JP6848241B2

JP6848241B2 - Ｆｃ結合性タンパク質を用いたＩｇＧ１の精製方法

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Publication number: JP6848241B2
Application number: JP2016145706A
Authority: JP
Inventors: 青木　大; 大青木; 陽介寺尾; 大江　正剛; 正剛大江
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2016-07-25
Filing date: 2016-07-25
Publication date: 2021-03-24
Anticipated expiration: 2036-07-25
Also published as: JP2018016552A

Description

本発明は、免疫グロブリンに親和性のあるＦｃ結合性タンパク質を用いた免疫グロブリンの精製方法に関する。より詳しくは、本発明は野生型のＦｃγＲＩＩＩａよりもＩｇＧ１への結合性が高いＦｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を用いたＩｇＧ１の精製方法に関する。

抗体医薬品の糖鎖構造は薬効や安定性に大きく関与するため、抗体医薬品を製造する際に糖鎖構造を制御することは極めて重要である。Ｆｃ結合性タンパク質のうちＦｃγＲＩＩＩａは、抗体（免疫グロブリン）の糖鎖構造を認識することが知られており、ＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる吸着剤を用いることで、抗体を糖鎖構造に基づき分離できる（特許文献１）。したがって、前記吸着剤は、抗体医薬品製造時の工程分析や分取時に有用である。

一方でＦｃγＲＩＩＩａは、他のＦｃ結合性タンパク質であるＦｃγＲＩと比較して、ＩｇＧ１への結合性が低いことが知られており（非特許文献１）、ＦｃγＲＩＩＩａを固定化した不溶性担体をＩｇＧ１の工程分析に用いると精度の低下等の問題が、ＩｇＧ１の分取に用いると分取効率の低下等の問題がそれぞれ生じる。したがって、前記担体をＩｇＧ１抗体医薬品製造における工程分析や分取目的へ適用するのは困難であった。

特開２０１５−０８６２１６号公報

Ｐ．Ｂｒｕｈｎｓ等，Ｂｌｏｏｄ，１６，３７１６−３７２５，２００９

本発明は、ＦｃγＲＩＩＩａを固定化した不溶性担体を用いた、高精度かつ高効率な免疫グロブリン、特にＩｇＧ１の精製方法を提供することにある。

上記課題を解決するために、本発明者らは、ＦｃγＲＩＩＩａにおけるＩｇＧ１に対する結合性向上に関与したアミノ酸残基を特定し、当該アミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換によりＩｇＧ１への結合力を向上させることで、ＦｃγＲＩＩＩａを固定化した不溶性担体による、高精度かつ高効率なＩｇＧ１の精製を可能にした。

すなわち、本発明は以下の（１）から（３）に記載の態様を包含する。
（１）Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムにＩｇＧ１を含む溶液を添加して当該ＩｇＧ１を前記担体に吸着させる工程と、前記担体に吸着したＩｇＧ１を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、ＩｇＧ１の精製方法であって、
前記Ｆｃ結合性タンパク質が、配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、但し、当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも１７８番目のセリンがアルギニンにアミノ酸置換されたタンパク質である、前記精製方法。
（２）Ｆｃ結合性タンパク質が、
配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、但し当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも２７番目のバリンがグルタミン酸に、２９番目のフェニルアラニンがイソロイシンに、３５番目のチロシンがアスパラギンに、４８番目のグルタミンがアルギニンに、７５番目のフェニルアラニンがロイシンに、９２番目のアスパラギンがセリンに、１１７番目のバリンがグルタミン酸に、１２１番目のグルタミン酸がグリシンに、１７１番目のフェニルアラニンがセリンに、１７８番目のセリンがアルギニンに、それぞれアミノ酸置換されたタンパク質、
又は
配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、但し当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくとも２１番目のグルタミン酸がグリシンに、２３番目のロイシンがメチオニンに、２７番目のバリンがグルタミン酸に、２９番目のフェニルアラニンがイソロイシンに、３５番目のチロシンがアスパラギンに、４８番目のグルタミンがアルギニンに、７５番目のフェニルアラニンがロイシンに、９２番目のアスパラギンがセリンに、１１７番目のバリンがグルタミン酸に、１２１番目のグルタミン酸がグリシンに、１７１番目のフェニルアラニンがセリンに、１７８番目のセリンがアルギニンに、それぞれアミノ酸置換されたタンパク質、である、（１）に記載の精製方法。
（３）Ｆｃ結合性タンパク質が、当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、さらに少なくとも６８番目のセリンがプロリンにアミノ酸置換されたタンパク質である、（１）又は（２）に記載の精製方法。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明で用いるＦｃ結合性タンパク質は、抗体（免疫グロブリン）のＦｃ領域に結合性を持つタンパク質であり、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（図１のＥＣの領域）のうち、少なくとも１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質であって、当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において特定位置におけるアミノ酸置換が少なくとも生じたタンパク質である。したがって、本発明に用いるＦｃ結合性タンパク質は、細胞外領域のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域（図１のＳ）の全てまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＣ末端側にある細胞膜貫通領域（図１のＴＭ）および細胞内領域（図１のＣ）の全てまたは一部を含んでもよい。前記特定位置におけるアミノ酸置換は、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列においてＳｅｒ１７８Ａｒｇ（この表記は、配列番号１の１７８番目のセリンがアルギニンに置換されていることを表す、以下同様）のアミノ酸置換である。なおＳｅｒ１７８Ａｒｇのアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質に対し、Ｓｅｒ６８Ｐｒｏのアミノ酸置換がさらに生じるとＩｇＧ１に対する結合性がさらに向上するため、本発明で用いるＦｃ結合性タンパク質として好ましい。

なお本発明で用いるＦｃ結合性タンパク質は、少なくともＳｅｒ１７８Ａｒｇ、好ましくはさらにＳｅｒ６８Ｐｒｏのアミノ酸置換が生じているものであり、抗体結合活性を有する限り、他のアミノ酸置換が生じてもよい。一例として、両アミノ酸の物理的性質と化学的性質またはそのどちらかが類似したアミノ酸間で置換する保守的置換があげられる。保守的置換は、Ｆｃ結合性タンパク質に限らず一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、アスパラギン酸とグルタミン酸間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間に生じる置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。

本発明で用いるＦｃ結合性タンパク質の具体例としては、
配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、但し当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくともＶａｌ２７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕ、Ｇｌｕ１２１ＧｌｙおよびＰｈｅ１７１Ｓｅｒのアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質（一例として、配列番号５に記載のアミノ酸配列。なお配列番号５に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までが配列番号１のアミノ酸配列の１７番目から１９２番目に相当する。）に対して、少なくともＳｅｒ１７８Ａｒｇ、好ましくは更にＳｅｒ６８Ｐｒｏのアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質や、
配列番号１に記載のアミノ酸配列の１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を少なくとも含み、但し当該１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基において、少なくともＧｌｕ２１Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３Ｍｅｔ、Ｖａｌ２７Ｇｌｕ、Ｐｈｅ２９Ｉｌｅ、Ｔｙｒ３５Ａｓｎ、Ｇｌｎ４８Ａｒｇ、Ｐｈｅ７５Ｌｅｕ、Ａｓｎ９２Ｓｅｒ、Ｖａｌ１１７Ｇｌｕ、Ｇｌｕ１２１ＧｌｙおよびＰｈｅ１７１Ｓｅｒのアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質（一例として、配列番号８に記載のアミノ酸配列。なお配列番号８に記載のアミノ酸配列の３３番目から２０８番目までが配列番号１のアミノ酸配列の１７番目から１９２番目に相当する。）に対して、少なくともＳｅｒ１７８Ａｒｇ、好ましくは更にＳｅｒ６８Ｐｒｏのアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質（それぞれ配列番号１２のＦｃＲ１２、配列番号１６のＦｃＲ１３）、
があげられる。

さらに野生型ＦｃγＲＩＩＩａには、Ｌｅｕ６６Ｈｉｓ、Ｌｅｕ６６Ａｒｇ、Ｇｌｙ１４７Ａｓｐ、Ｔｙｒ１５８Ｈｉｓ、Ｖａｌ１７６Ｐｈｅのうち、いずれか１つ以上のアミノ酸置換が生じた変異体が知られているが、前記特定位置におけるアミノ酸置換以外にこれらのアミノ酸置換を含んでいてもよい。

本発明で用いるＦｃ結合性タンパク質は、そのＮ末端側またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から分離する際に有用なオリゴペプチドをさらに付加してもよい。前記オリゴペプチドとしては、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等があげられる。また本発明に用いるＦｃ結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の固相に固定化する際に有用な、システインを含むオリゴペプチドを、本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にさらに付加してもよい。Ｆｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加するオリゴペプチドの長さは、特に制限はない。前記オリゴペプチドを本発明に用いるＦｃ結合性タンパク質に付加させる際は、前記オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製後、当業者に周知の方法を用いて遺伝子工学的にＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加させてもよいし、化学的に合成した前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させて付加させてもよい。さらに本発明に用いるＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌の場合における前記シグナルペプチドの例としては、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ（ＵｎｉＰｒｏｔＮｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、ＴｏｒＴなどといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる（特開２０１１−０９７８９８号公報）。

本発明を行なう際は、前述した特定位置におけるアミノ酸置換が少なくとも生じたＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に結合させた、ＩｇＧ１吸着剤を作製する必要がある。前記Ｆｃ結合性タンパク質に結合させる不溶性担体には特に限定はなく、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプンといった多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタンといった合成高分子を原料とした担体や、シリカなどのセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー製）等の水酸基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ製）等のセルロースゲルがあげられる。不溶性担体の形状については特に限定はなく、粒状物または非粒状物、多孔性または非多孔性、いずれであってもよい。

前述したＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化するには、当該不溶性担体にＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミド等の活性基を付与し、当該活性基を介してヒトＦｃ結合性タンパク質と不溶性担体とを共有結合させることで固定化すればよい。活性基を付与した担体は市販の担体をそのまま用いてもよいし、適切な反応条件で担体表面に活性基を導入して調製してもよい。活性基を付与した市販の担体としてはＴＯＹＯＰＥＡＲＬＡＦ−Ｅｐｏｘｙ−６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＡＦ−Ｔｒｅｓｙｌ−６５０Ｍ（いずれも東ソー製）、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄＨＰＣｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦａｓｔＦｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ−ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋＣｏｕｐｌｉｎｇＲｅｓｉｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）が例示できる。

一方、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。当該化合物の一例のうち、担体表面の水酸基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルが例示できる。前記化合物により担体表面にエポキシ基を導入した後、担体表面にカルボキシル基を導入する化合物としては、２−メルカプト酢酸、３−メルカプトプロピオン酸、４−メルカプト酪酸、６−メルカプト酪酸、グリシン、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸を例示できる。

担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ−（ε−マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ−（ε−マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４−［４−Ｎ−マレイミドフェニル］酢酸ヒドラジド、２−アミノマレイミド、３−アミノマレイミド、４−アミノマレイミド、６−アミノマレイミド、１−（４−アミノフェニル）マレイミド、１−（３−アミノフェニル）マレイミド、４−（マレイミド）フェニルイソシアナート、２−マレイミド酢酸、３−マレイミドプロピオン酸、４−マレイミド酪酸、６−マレイミドヘキサン酸、（Ｎ−［α―マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル）、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、（スクシンイミジル−４−［マレイミドメチル］シクロヘキサンー１−カルボニル−［６−アミノヘキサン酸］）、（スクシンイミジル−４−［マレイミドメチル］シクロヘキサンー１−カルボン酸）、（ｐ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ−マレイミドベンゾイル）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。

担体表面に存在する水酸基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２−（ヨードアセトアミド）酢酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、３−（ブロモアセトアミド）プロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−（ヨードアセチル）アミノ安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。なお担体表面に存在する水酸基やアミノ基にω−アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω−アルケニル部位をハロゲン化し活性化する方法も例示できる。ω−アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３−ブテニルグリシジルエーテル、４−ペンテニルグリシジルエーテルを例示でき、ハロゲン化剤としてはＮ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、Ｎ−ヨードスクシンイミドを例示できる。

担体表面に活性基を導入する方法の別の例として、担体表面に存在するカルボキシル基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性化基を導入する方法がある。縮合剤としては１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。また添加剤としてはＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４−ニトロフェノール、１−ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。

前述したＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化する際用いる緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、５℃から５０℃までの温度範囲の中から活性基の反応性やＦｃ結合性タンパク質の安定性を考慮の上、適宜設定すればよく、好ましくは１０℃から３５℃の範囲である。

前述した方法により得られたＩｇＧ１吸着剤を用いて本発明を実施するには、当該ＩｇＧ１吸着剤を充填したカラムに、ポンプ等の送液手段を用いてＩｇＧ１を含む溶液を添加することで、当該吸着剤にＩｇＧ１を特異的に吸着させた後、適切な溶出液を当該カラムに添加することで、ＩｇＧ１を溶出すればよい。なおＩｇＧ１を含む溶液は、カラムに添加する前にあらかじめ適切な緩衝液を用いて溶媒置換させるとよい。またＩｇＧ１を含む溶液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化すると、ＩｇＧ１をより高純度に分離できるため好ましい。緩衝液としてはリン酸緩衝液等、無機塩を成分とした緩衝液を例示することができる。なお緩衝液のｐＨは、ｐＨ３から１０、好ましくはｐＨ５から８である。ＩｇＧ１吸着剤に吸着したＩｇＧ１を溶出させるには、ＩｇＧ１とリガンド（本発明のＦｃ結合性タンパク質）との相互作用を弱めればよく、具体的には、緩衝液によるｐＨの低下、カウンターペプチドの添加、温度上昇、塩濃度変化が例示できる。ＩｇＧ１吸着剤に吸着したＩｇＧ１を溶出させるための溶出液の具体例として、ＩｇＧ１吸着剤にＩｇＧ１を吸着させる際に用いた溶液よりも酸性側の緩衝液があげられる。その緩衝液の種類としては酸性側に緩衝能を有するクエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。緩衝液のｐＨは、ＩｇＧ１が有する機能（抗原への結合性等）を損なわない範囲で設定すればよく、好ましくはｐＨ２．５から６．０、より好ましくはｐＨ３．０から５．０、さらに好ましくはｐＨ３．３から４．０である。

本発明に用いられるＦｃ結合性タンパク質は、野生型ＦｃγＲＩＩＩａと比較し、ＩｇＧ１に対する結合性が向上している。従って本発明により、ＦｃγＲＩＩＩａ固定化担体を用いた、ＩｇＧ１の工程分析における精度やＩｇＧ１分取時における精製効率が向上する。また本発明はＩｇＧ１を精製する際、溶離液中のＩｇＧ１を高濃度に溶離させる濃縮効果も期待できる。

さらに本発明で用いるＦｃ結合性タンパク質は、ＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸置換体（変異体）であり、ＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる吸着剤は糖鎖構造に基づく分離ができる（特開２０１５−０８６２１６号）ことから、本発明は特にＩｇＧ１抗体医薬品の工程分析や分取に有用な方法といえる。

ヒトＦｃγＲＩＩＩａの概略図である。図中の数字は配列番号１に記載のアミノ酸配列の番号を示している。図中のＳはシグナル配列、ＥＣは細胞外領域、ＴＭは細胞膜貫通領域、Ｃは細胞内領域を示している。

以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１Ｆｃ結合性タンパク質の作製
ＷＯ２０１５／１９９１５４号に記載の方法で作製したＦｃＲ９（配列番号５）に対し、以下に示すさらなるアミノ酸置換を行なった。具体的にはＦｃＲ９をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）を含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ９（ＷＯ２０１５／１９９１５４号）に対し、ＰＣＲを用いてアミノ酸の置換を行ない、以下の（ａ）から（ｃ）に示す３種類のＦｃ結合性タンパク質を作製した。

（ａ）ＦｃＲ９に対し、さらにＧｌｕ２１ＧｌｙおよびＬｅｕ２３Ｍｅｔのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ１１ｂ（配列番号８）
（ｂ）ＦｃＲ１１ｂに対し、さらにＳｅｒ１７８Ａｒｇのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ１２（配列番号１２）
（ｃ）ＦｃＲ１２に対し、さらにＳｅｒ６８Ｐｒｏのアミノ酸置換を行なったＦｃＲ１３（配列番号１６）。

なおＦｃＲ９（配列番号５）は、配列番号４に示す野生型ＦｃγＲＩＩＩ細胞外領域を含むＦｃ結合性タンパク質において、４３番目のＶａｌをＧｌｕに（配列番号１では２７番目に相当）、４５番目のＰｈｅをＩｌｅに（配列番号１では２９番目に相当）、５１番目のＴｙｒをＡｓｎに（配列番号１では３５番目に相当）、６４番目のＧｌｎをＡｒｇに（配列番号１では４８番目に相当）、９１番目のＰｈｅをＬｅｕに（配列番号１では７５番目に相当）、１０８番目のＡｓｎをＳｅｒに（配列番号１では９２番目に相当）、１３３番目のＶａｌをＧｌｕに（配列番号１では１１７番目に相当）、１３７番目のＧｌｕをＧｌｙに（配列番号１では１２１番目に相当）および１８７番目のＰｈｅをＳｅｒに（配列番号１では１７１番目に相当）のアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質である。

以下、各Ｆｃ結合性タンパク質の作製方法を詳細に説明する。
（ａ）ＦｃＲ１１ｂ（配列番号８）
ＦｃＲ９をコードするポリヌクレオチドに対して、配列番号１のＧｌｕ２１ＧｌｙおよびＬｅｕ２３Ｍｅｔに相当する変異を生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ１１ｂを作製した。
（ａ−１）前述したｐＥＴ−ＦｃＲ９（ＷＯ２０１５／１９９１５４号）を鋳型とし、配列番号３（５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ−３’）および配列番号７（５’−ＣＴＡＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＧＴＡＣＣＧＧＡＧＡＴＡＴＧＣＣＧＡＡＡＧＣＧＧＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマー（ＦｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒおよびＲｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ）として用いた。ＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することで行なった。増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、そのゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をｍ１１ｂｐとした。

（ａ−２）（ａ−１）で得られたｍ１１ｂｐを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ａ−３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃＲ９に対して２箇所（野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して１１箇所）アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ１１ｂをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ１１ｂを得た。

（ａ−４）（ａ−３）で作製したプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ１１ｂのうち、ＦｃγＲＩＩＩａをコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＦＳｒｅａｄＲｅａｃｔｉｏｎｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩＰｒｉｓｍ３７００ＤＮＡａｎａｌｙｚｅｒ（アプライドバイオシステムズ製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号２（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）または配列番号３（５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。

シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ１１ｂのアミノ酸配列を配列番号８に、前記ＦｃＲ１１ｂをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号９に示す。なお配列番号８において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ１１ｂのアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また、配列番号１のＧｌｕ２１Ｇｌｙのグリシンは配列番号８の３７番目の位置に、配列番号１のＬｅｕ２３Ｍｅｔのメチオニンは配列番号８の３９番目の位置に、それぞれ存在する。

（ｂ）ＦｃＲ１２（配列番号１２）
ＦｃＲ１１ｂをコードするポリヌクレオチドに対して、配列番号１のＳｅｒ１７８Ａｒｇに相当する変異を生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ１２を作製した。
（ｂ−１）（ａ）で作製した、ｐＥＴ−ＦｃＲ１１ｂを鋳型とし、配列番号２および配列番号１０（５’−ＴＧＣＴＣＡＣＡＴＴＴＴＴＴＣＴＧＣＣＣＡＣＣＡＧＣＣＣＡＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマー（ＦｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒおよびＲｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒ）として用いた。ＰＣＲは、表２に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で５分間熱処理することで行なった。増幅したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動に供し、そのゲルからＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（キアゲン製）を用いて精製した。精製したＰＣＲ産物をｍ１２Ｆとした。

（ｂ−２）（ａ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ１１ｂを鋳型としてＰＣＲを実施した。当該ＰＣＲにおけるプライマーは、配列番号３および配列番号１１（５’−ＧＴＧＧＧＣＴＧＧＴＧＧＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＴＧＴＧＡＧＣＡ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた他は、（ｂ−１）と同様な方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１２Ｒとした。
（ｂ−３）（ｂ−１）および（ｂ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ１２Ｆ、ｍ１２Ｒ）を混合後、表３に示す組成の反応液を調製した。当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを行ない、ｍ１２Ｆとｍ１２Ｒを連結したＰＣＲ産物ｍ１２ｐを得た。

（ｂ−４）（ｂ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ１２ｐを鋳型とし、配列番号２および配列番号３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、表４に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なった。これによりＦｃＲ１１ｂに１箇所アミノ酸置換を導入したＦｃＲ１２をコードするポリヌクレオチドを作製した。

（ｂ−５）（ｂ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｂ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃＲ９に対して３箇所（野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して１２箇所）アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ１２をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ１２を得た。
（ｂ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ１２のヌクレオチド配列の解析を、（ａ−４）と同様の方法で行なった。

シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ１２のアミノ酸配列を配列番号１２に、前記ＦｃＲ１２をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１３に示す。なお配列番号１２において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ１２のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また、配列番号１のＧｌｕ２１Ｇｌｙのグリシンは配列番号１２の３７番目の位置に、配列番号１のＬｅｕ２３Ｍｅｔのメチオニンは配列番号１２の３９番目の位置に、配列番号１のＳｅｒ１７８Ａｒｇのアルギニンは配列番号１２の１９４番目の位置に、それぞれ存在する。

（ｃ）ＦｃＲ１３（配列番号１６）
ＦｃＲ１２をコードするポリヌクレオチドに対して、配列番号１のＳｅｒ６８Ｐｒｏに相当する変異を生じさせる変異導入を行なうことにより、ＦｃＲ１３を作製した。
（ｃ−１）（ｂ）で作製した、ｐＥＴ−ＦｃＲ１２を鋳型とし、配列番号２および配列番号１４（５’−ＧＴＡＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＧＡＡＴＣＡＧＧＣＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ｂ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１３Ｆとした。

（ｃ−２）（ｂ）で作製したｐＥＴ−ＦｃＲ１２を鋳型とし、配列番号３および配列番号１５（５’−ＣＡＣＡＡＴＧＡＡＡＧＣＣＴＧＡＴＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＣＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとした他は、（ｂ−１）と同様の方法でＰＣＲを行なった。精製したＰＣＲ産物をｍ１３Ｒとした。
（ｃ−３）（ｃ−１）および（ｃ−２）で得られた２種類のＰＣＲ産物（ｍ１３Ｆ、ｍ１３Ｒ）を混合後、（ｂ−３）と同様の方法にてＰＣＲを行ない、ｍ１３Ｆとｍ１３Ｒを連結した。得られたＰＣＲ産物をｍ１３ｐとした。
（ｃ−４）（ｃ−３）で得られたＰＣＲ産物ｍ１３ｐを鋳型とし、配列番号２および配列番号３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、（ｂ−４）と同様の方法でＰＣＲを行なった。これによりＦｃＲ１３をコードするポリヌクレオチドを作製した。

（ｃ−５）（ｃ−４）で得られたポリヌクレオチドを精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（ｃ−６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出することで、ＦｃＲ９に対して４箇所（野生型Ｆｃ結合性タンパク質に対して１３箇所）アミノ酸置換したポリペプチドである、ＦｃＲ１３をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドｐＥＴ−ＦｃＲ１３を得た。
（ｃ−７）ｐＥＴ−ＦｃＲ１３のヌクレオチド配列の解析を、（ａ−４）と同様の方法で行なった。

シグナル配列およびポリヒスチジンタグを付加したＦｃＲ１３のアミノ酸配列を配列番号１６に、前記ＦｃＲ１３をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１７に示す。なお配列番号１６において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ１３のアミノ酸配列（配列番号１の１７番目から１９２番目までの領域に相当）、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また、配列番号１のＧｌｕ２１Ｇｌｙのグリシンは配列番号１６の３７番目の位置に、配列番号１のＬｅｕ２３Ｍｅｔのメチオニンは配列番号１６の３９番目の位置に、配列番号１のＳｅｒ６８Ｐｒｏのプロリンは配列番号１６の８４番目の位置に、配列番号１のＳｅｒ１７８Ａｒｇのアルギニンは配列番号１６の１９４番目の位置に、それぞれ存在する。

実施例２Ｆｃ結合性タンパク質とＩｇＧ１との結合性評価
（１）実施例１で作製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ１１ｂ、ＦｃＲ１２およびＦｃＲ１３）を発現する形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２０ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した１０００ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に前培養液を１０ｍＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
（３）培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養した。その後、終濃度０．０１ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養した。

（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で懸濁し、超音波破砕した。その後、遠心分離により上清を回収した。
（５）回収した上清は、ＮｉＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）を充填したカラムに通液し、洗浄緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で十分量の洗浄を行なった後、溶出緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌと５００ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で溶出し、当該溶出画分を回収した。
（６）（５）で回収した溶出画分を、ＩｇＧＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）を充填したカラムに通液し、洗浄緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で十分量の洗浄を行なった後、溶出緩衝液（１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ３．０））で溶出し、当該溶出画分を回収した。

（７）（６）の溶出画分として回収したＦｃ結合性タンパク質とＩｇＧ１との結合性評価を表面プラズモン共鳴法を用いて行なった。表面プラズモン共鳴法を用いた結合性の測定において、測定装置としてはＢｉａｃｏｒｅＴ１００（ＧＥヘルスケア製）を、センサーチップとしてはＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐＣＭ５（ＧＥヘルスケア製）を、解析ソフトとしてはＢｉａｃｏｒｅＴ１００ＥｖａｌｕａｔｉｏｎＳｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケア製）を、それぞれ用いた。
（８）ＡｍｉｎｅＣｏｕｐｌｉｎｇＫｉｔ（ＧＥヘルスケア製）を用いてＦｃ結合性タンパク質を固定化したセンサーチップに対し、ＩｇＧ１（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）をＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥヘルスケア製）で希釈した溶液を流すことでセンサグラムを得た。当該センサグラムを基にカーブフィッティングを行なうことで、ＩｇＧ１に対する結合性を算出した。

ＩｇＧ１に対する結合性を算出した結果を表５に示す。なお表５において、ＫＤ値（アフィニティ結合定数）が低いほど、高いアフィニティ（結合性）を有している。Ｓｅｒ１７８Ａｒｇのアミノ酸置換を含むＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ１２およびＦｃＲ１３は、当該置換を含まないＦｃＲ１１ｂと比較して、低い解離定数及び低いアフィニティ結合定数を有している。このことから、Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムにＩｇＧ１を含む溶液を添加して当該ＩｇＧ１を前記担体に吸着させる工程と前記担体に吸着したＩｇＧ１を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む方法でＩｇＧ１の精製を行なう際、前記Ｆｃ結合性タンパク質として、野生型ＦｃγＲＩＩＩａ（配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１７番目から１９２番目までのアミノ酸残基を少なくとも含むタンパク質、または配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基を少なくとも含むタンパク質）に対して配列番号１のＳｅｒ１７８Ａｒｇのアミノ酸置換が少なくとも生じたタンパク質を用いることで、野生型ＦｃγＲＩＩＩａをＦｃ結合性タンパク質として用いたときと比較し、ＩｇＧ１を高精度かつ高効率に精製できることが示唆される。

さらにＦｃＲ１２とＦｃＲ１３との比較で、ＦｃＲ１３のアフィニティ結合定数が低い（すなわちＩｇＧ１に対する結合性が高い）ことから、不溶性担体に固定化させるＦｃ結合性タンパク質として、前述した野生型ＦｃγＲＩＩＩａに対して配列番号１のＳｅｒ１７８Ａｒｇに加え、少なくとも配列番号１のＳｅｒ６８Ｐｈｅのアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質を用いると、ＩｇＧ１をさらに高精度かつ高効率に精製できることが示唆される。

Claims

Ｆｃ結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムにＩｇＧ１を含む溶液を添加して当該ＩｇＧ１を前記担体に吸着させる工程と、前記担体に吸着したＩｇＧ１を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、ＩｇＧ１の精製方法であって、
前記Ｆｃ結合性タンパク質が、配列番号１２または１６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である、前記精製方法。