JP7310142B2

JP7310142B2 - アルカリ耐性が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、当該タンパク質を用いた抗体吸着剤および当該抗体吸着剤を用いて抗体を分離する方法

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Publication number: JP7310142B2
Application number: JP2019001099A
Authority: JP
Inventors: 遼子渡邉; 諭遠藤; 陽介寺尾
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2018-01-11
Filing date: 2019-01-08
Publication date: 2023-07-19
Anticipated expiration: 2039-01-08
Also published as: JP2020092689A

Description

本発明は、免疫グロブリンに親和性を有するＦｃ結合性タンパク質に関する。より詳しくは本発明は、アルカリに対する安定性（アルカリ耐性）が天然型より向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、当該タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる抗体吸着剤、および当該抗体吸着剤を用いて抗体を分離する方法に関する。

また本発明は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａのうち、特定位置のアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換することで、遺伝子組換体による生産性が向上したＦｃ結合性タンパク質に関する。

Ｆｃレセプターは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域に結合する一群の分子である。個々の分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する認識ドメインによって、単一の、または同じグループの免疫グロブリンイソタイプをＦｃレセプター上の認識ドメインによって認識している。これによって、免疫応答においてどのアクセサリー細胞が動因されるかが決まってくる。Ｆｃレセプターは、さらにいくつかのサブタイプに分類することができ、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）に対するレセプターであるＦｃγレセプター、ＩｇＥのＦｃ領域に結合するＦｃεレセプター、ＩｇＡのＦｃ領域に結合するＦｃαレセプター等がある。また各レセプターは更に細かく分類されており、Ｆｃγレセプターは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ及びＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂの存在が報告されている（非特許文献１）。

Ｆｃγレセプターの中でも、ＦｃγＲＩＩＩａはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）やマクロファージなどの細胞表面に存在しており、ヒト免疫機構の中でも重要なＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）活性に関与している重要なレセプターである。このＦｃγＲＩＩＩａとヒトＩｇＧとの親和性は結合の強さを示す結合定数（ｋａ）が１０^７Ｍ^－１以下であることが報告されている（非特許文献２）。また、抗体の糖鎖構造の違いにより、ＦｃγＲＩＩＩａと抗体との結合性が異なることが知られている（非特許文献３）。天然型のヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列（配列番号１）はＵｎｉＰｒｏｔ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒ：Ｐ０８６３７）などの公的データベースに公表されている。また、ヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造上の機能ドメイン、細胞膜を貫通するためのシグナルペプチド配列、細胞膜貫通領域の位置についても同様に公表されている。図１にヒトＦｃγＲＩＩＩａの構造略図を示す。なお、図１中の番号はアミノ酸番号を示しており、その番号は配列番号１に記載のアミノ酸番号に対応する。すなわち、配列番号１中の１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から１６番目のアラニン（Ａｌａ）までがシグナル配列（Ｓ）、１７番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までが細胞外領域（ＥＣ）、２０９番目のバリン（Ｖａｌ）から２２９番目のバリン（Ｖａｌ）までが細胞膜貫通領域（ＴＭ）および２３０番目のリジン（Ｌｙｓ）から２５４番目のリジン（Ｌｙｓ）までが細胞内領域（Ｃ）とされている。なおＦｃγＲＩＩＩａはＩｇＧ１からＩｇＧ４まであるヒトＩｇＧサブクラスのうち、特にＩｇＧ１とＩｇＧ３に対し強く結合する一方、ＩｇＧ２とＩｇＧ４に対する結合は弱いことが知られている。

抗体の糖鎖構造は、抗体医薬品における薬効や安定性に大きく関与するため、抗体医薬品を製造する際に糖鎖構造を制御することは極めて重要である。ＦｃγＲＩＩＩａは抗体の糖鎖構造を認識することから、ＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる吸着剤は、抗体をその糖鎖構造に基づく結合性の違いにより分離できる（特許文献２および３）。このため、前記吸着剤は抗体医薬品製造時の工程分析や分取に有用である。しかしながら、抗体医薬品の工業的製造を前記吸着剤を用いて行なおうとした場合、天然型のＦｃγＲＩＩＩａではアルカリ耐性がなく、アルカリ洗浄による前記吸着剤の再利用が困難なため、前記工業的製造用途には不向きであった。

特許文献１には、天然型のＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域のアミノ酸残基において、特定位置のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することで、アルカリ耐性が向上したＦｃ結合性タンパク質を開示している。しかしながら特許文献１に開示のＦｃ結合性タンパク質であってもアルカリ耐性は十分とはいえず、抗体医薬品の工業的製造用途に用いる場合、製造コスト面で課題があった。

なおヒトＦｃγＲＩＩＩａには、配列番号１における１７６番目のアミノ酸がフェニルアラニンであるタイプ（配列番号１の態様）とバリンであるタイプ（ＧｅｎＢａｎｋ（ＡＡＨ１７８６５．１）において公表されている、配列番号１９の態様）の遺伝子多型が存在し、バリンのタイプの方が抗体親和性は高く、フェニルアラニンのタイプの方が抗体親和性は低いことが知られている（非特許文献４および５）。

特開２０１７－１１８８７１号公報特開２０１５－０８６２１６号公報特開２０１６－１６９１９７号公報

Ｔａｋａｉ．Ｔ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８，３１８－３２６，２００５Ｊ．Ｇａｌｏｎ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，１９２８－１９３２，１９９７Ｃ．Ｌ．Ｃｈｅｎ等，ＡＣＳＣｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１２，１３３５－１３４５，２０１７Ｈ．Ｒ．Ｋｏｅｎｅ等，Ｂｌｏｏｄ，９０，１１０９－１１１４，１９９７Ｐ．Ｂｒｕｈｎｓ等，Ｂｌｏｏｄ，１６，３７１６－３７２５，２００９

本発明の課題は、アルカリに対する安定性（アルカリ耐性）が向上したＦｃ結合性タンパク質、当該タンパク質の製造方法、および当該タンパク質を用いた抗体吸着剤を提供することを含む。

また前述した通り、ＦｃγＲＩＩＩａは抗体の糖鎖構造を認識することから、ＦｃγＲＩＩＩａを不溶性担体に固定化して得られる吸着剤は抗体医薬品製造時の工程分析や分取に有用である。しかしながら、抗体医薬品の工業的製造を前記吸着剤を用いて行なおうとした場合、従来のＦｃγＲＩＩＩａでは遺伝子組換体による生産性が劣っており、コスト面で課題があった。そこで少なくとも１つの本発明の課題は、従来のＦｃγＲＩＩＩａと比較し、遺伝子組換体による生産性が向上した、ＦｃγＲＩＩＩａアミノ酸置換体を提供することを場合により含む。

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、ヒトＦｃγＲＩＩＩａにおける安定性向上に関与したアミノ酸残基を特定し、当該アミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した変異体が、アルカリに対して優れた安定性を有することを見出した。また本発明者らは、配列番号１に示すヒトＦｃγＲＩＩＩａのアミノ酸配列のうち、１７６番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に網羅的に置換した結果、従来のＦｃγＲＩＩＩａよりも遺伝子組換体による生産性が向上したアミノ酸置換体を見出した。これらの知見に基づいて、本発明者らは本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の［１］から［１１］に記載の態様を包含する。

［１］
配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において、少なくとも以下に示す３５箇所のアミノ酸置換を有するアミノ酸残基を含み、かつ、抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質；
（１）配列番号４の３７番目のグルタミン酸のグリシンへの置換
（２）配列番号４の３９番目のロイシンのメチオニンへの置換
（３）配列番号４の４３番目のバリンのグルタミン酸への置換
（４）配列番号４の４５番目のフェニルアラニンのイソロイシンへの置換
（５）配列番号４の４９番目のグルタミンのプロリンへの置換
（６）配列番号４の５１番目のチロシンのアスパラギンへの置換
（７）配列番号４の５６番目のリジンのグルタミンへの置換
（８）配列番号４の６４番目のグルタミンのアルギニンへの置換
（９）配列番号４の６７番目のチロシンのヒスチジンへの置換
（１０）配列番号４の７０番目のグルタミン酸のアスパラギン酸への置換
（１１）配列番号４の７２番目のアスパラギンのアスパラギン酸への置換
（１２）配列番号４の８１番目のセリンのアルギニンへの置換
（１３）配列番号４の８４番目のセリンのプロリンへの置換
（１４）配列番号４の９０番目のチロシンのフェニルアラニンへの置換
（１５）配列番号４の９１番目のフェニルアラニンのイソロイシンへの置換
（１６）配列番号４の９４番目のアラニンのセリンへの置換
（１７）配列番号４の９６番目のスレオニンのセリンへの置換
（１８）配列番号４の１０８番目のアスパラギンのセリンへの置換
（１９）配列番号４の１３３番目のバリンのグルタミン酸への置換
（２０）配列番号４の１３５番目のリジンのバリンへの置換
（２１）配列番号４の１３７番目のグルタミン酸のグリシンへの置換
（２２）配列番号４の１３８番目のアスパラギン酸のグルタミン酸への置換
（２３）配列番号４の１４８番目のリジンのアルギニンへの置換
（２４）配列番号４の１５６番目のスレオニンのメチオニンへの置換
（２５）配列番号４の１５７番目のチロシンのフェニルアラニンへの置換
（２６）配列番号４の１６３番目のグリシンのバリンへの置換
（２７）配列番号４の１７４番目のチロシンのバリンへの置換
（２８）配列番号４の１８１番目のリジンのグルタミン酸への置換
（２９）配列番号４の１８７番目のフェニルアラニンのセリンへの置換
（３０）配列番号４の１９４番目のセリンのアルギニンへの置換
（３１）配列番号４の１９６番目のアスパラギンのリジンへの置換
（３２）配列番号４の２００番目のグルタミン酸のグリシンへの置換
（３３）配列番号４の２０１番目のスレオニンのアラニンへの置換
（３４）配列番号４の２０３番目のアスパラギンのアスパラギン酸への置換
（３５）配列番号４の２０６番目のイソロイシンのバリンへの置換

［２］
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）である、［１］に記載のＦｃ結合性タンパク質：
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において、
（ｉ）前記（１）～（３５）のアミノ酸置換、および
（ｉｉ）（ｉ）以外の１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加の１以上を有するアミノ酸残基を含む、Ｆｃ結合性タンパク質；
（ｂ）前記（１）～（３５）のアミノ酸置換を含むＦｃ結合性タンパク質であって、配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する、Ｆｃ結合性タンパク質；
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸配列に対して７０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列において、前記（１）～（３５）のアミノ酸置換がなされたアミノ酸配列を含み、かつ、抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質。

［３］
さらに以下に示すアミノ酸置換のいずれかを少なくとも有する、［１］または［２］に記載のＦｃ結合性タンパク質。
（３６）配列番号４の１９２番目のバリンのイソロイシンへの置換
（３７）配列番号４の１９２番目のバリンのアラニンへの置換
（３８）配列番号４の１９２番目のバリンのチロシンへの置換

［４］
配列番号７、９または１１に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含む、［１］～［３］の何れかに記載のＦｃ結合性タンパク質。

［５］
［１］～［４］のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。

［６］
［５］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

［７］
［６］に記載の組換えベクターで宿主を形質転換して得られる、Ｆｃ結合性タンパク質を生産可能な形質転換体。

［８］
宿主が大腸菌である、［７］に記載の形質転換体。

［９］
［７］または［８］に記載の形質転換体を培養することによりＦｃ結合性タンパク質を生産する工程と、得られた培養物から生産された前記Ｆｃ結合性タンパク質を回収する工程とを含む、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。

［１０］
［１］から［４］のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる、抗体の吸着剤。

［１１］
［１０］に記載の吸着剤を充填したカラムに抗体を含む溶液を添加して当該抗体を前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、抗体の分離方法。

［１２］
Ｆｃ結合性タンパク質との結合性の違いに基づいて、異なる糖鎖構造を有する抗体が分離される、［１１］に記載の分離方法。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明のＦｃ結合性タンパク質は、抗体のＦｃ領域に結合性を持つタンパク質であり、配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列のうち、天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（図１のＥＣ領域）に相当する３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまで（配列番号１では１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまで）のアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、少なくとも特定位置におけるアミノ酸置換が生じたタンパク質である。したがって、本発明のＦｃ結合性タンパク質は、細胞外領域のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域（図１のＳ）の全てまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＣ末端側にある細胞膜貫通領域（図１のＴＭ）および細胞内領域（図１のＣ）の全てまたは一部を含んでもよい。前記特定位置におけるアミノ酸置換は具体的には、Ｇｌｕ３７Ｇｌｙ（この表記は、配列番号４の３７番目のグルタミン酸がグリシンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｌｅｕ３９Ｍｅｔ、Ｖａｌ４３Ｇｌｕ、Ｐｈｅ４５Ｉｌｅ、Ｇｌｎ４９Ｐｒｏ、Ｔｙｒ５１Ａｓｎ、Ｌｙｓ５６Ｇｌｎ、Ｇｌｎ６４Ａｒｇ、Ｔｙｒ６７Ｈｉｓ、Ｇｌｕ７０Ａｓｐ、Ａｓｎ７２Ａｓｐ、Ｓｅｒ８１Ａｒｇ、Ｓｅｒ８４Ｐｒｏ、Ｔｙｒ９０Ｐｈｅ、Ｐｈｅ９１Ｉｌｅ、Ａｌａ９４Ｓｅｒ、Ｔｈｒ９６Ｓｅｒ、Ａｓｎ１０８Ｓｅｒ、Ｖａｌ１３３Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１３５Ｖａｌ、Ｇｌｕ１３７Ｇｌｙ、Ａｓｐ１３８Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１４８Ａｒｇ、Ｔｈｒ１５６Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１５７Ｐｈｅ、Ｇｌｙ１６３Ｖａｌ、Ｔｙｒ１７４Ｖａｌ、Ｌｙｓ１８１Ｇｌｕ、Ｐｈｅ１８７Ｓｅｒ、Ｓｅｒ１９４Ａｒｇ、Ａｓｎ１９６Ｌｙｓ、Ｇｌｕ２００Ｇｌｙ、Ｔｈｒ２０１Ａｌａ、Ａｓｎ２０３ＡｓｐおよびＩｌｅ２０６Ｖａｌである。

なお本発明のＦｃ結合性タンパク質は、前述した特定位置におけるアミノ酸置換を少なくとも有していればよく、抗体結合活性を有する限り、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上、さらに有してもよい。前記態様の具体例として、以下の（ｉ）から（ｖ）に示す、抗体結合活性を有したＦｃ結合性タンパク質があげられる：
（ｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、但し前述した特定位置におけるアミノ酸置換を有し、かつ少なくともＶａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２ＡｌａまたはＶａｌ１９２Ｔｙｒのアミノ酸置換をさらに有したＦｃ結合性タンパク質；
（ｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、但し前述した特定位置におけるアミノ酸置換を有しており、かつ前述した特定位置におけるアミノ酸置換以外の１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有したＦｃ結合性タンパク質；
（ｉｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を含み、但し前述した特定位置におけるアミノ酸置換を有しており、かつ前述した特定位置におけるアミノ酸置換以外の１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上をさらに有し、かつＶａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２ＡｌａまたはＶａｌ１９２Ｔｙｒのアミノ酸置換をさらに有したＦｃ結合性タンパク質；
（ｉｖ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して、７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＦｃ結合性タンパク質であって、前述した特定位置におけるアミノ酸置換を有したＦｃ結合性タンパク質；
（ｖ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して、７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するＦｃ結合性タンパク質であって、前述した特定位置におけるアミノ酸置換およびＶａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２ＡｌａまたはＶａｌ１９２Ｔｙｒのアミノ酸置換を有したＦｃ結合性タンパク質；
（ｖｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して、７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列において、前述した特定位置におけるアミノ酸置換を有したＦｃ結合性タンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して、７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列において、前述した特定位置におけるアミノ酸置換およびＶａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２ＡｌａまたはＶａｌ１９２Ｔｙｒのアミノ酸置換を有したＦｃ結合性タンパク質。

前記（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｖ）および（ｖｉｉ）に記載のＶａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２ＡｌａまたはＶａｌ１９２Ｔｙｒのアミノ酸置換は、遺伝子組換体による生産性を向上させるアミノ酸置換である。したがって、前述した特定位置におけるアミノ酸置換を少なくとも有した本発明のＦｃ結合性タンパク質に、前記アミノ酸置換をさらに有することで、天然型ＦｃγＲＩＩＩａよりもアルカリ耐性が向上し、かつ遺伝子組換体による生産性も向上したＦｃ結合性タンパク質が得られる。

本明細書において、「１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加」、ならびに「アミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加のうち、いずれか１つ以上」とは、タンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、例えば、１から５０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加であってよく、好ましくは１から４０個、より好ましくは１から３０個、更に好ましくは１から２０個（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個）、特に好ましくは１から１０個（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個）のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加であってよい。また本明細書における「置換」、「欠失」、「挿入」および「付加」には、遺伝子が由来する微生物の個体差、種の違いなどに基づく、天然にも生じ得る変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。例えばヒトＦｃγＲＩＩＩａには、Ｌｅｕ８２Ｈｉｓ、Ｌｅｕ８２Ａｒｇ、Ｇｌｙ１６３Ａｓｐ、Ｔｙｒ１７４Ｈｉｓのうち、いずれか１つ以上のアミノ酸置換を有したアミノ酸置換体が知られているが、本発明のＦｃ結合性タンパク質はこれらのアミノ酸置換をさらに含んでいてもよい。

前記（ｉｖ）および（ｖ）におけるアミノ酸配列の相同性は７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上、７９％以上または８０％以上であってよい。
前記（ｖｉ）および（ｖｉｉ）におけるアミノ酸配列の相同性は７０％以上、７１％以上、７２％以上、７３％以上、７４％以上、７５％以上、７６％以上、７７％以上、７８％以上または７９％以上であってよく、好ましくは８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上または８４％以上であってよく、より好ましくは８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上または８９％以上であってよく、更に好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってよい。

本明細書において、アミノ酸配列の「相同性」は、アミノ酸配列の「同一性」と同義である。ここで、アミノ酸配列の「同一性（相同性）」とは、比較すべき２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列を整列させ、一致したアミノ酸残基数を全アミノ酸残基数で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化方法は、特に限定されないが、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ等の周知の配列比較プログラムを用いて行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全アミノ酸残基数は、１つのギャップを１つのアミノ酸残基として数えた残基数となる。このようにして数えた全アミノ酸残基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、配列同一性（％）は、長い方の配列の全アミノ酸残基数で、一致したアミノ酸残基数を除して算出される。

本発明のＦｃ結合性タンパク質は、両アミノ酸の物理的性質と化学的性質またはそのどちらかが類似したアミノ酸間で置換する保守的置換をさらに有してもよい。保守的置換は、Ｆｃ結合性タンパク質に限らず一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、アスパラギン酸とグルタミン酸間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間に生じる置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。

また本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から目的の抗体を分離する際に有用なオリゴペプチドをさらに付加してもよい。前記オリゴペプチドとしては、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等があげられる。さらに本発明のＦｃ結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の固相に固定化する際に有用な、システインを含むオリゴペプチドを、本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にさらに付加してもよい。Ｆｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加するオリゴペプチドの長さは、特に制限はない。前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質に付加させる際は、前記オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製後、当業者に周知の方法を用いて遺伝子工学的にＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加させてもよいし、化学的に合成した前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させて付加させてもよい。さらに本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌の場合における前記シグナルペプチドの例としては、ＰｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ（ＵｎｉＰｒｏｔＮｏ．Ｐ０ＡＥＸ９に記載のアミノ酸配列のうち１番目から２６番目までの領域）、ＴｏｒＴなどのペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる（特開２０１１－０９７８９８号公報）。

本発明のＦｃ結合性タンパク質の好ましい態様として、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むＦｃ結合性タンパク質があげられる。これらのＦｃ結合性タンパク質はアルカリに対する安定性（アルカリ耐性）が向上する点で好ましい。

（ａ）ＦｃＲ３５ｄ（配列番号７に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基）
配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、Ｇｌｕ３７Ｇｌｙ、Ｌｅｕ３９Ｍｅｔ、Ｖａｌ４３Ｇｌｕ、Ｐｈｅ４５Ｉｌｅ、Ｇｌｎ４９Ｐｒｏ、Ｔｙｒ５１Ａｓｎ、Ｌｙｓ５６Ｇｌｎ、Ｇｌｎ６４Ａｒｇ、Ｔｙｒ６７Ｈｉｓ、Ｇｌｕ７０Ａｓｐ、Ａｓｎ７２Ａｓｐ、Ｓｅｒ８１Ａｒｇ、Ｓｅｒ８４Ｐｒｏ、Ｔｙｒ９０Ｐｈｅ、Ｐｈｅ９１Ｉｌｅ、Ａｌａ９４Ｓｅｒ、Ｔｈｒ９６Ｓｅｒ、Ａｓｎ１０８Ｓｅｒ、Ｖａｌ１３３Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１３５Ｖａｌ、Ｇｌｕ１３７Ｇｌｙ、Ａｓｐ１３８Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１４８Ａｒｇ、Ｔｈｒ１５６Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１５７Ｐｈｅ、Ｇｌｙ１６３Ｖａｌ、Ｔｙｒ１７４Ｖａｌ、Ｌｙｓ１８１Ｇｌｕ、Ｐｈｅ１８７Ｓｅｒ、Ｓｅｒ１９４Ａｒｇ、Ａｓｎ１９６Ｌｙｓ、Ｇｌｕ２００Ｇｌｙ、Ｔｈｒ２０１Ａｌａ、Ａｓｎ２０３ＡｓｐおよびＩｌｅ２０６Ｖａｌのアミノ酸置換を有する、ポリペプチド。

（ｂ）ＦｃＲ３６ｉ（配列番号９に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基）
配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、Ｇｌｕ３７Ｇｌｙ、Ｌｅｕ３９Ｍｅｔ、Ｖａｌ４３Ｇｌｕ、Ｐｈｅ４５Ｉｌｅ、Ｇｌｎ４９Ｐｒｏ、Ｔｙｒ５１Ａｓｎ、Ｌｙｓ５６Ｇｌｎ、Ｇｌｎ６４Ａｒｇ、Ｔｙｒ６７Ｈｉｓ、Ｇｌｕ７０Ａｓｐ、Ａｓｎ７２Ａｓｐ、Ｓｅｒ８１Ａｒｇ、Ｓｅｒ８４Ｐｒｏ、Ｔｙｒ９０Ｐｈｅ、Ｐｈｅ９１Ｉｌｅ、Ａｌａ９４Ｓｅｒ、Ｔｈｒ９６Ｓｅｒ、Ａｓｎ１０８Ｓｅｒ、Ｖａｌ１３３Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１３５Ｖａｌ、Ｇｌｕ１３７Ｇｌｙ、Ａｓｐ１３８Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１４８Ａｒｇ、Ｔｈｒ１５６Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１５７Ｐｈｅ、Ｇｌｙ１６３Ｖａｌ、Ｔｙｒ１７４Ｖａｌ、Ｌｙｓ１８１Ｇｌｕ、Ｐｈｅ１８７Ｓｅｒ、Ｖａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｓｅｒ１９４Ａｒｇ、Ａｓｎ１９６Ｌｙｓ、Ｇｌｕ２００Ｇｌｙ、Ｔｈｒ２０１Ａｌａ、Ａｓｎ２０３ＡｓｐおよびＩｌｅ２０６Ｖａｌのアミノ酸置換を有する、ポリペプチド。

（ｃ）ＦｃＲ３６ａ（配列番号１１に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基）
配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基であり、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、Ｇｌｕ３７Ｇｌｙ、Ｌｅｕ３９Ｍｅｔ、Ｖａｌ４３Ｇｌｕ、Ｐｈｅ４５Ｉｌｅ、Ｇｌｎ４９Ｐｒｏ、Ｔｙｒ５１Ａｓｎ、Ｌｙｓ５６Ｇｌｎ、Ｇｌｎ６４Ａｒｇ、Ｔｙｒ６７Ｈｉｓ、Ｇｌｕ７０Ａｓｐ、Ａｓｎ７２Ａｓｐ、Ｓｅｒ８１Ａｒｇ、Ｓｅｒ８４Ｐｒｏ、Ｔｙｒ９０Ｐｈｅ、Ｐｈｅ９１Ｉｌｅ、Ａｌａ９４Ｓｅｒ、Ｔｈｒ９６Ｓｅｒ、Ａｓｎ１０８Ｓｅｒ、Ｖａｌ１３３Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１３５Ｖａｌ、Ｇｌｕ１３７Ｇｌｙ、Ａｓｐ１３８Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１４８Ａｒｇ、Ｔｈｒ１５６Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１５７Ｐｈｅ、Ｇｌｙ１６３Ｖａｌ、Ｔｙｒ１７４Ｖａｌ、Ｌｙｓ１８１Ｇｌｕ、Ｐｈｅ１８７Ｓｅｒ、Ｖａｌ１９２Ａｌａ、Ｓｅｒ１９４Ａｒｇ、Ａｓｎ１９６Ｌｙｓ、Ｇｌｕ２００Ｇｌｙ、Ｔｈｒ２０１Ａｌａ、Ａｓｎ２０３ＡｓｐおよびＩｌｅ２０６Ｖａｌのアミノ酸置換を有する、ポリペプチド。

なお、配列番号７、９および１１に記載のＦｃ結合タンパク質のうち、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジンから３２番目のメチオニンまでがリンカー配列であり、３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでが抗体のＦｃ領域に結合可能なポリペプチド（ＦｃＲ３５ｄ（配列番号７）、ＦｃＲ３６ｉ（配列番号９）またはＦｃＲ３６ａ（配列番号１１））のアミノ酸配列であり、２０９番目から２１０番目までのグリシンがリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジンがタグ配列である。

本発明のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド（以下、単に本発明のポリヌクレオチドとも表記する）の作製方法の一例として、
（Ｉ）本発明のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
（ＩＩ）Ｆｃ結合性タンパク質の全体または部分配列をコードするポリヌクレオチドを直接人工的に、またはＦｃ結合性タンパク質のｃＤＮＡ等からＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した当該ポリヌクレオチドを適当な方法で連結する方法、
が例示できる。

前記（Ｉ）の方法において、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎＵｓａｇｅＤａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。

本発明のポリヌクレオチドへ変異を導入する場合、エラープローンＰＣＲ法を用いることができる。エラープローンＰＣＲ法における反応条件は、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに所望の変異を導入できる条件であれば特に限定はなく、例えば、基質である４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）の濃度を不均一にし、ＭｎＣｌ_２を０．０１から１０ｍＭ（好ましくは０．１から１ｍＭ）の濃度でＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲを行なうことで、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。またエラープローンＰＣＲ法以外の変異導入方法としては、Ｆｃ結合性タンパク質の全体または部分配列を含むポリヌクレオチドに、変異原となる薬剤を接触・作用させたり、紫外線を照射したりして、ポリヌクレオチドに変異を導入して作製する方法があげられる。当該方法において変異原として使用する薬剤としては、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン等、当業者が通常用いる変異原性薬剤を用いればよい。

本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現させる宿主には特に制限はなく、一例として、動物細胞（ＣＨＯ（ＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔｅｒＯｖａｒｙ）細胞、ＨＥＫ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞等）、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ等）、昆虫細胞（Ｓｆ９、Ｓｆ２１等）、大腸菌（ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、Ｗ３１１０株等）や枯草菌があげられる。なお動物細胞や大腸菌を宿主として用いると生産性の面で好ましく、大腸菌を宿主として用いるとさらに好ましい。

本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換する場合、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いてもよいが、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミド等）の適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入したものを用いると、より好ましい。なお当該発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はなく、大腸菌を宿主とする場合は、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣプラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクター、ｐＣＤＦプラスミドベクター、ｐＢＢＲプラスミドベクターを例示することができる。また前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモーターといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で挿入すると好ましい。当該プロモーターの例として、宿主が大腸菌の場合は、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌｐｐプロモーター、さらにはλファージのλＰＬプロモーター、λＰＲプロモーターがあげられ、宿主が動物細胞の場合は、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーターがあげられる。

前記方法により作製した、本発明のポリヌクレオチドを挿入した発現ベクター（以下、本発明の発現ベクターとする）を用いて宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。例えば、宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物（大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、大腸菌Ｗ３１１０株等）を選択する場合には、公知の文献（例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５６，１９９２）に記載の方法等により形質転換すればよい。なお宿主が動物細胞である場合にはエレクトロポレーションやリポフェクションを用いればよい。前述した方法で形質転換して得られた形質転換体は、適切な方法でスクリーニングすることにより、本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体（以下、本発明の形質転換体とする）を取得することができる。

本発明の形質転換体から本発明の発現ベクターを調製するには、形質転換に用いた宿主に適した方法で、本発明の形質転換体から本発明の発現ベクターを抽出し調製すればよい。例えば、本発明の形質転換体の宿主が大腸菌の場合、形質転換体を培養して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐｋｉｔ（キアゲン製）等の市販の抽出キットを用いて調製すればよい。

本発明の形質転換体を培養し、得られた培養物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収することで、本発明のＦｃ結合性タンパク質を製造することができる。なお本明細書において培養物とは、培養された本発明の形質転換体の細胞そのもののほか、培養に用いた培地も含まれる。本発明のタンパク質製造方法で用いる形質転換体は、対象宿主の培養に適した培地で培養すればよく、宿主が大腸菌の場合は、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培地が好ましい培地の一例としてあげられる。なお、本発明の発現ベクターの導入の有無により本発明の形質転換体を選択的に増殖させるために、培地に当該ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養すると好ましい。例えば、当該ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加してもよく、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。

さらにグリシンといった前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す試薬を添加してもよく、具体的には、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２０℃から３７℃、より好ましくは２５℃前後であるが、発現させるタンパク質の特性により選択すればよい。培地のｐＨは宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４、好ましくはｐＨ７．０前後である。また本発明のベクターに誘導性のプロモーターが含まれている場合は、本発明のＦｃ結合性タンパク質が良好に発現できるような条件下で誘導をかけると好ましい。誘導剤としてはＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示することができる。宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）を測定し、約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、Ｆｃ結合性タンパク質の発現を誘導することができる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１から０．５ｍＭの範囲が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。

本発明の形質転換体を培養して得られた培養物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収するには、本発明の形質転換体における本発明のＦｃ結合性タンパク質の発現形態に適した方法で、当該培養物から分離／精製して本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収すればよい。例えば、培養上清に発現する場合は菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清から本発明のＦｃ結合性タンパク質を精製すればよい。また、細胞内（ペリプラズムを含む）に発現する場合には、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加したり、超音波やフレンチプレス等を用いて菌体を破砕して本発明のＦｃ結合性タンパク質を抽出した後、精製すればよい。本発明のＦｃ結合性タンパク質を精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、一例として液体クロマトグラフィーを用いた分離／精製があげられる。液体クロマトグラフィーには、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があり、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製操作を行なうことにより、本発明のＦｃ結合性タンパク質を高純度に調製することができる。

得られた本発明のＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧに対する結合活性を測定する方法としては、例えばＩｇＧに対する結合活性をＥｎｚｙｍｅ－ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ（以下、ＥＬＩＳＡと表記）法や表面プラズモン共鳴法などを用いて測定すればよい。結合活性の測定に使用するＩｇＧは、ヒトＦｃ結合性タンパク質の改変型を用いる場合は、ヒトＩｇＧが好ましく、ヒトＩｇＧ１やヒトＩｇＧ３が特に好ましい。

本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に結合させることで、本発明の吸着剤を製造することができる。前記不溶性担体には特に限定はなく、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプンといった多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタンといった合成高分子を原料とした担体や、シリカなどのセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一例として、トヨパール（東ソー製）等の水酸基を導入したポリメタクリレートゲル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥヘルスケア製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮＣ製）等のセルロースゲルがあげられる。不溶性担体の形状については特に限定はなく、粒状物または非粒状物、多孔性または非多孔性、いずれであってもよい。

Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化するには、不溶性担体にＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシル基、マレイミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミド等の活性基を付与し、当該活性基を介してヒトＦｃ結合性タンパク質と不溶性担体とを共有結合させることで固定化すればよい。活性基を付与した担体は市販の担体をそのまま用いてもよいし、適切な反応条件で担体表面に活性基を導入して調製してもよい。活性基を付与した市販の担体としてはＴＯＹＯＰＥＡＲＬＡＦ－Ｅｐｏｘｙ－６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＡＦ－Ｔｒｅｓｙｌ－６５０Ｍ（いずれも東ソー製）、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＨＰＣｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦａｓｔＦｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ（いずれもＧＥヘルスケア製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋＣｏｕｐｌｉｎｇＲｅｓｉｎ（サーモサイエンティフィック製）が例示できる。

一方、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反応させる方法が例示できる。当該化合物の一例のうち、担体表面の水酸基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルが例示できる。前記化合物により担体表面にエポキシ基を導入した後、担体表面にカルボキシル基を導入する化合物としては、２－メルカプト酢酸、３－メルカプトプロピオン酸、４－メルカプト酪酸、６－メルカプト酪酸、グリシン、３－アミノプロピオン酸、４－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸を例示できる。

担体表面に存在する水酸基やエポキシ基、カルボキシル基、アミノ基にマレイミド基を導入する化合物としては、Ｎ－（ε－マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ－（ε－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４－［４－Ｎ－マレイミドフェニル］酢酸ヒドラジド、２－アミノマレイミド、３－アミノマレイミド、４－アミノマレイミド、６－アミノマレイミド、１－（４－アミノフェニル）マレイミド、１－（３－アミノフェニル）マレイミド、４－（マレイミド）フェニルイソシアナート、２－マレイミド酢酸、３－マレイミドプロピオン酸、４－マレイミド酪酸、６－マレイミドヘキサン酸、（Ｎ－［α―マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル）、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、（スクシンイミジル－４－［マレイミドメチル］シクロヘキサン－１－カルボニル－［６－アミノヘキサン酸］）、（スクシンイミジル－４－［マレイミドメチル］シクロヘキサン－１－カルボン酸）、（ｐ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。

担体表面に存在する水酸基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロリド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、２－（ヨードアセトアミド）酢酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、３－（ブロモアセトアミド）プロピオン酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、４－（ヨードアセチル）アミノ安息香酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。なお担体表面に存在する水酸基やアミノ基にω－アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤でω－アルケニル部位をハロゲン化し活性化する方法も例示できる。ω－アルケニルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３－ブテニルグリシジルエーテル、４－ペンテニルグリシジルエーテルを例示でき、ハロゲン化剤としてはＮ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミドを例示できる。

担体表面に活性基を導入する方法の別の例として、担体表面に存在するカルボキシル基に対して縮合剤と添加剤を用いて活性化基を導入する方法がある。縮合剤としては１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘキシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。また添加剤としてはＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４－ニトロフェノール、１－ヒドロキシベンズトリアゾールを例示できる。

本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化する際用いる緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２－ＭｏｒｐｈｏｌｉｎｏＥｔｈａｎｅＳｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４－（２－ＨｙｄｒｏｘｙＥｔｈｙｌ）－１－ＰｉｐｅｒａｚｉｎｅＥｔｈａｎｅＳｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、５℃から５０℃までの温度範囲の中から活性基の反応性や本発明のＦｃ結合性タンパク質の安定性を考慮の上、適宜設定すればよく、好ましくは１０℃から３５℃の範囲である。

本発明のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる本発明の吸着剤を用いて、抗体を分離するには、例えば、本発明の吸着剤を充填したカラムに抗体を含む緩衝液をポンプ等の送液手段を用いて添加することで、抗体を本発明の吸着剤に特異的に吸着させた後、適切な溶出液をカラムに添加することで、抗体を溶出すればよい。なお、抗体を含む緩衝液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化すると、抗体をより高純度に分離できるため好ましい。緩衝液としてはリン酸緩衝液等、無機塩を成分とした緩衝液を例示することができる。なお緩衝液のｐＨは、ｐＨ３から１０、好ましくはｐＨ４から８である。本発明の吸着剤に吸着した、抗体を溶出させるには、抗体とリガンド（本発明のＦｃ結合性タンパク質）との相互作用を弱めればよく、具体的には、緩衝液によるｐＨ変化、カウンターペプチド、温度変化、塩濃度変化が例示できる。本発明の吸着剤に吸着した、抗体を溶出させるための溶出液の具体例として、本発明の吸着剤に抗体を吸着させる際に用いた溶液よりも酸性側の緩衝液があげられる。緩衝液の種類としては酸性側に緩衝能を有するクエン酸緩衝液、グリシン塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。緩衝液のｐＨは、抗体が有する機能を損なわない範囲で設定すればよく、好ましくはｐＨ２．５から６．０、より好ましくはｐＨ３．０から５．０、さらに好ましくはｐＨ３．０から４．０である。

塩濃度の変化で抗体を溶出させる場合、高濃度の塩を含む緩衝液（溶出液）で一段階に溶出してもよく、任意に塩濃度を段階的に上昇させてもよく（ステップグラジエント）、直線的濃度勾配で塩濃度を上昇させてもよい（リニアグラジエント）が、リニアグラジエントで溶出させると好ましい。例えば水溶性の塩として塩化ナトリウムを用いる場合、塩化ナトリウム濃度０Ｍから１Ｍまでのリニアグラジエントで溶出させればよい。また、ｐＨ変化で抗体を溶出させる場合、平衡化緩衝液よりｐＨが低下した酸性緩衝液（溶出液）で一段階に溶出してもよく、任意に緩衝液のｐＨを段階的に低下させてもよく（ステップグラジエント）、直線的濃度勾配で緩衝液のｐＨを低下させてもよい（リニアグラジエント）が、リニアグラジエントで溶出させると好ましい。例えば抗体が吸着する中性から弱酸性の緩衝液から抗体が溶離する酸性の緩衝液へと、リニアグラジエントで溶出させればよい。

前述した方法で溶出された、抗体が含まれる画分を分取することで当該抗体を得ることができる。分取は常法により行なってよい。具体的には、例えば、一定の時間ごとや、一定の容量ごとに回収容器を交換する方法や、溶出液のクロマトグラムの形状に合わせて回収容器を換える方法や、自動フラクションコレクター等により画分の分取をすることが挙げられる。

なお抗体を含む溶液から、本発明の吸着剤を用いて前記抗体を分離する際、本発明のＦｃ結合性タンパク質は抗体に結合している糖鎖構造の違いを認識することから、前記抗体が有する糖鎖構造の違いにより、抗体を順次溶出させ、その結果、抗体の溶出位置（溶出フラクション）が異なる溶出離液を用いることが好ましい。従って、本発明の吸着剤を用いて抗体を分離することで、抗体が有する糖鎖構造の違いを識別することができる。識別可能な糖鎖の構造に特に限定はなく、一例として、ＣＨＯ細胞といった動物由来の細胞や、ピキア酵母やサッカロミセス酵母といった酵母を宿主として抗体を発現させたときに付加される糖鎖や、ヒト抗体が有する糖鎖や、化学合成法で抗体に付加した糖鎖があげられる。また本発明の吸着剤は、抗体が有する糖鎖構造の違いに基づき抗体を分離できる。

本発明のＦｃ結合性タンパク質は、天然型のＦｃ結合性タンパク質と比べて、アルカリに対して優れた安定性（アルカリ耐性）を有する。本発明のＦｃ結合性タンパク質を抗体の吸着剤におけるアフィニティリガンドとして用いることで、アルカリ洗浄に対する安定性（耐性）が高い吸着剤が得られる。したがって、抗体医薬品の工業的製造におけるコスト低減に寄与できる。

また、本発明のＦｃ結合性タンパク質において、特定位置のアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換することで、遺伝子組換体による生産性を向上させることができる。

ヒトＦｃγＲＩＩＩａの概略図である。図中の数字は配列番号１に記載のアミノ酸配列の番号を示している。図中のＳはシグナル配列、ＥＣは細胞外領域、ＴＭは細胞膜貫通領域、Ｃは細胞内領域を示している。ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルにより、モノクローナル抗体（リツキサン）を分離した際のクロマトグラムである。２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）および１０ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を用い、１０ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）が０％から１００％になるようにリニアグラジエント溶出することで、リツキサンを溶出した。ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを用いて、リニアグラジエント溶出により分取したモノクローナル抗体（リツキサン）のＡＤＣＣ活性を測定した結果を示している。ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを用いて、リニアグラジエント溶出により分取したモノクローナル抗体（リツキサン）の糖鎖構造を解析した結果を示している。ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルにより、モノクローナル抗体（リツキサン）を分離した際のクロマトグラムである。２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）および１０ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）により、ステップグラジエント溶出することで、リツキサンを溶出した。ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを用いて、ステップグラジエント溶出により分取したモノクローナル抗体（リツキサン）の糖鎖構造を解析した結果を示している。ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルにより、モノクローナル抗体（アバスチン）を分離した際のクロマトグラムである。２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）および１０ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）により、ステップグラジエント溶出することで、アバスチンを溶出した。ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを用いて、ステップグラジエント溶出により分取したモノクローナル抗体（アバスチン）の糖鎖構造を解析した結果を示している。

以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。

実施例１Ｆｃ結合性タンパク質への変異導入およびライブラリーの作製
特開２０１７－１１８８７１号公報に記載の方法で作製した、ＦｃＲ３５ｃを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号５）をコードするポリヌクレオチドに対し、エラープローンＰＣＲによるランダム変異導入を施した。なおＦｃＲ３５ｃ（配列番号５に記載のアミノ酸配列のうち、３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基）は、天然型ヒトＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域（図１のＥＣ領域）に相当する、配列番号４の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまで（配列番号１では１７番目のグリシンから１９２番目のグルタミンまで）のアミノ酸残基であり、ただし当該３３番目から２０８番目までのアミノ酸残基において、Ｇｌｕ３７Ｇｌｙ（この表記は、配列番号４の３７番目のグルタミン酸がグリシンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｌｅｕ３９Ｍｅｔ、Ｖａｌ４３Ｇｌｕ、Ｐｈｅ４５Ｉｌｅ、Ｇｌｎ４９Ｐｒｏ、Ｔｙｒ５１Ａｓｎ、Ｌｙｓ５６Ｇｌｎ、Ｇｌｎ６４Ａｒｇ、Ｔｙｒ６７Ｈｉｓ、Ｇｌｕ７０Ａｓｐ、Ａｓｎ７２Ａｓｐ、Ｓｅｒ８４Ｐｒｏ、Ｔｙｒ９０Ｐｈｅ、Ｐｈｅ９１Ｉｌｅ、Ａｌａ９４Ｓｅｒ、Ｔｈｒ９６Ｓｅｒ、Ａｓｐ９８Ｇｌｕ、Ａｓｎ１０８Ｓｅｒ、Ａｓｐ１１４Ｇｌｕ、Ｇｌｎ１１７Ｌｅｕ、Ｖａｌ１３３Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１３５Ｖａｌ、Ｇｌｕ１３７Ｇｌｙ、Ａｓｐ１３８Ｇｌｕ、Ｌｙｓ１４８Ａｒｇ、Ｔｈｒ１５６Ｍｅｔ、Ｔｙｒ１５７Ｐｈｅ、Ｇｌｙ１６３Ｖａｌ、Ｔｙｒ１７４Ｖａｌ、Ｌｙｓ１８１Ｇｌｕ、Ｐｈｅ１８７Ｓｅｒ、Ｓｅｒ１９４Ａｒｇ、Ｔｈｒ２０１Ａｌａ、Ａｓｎ２０３Ｇｌｕ、Ｉｌｅ２０６ＶａｌおよびＧｌｎ２０８Ｐｒｏのアミノ酸置換を有したポリペプチドである。

（１）鋳型として特開２０１７－１１８８７１号公報に記載の方法で作製した発現ベクターｐＥＴ－ＦｃＲ３５ｃ（当該発現ベクターのうち配列番号５に記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号６に示す）を用いてエラープローンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３５サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。この反応によりＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドに良好に変異が導入された。

（２）（１）で得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ同制限酵素で消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションした。

（３）ライゲーション反応終了後、反応液をエレクトロポレーション法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異ライブラリーとした。

実施例２アルカリ耐性を有したＦｃ結合性タンパク質のスクリーニング
（１）実施例１で作製したランダム変異ライブラリー（形質転換体）を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３０℃で一晩振とう培養した。

（２）培養後、５μＬの培養液を５００μＬの０．０５ｍＭのＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、０．３％（ｗ／ｖ）のグリシンおよび５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で一晩振とう培養した。

（３）培養後、遠心操作によって得られた、Ｆｃ結合性タンパク質を含む培養上清を純水にて２５倍に希釈し、等量の５００ｍＭの水酸化ナトリウム溶液と混合した後、３０℃で３時間静置することでアルカリ処理した。アルカリ処理後は、４倍量の１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０）でｐＨを中性付近に戻した。

（４）（３）に記載のアルカリ処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性と、（３）に記載のアルカリ処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、それぞれ下記に示すＥＬＩＳＡ法にて測定し、アルカリ処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。

（４－１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌで固定化し（４℃で１８時間）、固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭＭＩＬＫ（ＢＤ製）および１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）によりブロッキングした。

（４－２）洗浄緩衝液（０．０５％［ｗ／ｖ］のＴｗｅｅｎ２０、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、抗体結合活性を評価するＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を添加し、Ｆｃ結合性タンパク質と固定化ガンマグロブリンとを反応させた（３０℃で１時間）。

（４－３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ－６Ｈｉｓ抗体（ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。

（４－４）３０℃で１時間反応させ、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＳｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（テカン製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。

（５）（４）の方法で約２７００株の形質転換体を評価し、その中からＦｃＲ３５ｃと比較して安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。選択した形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地にて培養し、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐｋｉｔ（キアゲン製）を用いて発現ベクターを調製した。

（６）得られた発現ベクターに挿入されたＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列をチェーンターミネータ法に基づくＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＦＳｒｅａｄＲｅａｃｔｉｏｎｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩＰｒｉｓｍ３７００ＤＮＡａｎａｌｙｚｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号２（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’）または配列番号３（５’－ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。

（４）の方法で形質転換体を評価し、ＦｃＲ３５ｃと比較した結果を表２に示す。ＦｃＲ３５ｃと比較してアルカリ安定性が向上したポリペプチドを、ＦｃＲ３５ｄ、ＦｃＲ３６ｉおよびＦｃＲ３６ａと命名した。ＦｃＲ３５ｃと比較してアルカリ安定性が低下したポリペプチドを、それぞれＡ，Ｂ，ＣおよびＤとして表２に記載した（配列未確認）。

ＦｃＲ３５ｄを含むＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列を配列番号７に、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号８に示す。また、ＦｃＲ３６ｉを含むＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列を配列番号９に、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１０に示す。さらに、ＦｃＲ３６ａを含むＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１１に、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１２に示す。なお、配列番号７、９および１１において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ３５ｄ（配列番号７）、ＦｃＲ３６ｉ（配列番号９）またはＦｃＲ３６ａ（配列番号１１）のアミノ酸配列、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。

（６）の方法でＦｃＲ３５ｄ、ＦｃＲ３６ｉおよびＦｃＲ３６ａをコードするポリヌクレオチドの配列を解析した結果、ＦｃＲ３５ｄ（配列番号７）はＦｃＲ３５ｃに対して、Ｓｅｒ８１Ａｒｇ、Ａｓｎ１９６Ｌｙｓ、Ｇｌｕ２００ＧｌｙおよびＧｌｕ２０３Ａｓｐという新たなアミノ酸置換が生じた一方、９８番目、１１４番目、１１７番目および２０８番目のアミノ酸残基は天然型（配列番号４）のアミノ酸残基に戻っていた。またＦｃＲ３６ｉ（配列番号９）はＦｃＲ３５ｃに対して、Ｓｅｒ８１Ａｒｇ、Ｖａｌ１９２Ｉｌｅ、Ａｓｎ１９６Ｌｙｓ、Ｇｌｕ２００ＧｌｙおよびＧｌｕ２０３Ａｓｐという新たなアミノ酸置換が生じた一方、９８番目、１１４番目、１１７番目および２０８番目のアミノ酸残基はＦｃＲ３５ｄと同様、天然型（配列番号４）のアミノ酸残基に戻っていた。ＦｃＲ３６ａ（配列番号１１）はＦｃＲ３５ｃに対して、Ｓｅｒ８１Ａｒｇ、Ｖａｌ１９２Ａｌａ、Ａｓｎ１９６Ｌｙｓ、Ｇｌｕ２００ＧｌｙおよびＧｌｕ２０３Ａｓｐという新たなアミノ酸置換が生じた一方、９８番目、１１４番目、１１７番目および２０８番目のアミノ酸残基はＦｃＲ３５ｄおよびＦｃＲ３６ｉと同様、天然型（配列番号４）のアミノ酸残基に戻っていた。

実施例３Ｆｃ結合性タンパク質のアルカリ安定性評価
（１）ＦｃＲ３５ｃを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号５）、ならびに実施例２で取得した、ＦｃＲ３５ｄを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号７）、ＦｃＲ３６ｉを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号９）およびＦｃＲ３６ａを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号１１）を発現する形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１００ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。

（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した１０００ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に前培養液を１０ｍＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。

（３）培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養した。その後、終濃度０．０１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養した。

（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で懸濁し、超音波破砕した。その後、遠心分離により上清を回収した。

（５）回収した上清は、ＮｉＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）を充填したカラムに通液し、洗浄緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で十分量の洗浄を行なった後、溶出緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌと５００ｍＭのイミダゾールを含む２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で溶出し、当該溶出画分を回収した。

（６）（５）で回収した溶出画分を、ＩｇＧＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）を充填したカラムに通液し、洗浄緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で十分量の洗浄を行なった後、溶出緩衝液（１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ３．０））で溶出し、当該溶出画分を回収後、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を１／４倍量加えて中和することで、精製した各Ｆｃ結合性タンパク質を調製した。

（７）各Ｆｃ結合性タンパク質の濃度が１０μｇ／ｍＬになるよう純水で希釈後、前記希釈した溶液５０μＬと２００ｍＭの水酸化ナトリウム溶液５０μＬとを混合し、２５℃で９６時間静置することでアルカリ処理した。その後、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を４倍量加えることで中和した。

（８）（７）に記載のアルカリ処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性と、（７）に記載のアルカリ処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にてそれぞれ測定した。その後、アルカリ処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性を算出した。

結果を表３に示す。ＦｃＲ３５ｄを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号７）、ＦｃＲ３６ｉを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号９）およびＦｃＲ３６ａを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号１１）は、ＦｃＲ３５ｃを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号５）と比較し残存活性が高いことから、実施例２で取得したＦｃＲ３５ｄ、ＦｃＲ３６ｉおよびＦｃＲ３６ａは、ＦｃＲ３５ｃに比べてアルカリ安定性（アルカリ耐性）が向上していることが確認された。

実施例４Ｆｃ結合性タンパク質のＩｇＧに対する結合活性測定
形質転換体として、ＦｃＲ３５ｄを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号７）、ＦｃＲ３６ｉを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号９）、ＦｃＲ３６ａを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号１１）またはＦｃＲ３５ｃを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号５）を発現する形質転換体を用いて、下記の方法で測定した。

（１）前記ＦｃＲ３５ｄを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号７）またはＦｃＲ３６ｉを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号９）を発現する形質転換体をそれぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。

（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２０ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に前培養液を０．２ｍＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。

（３）培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養した。その後、終濃度０．０１ｍＭとなるようにＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）を添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養した。

（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒＰｒｏｔｅｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（メルクミリポア製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。

（５）Ｆｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、実施例２（４）に示すＥＬＩＳＡ法にて測定した。得られたＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧに対する結合活性よりＦｃ結合性タンパク質の発現量を算出した。

結果を表４に示す。培養液１ＬあたりのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ３５ｄおよびＦｃＲ３６ｉの発現量はそれぞれ４４３．５ｍｇおよび４９５．６ｍｇとなった。

（６）前記ＦｃＲ３５ｄを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号７）、ＦｃＲ３６ｉを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号９）、ＦｃＲ３６ａを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号１１）またはＦｃＲ３５ｃを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号５）を発現する形質転換体をそれぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。

（７）（２）と同様に振とう培養を行った。

（８）（３）に記載の方法のうち培養時間を１２時間とした以外は同様の方法で振とう培養した。

（９）（４）と同様にタンパク質抽出液を調製した。

（１０）（５）と同様に発現量を算出した。

結果を表５に示す。培養液１ＬあたりのＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ３５ｄ、ＦｃＲ３６ｉ、ＦｃＲ３６ａおよびＦｃＲ３５ｃの発現量はそれぞれ２２６ｍｇ、２４８ｍｇ、３０７ｍｇおよび２１１ｍｇとなった。

実施例５Ｆｃ結合性タンパク質とＩｇＧ１との結合親和性評価
（１）実施例３（１）から（６）と同様の方法で培養および精製を実施し、各Ｆｃ結合性タンパク質を調製した。

（２）（１）の溶出画分として回収したＦｃ結合性タンパク質とＩｇＧ１との結合親和性評価を表面プラズモン共鳴法により行なった。表面プラズモン共鳴法を用いた結合親和性の測定において、測定装置としてはＢｉａｃｏｒｅＴ１００（ＧＥヘルスケア製）を、センサーチップとしてはＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐＣＭ５（ＧＥヘルスケア製）を、解析ソフトとしてはＢｉａｃｏｒｅＴ１００ＥｖａｌｕａｔｉｏｎＳｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケア製）を、それぞれ用いた。

（３）ＡｍｉｎｅＣｏｕｐｌｉｎｇＫｉｔ（ＧＥヘルスケア製）を用いてＦｃ結合性タンパク質を固定化したセンサーチップに対し、ＩｇＧ１（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ製）をＨＢＳ－ＥＰ（ＧＥヘルスケア製）で希釈した溶液を流すことでセンサーグラムを得た。当該センサーグラムを基にカーブフィッティングを行なうことで、ＩｇＧ１に対する結合親和性を算出した。

ＩｇＧ１に対する結合親和性を算出した結果を表６に示す。なお表５において、Ｋ_Ｄ値（解離定数）が低いほど、高いアフィニティ（結合親和性）を有している。ＦｃＲ３５ｄを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号７）、ＦｃＲ３６ｉを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号９）およびＦｃＲ３６ａを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号１１）のＫ_Ｄ値は、それぞれ３．９×１０^－８Ｍ、４．３×１０^－８Ｍおよび９．５×１０^－８Ｍとなり、ＦｃＲ３５ｃを含むＦｃ結合性タンパク質（配列番号５）のＫ_Ｄ値（４．０×１０^－８Ｍ）と同等の結合親和性であった。

以上の結果から、実施例２で取得したＦｃＲ３５ｄ、ＦｃＲ３６ｉおよびＦｃＲ３６ａは、抗体のＦｃ領域と結合可能な既知のポリペプチド（ＦｃＲ３５ｃ、特開２０１７－１１８８７号公報）と同等の抗体に対する結合親和性を有しながら、アルカリ耐性は向上していることがわかる。

実施例６システインタグを付加したＦｃＲ３６ｉの作製
（１）実施例２で作製したＦｃＲ３６ｉをコードするポリヌクレオチド（配列番号１０）を鋳型としてＰＣＲを実施した。当該ＰＣＲにおけるプライマーは、配列番号１３（５’－ＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＡＧＧＴＧＣＡＣＧＣＡＴＣＣＴＣＧＣＡＴＴＡＴＣＣＧＣＡＴＴＡＡＣＧＡＣ－３’）および配列番号１４（５’－ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＧＣＡＧＧＴＡＴＣＧＴＴＧＣＧＧＣＡＣＣＣＴＴＧＧＧＴＡＡＣＧＧＴＡＡＴＧＴＣＣＡＣＧＧＣＣＣＣＧＣＴＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。ＰＣＲは、表７に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。

（２）（１）で得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したＷＯ２０１５／１９９１５４号に記載の方法で作製の発現ベクターｐＴｒｃ－ＰｅｌＢにライゲーションし、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換した。

（３）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐｋｉｔ（キアゲン製）を用いて、発現ベクターｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを抽出した。

（４）ｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓのヌクレオチド配列の解析を、配列番号１５（５’－ＴＧＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＡＧＧ－３’）または配列番号１６（５’－ＴＣＧＧＣＡＴＧＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを用いて行なった。

発現ベクターｐＴｒｃ－ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓで発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１７に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１８にそれぞれ示す。

なお配列番号１７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までが改良ＰｅｌＢシグナルペプチド（ＵｎｉＰｒｏｔＮｏ．Ｐ０Ｃ１Ｃ１の１番目から２２番目までのアミノ酸残基からなるオリゴペプチドであって、ただし１つのアミノ酸置換を含むオリゴペプチド）であり、２４番目のグリシン（Ｇｌｙ）から１９９番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ３６ｉのアミノ酸配列（配列番号９の３３番目から２０８番目までの領域）、２００番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０７番目のグリシン（Ｇｌｙ）までがシステインタグ配列である。

実施例７ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓの調製
（１）実施例６で作製したＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを発現する形質転換体を２Ｌのバッフルフラスコに入った１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む４００ｍＬの２ＹＴ液体培地（ペプトン１６ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ）に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。

（２）グルコース１０ｇ／Ｌ、酵母エキス２０ｇ／Ｌ、リン酸三ナトリウム十二水和物３ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物９ｇ／Ｌ、塩化アンモニウム１ｇ／Ｌおよびカルベニシリン１００ｍｇ／Ｌを含む液体培地１．８Ｌに、（１）の培養液１８０ｍＬを接種し、３Ｌ発酵槽（バイオット製）を用いて本培養を行なった。温度３０℃、ｐＨ６．９から７．１、通気量１ＶＶＭ、溶存酸素濃度３０％飽和濃度の条件に設定し、本培養を開始した。ｐＨの制御には酸として５０％リン酸、アルカリとして１４％アンモニア水をそれぞれ使用し、溶存酸素の制御は撹拌速度を変化させることで制御し、撹拌回転数は下限５００ｒｐｍ、上限１０００ｒｐｍに設定した。培養開始後、グルコース濃度が測定できなくなった時点で、流加培地（グルコース２４８．９ｇ／Ｌ、酵母エキス８３．３ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物７．２ｇ／Ｌ）を溶存酸素（ＤＯ）により制御しながら加えた。

（３）菌体量の目安として６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００ｎｍ）が約１５０に達したところで培養温度を２５℃に下げ、設定温度に到達したことを確認した後、終濃度が０．５ｍＭになるようＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、引き続き２５℃で培養を継続した。

（４）培養開始から約４８時間後に培養を停止し、培養液を４℃で８０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離により菌体を回収した。

（５）回収した菌体を２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に５ｍＬ／１ｇ（菌体）となるように懸濁し、超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ（商品名）、久保田商事製）を用いて、４℃で約１０分間、約１５０Ｗの出力で菌体を破砕した。菌体破砕液は４℃で２０分間、８０００ｒｐｍの遠心分離を２回行ない、上清を回収した。

（６）（５）で得られた上清を、あらかじめ２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した１４０ｍＬのＴＯＹＯＰＥＡＲＬＣＭ－６５０Ｍ（東ソー製）を充填したＶＬ３２×２５０カラム（メルクミリポア製）に流速１０ｍＬ／分でアプライした。平衡化に用いた緩衝液で洗浄後、０．８Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出した。

前記精製により、ＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを得た。

実施例８ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルの作製とリニアグラジエント溶出による抗体分離
（１）分離剤用親水性ビニルポリマー（東ソー製）の表面の水酸基をヨードアセチル基で活性化後、実施例７で調製したＦｃＲ３６ｉ＿Ｃｙｓを反応させることにより、ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを得た。

（２）（１）で調製したＦｃＲ３６ｉ固定化ゲル１．０ｍＬをＴｒｉｃｏｒｎカラム（ＧＥヘルスケア製、内径５ｍｍ）に充填した。

（３）ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを充填したカラムをＡＫＴＡＡｖａｎｔ（ＧＥヘルスケア製）に接続し、ｐＨ４．８の２０ｍＭの酢酸緩衝液（緩衝液Ａ）で平衡化した。

（４）ｐＨ４．８の２０ｍＭの酢酸緩衝液（緩衝液Ａ）で１０ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗体（リツキサン、全薬工業製）を流速０．２ｍＬ／ｍｉｎにて０．５ｍＬアプライした。

（５）流速０．２ｍＬ／ｍｉｎのまま平衡化緩衝液で６６分洗浄後、ｐＨ３．０の１０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（緩衝液Ｂ）によるリニアグラジエント（７５分でｐＨ３．０の１０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（緩衝液Ｂ）が１００％となるリニアグラジエント）で吸着したモノクローナル抗体を溶出した。

結果（溶出パターンのクロマトグラム）を図２に示す。モノクローナル抗体はＦｃＲ３６ｉと相互作用することで、ゲルろ過クロマトグラフィーのような単一のピークではなく、２つのピークに分離された。つまり、ＦｃＲ３６ｉと弱い結合を示す抗体は溶出時間が早く、強い結合を示す抗体は溶出時間が遅くなることにより、２つのピークに分離した。

実施例９ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを用いてリニアグラジエント溶出により分離した抗体のＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害作用）活性測定

（１）実施例８に記載の溶出条件でモノクローナル抗体を分離し、図２に記載の溶出パターンのクロマトグラムにおけるフラクションＡ（ＦｒＡ）およびフラクションＢ（ＦｒＢ）の画分を分取した。

（２）ＦｒＡおよびＦｒＢに含まれる抗体、ならびに分離前のモノクローナル抗体の濃度を２８０ｎｍの吸光度で測定した。

（３）以下に示す方法で、ＦｒＡおよびＦｒＢに含まれる抗体、ならびに分離前のモノクローナル抗体が有するＡＤＣＣ活性を測定した。

（３－１）１．４ｍＬのＬｏｗＩｇＧＳｅｒｕｍと３３．６ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地とを混合して調製したＡＤＣＣＡｓｓａｙＢｕｆｆｅｒを用いて、ＦｒＡおよびＦｒＢに含まれる抗体ならびに分離前のモノクローナル抗体を１ｎｇ／ｍＬから１／３希釈で９段階の希釈系列を調製した。

（３－２）Ｒａｊｉ細胞をＡＤＣＣＡｓｓａｙＢｕｆｆｅｒにて約５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、９６ｗｅｌｌプレート（３９１７：コーニング社）に２５μＬ／ｗｅｌｌで加えた。

（３－３）Ｒａｊｉ細胞を加えたｗｅｌｌに（３－１）で調製したＦｒＡ、ＦｒＢ、分離前のモノクローナル抗体、ブランク（ＡＤＣＣＡｓｓａｙＢｕｆｆｅｒのみ）を２５μＬ／ｗｅｌｌ加えた。

（３－４）Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞（プロメガ製）をＡＤＣＣＡｓｓａｙＢｕｆｆｅｒにて約３．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、Ｒａｊｉ細胞および抗体を加えたｗｅｌｌに２５μＬ／ｗｅｌｌで加えた。その後、ＣＯ_２インキュベーター（５％ＣＯ_２、３７℃）にて６時間静置した。

（３－５）９６ｗｅｌｌプレートを室温で５分から３０分静置した後、ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＲｅａｇｅｎｔ（プロメガ製）を７５μＬ／ｗｅｌｌで加えた。室温で３０分反応させたのち、ＧｌｏＭａｘＭｕｌｔｉＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（プロメガ製）で発光を測定した。

実施例８に記載の溶出条件で分取したＦｒＡおよびＦｒＢにそれぞれ含まれる抗体ならびに分離前のモノクローナル抗体の発光強度を比較した結果を図３に示す。なお図３の結果は、測定した発光強度からブランクの発光強度を引いた値を示しており、発光強度が高いほど、ＡＤＣＣ活性が高いことを意味している。

ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルで分取した溶出時間の早いＦｒＡに含まれる抗体は、分離前のモノクローナル抗体とほぼ同程度の発光強度であることからＡＤＣＣ活性はほぼ同等といえる。一方、溶出時間の遅いＦｒＢに含まれる抗体は、分離前のモノクローナル抗体と比べてＡＤＣＣ活性が約１．４倍、ＦｒＡに含まれる抗体と比べても約１．５倍に向上していた。つまり、ＦｒＢに含まれる抗体は分離前のモノクローナル抗体およびＦｒＡに含まれる抗体と比べてＡＤＣＣ活性が高いことが分かる。

実施例１０ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを用いてリニアグラジエント溶出により分離した抗体の糖鎖構造解析
（１）実施例９（１）で分取したＦｒＡおよびＦｒＢにそれぞれ含まれる抗体を１００℃、１０分の熱処理により変性後、グリコアミダーゼＡ／ペプシンおよびプロナーゼで順次処理し、ゲルろ過法による精製操作を経て糖鎖画分を取得した。

（２）（１）で得られた糖鎖をエバポレーターにて濃縮・乾燥後、酢酸溶媒下、２－アミノピリジン、次いでジメチルアミンボランを順次作用させて蛍光ラベル化糖鎖とし、ゲルろ過法により精製した。

（３）（２）で得られた蛍光ラベル化糖鎖を陰イオン交換カラム（ＴＳＫｇｅｌＤＥＡＥ－５ＰＷ、φ７．５ｍｍ×７．５ｃｍ：東ソー製）にて、中性糖鎖画分とモノシアリル化糖鎖画分に分離した。

（４）（３）で得られた中性糖鎖画分とモノシアリル化糖鎖画分をＯＤＳカラムを用いて、個々の糖鎖に単離した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析により単離した糖鎖の分子量情報を取得後、ＯＤＳカラムクロマトグラフのリテンションタイムと照らし合わせて糖鎖構造を帰属した。

帰属した糖鎖構造の結果を図４および表８、糖鎖構造の概略図を表９に示す。ＦｒＡに含まれる抗体と比較してＦｒＢに含まれる抗体では末端にガラクトースを含む糖鎖構造（Ｇ１ＦａおよびＧ２Ｆ）を有した抗体の割合が高く、末端にガラクトースを含まない糖鎖構造（Ｇ０Ｆ）を有した抗体の割合が低かった。このことより、末端にガラクトースを含む糖鎖構造を有した抗体はＦｃＲ３６ｉと強く結合し、Ｆｃ３６ｉ固定化ゲルで分離した際に遅い溶出時間で溶出され（すなわち、低いｐＨにて溶出される）、末端にガラクトースを含まない糖鎖構造を有した抗体はＦｃＲ３６ｉとの結合が弱いこと、およびＦｃ３６ｉ固定化ゲルで分離する際に早く溶出される（すなわち、高いｐＨにて溶出される）ことが分かる。

実施例１１ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルの作製とステップグラジエント溶出による抗体分離
（１）実施例８（１）と同様の方法により、ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを得た。

（２）実施例８（２）と同様の方法により、ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルをカラムに充填した。

（３）ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを充填したカラムをＡＫＴＡＡｖａｎｔ（ＧＥヘルスケア製）に接続し、２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で平衡化した。

（４）２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で１０ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗体（リツキサン、全薬工業製）を流速０．２ｍＬ／ｍｉｎにて１．５ｍＬアプライした。

（５）流速０．２ｍＬ／ｍｉｎのまま２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）を１２０分間送液後、流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）を１００分間送液し、モノクローナル抗体を溶出した。

（６）流速０．２ｍＬ／ｍｉｎのまま１０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を５０分間送液することで、吸着したモノクローナル抗体を溶出した。

結果（溶出パターンのクロマトグラム）を図５に示す。ｐＨの異なる緩衝液をカラムに送液したことで、それぞれの緩衝液にて抗体が溶出され、モノクローナル抗体は３つのピークに分離された。モノクローナル抗体はＦｃＲ３６ｉと相互作用することから、高いｐＨで早く溶出された抗体はＦｃＲ３６ｉと弱い親和性を示す抗体であり、低いｐＨで遅く溶出された抗体はＦｃＲ３６ｉと強い親和性を示す抗体であることがわかる。

実施例１２ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルで分離した抗体の糖鎖解析

（１）実施例１１に記載の溶出条件でモノクローナル抗体を分離し、図５に記載の溶出パターンのクロマトグラムにおけるフラクションＣ（ＦｒＣ）、フラクションＤ（ＦｒＤ）およびフラクションＥ（ＦｒＥ）の画分を分取した。

（２）上記で分取したＦｒＣ、ＦｒＤおよびＦｒＥにそれぞれ含まれる抗体を用いたこと以外は、実施例１０と同様の方法で、糖鎖構造を帰属した。

帰属した糖鎖構造の結果を図６および表１０、糖鎖構造の概略図を表９に示す。
ＦｒＣ（２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で溶出）、ＦｒＤ（２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）で溶出）およびＦｒＥ（１０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出）に含まれるそれぞれの抗体の糖鎖構造を比較すると、高いｐＨで溶出されたフラクションに含まれる抗体では末端にガラクトースを含まない糖鎖構造（Ｇ０Ｆ）を有した抗体の割合が高く、低いｐＨで溶出されたフラクションに含まれる抗体では末端にガラクトースを含む糖鎖構造（Ｇ１ＦａおよびＧ２Ｆ）を有した抗体の割合が高かった。このことより、末端にガラクトースを含む糖鎖構造を有した抗体はＦｃＲ３６ｉと強く結合し、Ｆｃ３６ｉ固定化ゲルで分離した際に低いｐＨで溶出され、末端にガラクトースを含まない糖鎖構造を有した抗体はＦｃＲ３６ｉとの結合が弱いこと、およびＦｃ３６ｉ固定化ゲルで分離した際に高いｐＨで溶出されることが分かる。

実施例１３ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを用いたステップグラジエント溶出による抗体分離（その２）
（１）実施例８（１）と同様の方法により、ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルを得た。

（２）ゲル量を０．２ｍＬとした以外は、実施例８（２）と同様の方法により、ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルをカラムに充填した。

（４）２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で１０ｍｇ／ｍＬのモノクローナル抗体（アバスチン、Ｒｏｃｈｅ製）を流速０．０４ｍＬ／ｍｉｎにて０．３ｍＬアプライした。

（５）流速０．０４ｍＬ／ｍｉｎのまま２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）を１８０分間送液後、流速０．０４ｍＬ／ｍｉｎで２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）を１５０分間送液し、モノクローナル抗体を溶出した。

（６）流速０．０４ｍＬ／ｍｉｎのまま１０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）を１００分間送液することで、吸着したモノクローナル抗体を溶出した。
結果（溶出パターンのクロマトグラム）を図７に示す。モノクローナル抗体は３つのピークに分離されたが実施例１１と異なる種類の抗体であることから、異なる溶出パターンが得られることが分かる。
実施例１４ＦｃＲ３６ｉ固定化ゲルでステップグラジエント溶出より分離した抗体の糖鎖解析（その２）
（１）実施例１３に記載の溶出条件でモノクローナル抗体を分離し、図７に記載の溶出パターンのクロマトグラムにおけるフラクションＦ（ＦｒＦ）、フラクションＧ（ＦｒＧ）およびフラクションＨ（ＦｒＨ）の画分を分取した。

（２）上記（１）で分取したＦｒＦ、ＦｒＧおよびＦｒＨにそれぞれ含まれる抗体を用いたこと以外は、実施例１０と同様の方法で、糖鎖構造を解析した。

解析した糖鎖構造の結果を図８および表１１、糖鎖構造の概略図を表９に示す。
ＦｒＦ（２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）で溶出）、ＦｒＧ（２０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）で溶出）およびＦｒＨ（１０ｍＭのグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出）に含まれるそれぞれの抗体の糖鎖構造を比較すると、高いｐＨで溶出されたフラクションに含まれる抗体（ＦｒＦ）では末端にガラクトースを含まない糖鎖構造（Ｇ０Ｆ）を有した抗体の割合が高く、低いｐＨで溶出されたフラクション（ＦｒＨ）に含まれる抗体では末端にガラクトースを含む糖鎖構造（Ｇ１ＦａおよびＧ２Ｆ）を有した抗体の割合が高かった。このことより、末端にガラクトースを含む糖鎖構造を有した抗体はＦｃＲ３６ｉと強く結合し、Ｆｃ３６ｉ固定化ゲルで分離した際に低いｐＨで溶出されることが分かる。

参考例１ＦｃＲ９アミノ酸置換体の作製
特開２０１６－１６９１９７号公報（特許文献３）に記載の方法で作製したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９（配列番号２０）に対し、１９２番目（配列番号１では１７６番目に相当）のアミノ酸残基を他のアミノ酸へ置換することの有用性を確認するため、以下に示すアミノ酸置換を行なった。具体的にはＦｃＲ９をコードするポリヌクレオチド（配列番号２１）を含むプラスミドｐＥＴ－ＦｃＲ９（特開２０１６－１６９１９７号公報）に対し、ＰＣＲを用いてアミノ酸の置換を行ない、ＦｃＲ９（配列番号２０）のうち１９２番目のバリンを他のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質を作製した。なおＦｃＲ９（配列番号２０）は、配列番号４に示すヒトＦｃγＲＩＩＩ細胞外領域を含むＦｃ結合性タンパク質において、４３番目（配列番号１では２７番目に相当）のバリンをグルタミン酸に、４５番目（配列番号１では２９番目に相当）のフェニルアラニンをイソロイシンに、５１番目（配列番号１では３５番目に相当）のチロシンをアスパラギンに、６４番目（配列番号１では４８番目に相当）のグルタミンをアルギニンに、９１番目（配列番号１では７５番目に相当）のフェニルアラニンをロイシンに、１０８番目（配列番号１では９２番目に相当）のアスパラギンをセリンに、１３３番目（配列番号１では１１７番目に相当）のバリンをグルタミン酸に、１３７番目（配列番号１では１２１番目に相当）のグルタミン酸をグリシンに、および１８７番目（配列番号１では１７１番目に相当）のフェニルアラニンをセリンに、それぞれアミノ酸置換されたＦｃ結合性タンパク質である。

（１）鋳型ＤＮＡとして特開２０１６－１６９１９７号公報に記載の方法で作製したＦｃＲ９（配列番号２０）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２１）を含むプラスミドｐＥＴ－ＦｃＲ９（特開２０１６－１６９１９７号公報）を、フォワードプライマーとして配列番号２（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号２２（５’－ＣＡＴＴＴＴＴＧＣＴＧＣＣＭＮＮＣＡＧＣＣＣＡＣＧＧＣＡＧＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いて、表１２に示す組成からなる反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することでＰＣＲを行なった。得られたＰＣＲ産物をＶ１９２ｐ１とした。

（２）フォワードプライマーとして配列番号２３（５’－ＣＣＴＧＣＣＧＴＧＧＧＣＴＧＮＮＫＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＡＴＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号３（５’－ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた他は（１）と同様な方法でＰＣＲを行ない、得られたＰＣＲ産物をＶ１９２ｐ２とした。

（３）ＰＣＲ産物として（１）で得られたＶ１９２ｐ１と（２）で得られたＶ１９２ｐ２との混合物を用いて、表１３に示す組成からなる反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理後、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル行なうＰＣＲを行ない、Ｖ１９２ｐ１とＶ１９２ｐ２を連結したＰＣＲ産物Ｖ１９２ｐを得た。

（４）ＰＣＲ産物として（３）で得られたＶ１９２ｐを、フォワードプライマーとして配列番号２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、リバースプライマーとして配列番号３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いて、表１４に示す組成からなる反応液を調製後、当該反応液を９８℃で５分間熱処理し、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル行なうＰＣＲを行ない、ＦｃＲ９（配列番号２０）の１９２番目のバリンを任意のアミノ酸に置換したＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得た。得られたポリヌクレオチドをＶ１９２ｐ３とした。

（５）（４）で得られたＶ１９２ｐ３を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１－２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。

（６）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養した。回収した菌体（形質転換体）からプラスミドを抽出した。

（７）得られたプラスミドのうちＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ライフテクノロジーズ製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３１３０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ライフテクノロジーズ製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号２または配列番号３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。

配列解析の結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９（配列番号２０）の１９２番目のバリンがアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンのいずれかに置換されたＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を得た。

参考例２Ｆｃ結合性タンパク質のＩｇＧに対する結合活性測定
（１）参考例１で得た形質転換体のうち、ＦｃＲ９（配列番号２０）の１９２番目（配列番号１では１７６番目）のアミノ酸残基をイソロイシン（以下、Ｖａｌ１９２Ｉｌｅとも表記）、アラニン（以下、Ｖａｌ１９２Ａｌａとも表記）またはチロシン（以下、Ｖａｌ１９２Ｔｙｒとも表記）に置換したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。

（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒＰｒｏｔｅｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。

（５）Ｆｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を、下記に示すＥＬＩＳＡ法にて測定した。

（５－１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌで添加して固定化（４℃で一晩）後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭＭＩＬＫ（ＢＤ製）および１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）をウェルに添加することでブロッキングした。

（５－２）洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、抗体結合活性を評価するＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を添加し、Ｆｃ結合性タンパク質と固定化ガンマグロブリンとを反応させた（３０℃で１時間）。

（５－３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ－６Ｈｉｓ抗体（ＢｅｔｈｙｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。

（５－４）３０℃で１時間反応させ、前記洗浄緩衝液で洗浄した後、ＴＭＢＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＳｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。１Ｍのリン酸を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加することで発色を止め、マイクロプレートリーダー（テカン製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。

（６）（５）の方法で得られたＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧに対する結合活性よりＦｃ結合性タンパク質の発現量を算出した。

結果を表１５に示す。Ｖａｌ１９２Ｉｌｅのアミノ酸置換を含むＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ｉ（配列番号２４）、Ｖａｌ１９２Ａｌａのアミノ酸置換を含むＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ａ（配列番号２６）、およびＶａｌ１９２Ｔｙｒのアミノ酸置換を含むＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ｙ（配列番号２８）を発現する形質転換体における培養液１ＬあたりのＦｃ結合性タンパク質発現量はそれぞれ、１３０．６ｍｇ、２１．７ｍｇおよび１４．６ｍｇとなった。

本参考例で検討したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ｉのアミノ酸配列を配列番号２４に、前記ＦｃＲ９＿Ｉをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２５にそれぞれ示す。なお配列番号２４において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２６番目のアラニン（Ａｌａ）までがＭａｌＥシグナルペプチドであり、２７番目のリジン（Ｌｙｓ）から３２番目のメチオニン（Ｍｅｔ）までがリンカー配列であり、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ９（配列番号２０）の３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列においてＶａｌ１９２Ｉｌｅのアミノ酸置換が生じたポリペプチドであり、２０９番目から２１０番目までのグリシン（Ｇｌｙ）がリンカー配列であり、２１１番目から２１６番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）がタグ配列である。また、Ｖａｌ１９２Ｉｌｅのイソロイシンは配列番号２４では１９２番目の位置に存在する。

本参考例で検討したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ａのアミノ酸配列を配列番号２６に、前記ＦｃＲ９＿Ａをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２７に示す。なお配列番号２６は、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ９（配列番号２０）の３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列においてＶａｌ１９２Ａｌａのアミノ酸置換が生じたポリペプチドである他は、配列番号２４と同じ配列である。また、Ｖａｌ１９２Ａｌａのアラニンは配列番号２６では１９２番目の位置に存在する。

本参考例で検討したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ｙのアミノ酸配列を配列番号２８に、前記ＦｃＲ９＿Ｙをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２９に示す。なお配列番号２８は、３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までがＦｃＲ９（配列番号２０）の３３番目のグリシン（Ｇｌｙ）から２０８番目のグルタミン（Ｇｌｎ）までのアミノ酸配列においてＶａｌ１９２Ｔｙｒのアミノ酸置換が生じたポリペプチドである他は、配列番号２４と同じ配列である。また、Ｖａｌ１９２Ｔｙｒのチロシンは配列番号２８では１９２番目の位置に存在する。

参考例３
形質転換体として、特開２０１６－１６９１９７号公報（特許文献３）で開示のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９（配列番号２０）を発現する形質転換体を用いたこと以外は参考例２と同様に行なった。

結果を表１５に示す。培養液１ＬあたりのＦｃ結合性タンパク質の発現量は１．４ｍｇとなった。以上の結果から、ＦｃＲ９にＶａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２Ｉｌｅ、Ｖａｌ１９２Ｔｙｒのいずれかのアミノ酸置換を導入したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体は、ＦｃＲ９を発現する形質転換体と比較し、発現量が大幅に向上していることがわかる。

参考例４
形質転換体として、ＦｃＲ９（配列番号２０）の１９２番目（配列番号１では１７６番目）のアミノ酸残基をフェニルアラニン（以下、Ｖａｌ１９２Ｐｈｅとも表記）、アルギニン（以下、Ｖａｌ１９２Ａｒｇとも表記）、ロイシン（以下、Ｖａｌ１９２Ｌｅｕとも表記）、アスパラギン（以下、Ｖａｌ１９２Ａｓｎとも表記）、アスパラギン酸（以下、Ｖａｌ１９２Ａｓｐとも表記）、システイン（以下、Ｖａｌ１９２Ｃｙｓとも表記）、グルタミン（以下、Ｖａｌ１９２Ｇｌｎとも表記）、グルタミン酸（以下、Ｖａｌ１９２Ｇｌｕとも表記）、グリシン（以下、Ｖａｌ１９２Ｇｌｙとも表記）、ヒスチジン（以下、Ｖａｌ１９２Ｈｉｓとも表記）、リジン（以下、Ｖａｌ１９２Ｌｙｓとも表記）、メチオニン（以下、Ｖａｌ１９２Ｍｅｔとも表記）、プロリン（以下、Ｖａｌ１９２Ｐｒｏとも表記）、セリン（以下、Ｖａｌ１９２Ｓｅｒとも表記）、スレオニン（以下、Ｖａｌ１９２Ｔｈｒとも表記）またはトリプトファン（以下、Ｖａｌ１９２Ｔｒｐとも表記）に置換したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を用いたこと以外は参考例２と同様に行なった。

結果を表１５に示す。いずれも培養液１ＬあたりのＦｃ結合性タンパク質の発現量はゼロまたは１ｍｇ未満であった。

参考例５Ｆｃ結合性タンパク質とＩｇＧ１との結合親和性評価
（１）参考例１で得た形質転換体のうち、ＦｃＲ９＿Ｉ（配列番号２４）またはＦｃＲ＿Ａ（配列番号２６）を発現する形質転換体を、それぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む１００ｍＬの２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。

（６）（５）で回収した溶出画分を、ＩｇＧＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）を充填したカラムに通液し、洗浄緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で十分量の洗浄を行なった後、溶出緩衝液（１００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ３．０））で溶出し、当該溶出画分を回収した。

（７）（６）の溶出画分として回収したＦｃ結合性タンパク質とＩｇＧ１との結合性評価を表面プラズモン共鳴法を用いて行なった。表面プラズモン共鳴法を用いた結合性の測定において、測定装置としてはＢｉａｃｏｒｅＴ１００（ＧＥヘルスケア製）を、センサーチップとしてはＳｅｎｓｏｒＣｈｉｐＣＭ５（ＧＥヘルスケア製）を、解析ソフトとしてはＢｉａｃｏｒｅＴ１００ＥｖａｌｕａｔｉｏｎＳｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥヘルスケア製）を、それぞれ用いた。

（８）ＡｍｉｎｅＣｏｕｐｌｉｎｇＫｉｔ（ＧＥヘルスケア製）を用いてＦｃ結合性タンパク質を固定化したセンサーチップに対し、ＩｇＧ１（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ製）をＨＢＳ－ＥＰ（ＧＥヘルスケア製）で希釈した溶液を流すことでセンサグラムを得た。当該センサグラムを基にカーブフィッティングを行なうことで、ＩｇＧ１に対する結合性を算出した。

ＩｇＧ１に対する親和性を算出した結果を表１６に示す。なお表５において、Ｋ_Ｄ値（解離定数）が低いほど、高いアフィニティ（親和性）を有している。ＦｃＲ９＿Ｉ（配列番号２４）およびＦｃＲ９＿Ａ（配列番号２６）のＫ_Ｄ値は、それぞれ６．０×１０^－８Ｍおよび３．６×１０^－８Ｍとなった。

参考例６
形質転換体として、特開２０１６－１６９１９７号公報（特許文献３）で開示のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲ９（配列番号２０）を発現する形質転換体を用いたこと以外は参考例５と同様に行なった。

ＩｇＧ１に対する親和性を算出した結果を表１６に示す。ＦｃＲ９のＫ_Ｄ値は７．７×１０^－８Ｍであり、ＦｃＲ９＿Ｉ（配列番号２４）およびＦｃＲ９＿Ａ（配列番号２６）と同等の親和性であった。このことから本発明のＦｃ結合性タンパク質の一態様である、ＦｃＲ９＿ＩおよびＦｃＲ９＿Ａは、ＦｃＲ９と同様、不溶性担体に固定化することで抗体医薬品製造における工程分析および分取のための抗体吸着剤として使用可能であることが示唆される。

参考例７
形質転換体として、ＦｃＲ９（配列番号２０）の１９２番目（配列番号１では１７６番目）のバリンをフェニルアラニンに置換したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲ＿Ｆ）を発現する形質転換体を用いたこと以外は参考例５と同様に行なった。

ＩｇＧ１に対する親和性を算出した結果を表１６に示す。ＦｃＲ９＿ＦのＫ_Ｄ値は、３．３×１０^－６Ｍとなり、本発明のＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲ９＿Ｉ（配列番号２４）およびＦｃＲ＿Ａ（配列番号２６）ならびにＦｃＲ９（配列番号２０）と比較し、親和性が低いことを確認した。

Claims

以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）である、Ｆｃ結合性タンパク質：
（ａ）配列番号７、９、１１に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基を少なくとも含む、Ｆｃ結合性タンパク質；
（ｂ）配列番号７、９、１１に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸残基において、前記アミノ酸配列が有するアミノ酸置換以外に１から１５個のアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加の１以上を有するアミノ酸残基を含み、かつ、抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質（ここで「前記アミノ酸配列が有するアミノ酸置換」とは、配列番号７においては配列番号４の３７番目のグルタミン酸のグリシンへの置換、３９番目のロイシンのメチオニンへの置換、４３番目のバリンのグルタミン酸への置換、４５番目のフェニルアラニンのイソロイシンへの置換、４９番目のグルタミンのプロリンへの置換、５１番目のチロシンのアスパラギンへの置換、５６番目のリジンのグルタミンへの置換、６４番目のグルタミンのアルギニンへの置換、６７番目のチロシンのヒスチジンへの置換、７０番目のグルタミン酸のアスパラギン酸への置換、７２番目のアスパラギンのアスパラギン酸への置換、８１番目のセリンのアルギニンへの置換、８４番目のセリンのプロリンへの置換、９０番目のチロシンのフェニルアラニンへの置換、９１番目のフェニルアラニンのイソロイシンへの置換、９４番目のアラニンのセリンへの置換、９６番目のスレオニンのセリンへの置換、１０８番目のアスパラギンのセリンへの置換、１３３番目のバリンのグルタミン酸への置換、１３５番目のリジンのバリンへの置換、１３７番目のグルタミン酸のグリシンへの置換、１３８番目のアスパラギン酸のグルタミン酸への置換、１４８番目のリジンのアルギニンへの置換、１５６番目のスレオニンのメチオニンへの置換、１５７番目のチロシンのフェニルアラニンへの置換、１６３番目のグリシンのバリンへの置換、１７４番目のチロシンのバリンへの置換、１８１番目のリジンのグルタミン酸への置換、１８７番目のフェニルアラニンのセリンへの置換、１９４番目のセリンのアルギニンへの置換、１９６番目のアスパラギンのリジンへの置換、２００番目のグルタミン酸のグリシンへの置換、２０１番目のスレオニンのアラニンへの置換、２０３番目のアスパラギンのアスパラギン酸への置換、２０６番目のイソロイシンのバリンへの置換、配列番号９においては配列番号４の３７番目のグルタミン酸のグリシンへの置換、３９番目のロイシンのメチオニンへの置換、４３番目のバリンのグルタミン酸への置換、４５番目のフェニルアラニンのイソロイシンへの置換、４９番目のグルタミンのプロリンへの置換、５１番目のチロシンのアスパラギンへの置換、５６番目のリジンのグルタミンへの置換、６４番目のグルタミンのアルギニンへの置換、６７番目のチロシンのヒスチジンへの置換、７０番目のグルタミン酸のアスパラギン酸への置換、７２番目のアスパラギンのアスパラギン酸への置換、８１番目のセリンのアルギニンへの置換、８４番目のセリンのプロリンへの置換、９０番目のチロシンのフェニルアラニンへの置換、９１番目のフェニルアラニンのイソロイシンへの置換、９４番目のアラニンのセリンへの置換、９６番目のスレオニンのセリンへの置換、１０８番目のアスパラギンのセリンへの置換、１３３番目のバリンのグルタミン酸への置換、１３５番目のリジンのバリンへの置換、１３７番目のグルタミン酸のグリシンへの置換、１３８番目のアスパラギン酸のグルタミン酸への置換、１４８番目のリジンのアルギニンへの置換、１５６番目のスレオニンのメチオニンへの置換、１５７番目のチロシンのフェニルアラニンへの置換、１６３番目のグリシンのバリンへの置換、１７４番目のチロシンのバリンへの置換、１８１番目のリジンのグルタミン酸への置換、１８７番目のフェニルアラニンのセリンへの置換、１９２番目のバリンのイソロイシンへの置換、１９４番目のセリンのアルギニンへの置換、１９６番目のアスパラギンのリジンへの置換、２００番目のグルタミン酸のグリシンへの置換、２０１番目のスレオニンのアラニンへの置換、２０３番目のアスパラギンのアスパラギン酸への置換、２０６番目のイソロイシンのバリンへの置換、配列番号１１においては配列番号４の３７番目のグルタミン酸のグリシンへの置換、３９番目のロイシンのメチオニンへの置換、４３番目のバリンのグルタミン酸への置換、４５番目のフェニルアラニンのイソロイシンへの置換、４９番目のグルタミンのプロリンへの置換、５１番目のチロシンのアスパラギンへの置換、５６番目のリジンのグルタミンへの置換、６４番目のグルタミンのアルギニンへの置換、６７番目のチロシンのヒスチジンへの置換、７０番目のグルタミン酸のアスパラギン酸への置換、７２番目のアスパラギンのアスパラギン酸への置換、８１番目のセリンのアルギニンへの置換、８４番目のセリンのプロリンへの置換、９０番目のチロシンのフェニルアラニンへの置換、９１番目のフェニルアラニンのイソロイシンへの置換、９４番目のアラニンのセリンへの置換、９６番目のスレオニンのセリンへの置換、１０８番目のアスパラギンのセリンへの置換、１３３番目のバリンのグルタミン酸への置換、１３５番目のリジンのバリンへの置換、１３７番目のグルタミン酸のグリシンへの置換、１３８番目のアスパラギン酸のグルタミン酸への置換、１４８番目のリジンのアルギニンへの置換、１５６番目のスレオニンのメチオニンへの置換、１５７番目のチロシンのフェニルアラニンへの置換、１６３番目のグリシンのバリンへの置換、１７４番目のチロシンのバリンへの置換、１８１番目のリジンのグルタミン酸への置換、１８７番目のフェニルアラニンのセリンへの置換、１９２番目のバリンのアラニンへの置換、１９４番目のセリンのアルギニンへの置換、１９６番目のアスパラギンのリジンへの置換、２００番目のグルタミン酸のグリシンへの置換、２０１番目のスレオニンのアラニンへの置換、２０３番目のアスパラギンのアスパラギン酸への置換、２０６番目のイソロイシンのバリンへの置換である）；
（ｃ）配列番号７、９、１１に記載のアミノ酸配列の３３番目のグリシンから２０８番目のグルタミンまでのアミノ酸配列に対して９０％以上の配列相同性を有し、かつ前記アミノ酸配列が有するアミノ酸置換が残存し、かつ、抗体結合活性を有するＦｃ結合性タンパク質（ここで「前記アミノ酸配列が有するアミノ酸置換」とは、配列番号７においては配列番号４の３７番目のグルタミン酸のグリシンへの置換、３９番目のロイシンのメチオニンへの置換、４３番目のバリンのグルタミン酸への置換、４５番目のフェニルアラニンのイソロイシンへの置換、４９番目のグルタミンのプロリンへの置換、５１番目のチロシンのアスパラギンへの置換、５６番目のリジンのグルタミンへの置換、６４番目のグルタミンのアルギニンへの置換、６７番目のチロシンのヒスチジンへの置換、７０番目のグルタミン酸のアスパラギン酸への置換、７２番目のアスパラギンのアスパラギン酸への置換、８１番目のセリンのアルギニンへの置換、８４番目のセリンのプロリンへの置換、９０番目のチロシンのフェニルアラニンへの置換、９１番目のフェニルアラニンのイソロイシンへの置換、９４番目のアラニンのセリンへの置換、９６番目のスレオニンのセリンへの置換、１０８番目のアスパラギンのセリンへの置換、１３３番目のバリンのグルタミン酸への置換、１３５番目のリジンのバリンへの置換、１３７番目のグルタミン酸のグリシンへの置換、１３８番目のアスパラギン酸のグルタミン酸への置換、１４８番目のリジンのアルギニンへの置換、１５６番目のスレオニンのメチオニンへの置換、１５７番目のチロシンのフェニルアラニンへの置換、１６３番目のグリシンのバリンへの置換、１７４番目のチロシンのバリンへの置換、１８１番目のリジンのグルタミン酸への置換、１８７番目のフェニルアラニンのセリンへの置換、１９４番目のセリンのアルギニンへの置換、１９６番目のアスパラギンのリジンへの置換、２００番目のグルタミン酸のグリシンへの置換、２０１番目のスレオニンのアラニンへの置換、２０３番目のアスパラギンのアスパラギン酸への置換、２０６番目のイソロイシンのバリンへの置換、配列番号９においては配列番号４の３７番目のグルタミン酸のグリシンへの置換、３９番目のロイシンのメチオニンへの置換、４３番目のバリンのグルタミン酸への置換、４５番目のフェニルアラニンのイソロイシンへの置換、４９番目のグルタミンのプロリンへの置換、５１番目のチロシンのアスパラギンへの置換、５６番目のリジンのグルタミンへの置換、６４番目のグルタミンのアルギニンへの置換、６７番目のチロシンのヒスチジンへの置換、７０番目のグルタミン酸のアスパラギン酸への置換、７２番目のアスパラギンのアスパラギン酸への置換、８１番目のセリンのアルギニンへの置換、８４番目のセリンのプロリンへの置換、９０番目のチロシンのフェニルアラニンへの置換、９１番目のフェニルアラニンのイソロイシンへの置換、９４番目のアラニンのセリンへの置換、９６番目のスレオニンのセリンへの置換、１０８番目のアスパラギンのセリンへの置換、１３３番目のバリンのグルタミン酸への置換、１３５番目のリジンのバリンへの置換、１３７番目のグルタミン酸のグリシンへの置換、１３８番目のアスパラギン酸のグルタミン酸への置換、１４８番目のリジンのアルギニンへの置換、１５６番目のスレオニンのメチオニンへの置換、１５７番目のチロシンのフェニルアラニンへの置換、１６３番目のグリシンのバリンへの置換、１７４番目のチロシンのバリンへの置換、１８１番目のリジンのグルタミン酸への置換、１８７番目のフェニルアラニンのセリンへの置換、１９２番目のバリンのイソロイシンへの置換、１９４番目のセリンのアルギニンへの置換、１９６番目のアスパラギンのリジンへの置換、２００番目のグルタミン酸のグリシンへの置換、２０１番目のスレオニンのアラニンへの置換、２０３番目のアスパラギンのアスパラギン酸への置換、２０６番目のイソロイシンのバリンへの置換、配列番号１１においては配列番号４の３７番目のグルタミン酸のグリシンへの置換、３９番目のロイシンのメチオニンへの置換、４３番目のバリンのグルタミン酸への置換、４５番目のフェニルアラニンのイソロイシンへの置換、４９番目のグルタミンのプロリンへの置換、５１番目のチロシンのアスパラギンへの置換、５６番目のリジンのグルタミンへの置換、６４番目のグルタミンのアルギニンへの置換、６７番目のチロシンのヒスチジンへの置換、７０番目のグルタミン酸のアスパラギン酸への置換、７２番目のアスパラギンのアスパラギン酸への置換、８１番目のセリンのアルギニンへの置換、８４番目のセリンのプロリンへの置換、９０番目のチロシンのフェニルアラニンへの置換、９１番目のフェニルアラニンのイソロイシンへの置換、９４番目のアラニンのセリンへの置換、９６番目のスレオニンのセリンへの置換、１０８番目のアスパラギンのセリンへの置換、１３３番目のバリンのグルタミン酸への置換、１３５番目のリジンのバリンへの置換、１３７番目のグルタミン酸のグリシンへの置換、１３８番目のアスパラギン酸のグルタミン酸への置換、１４８番目のリジンのアルギニンへの置換、１５６番目のスレオニンのメチオニンへの置換、１５７番目のチロシンのフェニルアラニンへの置換、１６３番目のグリシンのバリンへの置換、１７４番目のチロシンのバリンへの置換、１８１番目のリジンのグルタミン酸への置換、１８７番目のフェニルアラニンのセリンへの置換、１９２番目のバリンのアラニンへの置換、１９４番目のセリンのアルギニンへの置換、１９６番目のアスパラギンのリジンへの置換、２００番目のグルタミン酸のグリシンへの置換、２０１番目のスレオニンのアラニンへの置換、２０３番目のアスパラギンのアスパラギン酸への置換、２０６番目のイソロイシンのバリンへの置換である）。
請求項１に記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
請求項３に記載の組換えベクターで宿主を形質転換して得られる、Ｆｃ結合性タンパク質を生産可能な形質転換体。
宿主が大腸菌である、請求項４に記載の形質転換体。
請求項４または５に記載の形質転換体を培養することによりＦｃ結合性タンパク質を生産する工程と、得られた培養物から生産された前記Ｆｃ結合性タンパク質を回収する工程とを含む、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。
請求項１に記載のＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる、抗体の吸着剤。
請求項７に記載の吸着剤を充填したカラムに抗体を含む溶液を添加して当該抗体を前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した抗体を溶出液を用いて溶出させる工程とを含む、抗体の分離方法。
Ｆｃ結合性タンパク質との結合性の違いに基づいて、異なる糖鎖構造を有する抗体が分離される、請求項８に記載の分離方法。