JP2020025535A - フコース結合性タンパク質、その製造方法およびその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]
以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、フコース結合性タンパク質であって、
Fucα1−2Galβ1−3GlcNAcからなる構造を含む糖鎖および/またはFucα1−2Galβ1−3GalNAcからなる構造を含む糖鎖に対する結合親和性を有し、
ただし、配列番号1で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質は除く、フコース結合性タンパク質:
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列の1番目のプロリン残基からX番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列であって、Xが110以上140以下の整数である、アミノ酸配列;
(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列の1番目のプロリン残基からX番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列において、1個若しくは複数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列であって、Xが110以上140以下の整数である、アミノ酸配列;
(c)配列番号1で示されるアミノ酸配列の1番目のプロリン残基からX番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に対して90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、Xが110以上140以下の整数である、アミノ酸配列;
(d)前記(a)〜(c)のいずれかに記載のアミノ酸配列において、特定のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列であって、当該特定のアミノ酸置換が以下の(1)から(5)に記載のアミノ酸置換から選択される1つ以上のアミノ酸置換である、アミノ酸配列:
(1)配列番号1で示されるアミノ酸配列の39番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基の、グルタミン残基以外のアミノ酸残基への置換;
(2)配列番号1で示されるアミノ酸配列の72番目のシステイン残基に相当するアミノ酸残基の、システイン残基以外のアミノ酸残基への置換;
(3)配列番号1で示されるアミノ酸配列の65番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基の、グルタミン残基以外のアミノ酸残基への置換;
(4)配列番号1で示されるアミノ酸配列の81番目のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基の、グルタミン酸残基以外のアミノ酸残基への置換;
(5)配列番号1で示されるアミノ酸配列の36番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基の、グリシン残基以外のアミノ酸残基への置換。
[2]
前記(1)から(5)に記載のアミノ酸置換が、それぞれ、以下の(6)から(10)に記載のアミノ酸置換である、[1]に記載のフコース結合性タンパク質:
(6)配列番号1で示されるアミノ酸配列の39番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基の、ロイシン残基またはメチオニン残基への置換;
(7)配列番号1で示されるアミノ酸配列の72番目のシステイン残基に相当するアミノ酸残基の、グリシン残基またはアラニン残基への置換;
(8)配列番号1で示されるアミノ酸配列の65番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基の、ロイシン残基への置換;
(9)配列番号1で示されるアミノ酸配列の81番目のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基の、システイン残基、グルタミン残基、ヒスチジン残基、メチオニン残基、バリン残基、リジン残基、セリン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、グリシン残基、プロリン残基、ロイシン残基、またはアスパラギン残基への置換;
(10)配列番号1で示されるアミノ酸配列の36番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基の、システイン残基への置換。
[3]
全長が、95〜175残基である、[1]または[2]に記載のフコース結合性タンパク質。
[4]
前記(a)〜(d)に記載のアミノ酸配列の長さが、95〜155残基である、[1]から[3]のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質。
[5]
配列番号2から配列番号16のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、[1]から[4]のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質。
[6]
N末端および/またはC末端に付加的なアミノ酸配列を有する、[1]から[5]のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質。
[7]
C末端に付加したアミノ酸配列がシステイン残基を含むオリゴペプチドである、[1]から[6]のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質。
[8]
N末端に付加したアミノ酸配列がポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドである、[1]から[7]のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質。
[9]
[1]から[8]のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質をコードするDNA。
[10]
[9]に記載のDNAを含む発現ベクター。
[11]
[9]に記載のDNAまたは[10]に記載の発現ベクターを有する形質転換体。
[12]
エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)である、[11]に記載の形質転換体。
[13]
フコース結合性タンパク質の製造方法であって、
[11]または[12]に記載の形質転換体を培養することによりフコース結合性タンパク質を発現する工程;および
発現した前記フコース結合性タンパク質を回収する工程
を含み、
フコース結合性タンパク質が、[1]から[8]のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質である、方法。
[14]
不溶性担体と、該不溶性担体に固定化された[1]から[8]のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質とを備える、吸着剤。
[15]
吸着剤の製造方法であって、
不溶性担体から反応性不溶性担体を製造する工程;および
前記反応性不溶性担体に[1]から[8]のいずれかに記載のフコース結合性タンパク質を固定化する工程
を含み、
吸着剤が、[14]に記載の吸着剤である、方法。
[16]
前記反応性不溶性担体が、マレイミド基またはハロアセチル基を有する不溶性担体である、[15]に記載の方法。
[17]
[14]に記載の吸着剤が充填されたカラム。
[18]
細胞の分離方法であって、
[14]に記載の吸着剤と細胞混合物とを接触させる工程;および
前記吸着剤に吸着した細胞と吸着しなかった細胞とを分離する工程
を含む、方法。
[19]
前記細胞混合物が、第1の細胞と第2の細胞を含有する混合物であり、
前記第1の細胞が、Fucα1−2Galβ1−3GlcNAcからなる構造を含む糖鎖および/またはFucα1−2Galβ1−3GalNAcからなる構造を含む糖鎖を有する細胞であり、
前記第2の細胞が、Fucα1−2Galβ1−3GlcNAcからなる構造を含む糖鎖およびFucα1−2Galβ1−3GalNAcからなる構造を含む糖鎖のいずれも有しない細胞である、[18]に記載の方法。
[20]
前記第1の細胞が未分化細胞であり、前記第2の細胞が分化細胞である、[18]または[19]に記載の方法。
[21]
前記第1の細胞ががん細胞である、[18]または[19]に記載の方法。
[22]
フコース含有糖鎖を有する物質の精製方法であって、
[14]に記載の吸着剤と前記フコース含有糖鎖を有する物質とを接触させる工程;および
前記吸着剤に結合した前記物質を溶出する工程
を含み、
前記フコース含有糖鎖が、Fucα1−2Galβ1−3GlcNAcからなる構造を含む糖鎖および/またはFucα1−2Galβ1−3GalNAcからなる構造を含む糖鎖である、方法。
[23]
前記物質が、前記フコース含有糖鎖および/または当該フコース含有糖鎖を有する複合糖質である、[22]に記載の方法。
[24]
[17]に記載のカラムが用いられる、[18]から[23]のいずれかに記載の方法。
(1)配列番号1で示されるアミノ酸配列の39番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基の、グルタミン残基以外のアミノ酸残基への置換;
(2)配列番号1で示されるアミノ酸配列の72番目のシステイン残基に相当するアミノ酸残基の、システイン残基以外のアミノ酸残基への置換;
(3)配列番号1で示されるアミノ酸配列の65番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基の、グルタミン残基以外のアミノ酸残基への置換;
(4)配列番号1で示されるアミノ酸配列の81番目のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基の、グルタミン酸残基以外のアミノ酸残基への置換;
(5)配列番号1で示されるアミノ酸配列の36番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基の、グリシン残基以外のアミノ酸残基への置換。
比較例1は、155アミノ酸残基からなる配列番号1で示される組換えBC2LCNのアミノ酸配列に、ポリヒスチジン配列とシステインを含むオリゴペプチド配列を付加した組換えBC2LCN(155)cysの製造と生産性評価に関するものである。
(1)発現ベクターpET−BC2LCN(155)cysおよび組換えE. coli BL21(DE3)/pET−BC2LCN(155)cysの作製
発現ベクターpET−BC2LCN(155)cysは、組換えBC2LCN(155)cysを発現させるための発現ベクターである。組換えBC2LCN(155)cysのアミノ酸配列は配列番号32であり、その5番目から10番目まではポリヒスチジン配列、15番目から169番目までは配列番号1のアミノ酸配列(GenPept登録番号:WP_006490828の2番目から156番目の領域のアミノ酸配列に一致)、170番目から174番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。発現ベクターpET−BC2LCN(155)cysは、特開2018−000038号公報で開示されているプラスミドpET−BC2LCNcysと同一の塩基配列であり、当該公報に開示されている方法で作製した。次いで、発現ベクターpET−BC2LCN(155)cysを用いてE. coli BL21(DE3)を形質転換し、組換えE. coli BL21(DE3)/pET−BC2LCN(155)cysを作製した。
(2)組換えE. coliを用いた組換えBC2LCN(155)cysの生産
前記比較例1の(1)で作製した組換えE. coli BL21(DE3)/pET−BC2LCN(155)cysを、50μg/mLのカナマイシンを含む100mLのTB培地に接種し、30℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行った。TB培地の組成を表1に示す。
比較例1の(2)で回収した可溶性タンパク質抽出液中からの組換えBC2LCN(155)cysの精製は、His・Bind Resin(メルクミリポア製)を用いたニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーにより行った。具体的には、以下の(比1−1)から(比1−6)に記載の方法により、組換えBC2LCN(155)cysを精製した。
実施例1は、129アミノ酸残基からなる配列番号2で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列のN末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、C末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質(以下、フコース結合性タンパク質129とする。)の製造と生産性評価に関するものである。
(1)発現ベクターpET−BC2LCN(129)cysおよび組換えE. coli BL21(DE3)/pET−BC2LCN(129)cysの作製
発現ベクターpET−BC2LCN(129)cysは、フコース結合性タンパク質129を発現させるための発現ベクターである。フコース結合性タンパク質129のアミノ酸配列は、配列番号33であり、その5番目から10番目まではポリヒスチジン配列、15番目から143番目までは配列番号2のアミノ酸配列、144番目から150番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
(2)組換えE. coliを用いたフコース結合性タンパク質129の生産
前記組換えE. coli BL21(DE3)/pET−BC2LCN(129)cysを用いたフコース結合性タンパク質129の生産と可溶性タンパク質抽出液の回収は、比較例1の(2)と同様の方法で行った。
(3)フコース結合性タンパク質129の精製と生産性評価
実施例1の(2)で回収した可溶性タンパク質抽出液中からのフコース結合性タンパク質129の精製は比較例1の(3)と同様の方法で行い、「20%B回収液」、「50%B回収液」、「100%B回収液」を得た。得られた「20%B回収液」、「50%B回収液」、「100%B回収液」を、比較例1の(3)に記載の方法によりSDS−PAGE法で分析した結果を図1に示す。図1において、「129」の「50%B回収液」と「100%B回収液」の各回収液中に、フコース結合性タンパク質129の単量体の分子量付近(約14kDa)および二量体と推測される分子量付近(約28kDa)にバンドが確認された。後述する実施例6において、二量体と推測される分子量付近のバンドはフコース結合性タンパク質129の二量体であることを確認していることから、両回収液中に目的のフコース結合性タンパク質129が含まれることが明らかとなった。フコース結合性タンパク質129はC末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されていることから、当該オリゴペプチドに含まれるシステイン同士がジスルフィド結合を形成することにより二量体が生成したと考えられた。
実施例2は、127アミノ酸残基からなる配列番号3で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列のN末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、C末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質(以下、フコース結合性タンパク質127とする。)の製造と生産性評価に関するものである。
(1)発現ベクターpET−BC2LCN(127)cysおよび組換えE. coli BL21(DE3)/pET−BC2LCN(127)cysの作製
発現ベクターpET−BC2LCN(127)cysは、フコース結合性タンパク質127を発現させるための発現ベクターである。フコース結合性タンパク質127のアミノ酸配列は、配列番号34であり、その5番目から10番目まではポリヒスチジン配列、15番目から141番目までは配列番号3のアミノ酸配列、142番目から148番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
(2)組換えE. coliを用いたフコース結合性タンパク質127の生産
前記組換えE. coli BL21(DE3)/pET−BC2LCN(127)cysを用いたフコース結合性タンパク質127の生産と可溶性タンパク質抽出液の回収は、比較例1の(2)と同様の方法で行った。
(3)フコース結合性タンパク質127の精製と生産性評価
実施例2の(2)で回収した可溶性タンパク質抽出液中からのフコース結合性タンパク質127の精製は比較例1の(3)と同様の方法で行い、「20%B回収液」、「50%B回収液」、「100%B回収液」を得た。得られた「20%B回収液」、「50%B回収液」、「100%B回収液」を、比較例1の(3)に記載の方法によりSDS−PAGE法で分析した結果を図1に示す。図1において、「127」の「50%B回収液」と「100%B回収液」の各回収液中に、フコース結合性タンパク質127の単量体の分子量付近(約14kDa)および二量体と推測される分子量付近(約28kDa)にバンドが確認された。後述する実施例6において、二量体と推測される分子量付近のバンドはフコース結合性タンパク質127の二量体であることを確認していることから、両回収液中に目的のフコース結合性タンパク質127が含まれることが明らかとなった。フコース結合性タンパク質127はC末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されていることから、当該オリゴペプチドに含まれるシステイン同士がジスルフィド結合を形成することにより二量体が生成したと考えられた。
実施例3は、129アミノ酸残基からなる配列番号4で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列(配列番号2の36番目のグリシン残基をシステイン残基に置換したアミノ酸配列)のN末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、C末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質(以下、フコース結合性タンパク質129G36Cとする。)の製造と生産性評価に関するものである。
(1)発現ベクターpET−BC2LCN(129G36C)cysおよび組換えE. coli BL21(DE3)/pET−BC2LCN(129G36C)cysの作製
発現ベクターpET−BC2LCN(129G36C)cysは、フコース結合性タンパク質129G36Cを発現させるための発現ベクターである。フコース結合性タンパク質129G36Cのアミノ酸配列は、配列番号35であり、その5番目から10番目まではポリヒスチジン配列、15番目から143番目までは配列番号4のアミノ酸配列、144番目から150番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
(2)組換えE. coliを用いたフコース結合性タンパク質129G36Cの生産
前記組換えE. coli BL21(DE3)/pET−BC2LCN(129G36C)cysを用いたフコース結合性タンパク質129G36Cの生産と可溶性タンパク質抽出液の回収は、比較例1の(2)と同様の方法で行った。
(3)フコース結合性タンパク質129G36Cの精製と生産性評価
実施例3の(2)で回収した可溶性タンパク質抽出液中からのフコース結合性タンパク質129G36Cの精製は比較例1の(3)と同様の方法で行い、「20%B回収液」、「50%B回収液」、「100%B回収液」を得た。得られた「20%B回収液」、「50%B回収液」、「100%B回収液」を、比較例1の(3)に記載の方法によりSDS−PAGE法で分析した結果を図1に示す。図1において、「129G36C」の「50%B回収液」と「100%B回収液」の各回収液中に、フコース結合性タンパク質129G36Cの単量体の分子量付近(約14kDa)および二量体と推測される分子量付近(約28kDa)にバンドが確認された。後述する実施例6において、二量体と推測される分子量付近のバンドはフコース結合性タンパク質129G36Cの二量体であることを確認していることから、両回収液中に目的のフコース結合性タンパク質129G36Cが含まれることが明らかとなった。フコース結合性タンパク質129G36CはC末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されていることから、当該オリゴペプチドに含まれるシステイン同士がジスルフィド結合を形成することにより二量体が生成したと考えられた。
実施例4は、127アミノ酸残基からなる配列番号5で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列(配列番号3の36番目のグリシン残基をシステイン残基に置換したアミノ酸配列)のN末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、C末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質(以下、フコース結合性タンパク質127G36Cとする。)の製造と生産性評価に関するものである。
(1)発現ベクターpET−BC2LCN(127G36C)cysおよび組換えE. coli BL21(DE3)/pET−BC2LCN(127G36C)cysの作製
発現ベクターpET−BC2LCN(127G36C)cysは、フコース結合性タンパク質127G36Cを発現させるための発現ベクターである。フコース結合性タンパク質127G36Cのアミノ酸配列は、配列番号36であり、その5番目から10番目まではポリヒスチジン配列、15番目から141番目までは配列番号5のアミノ酸配列、142番目から148番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
(2)組換えE. coliを用いたフコース結合性タンパク質127G36Cの生産
前記組換えE. coli BL21(DE3)/pET−BC2LCN(127G36C)cysを用いたフコース結合性タンパク質127G36Cの生産と可溶性タンパク質抽出液の回収は、比較例1の(2)と同様の方法で行った。
(3)フコース結合性タンパク質127G36Cの精製と生産性評価
実施例4の(2)で回収した可溶性タンパク質抽出液中からのフコース結合性タンパク質127G36Cの精製は比較例1の(3)と同様の方法で行い、「20%B回収液」、「50%B回収液」、「100%B回収液」を得た。得られた「20%B回収液」、「50%B回収液」、「100%B回収液」を、比較例1の(3)に記載の方法によりSDS−PAGE法で分析した結果を図1に示す。図1において、「127G36C」の「50%B回収液」と「100%B回収液」の各回収液中に、フコース結合性タンパク質127G36Cの単量体の分子量付近(約14kDa)および二量体と推測される分子量付近(約28kDa)にバンドが確認された。後述する実施例6において、二量体と推測される分子量付近のバンドはフコース結合性タンパク質127G36Cの二量体であることを確認していることから、両回収液中に目的のフコース結合性タンパク質127G36Cが含まれることが明らかとなった。フコース結合性タンパク質127G36CはC末端にシステインを含むオリゴペプチドが付加されていることから、当該オリゴペプチドに含まれるシステイン同士がジスルフィド結合を形成することにより二量体が生成したと考えられた。
実施例5は、126アミノ酸残基からなる配列番号6で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列のN末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質(以下、フコース結合性タンパク質126とする。)の製造と生産性評価に関するものである。
(1)発現ベクターpET−BC2LCN(126)および組換えE. coli BL21(DE3)/pET−BC2LCN(126)の作製
発現ベクターpET−BC2LCN(126)は、フコース結合性タンパク質126を発現させるための発現ベクターである。フコース結合性タンパク質126のアミノ酸配列は、配列番号37であり、その5番目から10番目まではポリヒスチジン配列、15番目から140番目までは配列番号6のアミノ酸配列に相当する。
(2)組換えE. coliを用いたフコース結合性タンパク質126の生産
前記組換えE. coli BL21(DE3)/pET−BC2LCN(126)を用いたフコース結合性タンパク質126の生産と可溶性タンパク質抽出液の回収は、比較例1の(2)と同様の方法で行った。
(3)フコース結合性タンパク質126の精製と生産性評価
実施例5の(2)で回収した可溶性タンパク質抽出液中からのフコース結合性タンパク質126の精製は比較例1の(3)と同様の方法で行い、「20%B回収液」、「50%B回収液」、「100%B回収液」を得た。次に、フコース結合性タンパク質126を含む「50%B回収液」と「100%B回収液」をまとめて精製126溶液とし、比較例1の(4)に記載の方法に従ってフコース結合性タンパク質126の培養液1Lあたりの生産性を算出した結果、生産性は550mg/L−培養液であった。
実施例5は、実施例1から4および比較例1で得られた、フコース結合性タンパク質129を含む精製129溶液、フコース結合性タンパク質127を含む精製127溶液、フコース結合性タンパク質129G36Cを含む精製129G36C溶液、フコース結合性タンパク質127G36Cを含む精製127G36C溶液および組換えBC2LCN(155)cysを含む精製BC2LCN(155)溶液の、非還元条件および還元条件でのSDS−PAGE法による分析に関するものである。
(1)SDS−PAGE分析用試料の調製
精製129溶液、精製127溶液、精製129G36C溶液、精製127G36C溶液および精製BC2LCN(155)溶液を試料溶液として用い、以下の(実5−1)から(実5−3)に記載の方法により、SDS−PAGE分析用試料を調製した。
(2)SDS−PAGE法による分析
前記(実5−1)から(実5−3)で調製した15種類のSDS−PAGE分析用試料(5種類の非還元試料溶液、5種類のTCEP還元試料溶液および5種類のDTT還元試料溶液)について、市販15%ゲル(ATTO製)を用いてSDS−PAGE法で分析した結果を図2に示す。図2において、「M」は分子量マーカーを、「非還元」は前述の非還元試料溶液を、「TCEP還元」は前述のTCEP還元試料溶液を、「DTT還元」は前述のDTT還元試料溶液を示す。また、「129」は実施例1で製造したフコース結合性タンパク質129を、「127」は実施例2で製造したフコース結合性タンパク質127を、「129G36C」は実施例3で製造したフコース結合性タンパク質129G36Cを、「127G36C」は実施例4で製造したフコース結合性タンパク質127G36Cを、「155」は比較例1で製造した組換えBC2LCN(155)cysを示す。
実施例7は、129アミノ酸残基からなる配列番号7で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列(配列番号2の81番目のグルタミン酸残基をシステイン残基に置換したアミノ酸配列)のN末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、C末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質(以下、フコース結合性タンパク質129E81Cとする。)の製造と糖鎖への結合親和性評価に関するものである。
(1)フコース結合性タンパク質129E81Cの製造
実施例1に記載のフコース結合性タンパク質129に対して、配列番号1の81番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基をシステイン残基に置換する変異導入を行うことで、フコース結合性タンパク質129E81Cを製造した。フコース結合性タンパク質129E81Cのアミノ酸配列は配列番号38であり、その15番目から143番目までは配列番号7のアミノ酸配列(配列番号1の81番目のグルタミン酸残基をシステイン残基に置換したアミノ酸配列)、144番目から150番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
(2)フコース結合性タンパク質129E81Cの糖鎖への結合親和性評価
表面プラズモン共鳴法により、フコース結合性タンパク質129E81Cの、Hタイプ1型糖鎖およびHタイプ3型糖鎖への結合親和性評価を行った。具体的には、Biacore T100(T200 Sensitivity Enhanced)機器(GEヘルスケア製)を用い、アナライトを組換えタンパク質、固相をHタイプ1型糖鎖またはHタイプ3型糖鎖としてカイネティクス解析を行った。センサーチップはデキストランがコートされたSensor Chip CM5(GEヘルスケア製)を使用し、デキストランにストレプトアビジン(富士フイルム和光純薬製)をアミンカップリング法により固定したのち、ビオチン標識されたHタイプ1型糖鎖およびHタイプ3型糖鎖(Glycotech製)を添加し、ビオチンとストレプトアビジンの反応により各糖鎖をセンサーチップ上に固定してHタイプ1型糖鎖またはHタイプ3型糖鎖が固定されたセンサーチップを作製した。糖鎖結合親和性の測定には緩衝液としてHBS−EP+(GEヘルスケア製)を用い、測定条件は流速を30μL/分、結合時間を6分間、解離時間を3分間または6分間とした。センサーチップの再生は25mMの水酸化ナトリウムを用い、流速30μL/分、再生時間30秒で行った。解析はBiacore T100(T200 Sensitivity Enhanced)機器に付属の解析ソフト(Biacore T100 Evaluation Software、versionまたはBiacore T200 Evaluation Software、version)を用いて行い、1:1 Bindingのフィッティングにより解離定数(KD)を算出した。
実施例8は、129アミノ酸残基からなる配列番号8で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列(配列番号2の81番目のグルタミン酸残基をグルタミン残基に置換したアミノ酸配列)のN末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、C末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質(以下、フコース結合性タンパク質129E81Qとする。)の製造と糖鎖への結合親和性評価に関するものである。
(1)フコース結合性タンパク質129E81Qの製造
実施例1に記載のフコース結合性タンパク質129に対して、配列番号1の81番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基をグルタミン残基に置換する変異導入を行うことで、フコース結合性タンパク質129E81Qを製造した。フコース結合性タンパク質129E81Qのアミノ酸配列は配列番号39であり、その15番目から143番目までは配列番号8のアミノ酸配列(配列番号1の81番目のグルタミン酸残基をグルタミン残基に置換したアミノ酸配列)、144番目から150番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
(2)フコース結合性タンパク質129E81Qの糖鎖への結合親和性評価
実施例7の(2)に記載の方法により、フコース結合性タンパク質129E81QのHタイプ1型糖鎖およびHタイプ3型糖鎖への結合親和性評価を行った結果、Hタイプ1型糖鎖に対する解離定数は3.7nM、Hタイプ3型糖鎖に対する解離定数は3.6nMであった。
実施例9は、129アミノ酸残基からなる配列番号9で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列(配列番号2の81番目のグルタミン酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列)のN末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、C末端にシステイン残基を含むオリゴペプチド配列を付加したフコース結合性タンパク質(以下、フコース結合性タンパク質129E81Hとする。)の製造と、生産性および糖鎖への結合親和性評価に関するものである。
(1)フコース結合性タンパク質129E81Hの製造と生産性評価
実施例1に記載のフコース結合性タンパク質129に対して、配列番号1の81番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基をヒスチジン残基に置換する変異導入を行うことで、フコース結合性タンパク質129E81Hを製造した。フコース結合性タンパク質129E81Hのアミノ酸配列は配列番号40であり、その15番目から143番目までは配列番号9のアミノ酸配列(配列番号1の81番目のグルタミン酸残基をヒスチジン残基に置換したアミノ酸配列)、144番目から150番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
(2)フコース結合性タンパク質129E81Hの糖鎖への結合親和性評価
実施例7の(2)に記載の方法により、フコース結合性タンパク質129E81HのHタイプ1型糖鎖およびHタイプ3型糖鎖への結合親和性評価を行った結果、Hタイプ1型糖鎖に対する解離定数は1.0nM、Hタイプ3型糖鎖に対する解離定数は0.8nMであった。
実施例10は、129アミノ酸残基からなる配列番号10で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列(配列番号2の81番目のグルタミン酸残基をメチオニン残基に置換したアミノ酸配列)のN末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、C末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質(以下、フコース結合性タンパク質129E81Mとする。)の製造と糖鎖への結合親和性評価に関するものである。
(1)フコース結合性タンパク質129E81Mの製造
実施例1に記載のフコース結合性タンパク質129に対して、配列番号1の81番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基をメチオニン残基に置換する変異導入を行うことで、フコース結合性タンパク質129E81Mを製造した。フコース結合性タンパク質129E81Mのアミノ酸配列は配列番号41であり、その15番目から143番目までは配列番号10のアミノ酸配列(配列番号1の81番目のグルタミン酸残基をメチオニン残基に置換したアミノ酸配列)、144番目から150番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
(2)フコース結合性タンパク質129E81Mの糖鎖への結合親和性評価
実施例7の(2)に記載の方法により、フコース結合性タンパク質129E81MのHタイプ1型糖鎖およびHタイプ3型糖鎖への結合親和性評価を行った結果、Hタイプ1型糖鎖に対する解離定数は3.1nM、Hタイプ3型糖鎖に対する解離定数は3.1nMであった。
実施例11は、実施例1で製造したフコース結合性タンパク質129の糖鎖への結合親和性評価に関するものである。実施例7の(2)に記載の方法により、フコース結合性タンパク質129のHタイプ1型糖鎖およびHタイプ3型糖鎖への結合親和性評価を行った結果、Hタイプ1型糖鎖に対する解離定数は2.7nM、Hタイプ3型糖鎖に対する解離定数は11nMであった。
比較例2は、比較例1で製造した組換えBC2LCN(155)cysの糖鎖への結合親和性評価に関するものである。実施例7の(2)に記載の方法により、比較例1で製造した組換えBC2LCN(155)cysのHタイプ1型糖鎖およびHタイプ3型糖鎖への結合親和性評価を行った結果、Hタイプ1型糖鎖に対する解離定数は3.9nM、Hタイプ3型糖鎖に対する解離定数は11nMであった。
参考例1では、比較例1に記載の組換えBC2LCNに対して、配列番号1の81番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基への変異導入、すなわち、組換えBC2LCN(155)cysのアミノ酸配列(配列番号32)の95番目のグルタミン酸残基を他のアミノ酸残基に置換する変異導入を行ったのち、形質転換体を用いて組換えタンパク質を製造し、組換えタンパク質の熱安定性とHタイプ1型糖鎖およびHタイプ3型糖鎖に対する結合親和性を評価した。
(1)配列番号1の72番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基への変異導入
前記比較例1の(1)に記載の発現ベクターpET−BC2LCN(155)cysを鋳型として、配列番号54および配列番号61に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをPCRプライマーとして、特開2018−000038号公報で開示されている方法によりPCRを実施した。なお、配列番号61に記載の配列からなるPCRプライマーは縮重配列NNB(N=A,C,GまたはT、B=C,GまたはT)を有し、配列番号32の95番目のグルタミン酸残基(配列番号1の81番目のグルタミン酸残基に相当)が他のアミノ酸残基にランダムに置換されるよう設計した。得られたPCR産物を制限酵素KpnIおよびXhoIで消化し、同様に制限酵素処理した前記(1)の発現ベクターpET−BC2LCNcysとライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いてE. coli BL21(DE3)を形質転換し、複数の形質転換体を得た。それぞれの形質転換体から発現ベクターを抽出し、塩基配列を解析した。その結果、表7に示す19種類の発現ベクターとそれを有する形質転換体を作製した。
前記(1)で作製した形質転換体L1aからL19aまで(表7)を用い、比較例1に記載の方法により組換えタンパク質の生産、可溶性タンパク質抽出液の回収、およびニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる可溶性タンパク質抽出液からのフコース結合性タンパク質の精製を行い、表7に記載した19種類の組換えタンパク質を製造した。製造した19種類のフコース結合性タンパク質を含む溶液はD−PBS(−)に対して透析したのち、D−PBS(−)を用いて適切な濃度に調整後、後述する糖鎖への結合親和性評価に使用した。
(3)組換えタンパク質の糖鎖結合親和性評価
前記(2)で製造した組換えタンパク質の糖鎖への結合親和性を調べるため、実施例7の(2)に記載の方法により、Hタイプ1型糖鎖およびHタイプ3型糖鎖に対する結合親和性評価を行った。表8に、前記(3)で製造した組換えタンパク質および組換えBC2LCN(155)cysのHタイプ1型糖鎖およびHタイプ3型糖鎖に対する解離定数を示す。表8に示すように、フコース結合性タンパク質E81C(A1:配列番号1の81番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がシステイン残基に置換)、フコース結合性タンパク質E81Q(A2:配列番号1の81番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がグルタミン残基に置換)、フコース結合性タンパク質E81H(A3:配列番号1の81番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がヒスチジン残基に置換)、フコース結合性タンパク質E81M(A4:配列番号1の81番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基がメチオニンに置換)は、組換えBC2LCN(155)cys(C0:配列番号1の81番目のグルタミン酸残基として特定されるグルタミン酸残基は置換されていない)よりもHタイプ1型糖鎖およびHタイプ3型糖鎖に対する結合親和性が高いことがわかる。
実施例12は、127アミノ酸残基からなる配列番号11で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列(配列番号3の72番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列)のN末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、C末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質(以下、フコース結合性タンパク質127C72Gとする。)の製造と熱に対する安定性および糖鎖への結合親和性評価に関するものである。
(1)フコース結合性タンパク質127C72Gの製造
発現ベクターpET−BC2LCN(127C72G)cysは、フコース結合性タンパク質127C72Gを発現させるための発現ベクターである。フコース結合性タンパク質127C72Gのアミノ酸配列は、配列番号42であり、その5番目から10番目まではポリヒスチジン配列、15番目から141番目までは配列番号11のアミノ酸配列、142番目から148番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
(2)変性中点温度の測定
フコース結合性タンパク質127C72Gの変性中点温度の測定を行った。具体的には、前記フコース結合性タンパク質127C72GのD−PBS(−)溶液を再生セルロース膜(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、分画分子量3500)を用いて、透析用緩衝液(50mM酢酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、pH5.5)中で緩衝液交換を行った。透析内液の組換えタンパク質を紫外吸収法により濃度を測定し、透析用緩衝液を用いて500μg/mLになるよう希釈し、示差走査熱量計(マルバーン・パナテリティカル社製、MicroCalVP−Capillary DSC)を用いて変性中点温度を測定した。なお、変性中点温度はタンパク質の半分が変性する温度であり、る。変性中点温度が高いほど熱に対する安定性が高いことを示す。変性中点温度の測定条件は、前記透析後のフコース結合性タンパク質127C72G溶液の溶液量を400μL、昇温速度を60℃/h、加熱温度を40℃−110℃とした。測定の結果、フコース結合性タンパク質127C72Gの変性中点温度は88.3±0.5℃であった。
(3)糖鎖への結合親和性評価
実施例7の(2)に記載の方法により、フコース結合性タンパク質127C72GのHタイプ1型糖鎖およびHタイプ3型糖鎖への結合親和性評価を行った結果、Hタイプ1型糖鎖に対する解離定数は1.2nM、Hタイプ3型糖鎖に対する解離定数は1.1nMであった。
実施例13は、127アミノ酸残基からなる配列番号12で示されるフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列(配列番号3の72番目のシステイン残基をアラニン残基に置換したアミノ酸配列)のN末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、C末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質(以下、フコース結合性タンパク質127C72Aとする。)の製造と熱に対する安定性および糖鎖への結合親和性評価に関するものである。
(1)フコース結合性タンパク質127C72Aの製造
発現ベクターpET−BC2LCN(127C72A)cysは、フコース結合性タンパク質127C72Aを発現させるための発現ベクターである。フコース結合性タンパク質127C72Aのアミノ酸配列は、配列番号43であり、その5番目から10番目まではポリヒスチジン配列、15番目から141番目までは配列番号12のアミノ酸配列、142番目から148番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
(2)変性中点温度の測定
実施例12の(2)に記載の方法により、フコース結合性タンパク質127C72Aの変性中点温度を測定した結果、フコース結合性タンパク質127C72Aの変性中点温度は83.4±0.5℃であった。
(3)糖鎖への結合親和性評価
実施例7の(2)に記載の方法により、フコース結合性タンパク質127C72GのHタイプ1型糖鎖およびHタイプ3型糖鎖への結合親和性評価を行った結果、Hタイプ1型糖鎖に対する解離定数は0.7nM、Hタイプ3型糖鎖に対する解離定数は2.0nMであった。
比較例3は、比較例1で製造した組換えBC2LCN(155)cysの熱に対する安定性評価に関するものである。実施例12の(2)に記載の方法により、比較例1で製造した組換えBC2LCN(155)cysの変性中点温度の測定を行った結果、組換えBC2LCN(155)cysの変性中点温度は82.3±0.5℃であった。
参考例2では、比較例1に記載の組換えBC2LCNに対して、配列番号1の72番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基への変異導入、すなわち、組換えBC2LCN(155)cysのアミノ酸配列(配列番号32)の86番目のシステイン残基を他のアミノ酸残基に置換する変異導入を行ったのち、形質転換体を用いて組換えタンパク質を製造し、組換えタンパク質の熱に対する安定性とHタイプ1型糖鎖およびHタイプ3型糖鎖に対する結合親和性を評価した。
(1)配列番号1の72番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基への変異導入
前記比較例1の(1)に記載の発現ベクターpET−BC2LCN(155)cysを鋳型として、配列番号48および配列番号62に記載の配列からなる各オリゴヌクレオチドをPCRプライマーとして、特開2018−000038号公報で開示されている方法によりPCRを実施した。なお、配列番号50に記載の配列からなるPCRプライマーは縮重配列VNN(V=A,CまたはG、N=A,C,G)を有し、配列番号32の86番目のシステイン残基(配列番号1の72番目のシステイン残基に相当)が他のアミノ酸残基にランダムに置換されるよう設計した。得られたPCR産物を制限酵素NcoIおよびKpnIで消化し、同様に制限酵素処理した前記(1)の発現ベクターpET−BC2LCNcysとライゲーション反応を行った。このライゲーション産物を用いてE. coli BL21(DE3)を形質転換し、複数の形質転換体を得た。それぞれの形質転換体から発現ベクターを抽出し、塩基配列を解析した。その結果、表10に示す19種類の発現ベクターとそれを有する形質転換体を作製した。
前記(1)で作製した形質転換体L1bからL19bまで(表10)を用い、比較例1に記載の方法により組換えタンパク質の生産、可溶性タンパク質抽出液の回収、およびニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる可溶性タンパク質抽出液からのフコース結合性タンパク質の精製を行い、表10に記載した19種類の組換えタンパク質を製造した。
(3)組換えタンパク質の熱に対する安定性評価
前記(2)で製造した組換えタンパク質の熱に対する安定性を調べるため、加熱処理後の組換えタンパク質の糖鎖結合親和性の評価を表面プラズモン共鳴法により行った。具体的には、前記(2)で製造した組換えタンパク質を紫外吸収法により濃度を測定し、D−PBS(−)(富士フイルム和光純薬製)を用いて30μg/mLになるよう希釈した。調製した組換えタンパク質溶液を室温または73℃で30分間保持したのち、Biacore T100(T200 Sensitivity Enhanced)機器(GEヘルスケア製)を用い、アナライトを組換えタンパク質、固相をHタイプ3型糖鎖として糖鎖結合性評価を行った。センサーチップはデキストランがコートされたSensor Chip CM5(GEヘルスケア製)を用い、デキストランにストレプトアビジン(富士フイルム和光純薬製)をアミンカップリング法により固定した後、ビオチン標識されたHタイプ3型糖鎖(Glycotech製)を添加し、ビオチンとストレプトアビジンの反応により各糖鎖をセンサーチップ上に固定してHタイプ3型糖鎖が固定されたセンサーチップを作製した。Hタイプ3型糖鎖に対する結合性の測定はBinding Assay法により行い、Binding stabilityの値を糖鎖結合性の測定値とした。緩衝液としてHBS−EP+(GEヘルスケア製)を用い、温度25℃で測定を行った。結合条件は、流速30μL/分、結合時間を2分間、解離時間を1分間とした。センサーチップの再生条件は、25mMの水酸化ナトリウムを用い、流速30μL/分、再生時間15秒で行った。解析はBiacore T100(T200 Sensitivity Enhanced)機器に付属の解析ソフト(Biacore T100 Evaluation Software、versionまたはBiacore T200 Evaluation Software、version)を用いて行った。
前記(3)において、73℃、30分間の加熱処理後も糖鎖結合性を示したフコース結合性タンパク質C72G、フコース結合性タンパク質C72Aおよびフコース結合性タンパク質C72Wと、組換えBC2LCN(155)cysについて、実施例12の(2)に記載の方法により変性中点温度を測定した結果を表12に示す。表12に示すように、フコース結合性タンパク質C72G(配列番号1の72番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基がグリシン残基に置換)およびフコース結合性タンパク質C72A(配列番号1の72番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基がアラニン残基に置換)は、組換えBC2LCN(155)cys(配列番号1の72番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基は置換されていない)に比べ変性中点温度が高く、熱安定性が向上したことがわかる。一方、フコース結合性タンパク質C72W(配列番号1の72番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基がトリプトファン残基に置換)は、組換えBC2LCN(155)cysに比べ変性中点温度が低く、熱安定性が低下したことがわかる。
前記(4)において、組換えBC2LCN(155)cysに比べて熱に対する安定性が高いことが判明したフコース結合性タンパク質C72Gおよびフコース結合性タンパク質C72Aについて、実施例7の(2)に記載の方法により、Hタイプ1型糖鎖およびHタイプ3型糖鎖に対する結合親和性評価を行った。表13に、フコース結合性タンパク質C72Gおよびフコース結合性タンパク質C72Aおよび組換えBC2LCN(155)cysの、Hタイプ1型糖鎖およびHタイプ3型糖鎖に対する解離定数を示す。表13に示すように、フコース結合性タンパク質C72Gおよびフコース結合性タンパク質C72Aは、組換えBC2LCN(155)cysよりもHタイプ1型糖鎖およびHタイプ3型糖鎖に対する結合親和性が高いことがわかる。
実施例14から17は、実施例1から4で製造したフコース結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した吸着剤の製造に関するものである。具体的には、不溶性担体として市販多孔性合成高分子系担体(トヨパールHW−40EC、東ソー製)を用い、担体固定化用タグとしてシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質を固定化するための官能基(マレイミド基)を導入後、当該タンパク質のシステイン残基のメルカプト基とマレイミド基を反応させることにより、当該タンパク質が不溶性担体に固定化された吸着剤を製造した。
(1)不溶性担体への親水性高分子の固定
水に懸濁したトヨパールHW−40EC(東ソー製、100−300μm)をステンレス製標準ふるいにより150−250μmの粒度範囲に湿式分級したのち、グラスフィルターでろ過したものを使用した。なお、以下の比較例において、150−250μmに分級したトヨパールHW−40ECを吸着剤として評価する場合は、吸着剤Aとする。水に湿潤した状態での吸着剤HW−40ECの平均粒径は180μm、粒度範囲は150〜250μmであった。
(2)親水性高分子が固定された不溶性担体へのマレイミド基の導入
100mL容のテフロン(登録商標)製容器に、5.0gのDEX550トヨパールHW−40ECと、予め調製した10.0mLのテトラエチレングリコールジグリシジルエーテル水溶液(ナガセケムテックス製デナコールEX−821から調製、濃度100mg/mL)を添加したのち、30℃の振とう機内で30分間振とうしたのち、反応容器に104μL(156mg、1.87mmol)の48%(約18.1M)NaOH水溶液を添加し、30℃の振とう機内で8時間振とうすることによりエポキシ化DEX550トヨパールHW−40Eを作製した。反応終了後、反応液をグラスフィルター上でろ液が中性になるまで水で洗浄した。次に、ろ別したエポキシ化DEX550トヨパールHW−40EC全量を100mL容のテフロン(登録商標)製容器に添加し、10.0mLの0.5M エチレンジアミン水溶液(東京化成製エチレンジアミンから調製)を添加したのち、50℃の振とう機内で3時間振とうすることによりアミノ化DEX550トヨパールHW−40ECを作製した。反応終了後、反応液をグラスフィルター上でろ液が中性になるまで水で洗浄した。次に、ろ別したアミノ化DEX550トヨパールHW−40EC全量を100mL容のテフロン(登録商標)製容器に添加し、10.0mLの3−マレイミドプロピオン酸 N−スクシンイミジルのDMSO溶液(富士フイルム和光純薬製3−マレイミドプロピオン酸 N−スクシンイミジルから調製、濃度10mg/mL)を添加したのち、35℃の振とう機内で4時間振とうすることによりアミノ化トヨパールHW−40ECのマレイミド化を行なった。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で20mLのDMSOで3回、30mLの水で5回洗浄することにより、目的のマレイミド化DEX550トヨパールHW−40ECを作製した。
(3)マレイミド基が導入された不溶性担体へのフコース結合性タンパク質の固定化
フコース結合性タンパク質として、実施例1で調製した精製129溶液(フコース結合性タンパク質129のD−PBS(−)溶液)を使用した。また、前記マレイミド化DEX550トヨパールHW−40ECは水で懸濁したものをグラスフィルターでろ過したものを使用した。
(4)親水性高分子が固定された不溶性担体へのブロモアセチル基の導入
100mL容のテフロン製容器に、実施例14の(3)で作製したアミノ化DEX550トヨパールHW−40ECを5.0g添加したのち、10.0mLのN−(ブロモアセトキシ)スクシンイミドのDMSO溶液(東京化成製N−(ブロモアセトキシ)スクシンイミドから調製、濃度10mg/mL)を添加したのち、25℃の振とう機内で4時間振とうすることによりアミノ化トヨパールHW−40ECのハロアセチル化を行なった。反応終了後、反応液をグラスフィルター上で20mLのDMSOで3回、30mLの水で5回洗浄することにより、目的のブロモアセチル化DEX550トヨパールHW−40ECを作製した。
(5)ブロモアセチル基が導入された不溶性担体へのフコース結合性タンパク質の固定化
マレイミド化DEX550トヨパールHW−40ECの代わりにブロモアセチル化DEX550トヨパールHW−40ECを用いた以外は、実施例14の(3)と同様の方法によりフコース結合性タンパク質129の固定化を行い、目的の吸着剤129Brを製造した。
実施例15は、実施例2で製造したフコース結合性タンパク質127を不溶性担体に固定化した吸着剤(以下、吸着剤127とする。)の製造に関するものである。
実施例16は、実施例3で製造したフコース結合性タンパク質129G36Cを不溶性担体に固定化した吸着剤(以下、吸着剤129G36Cとする。)の製造に関するものである。
実施例17は、実施例4で製造したフコース結合性タンパク質127G36Cを不溶性担体に固定化した吸着剤(以下、吸着剤127G36Cとする。)の製造に関するものである。
参考例3は、比較例1で製造した組換えBC2LCN(155)cysを不溶性担体に固定化した吸着剤の製造に関するものである。具体的には、不溶性担体として市販多孔性合成高分子系担体(トヨパールHW−40EC、東ソー製)を用い、担体固定化用タグとしてシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加した組換えBC2LCN(155)cysを固定化するための官能基(マレイミド基)を導入後、当該タンパク質のシステイン残基のメルカプト基とマレイミド基を反応させることにより、当該タンパク質が不溶性担体に固定化された吸着剤(以下、吸着剤155とする。)を製造した。
実施例18から24、比較例4から10および参考例4から10は、前記実施例14から17および参考例3で製造した吸着剤の、細胞吸着能および細胞分離能評価に関するものである。
(1)吸着剤を充填したカラムの作製
2.5mL容シリンジ(テルモ製)と注射針(テルモ製、22G)の間に目開き40μmのポリエステルメッシュフィルター(BioLab製)を装着したカラムを作製した。次に、実施例14で作製した吸着剤129、実施例15で製造した吸着剤127、実施例16で製造した吸着剤129G36Cおよび実施例17で製造した吸着剤127G36CをMACS緩衝液で置換したのち、12時間以上放置後の吸着剤の沈降体積が50%となるように調整した吸着剤の50%懸濁液を調製し、作製したカラムに1.0mLを添加して、各吸着剤をカラムに充填した(吸着剤容量:500μL)。
(2)2102Ep細胞の培養と評価用細胞懸濁液の調製
接着性細胞である2102Ep細胞は、10%FBS(Biological Industries製)と抗生物質溶液(ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、富士フイルム和光純薬製)を添加したD−MEM培地(High Glucose、富士フイルム和光純薬製)を用い、直径6cmの接着培養用シャーレ(コーニング製)または直径10cmの接着培養用シャーレ(コーニング製)に細胞を播種し、5%CO2雰囲気下、37℃で培養した。
(3)吸着剤を充填したカラムを用いた2102Ep細胞の吸着能評価
各吸着剤を充填したカラムを垂直に立てた状態で、添加量が1.1x107個/mL−吸着剤となるよう、前記の方法で調製した2102Ep細胞の細胞懸濁液をカラムに添加した。
比較例4は、フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤Aの、2102Ep細胞の吸着能評価に関するものである。
参考例4は、組換えBC2LCN(155)cysを固定化した吸着剤155の、2102Ep細胞の吸着能評価に関するものである。
実施例19は、「Fucα1−2Galβ1−3GlcNAcおよび/またはFucα1−2Galβ1−3GalNAc」からなる構造を含む糖鎖を有するヒト肺腺がん細胞(PC−9細胞、DSファーマバイオメディカルより入手、ECACC株番号:90071810)を用いた、吸着剤129、吸着剤127、吸着剤129G36Cおよび吸着剤127G36Cの細胞吸着能評価に関するものである。
(1)吸着剤を充填したカラムの作製
実施例18の(1)に記載の方法により、前記各吸着剤を充填したカラムを作製した(吸着剤容量:500μL)。
(2)PC−9細胞の培養と評価用細胞懸濁液の調製
接着性細胞であるPC−9細胞は、10%FBS(Biological Industries製)と抗生物質溶液(ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、富士フイルム和光純薬製)を添加したRPMI 1640培地(富士フイルム和光純薬製)を用い、直径6cmの接着培養用シャーレ(コーニング製)または直径10cmの接着培養用シャーレ(コーニング製)に細胞を播種し、5%CO2雰囲気下、37℃で培養した。
(3)吸着剤を充填したカラムを用いたPC−9細胞の吸着能評価
各吸着剤を充填したカラムを垂直に立てた状態で、添加量が4.8x106個/mL−吸着剤となるよう、前記の方法で調製したPC−9細胞の細胞懸濁液をカラムに添加した。その後、実施例18の(3)に記載の方法により、各吸着剤から流出細胞液を回収し、PC−9細胞の流出率を算出した。なお、Cell Tracker Orangeで染色したPC−9細胞の濃度と蛍光強度の検量線の作成は、実施例18の(3)に記載の方法に従って行った。
比較例5は、フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤Aの、PC−9細胞の吸着能評価に関するものである。
参考例5は、組換えBC2LCN(155)cysを固定化した吸着剤155の、PC−9細胞の吸着能評価に関するものである。
実施例20は、「Fucα1−2Galβ1−3GlcNAcおよび/またはFucα1−2Galβ1−3GalNAc」からなる構造を含む糖鎖を有さないヒトバーキットリンパ腫細胞(Ramos細胞、JCRB9119)を用いた、吸着剤129、吸着剤127、吸着剤129G36Cおよび吸着剤127G36Cの細胞吸着能評価に関するものである。
(1)吸着剤を充填したカラムの作製
実施例18の(1)に記載の方法により、前記各吸着剤を充填したカラムを作製した(吸着剤容量:500μL)。
(2)Ramos細胞の培養と評価用細胞懸濁液の調製
浮遊性細胞であるRamos細胞は、10%FBS(Biological Industries製)と抗生物質溶液(ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、富士フイルム和光純薬製)を添加したRPMI 1640培地(富士フイルム和光純薬製)を用い、浮遊培養用シャーレ(住友ベークライト製)に細胞を播種し、5%CO2雰囲気下、37℃で培養した。
(3)吸着剤を充填したカラムを用いたRamos細胞の吸着能評価
各吸着剤を充填したカラムを垂直に立てた状態で、添加量が1.4x107個/mL−吸着剤となるよう、前記の方法で調製したRamos細胞の細胞懸濁液をカラムに添加した。その後、実施例18の(3)に記載の方法により、各吸着剤から流出細胞液を回収し、Ramos細胞の流出率を算出した。なお、Cell Tracker Orangeで染色したRamos細胞の濃度と蛍光強度の検量線の作成は、実施例18の(3)に記載の方法に従って行った。
比較例6は、フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤Aの、Ramos細胞の吸着能評価に関するものである。
参考例6は、組換えBC2LCN(155)cysを固定化した吸着剤155の、Ramos細胞の吸着能評価に関するものである。
実施例21は、「Fucα1−2Galβ1−3GlcNAcおよび/またはFucα1−2Galβ1−3GalNAc」からなる構造を含む糖鎖を有するヒト肺腺がん細胞(PC−9細胞)と「Fucα1−2Galβ1−3GlcNAcおよび/またはFucα1−2Galβ1−3GalNAc」からなる構造を含む糖鎖を有さないヒト慢性骨髄性白血病細胞であるK562細胞(JCRB0019)の細胞混合物を用いた、吸着剤127の細胞分離能評価に関するものである。
(1)吸着剤127の製造と吸着剤127を充填したカラムの作製
実施例15に記載の方法に従い、吸着剤127を製造した。1mLの吸着剤127あたりのフコース結合性タンパク質127の固定化量を算出した結果、固定化量は443μg/mL−吸着剤であった。次に、実施例18の(1)に記載の方法に従い、製造した吸着剤127を充填したカラムを作製した(吸着剤容量:500μL)。
(2)PC−9細胞およびK562細胞の培養と評価用細胞混合物の調製
接着性細胞であるPC−9細胞の培養は、実施例19に記載の方法に従って行った。培養終了後、Cell Tracker Orangeの代わりにCell Tracker Green(サーモフィッシャーサイエンティフィック製)を用いた以外は、実施例18の(2)に記載の方法に従い、Cell Tracker Greenで染色したPC−9細胞の細胞懸濁液を調製した。
(3)吸着剤を充填したカラムを用いた細胞分離能評価
各吸着剤を充填したカラムを垂直に立てた状態で、添加量が4.8x106個/mL−吸着剤となるよう、すなわち、PC−9細胞とK562細胞のそれぞれが2.4x106個/mL−吸着剤となるよう、前記の方法で調製した細胞混合物をカラムに添加した。
比較例7は、PC−9細胞とK562細胞の細胞混合物を用いた、フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤Aの細胞分離能評価に関するものである。
参考例7は、PC−9細胞とK562細胞の細胞混合物を用いた、吸着剤155の細胞分離能評価に関するものである。
実施例22は、「Fucα1−2Galβ1−3GlcNAcおよび/またはFucα1−2Galβ1−3GalNAc」からなる構造を含む糖鎖を有するヒトiPS細胞株である201B7細胞(特許実施許諾契約およびMTA契約を締結後、京都大学CiRAより分譲)を用いた、吸着剤127の細胞吸着能評価に関するものである。
(1)吸着剤を充填したカラムの作製
実施例21の(1)で作製した吸着剤127を用い、実施例18の(1)に記載の方法に従い、製造した吸着剤127を充填したカラムを作製した(吸着剤容量:500μL)。
(2)201B7細胞の培養と評価用細胞懸濁液の調製
201B7細胞の培養は、接着培養用シャーレ(コーニング製)を用いて、以下の方法で行った。
(3)吸着剤を充填したカラムを用いた201B7細胞の吸着能評価
吸着剤127を充填したカラムを垂直に立てた状態で、添加量が4.4x105個/mL−吸着剤となるよう、前記の方法で調製した201B7細胞の細胞懸濁液をカラムに添加した。その後、実施例18の(3)に記載の方法により、吸着剤127から流出細胞液を回収し、201B7細胞の流出率を算出した結果、吸着剤127における201B7細胞の流出率は0.5%であった(表18)。従って、本発明のフコース結合性タンパク質127を不溶性担体に固定化した吸着剤127は、高いiPS細胞吸着能を持つことが明らかとなった。なお、Cell Tracker Orangeで染色した201B7細胞の濃度と蛍光強度の検量線の作成は、実施例18の(3)に記載の方法に従って行った。
比較例8は、フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤Aの、201B7細胞の吸着能評価に関するものである。
参考例8は、組換えBC2LCN(155)cysを固定化した吸着剤155の、201B7細胞の吸着能評価に関するものである。
実施例23は、「Fucα1−2Galβ1−3GlcNAcおよび/またはFucα1−2Galβ1−3GalNAc」からなる構造を含む糖鎖を有さない正常ヒト皮膚線維芽細胞であるNHDF細胞(PromoCell製)を用いた、吸着剤127の細胞吸着能評価に関するものである。
(1)吸着剤を充填したカラムの作製
実施例21の(1)で製造した吸着剤127を用い、実施例18の(1)に記載の方法に従い、製造した吸着剤127を充填したカラムを作製した(吸着剤容量:500μL)。
(2)NHDF細胞の培養と評価用細胞懸濁液の調製
接着性細胞であるNHDF細胞は、線維芽細胞増殖培地2(PromoCell製)を用い、直径10cmの接着培養用シャーレ(コーニング製)または直径15cmの接着培養用シャーレ(コーニング製)に細胞を播種し、5%CO2雰囲気下、37℃で培養した。培養終了後、Cell Tracker Orangeの代わりにCell Tracker Green(サーモフィッシャーサイエンティフィック製)を用いた以外は、実施例18の(2)に記載の方法に従い、Cell Tracker Greenで染色したNHDF細胞の細胞懸濁液を調製した。
(3)吸着剤を充填したカラムを用いたNHDF細胞の吸着能評価
吸着剤127を充填したカラムを垂直に立てた状態で、添加量が8.2x105個/mL−吸着剤となるよう、前記の方法で調製したNHDF細胞の細胞懸濁液をカラムに添加した。その後、実施例18の(3)に記載の方法により、吸着剤127から流出細胞液を回収し、NHDF細胞の流出率を算出した結果、吸着剤127におけるNHDF細胞の流出率は90.3%であった(表19)。従って、本発明のフコース結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した各吸着剤に、NHDF細胞は吸着しないことが明らかとなった。なお、Cell Tracker Greenで染色したNHDF細胞の濃度と蛍光強度の検量線の作成は、実施例21の(3)に記載の方法に従って行った。
比較例9は、NHDF細胞を用いた、フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤Aの細胞吸着能評価に関するものである。
参考例9は、NHDF細胞を用いた、吸着剤155の細胞吸着能評価に関するものである。
実施例24は、「Fucα1−2Galβ1−3GlcNAcおよび/またはFucα1−2Galβ1−3GalNAc」からなる構造を含む糖鎖を有するヒトiPS細胞株である201B7細胞と「Fucα1−2Galβ1−3GlcNAcおよび/またはFucα1−2Galβ1−3GalNAc」からなる構造を含む糖鎖を有さないNHDF細胞の細胞混合物を用いた、吸着剤127の細胞分離能評価に関するものである。
(1)吸着剤を充填したカラムの作製
実施例21の(1)で製造した吸着剤127を用い、実施例18の(1)に記載の方法に従い、製造した吸着剤127を充填したカラムを作製した(吸着剤容量:500μL)。
(2)評価用細胞混合物の調製
Cell Tracker Orangeで染色した201B7細胞の細胞懸濁液は、実施例22の(2)で調製したものを使用した。また、Cell Tracker Greenで染色したNHDF細胞の細胞懸濁液は、実施例23の(2)で調製したものを使用した。
(3)吸着剤を充填したカラムを用いた細胞分離能評価
各吸着剤を充填したカラムを垂直に立てた状態で、添加量が1.3x106個/mL−吸着剤となるよう、すなわち、201B7細胞が0.46x106個/mL−吸着剤、NHDF細胞が0.84x106個/mL−吸着剤となるよう、前記の方法で調製した細胞混合物をカラムに添加した。
比較例10は、201B7細胞とNHDF細胞の細胞混合物を用いた、フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤Aの細胞分離能評価に関するものである。
参考例10は、201B7細胞とNHDF細胞の細胞混合物を用いた、吸着剤155の細胞分離能評価に関するものである。
実施例25は、「Fucα1−2Galβ1−3GlcNAcおよび/またはFucα1−2Galβ1−3GalNAc」からなる構造を含む糖鎖を有するヒトiPS細胞株である201B7細胞、253G1細胞、1231A3細胞(それぞれ特許実施許諾契約およびMTA契約を締結後、京都大学CiRAより分譲)と、「Fucα1−2Galβ1−3GlcNAcおよび/またはFucα1−2Galβ1−3GalNAc」からなる構造を含む糖鎖を有さないNHDF細胞との細胞混合物を用いた、吸着剤127の細胞分離能評価に関するものである。
(1)吸着剤127の製造と吸着剤127を充填したカラムの作製
実施例15に記載の方法に従い、吸着剤127を製造した。1mLの吸着剤127あたりのフコース結合性タンパク質127の固定化量を算出した結果、固定化量は1000μg/mL−吸着剤であった。次に、実施例18の(1)に記載の方法に従い、製造した吸着剤127を充填したカラムを作製した(吸着剤容量:500μL)。
(2)評価用細胞混合物の調製
Cell Tracker Orangeで染色した201B7細胞、253G1細胞、1231A3細胞の細胞懸濁液はそれぞれ、実施例22の(2)の方法に従い調製したものを使用した。また、Cell Tracker Greenで染色したNHDF細胞の細胞懸濁液は、実施例23の(2)で調製したものを使用した。
(3)吸着剤を充填したカラムを用いた細胞分離能評価
各吸着剤を充填したカラムを垂直に立てた状態で、201B7細胞の細胞懸濁液とNHDF細胞の細胞混合物については添加量が3.3x106個/mL−吸着剤となるよう、すなわち、201B7細胞が1.6x106個/mL−吸着剤、NHDF細胞が1.7x106個/mL−吸着剤となるよう、前記の方法で調製した細胞混合物をカラムに添加した。また、253G1細胞の細胞懸濁液とNHDF細胞の細胞混合物については添加量が3.6x106個/mL−吸着剤となるよう、すなわち、253G1細胞が1.9x106個/mL−吸着剤、NHDF細胞が1.7x106個/mL−吸着剤となるよう、また、1231A3細胞の細胞懸濁液とNHDF細胞の細胞混合物については添加量が5.5x106個/mL−吸着剤となるよう、すなわち、1231A3細胞が3.8x106個/mL−吸着剤、NHDF細胞が1.7x106個/mL−吸着剤となるよう、前記の方法で調製した細胞混合物をカラムに添加した。
比較例11は、201B7細胞とNHDF細胞の細胞混合物、253G1細胞とNHDF細胞の細胞混合物、1231A3細胞とNHDF細胞の細胞混合物を用いた、フコース結合性タンパク質を固定化していない吸着剤Aの細胞分離能評価に関するものである。
実施例26は、実施例12で製造したフコース結合性タンパク質127C72Gを不溶性担体に固定化した吸着剤(以下、吸着剤127C72Gとする。)の製造に関するものである。
実施例27は、吸着剤127C72Gの201B7細胞の吸着能評価に関するものである。
(1)吸着剤を充填したカラムの作製
実施例26で製造した吸着剤127C72Gを用い、実施例18の(1)に記載の方法に従い、製造した吸着剤127C72Gを充填したカラムを作製した(吸着剤容量:500μL)。次に、作製したカラムへの添加量が5.6x106個/mL−吸着剤となるよう、実施例22の(2)に記載の方法で調製した201B7細胞の細胞懸濁液を添加した。その後、実施例22の(3)に記載の方法により吸着剤を充填したカラムへの細胞懸濁液の添加、流出細胞液の回収、流出細胞液の蛍光強度測定を順次行い、吸着剤127C72Gにおける201B7細胞の流出率を算出した結果、流出率は4.0%であった。従って、本発明のフコース結合性タンパク質127C72Gを不溶性担体に固定化した吸着剤127C72Gは、高いiPS細胞吸着能を持つことが明らかとなった。
実施例28は、配列番号3で示されるアミノ酸配列の39番目のグルタミン残基として特定されるグルタミン残基をグルタミン残基以外のアミノ酸残基xに置換したアミノ酸配列に対し、N末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、C末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質、すなわち、配列番号34で示されるフコース結合性タンパク質127の53番目のグルタミン残基をグルタミン残基以外のアミノ酸残基xに置換したフコース結合性タンパク質(以下、フコース結合性タンパク質127Q39xとする。)の作製と、熱に対する安定性および糖鎖への結合親和性評価に関するものである。
(1)発現ベクターpET−BC2LCN(127Q39x)cysおよび組換えE. coli BL21(DE3)/pET−BC2LCN(127Q39x)cysの作製
発現ベクターpET−BC2LCN(127Q39x)cysは、フコース結合性タンパク質127Q39Xを発現させるための発現ベクターであり、組換えE. coli BL21(DE3)/pET−BC2LCN(127Q39x)cysは、フコース結合性タンパク質127Q39xを生産するための形質転換体である。ここでxはグルタミン残基以外の19種のアミノ酸残基を示す。以下に、前記発現ベクターおよび形質転換体の作製の一例として、配列番号13に示すフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列(配列番号3に示すアミノ酸配列の39番目のグルタミン残基をロイシン残基に置換したアミノ酸配列)のN末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、C末端にシステインを含むオリゴペプチド配列を付加したフコース結合性タンパク質127Q39L(配列番号44)を製造するための発現ベクターpET−BC2LCN(127Q39L)cysおよび組換えE. coli BL21(DE3)/pET−BC2LCN(127Q39L)cysの作製方法を示す。配列番号44のアミノ酸配列において、5番目から10番目まではポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、15番目から141番目までは配列番号13のアミノ酸配列、142番目から148番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
前記(1)で作製した形質転換体を用い、比較例1に記載の方法により組換えタンパク質の生産、可溶性タンパク質抽出液の回収、およびニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる可溶性タンパク質抽出液からのフコース結合性タンパク質の精製を行い、表22に記載した19種類の組換えタンパク質(フコース結合性タンパク質127Q39x)を製造した。
(3)組換えタンパク質の熱に対する安定性評価
前記(2)で製造した組換えタンパク質の熱に対する安定性を調べるため、加熱処理温度を81℃に変更した以外は参考例2の(3)に記載の方法に従って行うことにより、加熱処理後の各組換えタンパク質の糖鎖結合親和性を評価した。
前記(3)において、81℃、30分間の加熱処理後も糖鎖結合性を示したフコース結合性タンパク質127Q39Lについて、実施例12の(2)に記載の方法により変性中点温度を測定した結果、フコース結合性タンパク質127Q39Lの変性中点温度は90.2±0.5℃であった。
(5)糖鎖への結合親和性評価
実施例7の(2)に記載の方法により、フコース結合性タンパク質127Q39LのHタイプ3型糖鎖への結合親和性評価を行った結果、解離定数は1.1nMであった。
実施例29は、配列番号3で示されるアミノ酸配列の39番目のグルタミン残基および72番目のシステイン残基を他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列に対し、N末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、C末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質(以下、フコース結合性タンパク質127Q39x/C72zとする。)、および、配列番号3で示されるアミノ酸配列の39番目のグルタミン残基、65番目のグルタミン残基および72番目のシステイン残基を他のアミノ酸残基に置換したアミノ酸配列に対し、N末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、C末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質(以下、フコース結合性タンパク質127Q39x/Q65y/C72zとする。)の製造と、熱に対する安定性および糖鎖への結合親和性評価に関するものである。すなわち、フコース結合性タンパク質127Q39x/C72zは、配列番号34で示されるフコース結合性タンパク質127の、53番目のグルタミン残基をグルタミン残基以外のアミノ酸残基xに、86番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基をシステイン残基以外のアミノ酸残基zに置換したフコース結合性タンパク質であり、フコース結合性タンパク質127Q39x/Q65y/C72zは、配列番号34で示されるフコース結合性タンパク質127の、53番目のグルタミン残基をグルタミン残基以外のアミノ酸残基xに、79番目のグルタミン残基として特定されるグルタミン残基をグルタミン残基以外のアミノ酸残基yに、86番目のシステイン残基として特定されるシステイン残基をシステイン残基以外のアミノ酸残基zに置換したフコース結合性タンパク質である。
(1)発現ベクターpET−BC2LCN(127Q39x/C72z)cysおよび組換えE. coli BL21(DE3)/pET−BC2LCN(127Q39x/C72z)cysの作製
発現ベクターpET−BC2LCN(127Q39x/C72z)cysは、フコース結合性タンパク質127Q39x/C72zを発現させるための発現ベクターであり、組換えE. coli BL21(DE3)/pET−BC2LCN(127Q39x/C72z)cysは、フコース結合性タンパク質127Q39x/Q65y/C72zを生産するための形質転換体である。ここでxはグルタミン残基以外の19種のアミノ酸残基を、zはシステイン残基以外の19種のアミノ酸残基示す。以下に、前記発現ベクターおよび形質転換体の作製の一例として、配列番号15に示すフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列(配列番号3に示すアミノ酸配列の39番目のグルタミン残基をロイシン残基に、72番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列)のN末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、C末端にシステインを含むオリゴペプチド配列を付加したフコース結合性タンパク質127Q39L/C72G(配列番号46)を製造するための発現ベクターpET−BC2LCN(127Q39L/C72G)cysおよび組換えE. coli BL21(DE3)/pET−BC2LCN(127Q39L/C72G)cysの作製方法を示す。配列番号46のアミノ酸配列において、5番目から10番目まではポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、15番目から141番目までは配列番号15のアミノ酸配列、142番目から148番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。また、配列番号47のアミノ酸配列において、5番目から10番目まではポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、15番目から141番目までは配列番号16のアミノ酸配列、142番目から148番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
(2)発現ベクターpET−BC2LCN(127Q39x/Q65y/C72z)cysおよび組換えE. coli BL21(DE3)/pET−BC2LCN(127Q39x/Q65y/C72z)cysの作製
発現ベクターpET−BC2LCN(127Q39x/Q65y/C72z)cysは、フコース結合性タンパク質127Q39x/Q65y/C72zを発現させるための発現ベクターであり、組換えE. coli BL21(DE3)/pET−BC2LCN(127Q39x/Q65y/C72z)cysは、フコース結合性タンパク質127Q39x/Q65y/C72zを生産するための形質転換体である。ここでxとyはグルタミン残基以外の19種のアミノ酸残基を、zはシステイン残基以外の19種のアミノ酸残基示す。以下に、前記発現ベクターおよび形質転換体の作製の一例として、配列番号16に示すフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列(配列番号3に示すアミノ酸配列の39番目のグルタミン残基をロイシン残基に、65番目のグルタミン残基をロイシン残基に、72番目のシステイン残基をグリシン残基に置換したアミノ酸配列)のN末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、C末端にシステインを含むオリゴペプチド配列を付加したフコース結合性タンパク質127Q39L/Q65L/C72G(配列番号47)を製造するための発現ベクターpET−BC2LCN(127Q39L/Q65L/C72G)cysおよび組換えE. coli BL21(DE3)/pET−BC2LCN(127Q39L/Q65L/C72G)cysの作製方法を示す。配列番号47のアミノ酸配列において、5番目から10番目まではポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチド、15番目から141番目までは配列番号16のアミノ酸配列、142番目から148番目まではシステイン残基を含むオリゴペプチド配列に相当する。
前記(1)で作製した形質転換体を用い、比較例1に記載の方法により組換えタンパク質の生産、可溶性タンパク質抽出液の回収、およびニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる可溶性タンパク質抽出液からのフコース結合性タンパク質の精製を行い、表24に記載した8種類の組換えタンパク質(フコース結合性タンパク質127Q39x/Q65y/C72z)を製造した。
(4)組換えタンパク質の熱に対する安定性評価
前記(2)で製造した組換えタンパク質の熱に対する安定性を調べるため、加熱処理温度を84℃および88℃に変更した以外は参考例2の(3)に記載の方法に従って行うことにより、加熱処理後の各組換えタンパク質の糖鎖結合親和性を評価した。
前記(3)において、88℃、30分間の加熱処理後も糖鎖結合性を示したフコース結合性タンパク質127Q39L/C72Gおよびフコース結合性タンパク質127Q39L/Q65L/C72Gについて、実施例12の(2)に記載の方法により変性中点温度を測定した結果、フコース結合性タンパク質127Q39L/C72Gの変性中点温度は94.4±0.5℃、フコース結合性タンパク質127Q39L/Q65L/C72Gの変性中点温度は95.6±0.5℃であった。
実施例7の(2)に記載の方法により、フコース結合性タンパク質127Q39L/C72GのHタイプ3型糖鎖への結合親和性評価を行った結果、Hタイプ3型糖鎖に対する解離定数は3.9nMであった。また、フコース結合性タンパク質127Q39L/Q65L/C72GのHタイプ1型糖鎖およびHタイプ3型糖鎖への結合親和性評価を行った結果、Hタイプ1型糖鎖に対する解離定数は3.9nM、Hタイプ3型糖鎖に対する解離定数は4.6nMであった。
実施例30は、フコース結合性タンパク質127Q39L(配列番号44:配列番号13に示すフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列のN末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、C末端にシステインを含むオリゴペプチド配列を付加したフコース結合性タンパク質)の製造と生産性評価に関するものである。実施例28に記載の組換えE. coli BL21(DE3)/pET−BC2LCN(127Q39L)cysを用いたフコース結合性タンパク質127Q39Lの生産、可溶性タンパク質抽出液の回収、およびニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる可溶性タンパク質抽出液からのフコース結合性タンパク質127Q39Lの精製は、それぞれ比較例1の(2)および比較例1の(3)に記載の方法で行い、目的とするフコース結合性タンパク質127Q39Lを製造した。比較例1の(4)に記載の方法に従ってフコース結合性タンパク質127Q39Lの培養液1Lあたりの生産性を算出した結果、生産性は450mg/L−培養液であった。製造したフコース結合性タンパク質127Q39Lを含む溶液はD−PBS(−)に対して透析したのち、D−PBS(−)を用いて適切な濃度に調整後、後述する吸着剤の製造に使用した。
実施例31は、実施例30で製造したフコース結合性タンパク質127Q39Lを不溶性担体に固定化した吸着剤(以下、吸着剤127Q39Lとする。)の製造に関するものである。フコース結合性タンパク質として、実施例1で製造した精製129溶液(フコース結合性タンパク質129のD−PBS(−)溶液)の代わりに、実施例30で製造したフコース結合性タンパク質127Q39Lを使用した以外は、実施例14に記載の方法で行うことにより、目的の吸着剤127Q39Lを製造した。実施例14の(3)に記載の方法に従い、1mLの吸着剤127Q39Lあたりのフコース結合性タンパク質127Q39LGの固定化量を算出した結果、固定化量は316μg/mL−吸着剤であった。なお、水に湿潤した状態での吸着剤127Q39Lの平均粒径は182μm、粒度範囲は150〜250μmであった。
実施例32は、吸着剤127Q39Lの201B7細胞の吸着能評価に関するものである。実施例31で製造した吸着剤127Q39Lを用い、実施例18の(1)に記載の方法に従い、製造した吸着剤127Q39Lを充填したカラムを作製した(吸着剤容量:500μL)。次に、作製したカラムへの添加量が3.3x106個/mL−吸着剤となるよう、実施例22の(2)に記載の方法で調製した201B7細胞の細胞懸濁液を添加した。その後、実施例22の(3)に記載の方法により吸着剤を充填したカラムへの細胞懸濁液の添加、流出細胞液の回収、流出細胞液の蛍光強度測定を順次行い、吸着剤127Q39Lにおける201B7細胞の流出率を算出した結果、流出率は3.5%であった。従って、本発明のフコース結合性タンパク質127Q39Lを不溶性担体に固定化した吸着剤127Q39L/Q65L/C72Gは、高いiPS細胞吸着能を持つことが明らかとなった。
実施例33は、フコース結合性タンパク質127Q39L/C72G(配列番号46:配列番号15に示すフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列のN末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、C末端にシステインを含むオリゴペプチド配列を付加したフコース結合性タンパク質)の製造と生産性評価に関するものである。実施例29に記載の組換えE. coli BL21(DE3)/pET−BC2LCN(127Q39L/C72G)cysを用いたフコース結合性タンパク質127Q39L/C72Gの生産、可溶性タンパク質抽出液の回収、およびニッケルキレートアフィニティークロマトグラフィーによる可溶性タンパク質抽出液からのフコース結合性タンパク質127Q39L/C72Gの精製は、それぞれ比較例1の(2)および比較例1の(3)に記載の方法で行い、目的とするフコース結合性タンパク質127Q39L/C72Gを製造した。比較例1の(4)に記載の方法に従ってフコース結合性タンパク質127Q39L/C72Gの培養液1Lあたりの生産性を算出した結果、生産性は480mg/L−培養液であった。製造したフコース結合性タンパク質127Q39L/C72Gを含む溶液はD−PBS(−)に対して透析したのち、D−PBS(−)を用いて適切な濃度に調整後、後述する吸着剤の製造に使用した。
実施例34は、実施例33で製造したフコース結合性タンパク質127Q39L/C72Gを不溶性担体に固定化した吸着剤(以下、吸着剤127Q39L/C72Gとする。)の製造に関するものである。フコース結合性タンパク質として、実施例1で製造した精製129溶液(フコース結合性タンパク質129のD−PBS(−)溶液)の代わりに、実施例33で製造したフコース結合性タンパク質127Q39L/C72Gを使用した以外は、実施例14に記載の方法で行うことにより、目的の吸着剤127Q39L/C72Gを製造した。
実施例35は、吸着剤127Q39L/C72Gの201B7細胞の吸着能評価に関するものである。実施例34で製造した吸着剤127Q39L/C72Gを用い、実施例18の(1)に記載の方法に従い、製造した吸着剤127Q39L/C72Gを充填したカラムを作製した(吸着剤容量:500μL)。次に、作製したカラムへの添加量が3.3x106個/mL−吸着剤となるよう、実施例22の(2)に記載の方法で調製した201B7細胞の細胞懸濁液を添加した。その後、実施例22の(3)に記載の方法により吸着剤を充填したカラムへの細胞懸濁液の添加、流出細胞液の回収、流出細胞液の蛍光強度測定を順次行い、吸着剤127Q39L/C72Gにおける201B7細胞の流出率を算出した結果、流出率は2.3%であった。従って、本発明のフコース結合性タンパク質127Q39L/C72Gを不溶性担体に固定化した吸着剤127Q39L/C72Gは、高いiPS細胞吸着能を持つことが明らかとなった。
実施例36は、フコース結合性タンパク質127Q39L/Q65L/C72G(配列番号47:配列番号16に示すフコース結合性タンパク質のアミノ酸配列のN末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、C末端にシステインを含むオリゴペプチド配列を付加したフコース結合性タンパク質)の製造と生産性評価に関するものである。
実施例37は、実施例36で製造したフコース結合性タンパク質127Q39L/Q65L/C72Gを不溶性担体に固定化した吸着剤(以下、吸着剤127Q39L/Q65L/C72Gとする。)の製造に関するものである。
実施例38は、吸着剤127Q39L/Q65L/C72Gの201B7細胞の吸着能評価に関するものである。
(1)吸着剤を充填したカラムの作製
実施例37で製造した吸着剤127Q39L/Q65L/C72Gを用い、実施例18の(1)に記載の方法に従い、製造した吸着剤127Q39L/Q65L/C72Gを充填したカラムを作製した(吸着剤容量:500μL)。次に、作製したカラムへの添加量が3.3x106個/mL−吸着剤となるよう、実施例22の(2)に記載の方法で調製した201B7細胞の細胞懸濁液を添加した。その後、実施例22の(3)に記載の方法により吸着剤を充填したカラムへの細胞懸濁液の添加、流出細胞液の回収、流出細胞液の蛍光強度測定を順次行い、吸着剤127Q39L/Q65L/C72Gにおける201B7細胞の流出率を算出した結果、流出率は8.1%であった。従って、本発明のフコース結合性タンパク質127Q39L/Q65L/C72Gを不溶性担体に固定化した吸着剤127Q39L/Q65L/C72Gは、高いiPS細胞吸着能を持つことが明らかとなった。
比較例12は、配列番号3で示されるアミノ酸配列の39番目のグルタミン残基をロイシン残基に、72番目のシステイン残基をグリシン残基に、106番目のグルタミン残基をロイシン残基に置換したアミノ酸配列に対し、N末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、C末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質(以下、フコース結合性タンパク質127Q39L/C72G/Q106Lとする。)の製造と、熱に対する安定性評価に関するものである。フコース結合性タンパク質127Q39L/C72G/Q106Lは、配列番号34で示されるフコース結合性タンパク質127の53番目のグルタミン残基をロイシン残基に、86番目のシステイン残基をグリシン残基に、120番目のグルタミン残基をロイシン残に置換したフコース結合性タンパク質である。
比較例13は、配列番号3で示されるアミノ酸配列の39番目のグルタミン残基をロイシン残基に、65番目のグルタミン残基をロイシン残基に、72番目のシステイン残基をグリシン残基に、106番目のグルタミン残基をロイシン残基に置換したアミノ酸配列に対し、N末端にポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドを、C末端にシステイン残基を含むオリゴペプチドを付加したフコース結合性タンパク質(以下、フコース結合性タンパク質127Q39L/Q65L/C72G/Q106Lとする。)の製造と、熱に対する安定性評価に関するものである。フコース結合性タンパク質127Q39L/Q65L/C72G/Q106Lは、配列番号34で示されるフコース結合性タンパク質127の53番目のグルタミン残基をロイシン残基に、79番目のグルタミン残基をロイシン残基に、86番目のシステイン残基をグリシン残基に、120番目のグルタミン残基をロイシン残に置換したフコース結合性タンパク質である。
参考例11は、「Fucα1−2Galβ1−3GlcNAcおよび/またはFucα1−2Galβ1−3GalNAc」からなる構造を含む糖鎖を有さないマウス骨髄腫細胞であるSP2/0−Ag14細胞(DSファーマバイオメディカルより入手、ECACC株番号:85072401、以下SP2/0細胞と記載する。)を用いた、フコース結合性タンパク質を固定化していない粒径の異なる不溶性担体を充填したカラムの細胞通液性評価に関するものである。
(1)吸着剤の調製と吸着剤を充填したカラムの作製
5.0mL容シリンジ(テルモ製)と注射針(テルモ製、22G)の間に目開き40μmのメッシュフィルター(日本BD製、セルストレーナチューブの蓋のメンブレンを取り出して使用)を装着したカラムを作製した。不溶性担体として、粒径が100〜300μmのトヨパールHW−40EC(東ソー製)と、粒径が50〜150μmのトヨパールHW−40C(東ソー製)を用い、各不溶性担体をMACS緩衝液で置換したのち、12時間以上放置後の不溶性担体の沈降体積が50%となるように調整した不溶性担体の50%懸濁液を調製し、作製したカラムに4.0mLを添加して、各不溶性担体をカラムに充填した(吸着剤容量:2.0mL)。また、比較対照として、不溶性担体を充填しないカラムを準備した。
(2)SP2/0細胞の培養と評価用細胞懸濁液の調製
浮遊性細胞であるSP2/0細胞は、GIT培地(日本製薬製)を用い、浮遊培養用シャーレ(住友ベークライト製)に細胞を播種し、5%CO2雰囲気下、37℃で培養した。
(3)不溶性担体を充填したカラムを用いたSP2/0細胞の通液性
各不溶性担体を充填したカラムを垂直に立てた状態で、添加量が1.0x106個/mL−吸着剤となるよう、前記の方法で調製した1.0x107個/mLのSP2/0細胞懸濁液をカラムに添加した。
Claims (24)
- 以下の(a)〜(d)のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む、フコース結合性タンパク質であって、
Fucα1−2Galβ1−3GlcNAcからなる構造を含む糖鎖および/またはFucα1−2Galβ1−3GalNAcからなる構造を含む糖鎖に対する結合親和性を有し、
ただし、配列番号1で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質は除く、フコース結合性タンパク質:
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列の1番目のプロリン残基からX番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列であって、Xが110以上140以下の整数である、アミノ酸配列;
(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列の1番目のプロリン残基からX番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列において、1個若しくは複数個のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入、および/または付加を含むアミノ酸配列であって、Xが110以上140以下の整数である、アミノ酸配列;
(c)配列番号1で示されるアミノ酸配列の1番目のプロリン残基からX番目のアミノ酸残基までのアミノ酸配列に対して90%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、Xが110以上140以下の整数である、アミノ酸配列;
(d)前記(a)〜(c)のいずれかに記載のアミノ酸配列において、特定のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列であって、当該特定のアミノ酸置換が以下の(1)から(5)に記載のアミノ酸置換から選択される1つ以上のアミノ酸置換である、アミノ酸配列:
(1)配列番号1で示されるアミノ酸配列の39番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基の、グルタミン残基以外のアミノ酸残基への置換;
(2)配列番号1で示されるアミノ酸配列の72番目のシステイン残基に相当するアミノ酸残基の、システイン残基以外のアミノ酸残基への置換;
(3)配列番号1で示されるアミノ酸配列の65番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基の、グルタミン残基以外のアミノ酸残基への置換;
(4)配列番号1で示されるアミノ酸配列の81番目のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基の、グルタミン酸残基以外のアミノ酸残基への置換;
(5)配列番号1で示されるアミノ酸配列の36番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基の、グリシン残基以外のアミノ酸残基への置換。 - 前記(1)から(5)に記載のアミノ酸置換が、それぞれ、以下の(6)から(10)に記載のアミノ酸置換である、請求項1に記載のフコース結合性タンパク質:
(6)配列番号1で示されるアミノ酸配列の39番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基の、ロイシン残基またはメチオニン残基への置換;
(7)配列番号1で示されるアミノ酸配列の72番目のシステイン残基に相当するアミノ酸残基の、グリシン残基またはアラニン残基への置換;
(8)配列番号1で示されるアミノ酸配列の65番目のグルタミン残基に相当するアミノ酸残基の、ロイシン残基への置換;
(9)配列番号1で示されるアミノ酸配列の81番目のグルタミン酸残基に相当するアミノ酸残基の、システイン残基、グルタミン残基、ヒスチジン残基、メチオニン残基、バリン残基、リジン残基、セリン残基、イソロイシン残基、チロシン残基、グリシン残基、プロリン残基、ロイシン残基、またはアスパラギン残基への置換;
(10)配列番号1で示されるアミノ酸配列の36番目のグリシン残基に相当するアミノ酸残基の、システイン残基への置換。 - 全長が、95〜175残基である、請求項1または2に記載のフコース結合性タンパク質。
- 前記(a)〜(d)に記載のアミノ酸配列の長さが、95〜155残基である、請求項1から3のいずれか1項に記載のフコース結合性タンパク質。
- 配列番号2から配列番号16のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、請求項1から4のいずれか1項に記載のフコース結合性タンパク質。
- N末端および/またはC末端に付加的なアミノ酸配列を有する、請求項1から5のいずれか1項に記載のフコース結合性タンパク質。
- C末端に付加したアミノ酸配列がシステイン残基を含むオリゴペプチドである、請求項1から6のいずれか1項に記載のフコース結合性タンパク質。
- N末端に付加したアミノ酸配列がポリヒスチジン配列を含むオリゴペプチドである、請求項1から7のいずれか1項に記載のフコース結合性タンパク質。
- 請求項1から8のいずれか1項に記載のフコース結合性タンパク質をコードするDNA。
- 請求項9に記載のDNAを含む発現ベクター。
- 請求項9に記載のDNAまたは請求項10に記載の発現ベクターを有する形質転換体。
- エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)である、請求項11に記載の形質転換体。
- フコース結合性タンパク質の製造方法であって、
請求項11または12に記載の形質転換体を培養することによりフコース結合性タンパク質を発現する工程;および
発現した前記フコース結合性タンパク質を回収する工程
を含み、
フコース結合性タンパク質が、請求項1から8のいずれか1項に記載のフコース結合性タンパク質である、方法。 - 不溶性担体と、該不溶性担体に固定化された請求項1から8のいずれか1項に記載のフコース結合性タンパク質とを備える、吸着剤。
- 吸着剤の製造方法であって、
不溶性担体から反応性不溶性担体を製造する工程;および
前記反応性不溶性担体に請求項1から8のいずれか1項に記載のフコース結合性タンパク質を固定化する工程
を含み、
吸着剤が、請求項14に記載の吸着剤である、方法。 - 前記反応性不溶性担体が、マレイミド基またはハロアセチル基を有する不溶性担体である、請求項15に記載の方法。
- 請求項14に記載の吸着剤が充填されたカラム。
- 細胞の分離方法であって、
請求項14に記載の吸着剤と細胞混合物とを接触させる工程;および
前記吸着剤に吸着した細胞と吸着しなかった細胞とを分離する工程
を含む、方法。 - 前記細胞混合物が、第1の細胞と第2の細胞を含有する混合物であり、
前記第1の細胞が、Fucα1−2Galβ1−3GlcNAcからなる構造を含む糖鎖および/またはFucα1−2Galβ1−3GalNAcからなる構造を含む糖鎖を有する細胞であり、
前記第2の細胞が、Fucα1−2Galβ1−3GlcNAcからなる構造を含む糖鎖およびFucα1−2Galβ1−3GalNAcからなる構造を含む糖鎖のいずれも有しない細胞である、
請求項18に記載の方法。 - 前記第1の細胞が未分化細胞であり、前記第2の細胞が分化細胞である、請求項18または19に記載の方法。
- 前記第1の細胞ががん細胞である、請求項18または19に記載の方法。
- フコース含有糖鎖を有する物質の精製方法であって、
請求項14に記載の吸着剤と前記フコース含有糖鎖を有する物質とを接触させる工程;および
前記吸着剤に結合した前記物質を溶出する工程
を含み、
前記フコース含有糖鎖が、Fucα1−2Galβ1−3GlcNAcからなる構造を含む糖鎖および/またはFucα1−2Galβ1−3GalNAcからなる構造を含む糖鎖である、方法。 - 前記物質が、前記フコース含有糖鎖および/または当該フコース含有糖鎖を有する複合糖質である、請求項22に記載の方法。
- 請求項17に記載のカラムが用いられる、請求項18から23のいずれか1項に記載の方法。
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