람직하게 사용된다. 또한, 이들 렉틴에 더하여, (식 1) 및/또는 (식 2)로 표시되는 당쇄를 인식하는 렉틴이라면 특별히 한정되지 않고 사용될 수 있다.
BC2LCN 렉틴은, 그램 음성 세균(Burkholderia cenocepacia) 유래의 BC2L-C 단백질의 N 말단 도메인이다(비특허문헌 2 참조). (식 1) 또는 (식 2)로 표시되는 당쇄에 결합성을 갖는 렉틴에는, 이 BC2LCN 렉틴을 대장균에서 발현시킨 재조합 단백질(rBC2LCN 렉틴)을 적합하게 사용할 수 있다. rBC2LCN 렉틴은, 형질 전환 세균에 의해 대량 생산 가능하다. 구체적으로는, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 BC2LCN 유전자를 발현 벡터에 삽입하여 숙주 세포에 도입 발현시키고, 필요에 따라 단백질의 정제를 행함으로써 rBC2LCN 렉틴을 제조한다.
BC2LCN 렉틴 및 rBC2LCN 렉틴 및 이들의 개변체는, (식 1) 또는 (식 2)로 표시되는 당쇄에의 결합을 갖는 한, 서열 번호 1의 아미노산 서열의 전체 길이를 포함하는 것을 필요로 하지 않고, 또한 서열 번호 1에 있어서 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 부가되어 있어도 된다. 여기서, 수개란 20개 이하, 바람직하게는 10개 이하, 보다 바람직하게는 5개 이하의 자연수를 나타낸다.
[항체]
케라탄황산에 결합성을 갖는 항체에는, 하이브리도마 R-10G(기탁 번호: FERM BP-11301)가 산생하는 IgG 항체가 바람직하게 사용된다. 하이브리도마 R-10G가 산생하는 항체(이하, 「R-10G 항체」라고도 함)는, 특허문헌 3에 기재되어 있다. R-10G 항체는, 인간 iPS 세포를 면역원으로 하여 제작한 하이브리도마를, 인간 iPS 세포 양성이면서 인간 태아성 암 세포 음성을 지표로 하여 스크리닝하고 얻어진 모노크로날 항체이다. R-10G 항체의 에피토프는, 황산화도가 낮은 케라탄황산이며(황산화도가 높은 케라탄황산에는 반응하지 않음), 당해 에피토프의 폴리펩티드 부분은, 포도칼릭신인 것이 밝혀져 있다(비특허문헌 3 참조). 또한, 비특허문헌 3에 의하면, R-10G 항체의 에피토프에는, 「Gal-GlcNAc(6S)」 또는 그의 탠덤 리피트가 포함된다고 되어 있다. R-10G 항체는, 특허문헌 3에 기재된 방법에 따라서 제조할 수도 있지만, 시판되는 것(예를 들어, 코스모·바이오 가부시키가이샤, RIT-M001)을 사용해도 된다.
추가로, 케라탄황산은, 「Gal-GlcNAc(6S)」의 반복 구조를 포함하고, 「Gal-GlcNAc(6S)」 중의 Gal이 황산화 부위가 된다. 상기 황산화도는, 이 Gal의 황산화 정도를 의미하는 것이다.
케라탄황산에 결합성을 갖는 항체에는, R-10G 항체에 더하여, 해당 항체와 경합하는 항체도 사용할 수 있다. R-10G 항체와 경합하는 항체란, 케라탄황산과의 결합에 있어서 R-10G 항체와 경합하는 항체, 즉 R-10G 항체가 결합하는 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 의미한다. R-10G 항체와 경합하는 항체는, 종래 공지된 경합적 결합 분석을 사용하여, R-10G 항체의 포도칼릭신에의 결합에 대하여 후보 항체가 경합하는(즉, 후보 항체가 R-10G 항체와 포도칼릭신의 결합을 방해함) 것을 확인함으로써 취득할 수 있다. 이 경합적 결합 분석에 의하면, R-10G 항체의 구체적인 에피토프가 결정되어 있지 않아도 경합 항체를 취득할 수 있지만, 경합 항체는, 저황산화 케라탄황산을 에피토프로 하고, 특히 Gal-GlcNAc(6S) 또는 그의 탠덤 리피트를 에피토프에 포함하는 항체인 것이 바람직하다.
또한, 케라탄황산에 결합성을 갖는 항체에는, R-10G 항체 및 해당 항체와 경합하는 항체에 더하여, 케라탄황산, 바람직하게는 저황산화 케라탄황산을 인식하는 항체라면 특별히 한정되는 일없이 사용될 수 있다.
여기서, 본 발명에 있어서 「항체」라는 용어에는, 「항체의 기능성 단편」도 포함되는 것으로 한다. 「항체의 기능성 단편」이란, 항원과의 결합 활성을 갖는 항체의 부분 단편을 의미하고 있으며, Fab, F(ab')2, scFv 등을 포함한다. 또한, F(ab')2를 환원 조건 하에서 처리한 항체의 가변 영역의 1가의 단편인 Fab'도 항체의 기능성 단편에 포함된다. 단, 항원과의 결합능을 갖고 있는 한 이들 분자에 한정되지 않는다. 기능성 단편에는, 항체 단백질의 전체 길이 분자를 적당한 효소로 처리한 것뿐만 아니라, 유전자 공학적으로 개변된 항체 유전자를 사용하여 적당한 숙주 세포에 있어서 산생된 단백질도 포함된다.
[줄기 세포]
「줄기 세포」는, 일반적으로, 미분화 상태를 유지한 채 증식할 수 있는 「자기 재생능」과, 삼배엽 계열 모두로 분화할 수 있는 「분화 다능성」을 갖는 미분화 세포라고 정의되어 있다. 본 발명에 따른 검출 방법이 검출의 대상으로 하는 줄기 세포(다분화능 줄기 세포)는, 자기 재생능 및 분화 다능성을 갖는 미분화 세포이며, 적어도 다능성 줄기 세포(pluripotent stem cell) 및 복능성 줄기 세포(multipotent stem cell)를 포함한다. 줄기 세포로서는, 특히, 배아 줄기 세포(Embryonic stem cell: ES 세포) 및 체세포에 초기화 인자를 도입하여 얻어지는 유도성 다능성 줄기 세포(induced pluripotent cell: iPS 세포) 등의 다능성 줄기 세포를 들 수 있다. 또한, 복능성 줄기 세포는, 중간엽 줄기 세포, 조혈계 줄기 세포, 신경계 줄기 세포, 골수 줄기 세포 및 생식 줄기 세포 등의 체성 줄기 세포 등을 포함한다. 본 발명에 있어서, 간단히 「세포」라고 기재하는 경우에는, 줄기 세포와 분화 세포(체세포)의 양쪽을 포함하는 의미로 사용하는 것으로 한다.
세포의 유래종은 특별히 한정되지 않고, 인간, 원숭이, 돼지, 소, 염소, 양, 마우스, 래트 등이어도 된다.
[배양 상청·용해물]
(식 1) 및/또는 (식 2)로 표시되는 당쇄 구조는, 미분화 세포의 세포 표면 및 배양 상청 중에 특이적으로 존재하는 것이 명확해지고 있기 때문에(특허문헌 1, 2 참조), 본 발명에 따른 줄기 세포의 검출 방법에 있어서, 줄기 세포의 검출을 위해 사용되는 샘플은, 세포의 용해물이어도 배양 상청이어도 된다.
세포의 배양 상청 및 용해물은, 종래 공지된 방법을 따라서 제조할 수 있다. 용해물은, 물리적으로 세포를 파쇄하는 방법 또는 화학적으로 세포를 가용화시키는 방법에 의해 제조할 수 있다. 단백질이 열 변성을 일으키지 않고, 단백질이 실활되지 않으며, 단백질의 회수율이 높고, 조작이 간편한 등의 점에서, 계면 활성제를 사용하여 세포를 가용화시키는 방법이 바람직하다.
예를 들어, 5×106 내지 5×107 세포의 세포 펠릿에, 계면 활성제를 함유하는 세포 용해제를 첨가하여, 세포를 현탁시킨 후 1 내지 10분간 빙상에서 반응시킨다. 그 후 20,000×g으로 15분간 정도 원심 처리하여, 얻어진 상청을 세포 라이세이트로서 사용하면 된다.
세포 용해제에는, 통상의 분야에서 사용되는 세포 용해제로서의 계면 활성제를 첨가한, 적당한 염(KCl, NaCl 등)이나 DTT 등의 환원제를 포함하는 완충액이 사용된다. 완충액으로서는, pH 5.0 내지 10.0, 바람직하게는 pH 7.0 내지 8.0의 중성 부근에 완충 작용을 갖는 인산 완충액, 트리스 완충액, 굿 완충액, 글리신 완충액, 붕산 완충액 등이 바람직하다. 또한, 완충액 내의 완충제 농도는, 통상 10 내지 500mM, 바람직하게는 10 내지 100mM의 범위로부터 적절히 선택된다. 염의 농도는, 통상 100 내지 200mM이다. 계면 활성제는, 세포의 종류나 사용되는 완충액의 pH나 염 농도 등의 조건에 따라 적절히 선택하면 된다. 예를 들어 NP-40, 폴리(옥시에틸렌)노닐페닐에테르(와코 쥰야꾸 고교 가부시키가이샤), TritonX-100, 디기토닌 등을 들 수 있다. 농도는, 완충액 전량에 대하여 통상 0.01 내지 1.0％ 정도이면 된다.
배양 상청 및 용해물은 혈청을 함유하고 있어도 된다. 본 발명에 따른 줄기 세포의 검출 방법에 의하면, 혈청 함유 배지에서 배양된 세포의 배양 상청 및 용해물을 사용한 경우에도, 줄기 세포의 존재를 고감도로 검출하는 것이 가능하다(시험예 1 참조).
배지에는, 종래, 줄기 세포의 미분화 유지 및 분화 유도를 위해 사용되고 있는 배지를 사용하면 된다. 예를 들어, StemSure(등록 상표) hPSC medium(와코 쥰야꾸 고교 가부시키가이샤), Nutristem(등록 상표)(Biological Industries Ltd), ReproFF(ReproCELL), TeSRTM-E8TM(STEMCELL Technologies), Essential 8TM Medium(Life Technologies), StemPro(등록 상표) hESC SFM(Life Technologies) 및 mTeSR1(STEMCELL Technologies) 등을 사용할 수 있다.
혈청은, 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 송아지 혈청(CS), 소태아 혈청(FBS), 인간 유래 혈청, 소 유래 혈청, 양 유래 혈청, 염소 유래 혈청, 원숭이 유래 혈청, 말 유래 혈청, 래트 유래 혈청, 마우스 유래 혈청, 토끼 유래 혈청, 햄스터 유래 혈청, 모르모트 유래 혈청, 돼지 유래 혈청, 새(닭) 유래 혈청, 개 유래 혈청, 고양이 유래 혈청 등이 사용된다. 배양 상청 및 용해물 중의 혈청 농도는, 배지로의 혈청의 첨가 농도에 따라서 변화될 수 있다. 통상의 줄기 세포의 유지 배양 또는 분화 배양에 있어서의, 배지로의 혈청의 첨가 농도는, 0.5 내지 20％(v/v) 정도이다.
배양 상청 및 용해물은, 정제 공정을 거치지 않고 그대로, 또는 희석하거나, 또는 미리 항체나 렉틴 등으로 농축하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 줄기 세포의 검출 방법은 고감도이기 때문에, 배양 상청에서 0.1 내지 10μl 정도의 양으로, 피코모랄(pM) 또는 나노모랄(nM) 레벨의 (식 1) 및 (식 2)로 표시되는 당쇄를 검출할 수 있다.
[렉틴-항체 샌드위치법]
본 발명에 따른 줄기 세포의 검출 방법의 수순에는, 배양 상청 또는 용해물(이하 「배양 상청 등」이라고도 함)과 렉틴과 케라탄황산에 결합성을 갖는 항체를 접촉시켜 렉틴과 포도칼릭신과 항체로 구성되는 복합체를 형성시키는 복합체 형성 수순과, 복합체를 검출하는 검출 수순이 포함된다. 이하, rBC2LCN 렉틴 및 R-10G 항체를 사용하는 경우를 예로 들어 구체적으로 설명한다.
복합체 형성 수순에서는, rBC2LCN 렉틴과 R-10G 항체를 동시에 배양 상청 등과 접촉시켜도 되지만, 배양 상청 등과 rBC2LCN 렉틴을 접촉시킨 후에 R-10G 항체를 반응시키는 것이 보다 바람직하다. 즉, 복합체 형성 수순은, 배양 상청 등과 렉틴을 접촉시켜, rBC2LCN 렉틴과 배양 상청 등에 포함되는 포도칼릭신으로 구성되는 제1 복합체를 형성시키는 제1 수순과, 제1 복합체와 R-10G 항체를 접촉시켜, rBC2LCN 렉틴과 포도칼릭신과 R-10G 항체로 구성되는 제2 복합체를 형성시키는 제2 수순을 포함하는 것이 바람직하다.
복합체 형성 수순은, B/F 분리를 행하지 않는 호모지니어스 방법으로 행해도 되지만, 불용성 담체를 사용하여 B/F 분리를 행하는 헤테로지니어스 방법으로 행하는 것이 보다 바람직하다.
배양 상청 등의 양, 및 이들과 반응시키는 렉틴 및 항체의 양(농도)은, 세포의 종류, 요구되는 측정 감도, 사용되는 측정 방법이나 측정 장치 등에 따라 적절히 설정된다.
불용성 담체를 사용하여 B/F 분리를 행하는 방법은, 예를 들어 불용성 담체에 결합한 rBC2LCN 렉틴과, 불용성 담체에 결합되어 있지 않은 R-10G 항체와, 배양 상청 등을 접촉시켜 복합체를 형성시킴으로써 행해진다. 보다 구체적으로는, B/F 분리를 행하는 방법은, 배양 상청 등과, 불용성 담체에 결합한 rBC2LCN 렉틴을 접촉시켜, rBC2LCN 렉틴과 포도칼릭신으로 구성되는 제1 복합체를 얻는 제1 수순과, 제1 복합체와 유리(遊離)의 R-10G 항체를 접촉시켜, rBC2LCN 렉틴과 포도칼릭신과 R-10G 항체로 구성되는 제2 복합체를 얻는 제2 수순에 의해 행해진다.
B/F 분리를 위한 불용성 담체에는, 슬라이드 글래스, ELISA 플레이트(마이크로 플레이트), 자기 비즈, 필터, 필름, 멤브레인 등, 통상의 단백질 고정화법에 사용되는 기재를 사용할 수 있다. 기재의 재료에는, 통상, 유리, 실리콘, 폴리카르보네이트, 폴리스티렌 또는 폴리우레탄 등이 사용된다.
렉틴을 불용성 담체에 고정화시키는 방법은, 특별히 한정되지 않고, 화학적 결합법(공유 결합에 의해 고정화하는 방법), 물리적으로 흡착시키는 방법 등의 공지된 방법을 적용할 수 있다. 아비딘-비오틴 반응과 같은 매우 견고한 결합 반응을 이용하여 렉틴을 불용성 담체에 고정화하는 것도 가능하다. 이 경우, 렉틴에 비오틴을 결합한 비오틴화 렉틴을, 스트렙트아비딘을 코팅한 스트렙트아비딘 플레이트에 고정화하면 된다. 또한, 이 분야에서 통상 사용되는 각종 링커를 통해, 렉틴을 불용성 담체에 고정화시켜도 된다.
불용성 담체를 사용하여 B/F 분리를 행하는 방법에서는, 배양 상청 등과 불용성 담체에 고정화된 rBC2LCN 렉틴을 반응시키는 제1 수순 후, 제1 복합체와 유리의 R-10G 항체를 반응시키는 제2 수순을 행하기 전에, 고상 표면 상으로부터 불필요한 물질을 제거하기 위한 세정 수순을 포함해도 된다. 또한, 제2 수순 후, 검출 수순을 행하기 전에도, 세정 수순을 포함해도 된다. 세정 수순에 의해, 고상 표면 상으로부터 시료 중의 협잡물이나 미반응 R-10G 항체를 제거하고, 제2 복합체만을 고상 표면 상에 분리할 수 있다.
B/F 분리를 행하지 않는 방법에서는, rBC2LCN 렉틴과 포도칼릭신과 R-10G 항체의 복합체를 분리하기 위한 방법으로서, 예를 들어 크로마토그래피법, 고속 액체 크로마토그래피법, 전기 영동법, 모세관 전기 영동법, 모세관 칩 전기 영동법, 예를 들어 LiBASys(시마즈 세이사쿠쇼 가부시끼가이샤 제조) 등의 자동 면역 분석 장치를 사용한 방법 등을 적용할 수 있다.
검출 수순은, 표지 물질을 사용하여 rBC2LCN 렉틴과 포도칼릭신과 R-10G 항체로 구성되는 제2 복합체를 검출함으로써 행할 수 있다. 표지 물질로서는, 예를 들어 통상의 면역 측정법 등에 있어서 사용되는 효소류, 방사성 동위 원소, 형광성 물질, 발광성 물질, DNA, RNA, 조효소 또는 조효소와 특이적으로 결합하는 것(비오틴, 아비딘), 태그, 자외부 내지 적외부에 흡수를 갖는 물질, 발색성 미립자, 형광성 미립자, 금속성 미립자, 자성 물질, 스핀 라벨화제로서의 성질을 갖는 물질 등, 통상의 분야에서 사용되고 있는 표지 물질을 들 수 있다.
표지 물질을 rBC2LCN 렉틴 및/또는 R-10G 항체, 바람직하게는 R-10G 항체에 결합시키기 위해서는, 예를 들어 통상의 면역 측정법 등에 있어서 행해지고 있는 표지 방법을 적절히 이용하여 행하면 된다. 또한, 1개 또는 수개의 아미노산을 통해, 또는 1개 또는 수개의 아미노산과 링커를 통해, 항체에 표지 물질을 결합시키는 방법도 채용할 수 있다. 또한, 표지 물질을 단백질에 결합시키는 키트도 각종 시판되고 있으므로, 그들을 사용하여, 키트에 첨부된 사용 설명서를 따라서 표지를 행해도 된다.
예를 들어, 불용성 담체에 고정화한 rBC2LCN 렉틴과, 표지 물질로서 서양 고추냉이 퍼옥시다아제(HRP)를 표지한 유리의 R-10G 항체를 사용하여 B/F 분리를 행하는 방법은, 개략 이하와 같다.
배양 상청 등을, rBC2LCN 렉틴을 고정화한 불용성 담체에 접촉시키고, 4 내지 40℃에서 3분 내지 20시간, 반응을 행하여, 고상 표면 상에 rBC2LCN 렉틴과 포도칼릭신의 제1 복합체를 생성시킨다. 이어서, HRP로 표지한 R-10G 항체를 함유하는 용액을 고상 표면 상에 첨가하여 4 내지 40℃에서 3분 내지 16시간 반응시켜, 고정화 rBC2LCN 렉틴-포도칼릭신-표지 R-10G 항체의 제2 복합체를 생성시킨다. 계속해서, 적당한 농도의 TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 용액을 첨가하여, 일정 시간 반응시킨다. 그 후, 1M 황산 등의 반응 정지액을 첨가하여 반응을 정지시키고, 450nm의 흡광도를 측정한다. 얻어진 측정값과, 미리 농도 기지(旣知)의 포도칼릭신의 용액에 대하여 동일한 측정을 행하여 얻은 검량선으로부터, 배양 상청 등 중의 포도칼릭신(또는, 포도칼릭신 상의 (식 1) 또는 (식 2)로 표시되는 당쇄)의 양을 구할 수 있다.
또한, 예를 들어 알렉사 플루오르-488 테트라플루오로페닐 에스테르(Alexa Fluor-488 tetrafluorophenyl ester) 등으로 표지한 rBC2LCN 렉틴과, 예를 들어 알렉사 플루오르-647 숙신이미딜 에스테르(Alexa Fluor-647 succinimidyl ester) 등으로 표지한 R-10G 항체를 사용하고, 공지된 형광 상호 상관 분광법(Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCCS)을 따라서 (식 1) 또는 상기 (식 2)로 표시되는 당쇄를 측정할 수도 있다.
또한, 「rBC2LCN 렉틴-포도칼릭신-R-10G 항체」의 복합체의 검출은, 표지 물질을 사용하지 않고, 예를 들어 복합체에서 유래되는 성질을 이용하여 측정하는 방법, 구체적으로는 표면 프라즈몬 공명 등의 호모지니어스 면역 검정계 등의 방법에 의해서도 행하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명에 따른 렉틴-항체 샌드위치법은, 용수(用手)법에 한정되지 않고, 자동 분석 장치를 사용한 측정계에 적용하여 용이하면서 신속하게 측정을 행할 수도 있다. 용수법 또는 자동 분석 장치를 사용하여 측정을 행하는 경우의 시약류 등의 조합 등에 대해서는, 특별히 제한은 없고, 적용하는 자동 분석 장치의 환경이나 기종에 따라서, 또는 다른 요인을 고려하여 가장 좋다고 생각되는 시약류 등의 조합을 선택하여 사용하면 된다. 또한, 본 발명에 따른 렉틴-항체 샌드위치법은, Micro-TAS(Micro-Total Analysis Systems: μ-TAS, μ 종합 분석 시스템)로의 응용도 가능하다.
[응용]
(식 1) 및 (식 2)로 표시되는 당쇄 구조는, 미분화 세포의 세포 표면 및 배양 상청 중에 특이적으로 존재하는 점에서, 본 발명에 따른 검출 방법에 의해, 세포의 배양 상청 등에 포함되는 포도칼릭신 상의 당해 당쇄를 검출함으로써, 세포 중에 존재하는 줄기 세포의 유무를 검출할 수 있다. 또한, 당해 당쇄를 정량적으로 검출하면, 세포 중의 줄기 세포의 존재량을 판정할 수도 있다.
예를 들어, 미분화 상태를 유지하는 배양(유지 배양)을 행하고 있는 줄기 세포의 배양 상청 등을 마이크로 피펫 등으로 일정량 채취하고, 본 발명에 따른 검출 방법에 의해, 포도칼릭신 상의 (식 1) 및/또는 (식 2)로 표시되는 당쇄의 검출을 행한다. 당쇄가 검출되면, 세포가 미분화 상태를 유지하고 있음을 확인할 수 있고, 이에 의해 분화 세포의 혼입이 없는 고품질의 줄기 세포를 취득하는 것이 가능해진다. 또는, 당쇄의 정량값에 기초하여, 전체 세포 중 어느 정도의 비율의 세포가 미분화 상태를 유지하고 있는지(반대로, 어느 정도의 비율이 분화되어 있는지)를 판정할 수도 있다.
배양 상청 등을 일정량 채취하는 수단으로서는, 수작업으로도 되지만, 자동 배양 장치 등에 의해 자동으로 채취할 수도 있다.
또한, 예를 들어 줄기 세포의 분화 유도를 행한 후, 세포의 배양 상청 등을 마이크로 피펫 등으로 일정량 채취하고, 본 발명에 따른 검출 방법에 의해, 포도칼릭신 상의 (식 1) 및/또는 (식 2)로 표시되는 당쇄의 검출을 행한다. 당쇄가 검출되면, 세포 중에 미분화 상태의 줄기 세포가 잔존하고 있음을 확인할 수 있다. 반대로, 당쇄가 검출되지 않게 되면(백그라운드값과 동일한 레벨이 되면), 세포가 모두 분화된 것을 확인할 수 있고, 이에 의해 미분화 세포의 혼입의 우려가 없는 분화 세포를 취득하는 것이 가능해진다. 또는, 당쇄의 정량값에 기초하여, 전체 세포 중 어느 정도의 비율이 분화되어 있는지(반대로, 어느 정도의 세포가 미분화 상태에 머물고 있는지)를 판정할 수도 있다.
본 발명에 따른 검출 방법에 세포의 배양 상청을 제공할 경우에는, (식 1) 또는 (식 2)의 당쇄가 검출 가능량 분비된 후의 배양 상청을 사용하는 것으로 할 필요가 있다. 교환 후, 배양액 내에 검출 가능량의 당쇄가 출현할 때까지 소요되는 시간은, 세포의 종류나 배양 조건에 의해 다르고 적절히 설정될 수 있지만, 예를 들어 18 내지 30시간 정도가 된다. 통상은 24시간 정도마다 배지 교환을 행하므로, 그 때 폐기되는 배양 상청의 일부를 이용하는 것이 바람직하다.
여기서, 줄기 세포를 분화 유도하는 방법으로서는, 어떠한 방법이어도 된다. 예를 들어, 줄기 세포를 레티노산 존재 하에서 배양하여 신경계 세포로 분화시키는 방법, 증식을 중지시킨 NIH3T3 세포 표면을 토대로 하여 표피 세포를 형성시키는 방법 등의 방법을 적용할 수 있다.
2. 줄기 세포의 검출 키트
본 발명에 따른 줄기 세포의 검출 키트는, 상기 줄기 세포 검출 방법에 사용되는 것이며, 하기 (식 1):
Figure pct00011
(R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타낸다. R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타낸다.)
또는 하기 (식 2):
Figure pct00012
(R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타낸다. R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타낸다.)
로 표시되는 당쇄에 결합성을 갖는 렉틴과, 케라탄황산에 결합성을 갖는 항체를 포함한다.
키트의 구성의 바람직한 형태와 구체예는, 상기 줄기 세포 검출 방법에 있어서 설명한 바와 같다. 구체적으로는, 케라탄황산에 결합성을 갖는 항체는, 특히 저황산화 케라탄황산에 결합성을 갖는 항체인 것이 바람직하다. 또한, 해당 항체는, Gal-GlcNAc(6S) 또는 그의 탠덤 리피트를 에피토프에 포함하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 하이브리도마 R-10G(기탁 번호: FERM BP-11301)가 산생하는 항체 또는 해당 항체와 경합하는 항체가 사용될 수 있다.
또한, 키트에 포함되는 시약 중에는, 통상의 분야에서 사용되는 시약류, 예를 들어 완충제, 반응 촉진제, 당류, 단백질, 염류, 계면 활성제 등의 안정화제, 방부제 등이며, 공존하는 시약 등의 안정성을 저해하거나 하지 않고, 포도칼릭신과 렉틴 및 항체의 반응을 저해하지 않는 것이 포함되어 있어도 된다. 또한, 그 농도도, 통상의 분야에서 통상 사용되는 농도 범위로부터 적절히 선택하면 된다. 또한, 키트는, 포도칼릭신에 대하여 검량선을 작성하기 위해 사용되는 표준품을 포함하고 있어도 된다.
본 발명에 따른 줄기 세포의 검출 키트에 있어서, (식 1) 또는 (식 2)로 표시되는 당쇄에 결합성을 갖는 렉틴은, 불용성 담체에 결합되어 있는 것이 바람직하다. 케라탄황산에 결합성을 갖는 항체는 미리 표지되어 있는 것이 바람직하지만, 유저가 사용 시에 항체의 표지를 행하기 위한 시약이 키트에 포함되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서의 용어나 개념은, 당해 분야에 있어서 관용적으로 사용되는 용어의 의미에 기초하는 것이고, 본 발명을 실시하기 위해 사용하는 각종 기술은, 특히 그 출전을 명시한 기술을 제외하고는, 공지된 문헌 등에 기초하여 당업자라면 용이하면서도 확실하게 실시 가능하다.
또한, 각종 분석 등은, 사용한 분석 기기 또는 시약, 키트의 취급 설명서, 카탈로그 등에 기재된 방법을 준용하여 행하였다.
또한, 본 명세서 중에 인용한 기술 문헌, 특허 공보 및 특허 출원 명세서 중의 기재 내용은, 본 발명의 기재 내용으로서 참조되는 것으로 한다.
실시예
[시험예 1: 렉틴-항체 샌드위치법에 의한 줄기 세포의 검출]
본 발명에 따른 렉틴-항체 샌드위치법에 의한 줄기 세포의 검출 방법을 평가하기 위해서, iPS 세포의 배양 상청의 희석 용액을 사용하여 포도칼릭신의 정량적인 측정을 행하였다. 측정은, 마이크로 플레이트를 사용한 ELISA 검출계로 행하였다.
스트렙트아비딘 플레이트(스미토모 베이크라이트 가부시키가이샤)의 웰에 비오틴화 rBC2LCN 렉틴(0.5μg당량)을 첨가하고, 37도에서 1시간, 고정화하였다. 재조합 렉틴의 제작은, 비특허문헌 4에 기재된 방법에 따랐다. 웰을 완충액(1％ TritonX-100, 인산 완충액)으로 세정 후, mTeSR1 배지에서 24시간 배양한 iPS 세포(201B7주)의 배양 상청을 배지(2％ FBS, DMEM)로 단계 희석한 용액 50μl를 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 반응시켰다. iPS 세포(201B7주)는, 리까가꾸 겡뀨쇼 바이오리소스 센터로부터 분양을 받았다.
웰을 완충액으로 세정 후, 퍼옥시다아제를 표지한 R10G 항체(0.1μg/ml)를 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 웰을 완충액으로 세정 후, 기질 용액(TMB, 와코 쥰야쿠 가부시키가이샤) 100μl를 웰에 첨가하고, 실온에서 30분 반응을 행하였다. 1M 황산을 웰에 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 각 웰의 흡광도(450nm)를 측정하였다. 비교를 위하여, R10G 항체 대신에, rABA 렉틴(Agaricus bisporus 유래, 특허문헌 2 참조), 항SSEA3 항체, 항SSEA4 항체, 항Tra-1-60 항체, 항Tra-1-81 항체, 항포도칼릭신 항체를 동일한 농도로 사용하였다.
(1) R10G 항체: 저황산화 케라탄 항체(코스모·바이오 가부시키가이샤, RIT-M001). 포도칼릭신 상의 황산화도가 낮은 케라탄황산(저황산화 케라탄황산)을 인식한다.
(2) rABA 렉틴: 아미노산 서열을 서열 번호 2에 나타낸다(RCSB Protein Data Bank Accession No. 1Y2V도 참조).
(3) 항SSEA3 항체: 래트 모노클로날 IgM 항체(Millipore, MAB4303). 인간 EC 세포(Tetracarcinoma stem cell), 인간 EG 세포(Embryonic germ cell) 및 인간 ES 세포의 표면에 발현하는 SSEA3 항원(Stage-specific embryonic antigen 3)을 인식한다.
(4) 항SSEA4 항체: 마우스 모노클로날 IgG 항체(Millipore, MAB4304). 인간 EC 세포, 인간 EG 세포 및 인간 ES 세포의 표면에 발현하는 SSEA4 항원(Stage-specific embryonic antigen 4)을 인식한다.
(5) 항Tra-1-60 항체: 마우스 모노클로날 IgM 항체(Millipore, MAB4360). 포도칼릭신 상의 케라탄황산을 인식한다(비특허문헌 5, 6 참조).
(6) 항Tra-1-81 항체: 마우스 모노클로날 IgM 항체(Millipore, MAB4381). 포도칼릭신 상의 케라탄황산을 인식한다(비특허문헌 5, 6 참조).
(7) 항포도칼릭신 항체: 염소 폴리클로날 IgG 항체(R&D System. AF1658). 인간 포도칼릭신을 인식한다.
결과를 도 1 및 도 2에 도시한다. rABA 렉틴을 사용한 경우에는, 희석 배율 40배(도면 중, 희석 인자(dilution factor): 0.025) 이하의 고희석 용액을 사용한 경우에 백그라운드의 영향이 현저하여, 정량성의 저하가 발생하였다(선형 회귀 직선의 결정 계수: 0.6387). 그 원인으로서, 배지 중의 혈청 성분과, rBC2LCN 렉틴 및 rABA 렉틴의 비특이적인 결합에 의한 백그라운드의 상승이 생각되었다.
한편, R10G 항체를 사용한 경우에는, 어느 희석 배율에 있어서도 상기와 같은 비특이적인 결합에 의한 백그라운드의 상승은 보이지 않고, 고정밀도의 정량 측정이 가능하였다(선형 회귀 직선의 결정 계수: 0.9988).
또한, 항SSEA3 항체 및 항SSEA4 항체는, 항원과의 반응성의 결여 때문에, 측정은 불능하였다(도 2 참조). 포도칼릭신 상의 케라탄황산을 인식하는 항Tra-1-60 항체 및 항Tra-1-81 항체를 사용한 경우에도, 항원에 거의 결합하지 않거나 완전히 결합하지 않아, 측정은 불능하였다(도 2 참조). 그 원인으로서, 이하가 생각되었다.
항Tra-1-60 항체 및 항Tra-1-81 항체는, 모두 포도칼릭신 상의 케라탄황산을 에피토프로 하는 항체이지만, 「Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc」를 에피토프에 포함한다고 되어 있고(비특허문헌 7 참조), 「Gal-GlcNAc(6S)」 또는 그의 탠덤 리피트를 에피토프에 포함한다고 되어 있는 R-10G 항체와는 에피토프가 상이하다.
항Tra-1-60 항체 및 항Tra-1-81 항체는, 고황산화 케라탄황산을 에피토프로 한다고 되어 있고, 저황산화 케라탄황산을 에피토프로 하는 R-10G 항체와는 에피토프가 상이하다.
항Tra-1-60 항체 및 항Tra-1-81 항체는, IgG 항체인 R-10G 항체와는 달리, IgM 항체이다.
추가로, 항포도칼릭신 항체(R&D System. AF1658)를 사용한 경우에도, 측정은 불가능하였다. 그 원인으로서, 동일 항체는, 미엘로마 세포로 발현시킨 재조합 포도칼릭신을 항원으로 사용하여 제조된 것이기 때문에, 줄기 세포에 발현되는 포도칼릭신에 대하여 충분한 반응성을 갖지 않은 것으로 생각된다. 줄기 세포에서의 발현에서 유래하는, 포도칼릭신의 특이적인 구조(예를 들어, (식 1) 및 (식 2)의 당쇄 구조)에 의해, 동일 항체의 에피토프로의 결합이 저해될 가능성이 생각된다.
도 3에, iPS 세포의 배양 시의 혈청 농도를 2％로부터 1％, 5％, 10％ 또는 20％로 변경한 것 이외에는 상기와 동일하게 하여, 배양 상청 희석 용액을 사용한 포도칼릭신의 정량 측정을 행한 결과를 나타낸다. 혈청 농도 1％ 내지 20％의 범위에서 양호한 정량성을 확인할 수 있었다.
[시험예 2: 렉틴-항체 샌드위치법에 의한 줄기 세포의 검출 하한량의 산출]
상이한 종류의 배지에서 배양한 iPS 세포(201B7주)의 배양 상청의 희석 용액을 사용하여 포도칼릭신의 정량적인 측정을 행하였다. 배지에는 이하의 4종류를 사용하였다. 각 배지에서 iPS 세포(201B7주)를 24시간 배양 후, 회수한 배양 상청을 각각의 배지로 희석하여, 희석 용액을 얻었다.
StemSure hPSC 배지Δ(와코 쥰야꾸 고교 가부시키가이샤)
mTeSR1 배지(STEMCELL Technologies)
MEF-CM(Mouse Embryonic Fibroblast-conditioned Medium, 마우스 배아 섬유아세포를 배양한 배양 상청)
TeSR-E8 배지(STEMCELL Technologies)
스트렙트아비딘 플레이트의 웰에 비오틴화 rBC2LCN 렉틴(0.3μg/ml)을 첨가하고, 실온(20℃ 내지 25℃)에서 1시간, 고정화하였다. 웰을 완충액(1％ TritonX-100, 인산 완충액)으로 세정 후, 배양 상청의 희석 용액 50μl를 웰에 첨가하여, 실온에서 1시간 반응시켰다.
웰을 완충액으로 세정 후, 퍼옥시다아제를 표지한 R10G 항체(0.5μg/ml)를 웰에 첨가하여, 실온에서 1시간 반응시켰다. 웰을 완충액으로 세정 후, 기질 용액(TMB) 50μl를 웰에 첨가하여, 실온에서 30분 반응시켰다. 0.5M 황산을 웰에 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 각 웰의 흡광도(450nm-650nm)를 측정하였다.
결과를 도 4 내지 도 7에 나타낸다. 도면 중, 횡축은, 배양 상청의 희석 배율을 나타내고, 배지 1ml당 배양 세포수가 10000개가 되는 배양 조건에서 얻어진 배양 상청의 희석 배율을 「배지 1ml당 배양 세포 상당수」로 나타낸다. 즉, 「10×103cells/ml」가 희석 없음을 의미하고, 예를 들어 「5.0×103cells/ml」는 2배 희석, 「2.5×103cells/ml」는 4배 희석, 「1.25×103cells/ml」는 8배 희석을 의미한다. 도면 중, 선형 회귀 직선 및 회귀식은, 결정 계수(R2승)가 가장 양호할 (1.0에 가까울) 때의 직선 및 식이다.
4종류의 배지 중 어느 것을 사용한 경우에도, 고희석 배율에 있어서도 양호한 정량성이 얻어졌다. 본 발명에 따른 렉틴-항체 샌드위치법이, 배지의 종류 영향을 받지 않는 것이 확인되었다.
회귀식에 기초하여, 검출 하한값이 되는 희석 배율을 구하고, 검출 하한값을 「배지 1ml당 배양 세포 상당수」로 산출한 결과를 「표 1」에 나타낸다. 검출 하한값은, 배지만의 흡광도(흡광도의 평균값에 표준 편차의 3.3배를 가산한 값)를 산출하고, 당해 흡광도를 나타내는 희석 배율을 회귀식으로부터 구하였다.
Figure pct00013
검출 하한의 「배지 1ml당 배양 세포 상당수」는, 27 내지 321cell/ml였다. 종래 기술에 관한 rBC2LCN 렉틴과 rABA 렉틴을 조합한 「렉틴-렉틴 샌드위치법」에서의 검출 하한은, 623 내지 4,753cell/ml로 보고되어 있다(비특허문헌 8 참조). rBC2LCN 렉틴과 저황산화 케라탄 항체 R10G 항체를 조합한 본 발명에 따른 「렉틴-항체 샌드위치법」은, 종래의 「렉틴-렉틴 샌드위치법」에 비해, 줄기 세포를 한층 고감도로 검출할 수 있는 것이 명백해졌다.
[시험예 3: 렉틴-항체 샌드위치법에 의한 줄기 세포의 검출 2]
본 발명에 따른 렉틴-항체 샌드위치법에 의한 줄기 세포의 검출 방법을 평가하기 위해서, iPS 세포의 배양 상청의 희석 용액을 사용하여 포도칼릭신의 정량적인 측정을 행하였다. 측정은, 슬라이드 글래스를 사용한 어레이 검출계로 행하였다.
비접촉형 스폿터(MicroSys4000; Genomic Solutions)를 사용하여, rBC2LCN 렉틴을 에폭시 활성화 슬라이드 글래스에 고정화하였다. 시험예 1과 동일하게 하여 제조한 배양 상청의 희석 용액을, rBC2LCN 렉틴을 고정화한 슬라이드 글래스에 적하하고, 20℃에서 밤새 반응시켰다. 세정 후, R10G 항체(1μg/mL)를 적하하고, 20℃에서 1시간 반응시켰다. 이어서, Cy3 표지 항마우스 IgG 항체(JacksonImmunoResearch, 1μg/mL)를 적하하고, 20℃에서 1시간 반응시켰다. 세정 후, 에바네센트파 여기 형광형 스캐너(Bio-REX Scan 200, Rexxam)로 스캔하였다.
결과를 도 8에 나타낸다. 도면 중, 횡축은, 도 1 내지 4와 동일하게, 배양 상청의 희석 배율을 「배지 1ml당 배양 세포 상당수」로 나타낸다. 도면 중, 선형 회귀 직선 및 회귀식은, 결정 계수(R2승)가 가장 양호할(1.0에 가까울) 때의 직선 및 식이다.
어느 희석 배율에 있어서도 비특이적인 결합에 의한 백그라운드는 보이지 않고, 고정밀도의 정량 측정이 가능하였다(선형 회귀 직선의 결정 계수: 0.9997).
시험예 1 내지 3의 결과로부터, rBC2LCN 렉틴에 저황산화 케라탄 항체 R10G 항체를 조합한 렉틴-항체 샌드위치법에 의하면, 혈청 함유 배지에서 배양된 세포의 배양 상청을 사용한 경우에도, 포도칼릭신을 고정밀도로 검출할 수 있고, 고감도의 줄기 세포 검출이 가능하게 되는 것이 명백해졌다. 또한, mTeSR1 배지에서 24시간 배양한 iPS 세포(201B7주)에서, 시판되고 있는 키트(CelLytic MEM Protein Extraction Kit, Sigma-Aldrich)를 사용하여 얻어진 수용성 분획을 사용하여 동일한 시험을 행한 경우에도, 배양 상청을 사용한 경우와 동일한 결과가 얻어졌다.
서열표 프리텍스트
서열 번호 1: BC2LCN 렉틴의 아미노산 서열
서열 번호 2: ABA 렉틴의 아미노산 서열
SEQUENCE LISTING <110> National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Wako Pure Chemical Industries, Ltd. <120> METHOD AND KIT FOR DETECTING STEM CELLS <130> PSK-9028WO <150> JP2015-053802 <151> 2015-03-17 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 156 <212> PRT <213> Burkholderia cenocepacia <400> 1 Met Pro Leu Leu Ser Ala Ser Ile Val Ser Ala Pro Val Val Thr Ser 1 5 10 15 Glu Thr Tyr Val Asp Ile Pro Gly Leu Tyr Leu Asp Val Ala Lys Ala 20 25 30 Gly Ile Arg Asp Gly Lys Leu Gln Val Ile Leu Asn Val Pro Thr Pro 35 40 45 Tyr Ala Thr Gly Asn Asn Phe Pro Gly Ile Tyr Phe Ala Ile Ala Thr 50 55 60 Asn Gln Gly Val Val Ala Asp Gly Cys Phe Thr Tyr Ser Ser Lys Val 65 70 75 80 Pro Glu Ser Thr Gly Arg Met Pro Phe Thr Leu Val Ala Thr Ile Asp 85 90 95 Val Gly Ser Gly Val Thr Phe Val Lys Gly Gln Trp Lys Ser Val Arg 100 105 110 Gly Ser Ala Met His Ile Asp Ser Tyr Ala Ser Leu Ser Ala Ile Trp 115 120 125 Gly Thr Ala Ala Pro Ser Ser Gln Gly Ser Gly Asn Gln Gly Ala Glu 130 135 140 Thr Gly Gly Thr Gly Ala Gly Asn Ile Gly Gly Gly 145 150 155 <210> 2 <211> 143 <212> PRT <213> Agaricus bisporus <400> 2 Met Thr Tyr Thr Ile Ser Ile Arg Val Tyr Gln Thr Thr Pro Lys Gly 1 5 10 15 Phe Phe Arg Pro Val Glu Arg Thr Asn Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly 20 25 30 Thr Trp Asp Glu Val Arg Gly Glu Tyr Val Leu Thr Met Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Thr Ser Gly Ser Leu Arg Phe Val Ser Ser Asp Thr Asp Glu Ser 50 55 60 Phe Val Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile 65 70 75 80 Val Thr Asn Leu Thr Asn Glu Gln Thr Ala Leu Val Ile Asn Gln Glu 85 90 95 Tyr Tyr Gly Val Pro Ile Arg Asp Gln Ala Arg Glu Asn Gln Leu Thr 100 105 110 Ser Tyr Asn Val Ala Asn Ala Lys Gly Arg Arg Phe Ala Ile Glu Tyr 115 120 125 Thr Val Thr Glu Gly Asp Asn Leu Lys Ala Asn Leu Ile Ile Gly 130 135 140

Claims (17)

  1. 세포의 배양 상청 또는 용해물에 포함되는 포도칼릭신을 검출함으로써, 줄기 세포를 검출하는 방법이며,
    상기 배양 상청 또는 용해물과, 하기 (식 1):
    Figure pct00014

    (R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타낸다. R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타낸다.)
    또는 하기 (식 2):
    Figure pct00015

    (R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타낸다. R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타낸다.)
    로 표시되는 당쇄에 결합성을 갖는 렉틴과, 케라탄황산에 결합성을 갖는 항체를 접촉시켜, 상기 렉틴과 포도칼릭신과 상기 항체로 구성되는 복합체를 형성시키는 수순과,
    상기 복합체를 검출하는 수순을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 저황산화 케라탄황산에 결합성을 갖는 항체인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체가 Gal-GlcNAc(6S) 또는 그의 탠덤 리피트를 에피토프에 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가, 하이브리도마 R-10G(기탁 번호: FERM BP-11301)가 산생하는 항체 또는 해당 항체와 경합하는 항체인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 혈청 함유 배지에서 배양된 세포인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 렉틴이,
    서열 번호 1에 나타내어지는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 단백질, 또는 당해 아미노산 서열의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 상기 (식 1) 또는 (식 2)로 표시되는 당쇄에 결합성을 갖는 단백질인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 상청 또는 용해물과 상기 렉틴을 접촉시켜, 해당 렉틴과 상기 배양 상청 또는 용해물에 포함되는 포도칼릭신으로 구성되는 제1 복합체를 형성시키는 수순과,
    제1 복합체와 상기 항체를 접촉시켜, 상기 렉틴과 포도칼릭신과 해당 항체로 구성되는 제2 복합체를 형성시키는 수순을 포함하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 렉틴이 불용성 담체에 결합되는 방법.
  9. 세포의 배양 상청 또는 용해물에 포함되는 하기 (식 1):
    Figure pct00016

    (R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타낸다. R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타낸다.)
    또는 하기 (식 2):
    Figure pct00017

    (R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타낸다. R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타낸다.)
    로 표시되는 당쇄를 검출함으로써, 줄기 세포를 검출하는 방법이며,
    상기 배양 상청 또는 용해물과, 상기 당쇄에 결합성을 갖는 렉틴과, 케라탄황산에 결합성을 갖는 항체를 접촉시켜, 상기 렉틴과 상기 당쇄와 상기 항체를 포함하여 이루어지는 복합체를 형성시키는 수순과,
    상기 복합체를 검출하는 수순을 포함하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복합체의 유무 또는 검출량에 기초하여 상기 세포에 포함되는 줄기 세포의 유무 또는 존재량을 판정하는 수순을 더 포함하는 방법.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복합체의 유무 또는 검출량에 기초하여 상기 세포의 분화 상태를 판정하는 수순을 더 포함하는 방법.
  12. 세포의 배양 상청 또는 용해물에 포함되는 포도칼릭신을 검출하는 방법이며,
    상기 배양 상청 또는 용해물과, 하기 (식 1):
    Figure pct00018

    (R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타낸다. R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타낸다.)
    또는 하기 (식 2):
    Figure pct00019

    (R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타낸다. R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타낸다.)
    로 표시되는 당쇄에 결합성을 갖는 렉틴과, 케라탄황산에 결합성을 갖는 항체를 접촉시켜, 상기 렉틴과 포도칼릭신과 상기 항체로 구성되는 복합체를 형성시키는 수순과,
    상기 복합체를 검출하는 수순을 포함하는 방법.
  13. 세포의 배양 상청 또는 용해물에 포함되는 포도칼릭신을 검출함으로써, 줄기 세포를 검출하기 위한 키트이며,
    하기 (식 1):
    Figure pct00020

    (R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타낸다. R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타낸다.)
    또는 하기 (식 2):
    Figure pct00021

    (R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타낸다. R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타낸다.)
    로 표시되는 당쇄에 결합성을 갖는 렉틴과,
    케라탄황산에 결합성을 갖는 항체를 포함하는 키트.
  14. 제13항에 있어서, 상기 항체가 저황산화 케라탄황산에 결합성을 갖는 항체인 키트.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 항체가 Gal-GlcNAc(6S) 또는 그의 탠덤 리피트를 에피토프에 포함하는 키트.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가, 하이브리도마 R-10G(기탁 번호: FERM BP-11301)가 산생하는 항체 또는 해당 항체와 경합하는 항체인 키트.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 렉틴이 불용성 담체에 결합되어 있는 키트.
KR1020177029167A 2015-03-17 2015-12-21 줄기 세포를 검출하기 위한 방법 및 키트 KR20170128457A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2015-053802 2015-03-17
JP2015053802 2015-03-17
PCT/JP2015/085685 WO2016147514A1 (ja) 2015-03-17 2015-12-21 幹細胞を検出するための方法及びキット

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20170128457A true KR20170128457A (ko) 2017-11-22

Family

ID=56919838

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177029167A KR20170128457A (ko) 2015-03-17 2015-12-21 줄기 세포를 검출하기 위한 방법 및 키트

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10539553B2 (ko)
EP (1) EP3273241B1 (ko)
JP (1) JP6754932B2 (ko)
KR (1) KR20170128457A (ko)
CN (1) CN108064342A (ko)
WO (1) WO2016147514A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201841935A (zh) * 2017-04-11 2018-12-01 國立研究開發法人產業技術總合研究所 凝集素的固定化方法
JP2020025535A (ja) * 2018-08-13 2020-02-20 東ソー株式会社 フコース結合性タンパク質、その製造方法およびその用途

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008122410A (ja) * 2000-10-27 2008-05-29 Masanori Hara 腎障害の検査方法
WO2002037099A1 (fr) * 2000-10-27 2002-05-10 International Reagents Corporation Procede de diagnostic de la nephropathie
ATE488588T1 (de) 2003-03-10 2010-12-15 Japan Science & Tech Agency Verfahren zur kennzeichnung mesenchymaler stammzellen unter verwendung verschiedener marker
SG160248A1 (en) 2008-09-18 2010-04-29 Agency Science Tech & Res Use of novel monoclonal antibodies targeting human embryonic stem cells to characterize and kill induced pluripotent stem cells
CN104634974B (zh) * 2009-03-05 2017-08-08 独立行政法人产业技术综合研究所 肝内胆管癌的检出、辨别方法
WO2012147992A1 (en) * 2011-04-25 2012-11-01 The Ritsumeikan Trust ANTI-iPS/ES CELL-SPECIFIC ANTIBODY AND USE THEREOF
JP5846599B2 (ja) * 2011-08-11 2016-01-20 国立研究開発法人産業技術総合研究所 ガラクトース６硫酸結合性タンパク質
KR101924673B1 (ko) * 2011-11-01 2018-12-03 내셔날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지 미분화 세포 검출 방법 및 복합 당질 검출 방법
JP6176738B2 (ja) 2012-02-28 2017-08-09 国立研究開発法人産業技術総合研究所 細胞の分化判定、細胞の分離、並びに誘導性多能性幹細胞及び分化細胞の製造のための方法
WO2014098243A1 (ja) * 2012-12-21 2014-06-26 学校法人立命館 標的細胞障害活性を有するiPS/ES細胞特異的抗体及びその用途

Also Published As

Publication number Publication date
EP3273241A1 (en) 2018-01-24
JP6754932B2 (ja) 2020-09-16
JPWO2016147514A1 (ja) 2017-12-28
US20180038847A1 (en) 2018-02-08
EP3273241B1 (en) 2019-10-30
CN108064342A (zh) 2018-05-22
WO2016147514A1 (ja) 2016-09-22
US10539553B2 (en) 2020-01-21
EP3273241A4 (en) 2018-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101924673B1 (ko) 미분화 세포 검출 방법 및 복합 당질 검출 방법
US9279809B2 (en) Cell differentiation assay method, cell isolation method, method for producing induced pluripotent stem cells, and method for producing differentiated cells
US20210293791A1 (en) Bacterial vaginosis diagnostic
RU2018138782A (ru) Антитела к фактору ix padua
JP2023011764A (ja) レクチンの固定化方法
JP6733889B2 (ja) 細胞分化ポテンシャル判定法
JP6754932B2 (ja) 幹細胞を検出するための方法及びキット
EP2986713A1 (en) A method for generating induced pluripotent stem cells
US9182390B2 (en) Biomolecule-immobilized carrier and method for immobilizing biomolecule on carrier
JP2017133951A (ja) 検体中の特定の細菌を検出する方法
EP3778916A1 (en) Antigen treatment method
JP5846599B2 (ja) ガラクトース６硫酸結合性タンパク質
US20110045497A1 (en) Novel acidic glycan markers of human cells
US20110039281A1 (en) Method of immunological analysis for detection of antibodies against human gstt1 (anti-hgstt1)
JP2011122957A (ja) 高特異的かつ高感度なタンパク質検出方法
JP2017133952A (ja) 特定の細菌を検出するイムノクロマト方法及びそれに用いるキット
Tateno et al. The cellular glycome of human induced pluripotent stem cells and their specific probe rBC2LCN
Tateno et al. Discovery and Applications of a Novel Human Pluripotent Stem Cell-Specific Lectin Probe rBC2LCN
JP2020162572A (ja) 抗原の処理方法。
CN106198952A (zh) 一种抑制核酸分子对传感界面非特异性吸附的封闭方法