JP2023103953A

JP2023103953A - 免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質

Info

Publication number: JP2023103953A
Application number: JP2022161843A
Authority: JP
Inventors: 崇俊長谷見; Takatoshi Hasemi; 瑛大岩瀬; Akihiro Iwase; 諭遠藤; Satoshi Endo; 亨田中; Toru Tanaka
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2022-01-14
Filing date: 2022-10-06
Publication date: 2023-07-27
Anticipated expiration: 2042-10-06
Also published as: JP7414106B2

Abstract

【課題】従来の免疫グロブリン吸着剤よりも温和な条件で抗体溶出が可能な、免疫グロブリン吸着剤のリガンドタンパク質を提供すること。【解決手段】Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ属細菌由来ＰｒｏｔｅｉｎＬの免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において抗体溶出特性に関与する特定位置のアミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換することで、前記課題を解決する。【選択図】なし

Description

本発明は、免疫グロブリン吸着剤のリガンドタンパク質として利用可能な、免疫グロブ
リン結合活性を有するタンパク質に関する。より詳しくは、本発明は、従来の免疫グロブ
リン吸着剤よりも温和なｐＨ条件で抗体の溶出が可能な免疫グロブリン吸着剤のリガンド
タンパク質として利用可能な、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質に関する。

抗体医薬は生体内の免疫機能を担う分子である抗体（免疫グロブリン）を利用した医薬
である。抗体医薬は抗体が有する可変領域の多様性により標的分子に対し高い特異性と親
和性をもって結合する。そのため抗体医薬は副作用が少なく、また、近年では適応疾患が
広がってきていることもあり市場が急速に拡大している。

抗体医薬の製造は培養工程と精製工程を含み、培養工程では生産性を向上させるために
抗体産生細胞の改質や培養条件の最適化が図られている。また、精製工程では粗精製とし
てアフィニティークロマトグラフィーが採用され、その後の中間精製、最終精製、および
ウイルス除去を経て製剤化される。

粗精製として実施するアフィニティークロマトグラフィーでは抗体分子を特異的に認識
するアフィニティー担体が用いられる。前記担体で用いられるリガンドタンパク質として
、抗体（免疫グロブリン）に結合する性質を有した、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ）属細菌由来ＰｒｏｔｅｉｎＡが多く用いられている。しかしながら、Ｐｒｏ
ｔｅｉｎＡは抗体のＦｃ領域に特異的に結合するタンパク質であるため、シングルチェ
ーンＦｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ＩｇＡおよび二重特異性Ｔ細胞誘導（
ＢｉＴＥ）抗体といったＦｃ領域を有しない抗体の精製には適用できなかった。一方、Ｆ
ｉｎｅｇｏｌｄｉａ属細菌由来ＰｒｏｔｅｉｎＬは、免疫グロブリンのκ軽鎖に結合す
るタンパク質であるため、ＰｒｏｔｅｉｎＬをリガンドタンパク質とすることで、前述
したＰｒｏｔｅｉｎＡでは精製できない、Ｆｃ領域を有しない抗体の精製も可能となる
。

抗体医薬の精製工程では、中性ｐＨ条件下で抗体分子をアフィニティー担体に吸着させ
た後、酸性ｐＨ条件下で抗体分子を前記担体から溶出させる工程を含むが、当該酸性ｐＨ
条件は抗体分子にダメージを与え、凝集の原因となるため、溶出時のｐＨは高い（つまり
中性に近い）ほうが好ましい。

抗体溶出ｐＨを高める方法として、フレキシブルなアミノ酸残基を有したオリゴペプチ
ドを免疫グロブリン結合性タンパク質に挿入する方法（非特許文献１）や、免疫グロブリ
ン結合性タンパク質中の特定アミノ酸残基をヒスチジン残基に置換する方法（特許文献１
）が知られている。しかしながら、これらの文献に記載の方法では免疫グロブリン結合性
タンパク質の化学的安定性が低下することが報告されている。そのため、化学的安定性を
低下させることなく、抗体溶出ｐＨが高い（すなわち温和なｐＨ条件での抗体溶出が可能
な）免疫グロブリン結合性タンパク質が求められている。

ＷＯ２０１９／０５９４００号

ＳｕｓａｎｎｅＧｕｌｉｃｈ他，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０００，７６，２３３－２４４

本発明の課題は、従来の免疫グロブリン吸着剤よりも温和なｐＨ条件で抗体溶出が可能
な免疫グロブリン吸着剤のリガンドタンパク質として利用可能な、免疫グロブリン結合活
性を有するタンパク質を提供することにある。

本発明者らは、前記課題を解決するため鋭意検討した結果、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ属細
菌由来ＰｒｏｔｅｉｎＬ（ＦｐＬ）の免疫グロブリン結合ドメインにおける抗体溶出特
性に関与したアミノ酸残基を特定し、当該アミノ酸残基を他の特定のアミノ酸残基に置換
することで、前記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の態様を包含する：
［１］
Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ属細菌由来ＰｒｏｔｅｉｎＬの免疫グロブリン結合ドメインの
アミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、少なくとも以下の（１）から（
１１）より選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有
するタンパク質；
（１）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がグルタミンに置換
（２）配列番号１の１３番目のリジンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（３）配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がバリンまたはイソロイシ
ンに置換
（４）配列番号１の６番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（５）配列番号１の８番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
（６）配列番号１の１５番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（７）配列番号１の２３番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニン
またはロイシンに置換
（８）配列番号１の３４番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸、
フェニルアラニン、ロイシンおよびバリンのいずれかに置換
（９）配列番号１の３８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置換
（１０）配列番号１の５０番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がメチオニンに置
換
（１１）配列番号１の５３番目のチロシンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換。
［２］
以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質である、［１］に記載のタンパ
ク質：
（ａ）配列番号１または５に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列におい
て、少なくとも前記（１）から（１１）より選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し、
かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１または５に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列におい
て、少なくとも前記（１）から（１１）より選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し、
さらに前記（１）から（１１）以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ
酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を
有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１または５に記載のアミノ酸配列またはその部分配列と７０％以上の相同
性を有するアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、少なくとも前記（１
）から（１１）より選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し、かつ免疫グロブリン結合
活性を有するタンパク質。
［３］
さらに、少なくとも以下の（ｉ）から（ｌｉｉｉ）より選択される１つ以上のアミノ酸
置換を有する、［１］または［２］に記載のタンパク質：
（ｉ）配列番号１の５０番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換
（ｉｉ）配列番号１の１番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がグリシンまたはバ
リンに置換
（ｉｉｉ）配列番号１の３番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換
（ｉｖ）配列番号１の４番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がリジンまたはグリ
シンに置換
（ｖ）配列番号１の５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（ｖｉ）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（ｖｉｉ）配列番号１の８番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がグリシンに置換
（ｖｉｉｉ）配列番号１の９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（ｉｘ）配列番号１の１７番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニ
ンに置換
（ｘ）配列番号１の２１番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
（ｘｉ）配列番号１の２７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がグリシンまたは
アルギニンに置換
（ｘｉｉ）配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がプロリンに置換
（ｘｉｉｉ）配列番号１の３１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置
換
（ｘｉｖ）配列番号１の３６番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（ｘｖ）配列番号１の４１番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置換
（ｘｖｉ）配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がセリンまたは
グリシンに置換
（ｘｖｉｉ）配列番号１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がスレオニン
またはイソロイシンに置換
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１の５０番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がセリン、
リジンおよびアスパラギン酸のいずれかに置換
（ｘｉｘ）配列番号１の５１番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（ｘｘ）配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリン、グリシ
ンおよびアスパラギン酸のいずれかに置換
（ｘｘｉ）配列番号１の５３番目のチロシンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニン
に置換
（ｘｘｉｉ）配列番号１の５４番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がイソロイシン
またはメチオニンに置換
（ｘｘｉｉｉ）配列番号１の６２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチジ
ン、アルギニン、ロイシン、メチオニンおよびトリプトファンのいずれかに置換
（ｘｘｉｖ）配列番号１の６５番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに
置換
（ｘｘｖ）配列番号１の６９番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置換
（ｘｘｖｉ）配列番号１の２番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がセリンまたはプ
ロリンに置換
（ｘｘｖｉｉ）配列番号１の３番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置
換
（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号１の５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がリジンま
たはアルギニンに置換
（ｘｘｉｘ）配列番号１の２７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリン、リ
ジンおよびイソロイシンのいずれかに置換
（ｘｘｘ）配列番号１の３２番目のフェニルアラニンに相当するアミノ酸残基がロイシン
に置換
（ｘｘｘｉ）配列番号１の３８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（ｘｘｘｉｉ）配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がイソロイ
シンに置換、
（ｘｘｘｉｉｉ）配列番号１の４７番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニン
またはアルギニンに置換
（ｘｘｘｉｖ）配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアスパラ
ギンに置換
（ｘｘｘｖ）配列番号１の２番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（ｘｘｘｖｉ）配列番号１の５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアスパラギ
ン酸に置換
（ｘｘｘｖｉｉ）配列番号１の６番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がロイシンまた
はスレオニンに置換
（ｘｘｘｖｉｉｉ）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がプロリンに置
換
（ｘｘｘｉｘ）配列番号１の１４番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（ｘｌ）配列番号１の２３番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がアルギニンまた
はバリンに置換
（ｘｌｉ）配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニンに
置換
（ｘｌｉｉ）配列番号１の３１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がメチオニンに
置換
（ｘｌｉｉｉ）配列番号１の３３番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアスパラ
ギン酸、グリシンおよびバリンのいずれかに置換
（ｘｌｉｖ）配列番号１の３５番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置
換
（ｘｌｖ）配列番号１の３６番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換
（ｘｌｖｉ）配列番号１の３７番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置
換
（ｘｌｖｉｉ）配列番号１の４１番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がイソロイシン
またはチロシンに置換
（ｘｌｖｉｉｉ）配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチ
ジンまたはアルギニンに置換
（ｘｌｖｉｖ）配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がロイシン
またはチロシンに置換
（ｌ）配列番号１の６０番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
（ｌｉ）配列番号１の６４番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置換
（ｌｉｉ）配列番号１の６６番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（ｌｉｉｉ）配列番号１の６９番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がロイシンまたは
バリンに置換。
［４］
さらに、少なくとも以下の（Ｉ）から（ＶＩＩ）より選択される１つ以上のリジン残基
がリジン以外の塩基性アミノ酸またはヒドロキシ基を有するアミノ酸残基に置換した、［
１］から［３］のいずれかに記載のタンパク質：
（Ｉ）配列番号１の７番目に相当するリジン残基
（ＩＩ）配列番号１の１３番目に相当するリジン残基
（ＩＩＩ）配列番号１の２２番目に相当するリジン残基
（ＩＶ）配列番号１の２９番目に相当するリジン残基
（Ｖ）配列番号１の３８番目に相当するリジン残基
（ＶＩ）配列番号１の４８番目に相当するリジン残基
（ＶＩＩ）配列番号１の６７番目に相当するリジン残基。
［５］
さらに、配列番号１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のアスパラギン
酸への置換、配列番号１の６番目のプロリンに相当するアミノ酸残基のセリンへの置換、
配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換
、配列番号１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のバリンへの置換、配列
番号１の６２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のチロシンへの置換、配列番号
１の２３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、および
配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換
より選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する、［１］から［４］のいずれかに記載の
タンパク質。
［６］
少なくとも以下の（Ｘ）または（Ｙ）のアミノ酸置換を有する、［１］から［５］のい
ずれかに記載のタンパク質：
（Ｘ）配列番号１の４番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のグリシンへの置換、
配列番号１の６番目のプロリンに相当するアミノ酸残基のセリンへの置換、配列番号１の
７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、配列番号１の１３番目、２
２番目、４８番目および６７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置換
、配列番号１の２３番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置換、
配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基のイソロイシンへの置換、配列番
号１の３８番目のリジンに相当するアミノ酸残基のグルタミン酸への置換、配列番号１の
４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置換、配列番号１の４
９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、配列番号１の
５０番目および６２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のチロシンへの置換、配
列番号１の５３番目のチロシンに相当するアミノ酸残基のフェニルアラニンへの置換なら
びに配列番号１の６９番目のアラニンに相当するアミノ酸残基のバリンへの置換；
（Ｙ）配列番号１の４番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のグリシンへの置換、
配列番号１の６番目のプロリンに相当するアミノ酸残基のセリンへの置換、配列番号１の
７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、配列番号１の１３番目、２
２番目および６７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置換、配列番号
１の２３番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置換、配列番号１
の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基のイソロイシンへの置換、配列番号１の３８
番目のリジンに相当するアミノ酸残基のグルタミン酸への置換、配列番号１の４４番目の
アスパラギンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置換、配列番号１の４８番目のリ
ジンに相当するアミノ酸残基のヒスチジンへの置換、配列番号１の４９番目のグルタミン
酸に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、配列番号１の５０番目および６２
番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のチロシンへの置換、配列番号１の５３番目
のチロシンに相当するアミノ酸残基のフェニルアラニンへの置換、配列番号１の６４番目
のイソロイシンに相当するアミノ酸残基のロイシンへの置換ならびに配列番号１の６９番
目のアラニンに相当するアミノ酸残基のバリンへの置換。
［７］
配列番号２０７または２１２に記載のアミノ酸配列を含む、［１］から［６］のいずれ
かに記載のタンパク質。
［８］
［１］から［７］のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［９］
［８］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［１０］
以下の（Ａ）または（Ｂ）を含む、遺伝子組換え宿主：
（Ａ）［１］から［７］のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（Ｂ）［１］から［７］のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを
含む発現ベクター。
［１１］
宿主がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）である、［１０］に
記載の遺伝子組換え宿主。
［１２］
［１］から［７］のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む
遺伝子組換え宿主または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む遺伝子組換え宿主
を培養し該タンパク質を発現させる工程と、発現した前記タンパク質を回収する工程とを
含む、免疫グロブリン結合性タンパク質の製造方法。
［１３］
宿主がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）である、［１２］に
記載の製造方法。
［１４］
不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化した［１］から［７］のいずれかに記載のタン
パク質とを含む、免疫グロブリン吸着剤。
［１５］
［１４］に記載の吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加し当該免
疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを
ｐＨ変化で溶出させる工程とを含む、前記溶液中に含まれる免疫グロブリンの分離方法。
［１６］
前記ｐＨ変化が、ｐＨの低下である、［１５］に記載の方法。

本発明のタンパク質は、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ属由来のプロテインＬの免疫グロブリン
結合ドメインのアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、抗体溶出特性が
向上したアミノ酸置換を少なくとも一つ有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有すること
を特徴としている。不溶性担体と当該不溶性担体に固定化した本発明のタンパク質とを含
む本発明の免疫グロブリン吸着剤によれば、従来の免疫グロブリン吸着剤と比較し、温和
なｐＨ条件で免疫グロブリン（抗体）を溶出できることから、高品質の免疫グロブリンが
得られる。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明のタンパク質は、特定の免疫グロブリン結合性タンパク質である。本明細書にお
いて「免疫グロブリン結合性タンパク質」とは、免疫グロブリンに対する結合性を有する
タンパク質を意味する。すなわち、本発明のタンパク質は、特定の免疫グロブリンに対す
る結合性を有する。本発明のタンパク質は、具体的には、免疫グロブリンのκ軽鎖に対す
る結合性を有するものであってもよい。本明細書では、免疫グロブリンに対する結合性を
、「免疫グロブリン結合活性」または「抗体結合活性」ともいう。免疫グロブリン結合活
性は、例えば、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ
Ａｓｓａｙ）法で測定できる。ＥＬＩＳＡ法は、例えば、実施例に記載の条件で実施で
きる。

本発明のタンパク質は、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ属細菌由来ＰｒｏｔｅｉｎＬ（「Ｆｐ
Ｌ」ともいう）の免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ
酸配列において、特定位置におけるアミノ酸置換を有したタンパク質である。以降、本明
細書において、ＦｐＬの免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列であって、特定位置
におけるアミノ酸置換を有さないものを「非改変型アミノ酸配列」ともいい、ＦｐＬの免
疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列であって、特定位置におけるアミノ酸置換を有
するものを「改変型アミノ酸配列」ともいう。すなわち、改変型アミノ酸配列は、特定位
置におけるアミノ酸置換を有すること以外は非改変型アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列
であってよい。また、本発明のタンパク質は、例えば、特定位置におけるアミノ酸置換を
有すること以外は非改変型アミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であって
よい。また、本発明のタンパク質は、例えば、改変型アミノ酸配列を含むタンパク質であ
ってよい。非改変型アミノ酸配列は、天然に見出されるアミノ酸配列であってもよく、そ
うでなくてもよい。非改変型アミノ酸配列は、例えば、所望の性質を有するように改変さ
れていてもよい。非改変型アミノ酸配列は、例えば、特定位置におけるアミノ酸置換以外
のアミノ酸置換を有していてもよい。

ＦｐＬの由来であるＦｉｎｅｇｏｌｄｉａ属細菌としては、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａｍ
ａｇｎａが挙げられる。Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａｍａｇｎａ由来ＰｒｏｔｅｉｎＬの免
疫グロブリン結合ドメインとしては、
ドメインＢ１（配列番号３８（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＡＡＡ２５６１２）の１０４番目
から１７３番目までのアミノ酸残基）、
ドメインＢ２（配列番号３８の１７６番目から２４５番目までのアミノ酸残基）、
ドメインＢ３（配列番号３８の２４８番目から３１７番目までのアミノ酸残基）、
ドメインＢ４（配列番号３８の３２０番目から３８９番目までのアミノ酸残基）、
ドメインＢ５（配列番号３８の３９３番目から４６２番目までのアミノ酸残基）、
ドメインＣ１（配列番号３９（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＡＡＡ６７５０３）の２４９番目
から３１７番目までのアミノ酸残基）、
ドメインＣ２（配列番号３９の３２０番目から３８９番目までのアミノ酸残基）、
ドメインＣ３（配列番号３９の３９４番目から４６３番目までのアミノ酸残基：配列番号
１）、および
ドメインＣ４（配列番号３９の４６８番目から５３７番目までのアミノ酸残基：配列番号
５）が挙げられる。

本明細書において非改変型アミノ酸配列とは、
（Ａ）前述したＦｐＬの免疫グロブリン結合ドメインの全アミノ酸配列であってもよく、
（Ｂ）免疫グロブリンへの結合活性を有している限り、前記ドメインの部分アミノ酸配列
であってもよい。

なお、前記（Ｂ）に関して、ＦｐＬの免疫グロブリン結合ドメインは四つのβシートと
一つのαヘリックス、それらをつなぐループ部分とＮ末端ループ領域で構成されているが
、Ｎ末端ループ領域など、免疫グロブリンへの結合とは無関係の領域のアミノ酸残基は欠
損してもよい。具体例として、ＦｐＬのドメインＣ３（配列番号１）のＮ末端ループ領域
に相当する、１番目のグルタミン酸から９番目のグルタミン酸までのアミノ酸残基を欠損
させても免疫グロブリン結合能を有していることが知られている（ＨｏｕｓｄｅｎＮ．
Ｇ．ｅｔ．ａｌ．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙＴｒａｎｓａｃｔｉｏｎ，
２００３，３１，７１６－７１８）。すなわち、前記（Ｂ）における部分アミノ酸配列は
、少なくとも免疫グロブリンへの結合部位のアミノ酸配列を含んでいればよいといえる。
すなわち、前記（Ｂ）における部分アミノ酸配列としては、免疫グロブリンへの結合部位
のアミノ酸配列を含む部分配列が挙げられる。

本明細書における改変型アミノ酸配列として、具体的には、配列番号１に記載のアミノ
酸配列など、前述した免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列において特定位置にお
けるアミノ酸置換を有するアミノ酸配列が挙げられる。すなわち、本発明のタンパク質と
して、具体的には、配列番号１に記載のアミノ酸配列など、前述した免疫グロブリン結合
ドメインのアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、特定位置におけるア
ミノ酸置換を有するタンパク質が挙げられる。言い換えると、本発明のタンパク質は、例
えば、特定位置におけるアミノ酸置換を有すること以外は配列番号１に記載のアミノ酸配
列など、前述した免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含
むタンパク質であってよい。

本明細書において、タンパク質がアミノ酸配列を含むことを、「タンパク質がアミノ酸
配列からなるアミノ酸残基を含む」ともいい、タンパク質またはアミノ酸配列がアミノ酸
置換を有することを、「タンパク質またはアミノ酸配列においてアミノ酸置換が生じる」
ともいう。またタンパク質またはアミノ酸配列を構成するアミノ酸を、「アミノ酸残基」
ともいう。

本発明のタンパク質は、温和なｐＨ条件で抗体溶出が可能な免疫グロブリン結合性タン
パク質であってよい。本発明のタンパク質は、具体的には、改変型アミノ酸配列を有しな
い（例えば非改変型アミノ酸配列からなる）免疫グロブリン結合性タンパク質と比較して
温和なｐＨ条件で抗体溶出が可能な免疫グロブリン結合性タンパク質であってよい。本発
明のタンパク質は、具体的には、特定位置におけるアミノ酸置換を有しない免疫グロブリ
ン結合性タンパク質と比較して温和なｐＨ条件で抗体溶出が可能な免疫グロブリン結合性
タンパク質であってよい。言い換えると、本発明のタンパク質は、特定位置におけるアミ
ノ酸置換を有することにより温和なｐＨ条件で抗体溶出が可能となった免疫グロブリン結
合性タンパク質であってよい。また、言い換えると、特定位置におけるアミノ酸置換は、
温和なｐＨ条件で免疫グロブリン結合性タンパク質からの抗体溶出を可能とするものであ
ってよい。

「温和なｐＨ条件」とは、中性に近いｐＨ条件を意味してよい。すなわち、「温和な条
件で抗体溶出が可能」とは、中性に近いｐＨ条件で抗体溶出が可能であることを意味して
よい。また、典型的な抗体の溶出ｐＨは酸性であり得るため、「温和な条件で抗体溶出が
可能」とは、抗体の溶出ｐＨが増大していることを意味してもよい。抗体の溶出ｐＨは、
例えば、実施例に記載の条件で測定できる。

前記特定位置におけるアミノ酸置換は、具体的には、Ｌｙｓ７Ｇｌｎ（この表記は、配
列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がグルタミンに置換されていることを
表す；以下、他のアミノ酸置換についても同様に解釈するものとする）、Ｌｙｓ１３Ｖａ
ｌ、Ｌｙｓ２９Ｖａｌ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｐｒｏ６Ａｌａ、Ｇｌｕ８Ａｒｇ、Ａｓｎ１
５Ｖａｌ、Ｉｌｅ２３Ｐｈｅ、Ｉｌｅ２３Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３４Ａｓｐ、Ｇｌｕ３４Ｐｈｅ
、Ｇｌｕ３４Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３４Ｖａｌ、Ｌｙｓ３８Ｌｅｕ、Ａｓｎ５０ＭｅｔおよびＴ
ｙｒ５３Ｓｅｒから選ばれる少なくとも１つ以上のアミノ酸置換を含む。

言い換えると、前記特定位置におけるアミノ酸置換は、少なくとも、
（１）Ｌｙｓ７Ｇｌｎ
（２）Ｌｙｓ１３Ｖａｌ
（３）Ｌｙｓ２９ＶａｌまたはＬｙｓ２９Ｉｌｅ
（４）Ｐｒｏ６Ａｌａ
（５）Ｇｌｕ８Ａｒｇ
（６）Ａｓｎ１５Ｖａｌ
（７）Ｉｌｅ２３ＰｈｅまたはＩｌｅ２３Ｌｅｕ
（８）Ｇｌｕ３４Ａｓｐ、Ｇｌｕ３４Ｐｈｅ、Ｇｌｕ３４ＬｅｕおよびＧｌｕ３４Ｖａｌ
のいずれか
（９）Ｌｙｓ３８Ｌｅｕ
（１０）Ａｓｎ５０Ｍｅｔ
（１１）Ｔｙｒ５３Ｓｅｒ
より選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。本発明のタンパク質は、例えば、前記（
１）から（１１）より選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまた
は９つのアミノ酸置換を有してよいし、１０個以上のアミノ酸置換を有してもよい。

なお、本発明のタンパク質が２つまたはそれ以上のアミノ酸置換を有する場合、それら
アミノ酸置換の組み合わせは、少なくとも前記（１）から（１１）より選択される１つ以
上のアミノ酸置換を含む限り、特に制限されない。

アミノ酸置換の組み合わせの一態様として、
Ｐｒｏ６ＡｌａおよびＬｙｓ２９Ｉｌｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ８ＡｒｇおよびＬｙｓ２９Ｉｌｅのアミノ酸置換；
Ｉｌｅ２３ＰｈｅおよびＬｙｓ２９Ｉｌｅのアミノ酸置換；
Ｉｌｅ２３ＬｅｕおよびＬｙｓ２９Ｉｌｅのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ２９ＩｌｅおよびＬｙｓ３８Ｌｅｕのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ２９ＩｌｅおよびＡｓｎ５０Ｍｅｔのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ５９ＩｌｅおよびＴｙｒ５３Ｓｅｒのアミノ酸置換；
Ａｓｎ１５ＶａｌおよびＬｙｓ２９Ｉｌｅのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ２９ＩｌｅおよびＧｌｕ３４Ａｓｐのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ２９ＩｌｅおよびＧｌｕ３４Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ２９ＩｌｅおよびＧｌｕ３４Ｌｅｕのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ２９ＩｌｅおよびＧｌｕ３４Ｖａｌのアミノ酸置換；
があげられる。

また前記特定位置におけるアミノ酸置換は、さらに、以下の（ｉ）から（ｌｉｉｉ）よ
り選択される１つ以上のアミノ酸置換を含んでいてよい。すなわち、本発明のタンパク質
が有するアミノ酸置換の組み合わせの別態様として、少なくとも前記（１）から（１１）
より選択される１つ以上のアミノ酸置換と、少なくとも以下の（ｉ）から（ｌｉｉｉ）よ
り選択される１つ以上のアミノ酸置換との組み合わせもあげられる。
（ｉ）配列番号１の５０番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換（
ｉｉ）配列番号１の１番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がグリシンまたはバリ
ンに置換
（ｉｉｉ）配列番号１の３番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換
（ｉｖ）配列番号１の４番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がリジンまたはグリ
シンに置換
（ｖ）配列番号１の５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（ｖｉ）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（ｖｉｉ）配列番号１の８番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がグリシンに置換
（ｖｉｉｉ）配列番号１の９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（ｉｘ）配列番号１の１７番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニ
ンに置換
（ｘ）配列番号１の２１番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
（ｘｉ）配列番号１の２７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がグリシンまたは
アルギニンに置換
（ｘｉｉ）配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がプロリンに置換
（ｘｉｉｉ）配列番号１の３１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置
換
（ｘｉｖ）配列番号１の３６番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（ｘｖ）配列番号１の４１番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置換
（ｘｖｉ）配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がセリンまたは
グリシンに置換
（ｘｖｉｉ）配列番号１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がスレオニン
またはイソロイシンに置換
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１の５０番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がセリン、
リジンおよびアスパラギン酸のいずれかに置換
（ｘｉｘ）配列番号１の５１番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（ｘｘ）配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリン、グリシ
ンおよびアスパラギン酸のいずれかに置換
（ｘｘｉ）配列番号１の５３番目のチロシンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニン
に置換
（ｘｘｉｉ）配列番号１の５４番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がイソロイシン
またはメチオニンに置換
（ｘｘｉｉｉ）配列番号１の６２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチジ
ン、アルギニン、ロイシン、メチオニンおよびトリプトファンのいずれかに置換
（ｘｘｉｖ）配列番号１の６５番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに
置換
（ｘｘｖ）配列番号１の６９番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置換
（ｘｘｖｉ）配列番号１の２番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がセリンまたはプ
ロリンに置換
（ｘｘｖｉｉ）配列番号１の３番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置
換
（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号１の５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がリジンま
たはアルギニンに置換
（ｘｘｉｘ）配列番号１の２７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリン、リ
ジンおよびイソロイシンのいずれかに置換
（ｘｘｘ）配列番号１の３２番目のフェニルアラニンに相当するアミノ酸残基がロイシン
に置換
（ｘｘｘｉ）配列番号１の３８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（ｘｘｘｉｉ）配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がイソロイ
シンに置換、
（ｘｘｘｉｉｉ）配列番号１の４７番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニン
またはアルギニンに置換
（ｘｘｘｉｖ）配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアスパラ
ギンに置換
（ｘｘｘｖ）配列番号１の２番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（ｘｘｘｖｉ）配列番号１の５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアスパラギ
ン酸に置換
（ｘｘｘｖｉｉ）配列番号１の６番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がロイシンまた
はスレオニンに置換
（ｘｘｘｖｉｉｉ）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がプロリンに置
換
（ｘｘｘｉｘ）配列番号１の１４番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（ｘｌ）配列番号１の２３番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がアルギニンまた
はバリンに置換
（ｘｌｉ）配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニンに
置換
（ｘｌｉｉ）配列番号１の３１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がメチオニンに
置換
（ｘｌｉｉｉ）配列番号１の３３番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアスパラ
ギン酸、グリシンおよびバリンのいずれかに置換
（ｘｌｉｖ）配列番号１の３５番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置
換
（ｘｌｖ）配列番号１の３６番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換
（ｘｌｖｉ）配列番号１の３７番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置
換
（ｘｌｖｉｉ）配列番号１の４１番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がイソロイシン
またはチロシンに置換
（ｘｌｖｉｉｉ）配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチ
ジンまたはアルギニンに置換
（ｘｌｖｉｖ）配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がロイシン
またはチロシンに置換
（ｌ）配列番号１の６０番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
（ｌｉ）配列番号１の６４番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置換
（ｌｉｉ）配列番号１の６６番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（ｌｉｉｉ）配列番号１の６９番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がロイシンまたは
バリンに置換。

なお、前記（ｉ）から（ｌｉｉｉ）のアミノ酸置換の内、同位置のアミノ酸置換は同時
には選択されない。例えば、前記（ｉｉｉ）のアミノ酸置換と前記（ｘｘｖｉｉ）のアミ
ノ酸置換は同時には選択されない。

一態様において、前記特定位置におけるアミノ酸置換は、前記（ｉ）から（ｌｉｉｉ）
より選択される１つ以上のアミノ酸置換を含んでいてよい。

前記（１）から（１１）より選択される１つ以上のアミノ酸置換と前記（ｉ）から（ｌ
ｉｉｉ）より選択される１つ以上のアミノ酸置換との組み合わせを有した、本発明のタン
パク質は、アルカリ安定性も向上し得る点で好ましい。特に、前記（１）から（１１）よ
り選択される１つ以上のアミノ酸置換と少なくとも前記（ｉ）のアミノ酸置換との組み合
わせを有した、本発明のタンパク質は、温和なｐＨ条件での抗体溶出が可能で、かつアル
カリ安定性も向上しているため、より好ましい。

「アルカリ安定性」とは、アルカリ条件における失活に対する耐性を意味してよい。ア
ルカリ安定性の向上は、例えば、アルカリ処理後の残存活性の向上として測定できる。こ
こでいう「活性」とは、免疫グロブリン結合活性を意味する。アルカリ処理は、例えば、
実施例に記載の条件で実施できる。

本発明のタンパク質は、例えば、前記（ｉ）から（ｌｉｉｉ）に記載のアミノ酸置換か
ら選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたは９つのアミノ酸置
換を有してよいし、１０個以上のアミノ酸置換を有してもよい。本発明のタンパク質は、
例えば、少なくとも、前記（ｉ）のアミノ酸置換を有してよい。ただし、
（１）Ｌｙｓ７Ｇｌｎのアミノ酸置換を選択した場合は、前記（ｖｉ）および前記（ｘｘ
ｘｖｉｉｉ）のアミノ酸置換は選択できず、
（３）Ｌｙｓ２９ＶａｌまたはＬｙｓ２９Ｉｌｅのアミノ酸置換を選択した場合は、前記
（ｘｉｉ）および前記（ｘｌｉ）のアミノ酸置換は選択できず、
（４）Ｐｒｏ６Ａｌａのアミノ酸置換を選択した場合は、前記（ｘｘｘｖｉｉ）のアミノ
酸置換は選択できず、
（５）Ｇｌｕ８Ａｒｇのアミノ酸置換を選択した場合は、前記（ｖｉｉ）のアミノ酸置換
は選択できず、
（７）Ｉｌｅ２３ＰｈｅまたはＩｌｅ２３Ｌｅｕのアミノ酸置換を選択した場合は、前記
（ｘｌ）のアミノ酸置換は選択できず、
（９）Ｌｙｓ３８Ｌｅｕのアミノ酸置換を選択した場合は、前記（ｉ）および前記（ｘｘ
ｘｉ）のアミノ酸置換は選択できず、
（１０）Ａｓｐ５０Ｍｅｔのアミノ酸置換を選択した場合は、前記（ｘｖｉｉｉ）のアミ
ノ酸置換は選択できず、
（１１）Ｔｙｒ５３Ｓｅｒのアミノ酸置換を選択した場合は、前記（ｘｘｉ）のアミノ酸
置換は選択できない。

アミノ酸置換の組み合わせの別態様の具体例として、
Ｌｙｓ７ＡｌａおよびＬｙｓ２９Ｉｌｅのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０ＴｙｒおよびＧｌｕ５２Ｇｌｙのアミノ
酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｕ９Ｖａｌ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０ＴｙｒおよびＧｌｕ５
２Ｇｌｙのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＴｙｒ
５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＴｈｒ
５４Ｍｅｔのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＡｌａ
６９Ｔｈｒのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ１Ｖａｌ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇ
ｌｙおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇ
ｌｙおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミ
ノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｙ２１Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２
ＧｌｙおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ
５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａ
ｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａ
ｓｐ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｕ８Ｇｌｙ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｇｌｕ３３Ｖａ
ｌ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｉｌｅ２３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｌａ４１Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｌａ４１Ｔｙｒ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｌ
ｅｕおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｖ
ａｌおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｐｒｏ６Ａｌａ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙ
ｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｕ８Ｇｌｙ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙ
ｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｕ８Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙ
ｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｙ２１Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｉｌｅ２３Ｐｈｅ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｉｌｅ２３Ｌｅｕ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｇｌｕ３３Ｖａｌ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ｌｅｕ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ４４Ｈｉｓ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ４４Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ｈｉｓ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｍｅｔ、Ｇｌｕ５２Ａ
ｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｔ
ｙｒおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａ
ｓｐおよびＴｙｒ５３Ｓｅｒのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｖ
ａｌ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＡｌａ６７Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｌ
ｅｕ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＡｌａ６７Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐ
ｈｅおよびＡｌａ６７Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｖａｌ１４Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＡｌａ６７Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｙ２１Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＡｌａ６７Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ４４Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＡｌａ６７Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ４４Ｈｉｓ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＡｌａ６７Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｔ
ｙｒ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＡｌａ６７Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐ
ｈｅ、Ｇｌｙ６０ＡｒｇおよびＡｌａ６７Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐ
ｈｅ、Ｉｌｅ６４ＬｅｕおよびＡｌａ６７Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｉｌｅ２３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ４４Ａ
ｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｉｌｅ２３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ４４Ｈ
ｉｓ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｉｌｅ２３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｉｌｅ６４ＬｅｕおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ４４Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｉｌｅ６４ＬｅｕおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ４４Ｈｉｓ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｉｌｅ６４ＬｅｕおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｉｌｅ２３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ４４Ａ
ｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｉｌｅ６４ＬｅｕおよびＡｌａ６９Ｖａｌ
のアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ４４Ｈｉｓ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｉｌｅ６４ＬｅｕおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ａｓｎ１５Ｖａｌ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｇｌｕ３４Ａｓｐ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｇｌｕ３４Ｐｈｅ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｇｌｕ３４Ｌｅｕ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｇｌｕ３４Ｖａｌ、Ａｓｎ５０Ｔ
ｙｒ、Ｇｌｕ５２ＡｓｐおよびＴｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換；
があげられる。

また、前記特定位置におけるアミノ酸置換は、さらに、以下の（Ｉ）から（ＶＩＩ）よ
り選択される１つ以上のリジン（Ｌｙｓ）残基のリジン以外の塩基性アミノ酸（アルギニ
ン（Ａｒｇ）もしくはヒスチジン（Ｈｉｓ））またはヒドロキシ基を有するアミノ酸（セ
リン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）もしくはチロシン（Ｔｙｒ））への置換を含んで
いてよい。すなわち、本発明のタンパク質が有するアミノ酸置換の組み合わせのさらに別
の態様として、少なくとも前記（１）から（１１）より選択される１つ以上のアミノ酸置
換と、少なくとも以下の（Ｉ）から（ＶＩＩ）より選択される１つ以上のリジン（Ｌｙｓ
）残基のリジン以外の塩基性アミノ酸（アルギニン（Ａｒｇ）もしくはヒスチジン（Ｈｉ
ｓ））またはヒドロキシ基を有するアミノ酸（セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）
もしくはチロシン（Ｔｙｒ））への置換との組み合わせも挙げられる。
（Ｉ）配列番号１の７番目に相当するリジン残基
（ＩＩ）配列番号１の１３番目に相当するリジン残基
（ＩＩＩ）配列番号１の２２番目に相当するリジン残基
（ＩＶ）配列番号１の２９番目に相当するリジン残基
（Ｖ）配列番号１の３８番目に相当するリジン残基
（ＶＩ）配列番号１の４８番目に相当するリジン残基
（ＶＩＩ）配列番号１の６７番目に相当するリジン残基

本発明のタンパク質は、前記（Ｉ）から（ＶＩＩ）より選択される１つ、２つ、３つ、
４つ、５つまたは６つのリジン残基の置換を有してよく、さらに前記（ｉ）から（ｌｉｉ
ｉ）より選択される１つ以上のアミノ酸置換を有してもよい。ただし、
（１）Ｌｙｓ７Ｇｌｎのアミノ酸置換を選択した場合は、前記（Ｉ）のリジン残基の置換
は選択できず、
（２）Ｌｙｓ１３Ｖａｌのアミノ酸置換を選択した場合は、前記（ＩＩ）のリジン残基の
置換は選択できず、
（３）Ｌｙｓ２９ＶａｌまたはＬｙｓ２９Ｉｌｅのアミノ酸置換を選択した場合は、前記
（ＩＶ）のリジン残基の置換は選択できず、
（９）Ｌｙｓ３８Ｌｅｕのアミノ酸置換を選択した場合は、前記（Ｖ）のリジン残基の置
換は選択できない。

なお、塩基性アミノ酸またはヒドロキシ基を有するアミノ酸に置換されたリジン残基以
外のリジン残基（すなわち、前記（Ｉ）～（ＶＩＩ）のリジン残基の内の選択されなかっ
たもの）については、未置換（リジン残基）のままでもよいし、塩基性アミノ酸およびヒ
ドロキシ基を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換されてもよい。後者の例としては、リ
ジン残基のグルタミンまたはイソロイシンへの置換や、前述したＬｙｓ１３Ｖａｌ、Ｌｙ
ｓ２９ＶａｌおよびＬｙｓ３８Ｌｅｕのアミノ酸置換が挙げられる。

アミノ酸置換の組み合わせのさらに別の態様の具体例として、
Ｌｙｓ７Ｇｌｎ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８
ＡｒｇおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｒｇ、Ｌｙｓ１３Ｖａｌ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８
ＡｒｇおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｒｇ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｖａｌ、Ｌｙｓ４８
ＡｒｇおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｒｇ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８
ＡｒｇおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
があげられる。

また、前記特定位置におけるアミノ酸置換は、前記（ｉ）から（ｌｉｉｉ）より選択さ
れる１つ以上のアミノ酸置換と前記（Ｉ）から（ＶＩＩ）より選択される１つ以上のリジ
ン（Ｌｙｓ）残基のリジン以外の塩基性アミノ酸またはヒドロキシ基を有するアミノ酸へ
の置換との組み合わせを含んでいてもよい。すなわち、本発明のタンパク質が有するアミ
ノ酸置換の組み合わせのさらにまた別の態様として、少なくとも前記（１）から（１１）
より選択される１つ以上のアミノ酸置換と、少なくとも前記（ｉ）から（ｌｉｉｉ）より
選択される１つ以上のアミノ酸置換と、少なくとも前記（Ｉ）から（ＶＩＩ）より選択さ
れる１つ以上のリジン（Ｌｙｓ）残基のリジン以外の塩基性アミノ酸またはヒドロキシ基
を有するアミノ酸への置換との組み合わせも挙げられる。

アミノ酸置換の組み合わせのさらにまた別の態様の具体例として
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８
ＡｒｇおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８
Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｕ９Ｖａｌ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａ
ｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８
Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＬｙｓ６７Ａｒ
ｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８
Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒ
ｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８
ｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、Ｔｈｒ５４ＭｅｔおよびＬｙｓ６７Ａｒｇ
のアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８
ｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、Ｌｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｔｈｒ
のアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８
Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅお
よびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ１Ｖａｌ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ｓｅｒ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８
Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅお
よびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｇｌｙ２１Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９
Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、
Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８
Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅお
よびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅおよ
びＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｕ８Ｇｌｙ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒ
ｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｇｌｕ３３Ｖａｌ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌ
ｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｉｌｅ２３Ａ
ｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ａｌａ４１Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ａｌａ４１Ｔｙｒ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｌｅｕ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅおよ
びＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｖａｌ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅおよ
びＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｐｒｏ６Ａｌａ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒ
ｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙ
ｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｕ８Ｇｌｙ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒ
ｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙ
ｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｇｌｕ８Ａｒｇ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒ
ｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙ
ｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｇｌｙ２１Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａ
ｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｉｌｅ２３Ｐ
ｈｅ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｉｌｅ２３Ｌ
ｅｕ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｇｌｕ３３Ｖａｌ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ３８Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ３８Ｌｅｕ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ａｓｎ４４Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ａｓｎ４４Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ａｓｎ４４Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｍｅｔ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅおよ
びＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅおよ
びＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙｒ５３Ｓｅｒおよ
びＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｖａｌ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｌｅｕ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌｙｓ６７Ａｒｇおよ
びＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｖａｌ１４Ａｌａ、Ｌｙｓ２２Ａ
ｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｇｌｙ２１Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａ
ｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ａｓｎ４４Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ａｓｎ４４Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｇｌｙ６０Ａｒｇ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｉｌｅ６４Ｌｅｕ、Ｌ
ｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｉｌｅ２３Ａ
ｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ４４Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔ
ｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｉｌｅ２３Ａ
ｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ４４Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔ
ｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｌｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｉｌｅ２３Ａ
ｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｉ
ｌｅ６４Ｌｅｕ、Ｌｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ａｓｎ４４Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｉ
ｌｅ６４Ｌｅｕ、Ｌｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ａｓｎ４４Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｉ
Ｉｌｅ６４Ｌｅｕ、Ｌｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｉｌｅ２３Ａ
ｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ａｓｎ４４Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ｈｉｓ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔ
ｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｉｌｅ６４Ｌｅｕ、Ｌｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ
酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ａｓｎ４４Ｈｉｓ、Ｌｙｓ４８Ｈｉｓ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｉ
ｌｅ６４Ｌｅｕ、Ｌｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ａｓｎ１５Ｖａｌ、Ｌｙｓ２２Ａ
ｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｇｌｕ３４Ａｓｐ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｇｌｕ３Ｐｈｅ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔｙ
ｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｇｌｕ３４Ｌｅｕ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉ
ｌｅ、Ｇｌｕ３４Ｖａｌ、Ｌｙｓ４８Ａｒｇ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２Ａｓｐ、Ｔ
ｙｒ５３ＰｈｅおよびＬｙｓ６７Ａｒｇのアミノ酸置換；
があげられる。

なお、本発明のタンパク質は、少なくとも１つの他のアミノ酸置換をさらに有してもよ
い。他のアミノ酸置換としては、Ｇｌｕ４９Ａｓｐ、Ｐｒｏ６Ｓｅｒ、Ａｓｎ４４Ａｓｐ
、Ｇｌｕ４９Ｖａｌ、Ａｓｎ６２Ｔｙｒ、Ｉｌｅ２３Ｔｈｒ、Ａｌａ４１Ａｒｇが挙げら
れる。他のアミノ酸置換は、例えば、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性
を向上させるものであってよい。例えば、Ａｓｎ４４Ａｓｐ、Ｇｌｕ４９Ｖａｌ、Ａｓｎ
６２Ｔｙｒ、Ｉｌｅ２３Ｔｈｒ、およびＡｌａ４１Ａｒｇのアミノ酸置換は、いずれも、
免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性を向上させるものであり得る。本発明
のタンパク質は、例えば、前記他のアミノ酸置換を１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、また
は６つ有してよい。すなわち、改変型アミノ酸配列としては、上記例示した非改変型アミ
ノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）において前記特定位置におけるアミ
ノ酸置換およびＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒなど他のアミノ酸置換を有するアミノ
酸配列も挙げられる。すなわち、本発明のタンパク質としては、上記例示した非改変型ア
ミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）を含み、ただし当該アミノ酸配列
において、前記特定位置におけるアミノ酸置換およびＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒ
など他のアミノ酸置換を有するタンパク質も挙げられる。言い換えると、本発明のタンパ
ク質は、例えば、前記特定位置におけるアミノ酸置換およびＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６
Ｓｅｒなど他のアミノ酸置換を有すること以外は上記例示した非改変型アミノ酸配列（例
えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であって
もよい。なお、前記他のアミノ酸置換として例示したＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒ
は、ｓｕｂｇｒｏｕｐに関係なく免疫グロブリンのκ軽鎖に結合可能な、アミノ酸置換で
ある。

前記他のアミノ酸置換を含むアミノ酸置換の組み合わせとしては、上記例示したアミノ
酸置換の組み合わせにおいてさらに前記他のアミノ酸置換を１つ、２つ、３つ、４つ、５
つ、または６つ含む組み合わせが挙げられる。前記他のアミノ酸置換を含むアミノ酸置換
の組み合わせとしては、特に、上記例示したアミノ酸置換の組み合わせにおいてさらに少
なくともＡｓｎ６２Ｔｙｒのアミノ酸置換を含む組み合わせが挙げられる。

前記他のアミノ酸置換をさらに有した、本発明のタンパク質の一例として、以下のタン
パク質があげられる。前記タンパク質を不溶性担体に固定化して得られる本発明の免疫グ
ロブリン吸着剤は、従来の免疫グロブリン吸着剤と比較し、κ軽鎖を有する免疫グロブリ
ン（抗体）を、ｓｕｂｇｒｏｕｐに関係なく、温和なｐＨ条件で溶出できる点で好ましい
。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、Ｇｌｕ４Ｇ
ｌｙ、Ｐｒｏ６Ｓｅｒ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｉｌｅ
２３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ｇｌｕ、Ａｓｎ４４Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ａｒ
ｇ、Ｇｌｕ４９Ａｓｐ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ａｓｎ６２Ｔｙｒ、Ｌｙ
ｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換を有する免疫グロブリン結合性タン
パク質（配列番号２０７に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン結合性タンパク質）
。
配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、Ｇｌｕ４Ｇ
ｌｙ、Ｐｒｏ６Ｓｅｒ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｉｌｅ
２３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ｇｌｕ、Ａｓｎ４４Ａｒｇ、Ｌｙｓ４８Ｈｉ
ｓ、Ｇｌｕ４９Ａｓｐ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ａｓｎ６２Ｔｙｒ、Ｉｌ
ｅ６４Ｌｅｕ、Ｌｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換を有する免疫グ
ロブリン結合性タンパク質（配列番号２１２に記載のアミノ酸配列を含む免疫グロブリン
結合性タンパク質）。

言い換えると、本発明のタンパク質が有するアミノ酸置換の一例として、以下のものが
挙げられる：
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｐｒｏ６Ｓｅｒ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒ
ｇ、Ｉｌｅ２３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ｇｌｕ、Ａｓｎ４４Ａｒｇ、Ｌｙ
ｓ４８Ａｒｇ、Ｇｌｕ４９Ａｓｐ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ａｓｎ６２Ｔ
ｙｒ、Ｌｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換；
Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｐｒｏ６Ｓｅｒ、Ｌｙｓ７Ａｌａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒ
ｇ、Ｉｌｅ２３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ３８Ｇｌｕ、Ａｓｎ４４Ａｒｇ、Ｌｙ
ｓ４８Ｈｉｓ、Ｇｌｕ４９Ａｓｐ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ａｓｎ６２Ｔ
ｙｒ、Ｉｌｅ６４Ｌｅｕ、Ｌｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換。

本明細書では、配列番号１に記載のアミノ酸配列において上記例示したアミノ酸置換（
すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意のＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓ
ｅｒなど他のアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を、「配列番号１由来置換アミノ酸配
列」ともいう。配列番号１由来置換アミノ酸配列は、言い換えると、上記例示したアミノ
酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意のＧｌｕ４９ＡｓｐやＰ
ｒｏ６Ｓｅｒなど他のアミノ酸置換）が生じた配列番号１に記載のアミノ酸配列である。
また、配列番号１由来置換アミノ酸配列は、言い換えると、上記例示したアミノ酸置換（
すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意のＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓ
ｅｒなど他のアミノ酸置換）を有すること以外は配列番号１に記載のアミノ酸配列と同一
のアミノ酸配列である。配列番号１由来置換アミノ酸配列は、本明細書における改変型ア
ミノ酸配列の一例である。

本明細書における改変型アミノ酸配列としては、上記例示した改変型アミノ酸配列（例
えば配列番号１由来置換アミノ酸配列）のバリアント（ｖａｒｉａｎｔ）配列も挙げられ
る。すなわち、本発明のタンパク質としては、上記例示した改変型アミノ酸配列（例えば
配列番号１由来置換アミノ酸配列）のバリアント配列を含み、かつ、免疫グロブリン結合
活性を有するタンパク質も挙げられる。以下、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリア
ント配列の場合を例示して説明するが、当該説明は任意の改変型アミノ酸配列のバリアン
ト配列にも準用できる。

配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列は、前記特定位置におけるアミノ酸
置換が残存するように（すなわち、本発明のタンパク質が前記特定位置におけるアミノ酸
置換を有するように）設定されるものとする。また、配列番号１由来置換アミノ酸配列の
バリアント配列は、Ｇｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒなど他のアミノ酸置換が残存する
ように（すなわち、本発明のタンパク質がＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒなど他のア
ミノ酸置換を有するように）設定されてもよい。また、配列番号１由来置換アミノ酸配列
のバリアント配列は、例えば、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけ
るアミノ酸置換および任意のＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒなど他のアミノ酸置換）
から選択される、配列番号１由来置換アミノ酸配列が有さない１つ以上のアミノ酸置換を
追加的に有していてもよい。例えば、配列番号１由来置換アミノ酸配列がＧｌｕ４９Ａｓ
ｐやＰｒｏ６Ｓｅｒなど他のアミノ酸置換を有さない場合に、配列番号１由来置換アミノ
酸配列のバリアント配列が前記他のアミノ酸置換を有していてもよい。

配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列としては、配列番号１由来置換アミ
ノ酸配列において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠
失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列が挙げられる。すなわち、本発明のタ
ンパク質は、免疫グロブリン結合活性を有する限り、上記例示したアミノ酸置換（すなわ
ち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意のＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒな
ど他のアミノ酸置換）に加えて、さらに、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１
もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／ま
たは付加を含んでいてもよい。すなわち、本発明のタンパク質としては、配列番号１に記
載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、上記例示したアミノ酸置換
（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意のＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６
Ｓｅｒなど他のアミノ酸置換）を有し、さらに１もしくは数個の位置での１もしくは数個
のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、かつ、免疫グロブリン
結合活性を有するタンパク質も挙げられる。言い換えると、本発明のタンパク質は、例え
ば、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意
のＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒなど他のアミノ酸置換）を有し、さらに１もしくは
数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加
を含むこと以外は配列番号１と同一のアミノ酸配列を含み、かつ、免疫グロブリン結合活
性を有するタンパク質であってもよい。なお、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、
および／または付加は、前記特定位置におけるアミノ酸置換が残存するように選択される
ものとする。すなわち、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は
、例えば、前記特定位置以外の位置に生じてよい。また、上記のアミノ酸残基の置換、欠
失、挿入、および／または付加は、前記他のアミノ酸置換が残存するように選択されても
よい。すなわち、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、例え
ば、前記他のアミノ酸置換以外の位置に生じてもよい。また、上記のアミノ酸残基の置換
、欠失、挿入、および／または付加は、例えば、上記例示したアミノ酸置換から選択され
る、配列番号１由来置換アミノ酸配列が有さない１つ以上のアミノ酸置換を含んでいても
よい。前記「１もしくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置
やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１から２０個、１から
１０個、１から９個、１から８個、１から７個、１から６個、１から５個、１から４個、
１から３個、１から２個、１個のいずれかを意味する。上記のアミノ酸残基の置換の一例
としては、物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸間で置換が生じる保
守的置換が挙げられる。保守的置換の場合、一般に、置換が生じているものと置換が生じ
ていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている
。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、セリンとプロリン間、またはグル
タミン酸とアラニン間での置換が挙げられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サ
イエンス・インターナショナル社，９，２００５）。また、上記のアミノ酸残基の置換、
欠失、挿入、および／または付加には、例えば、タンパク質またはそれをコードする遺伝
子が由来する微生物の個体差や種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ミュータ
ント（ｍｕｔａｎｔ）またはバリアント）によって生じるものも含まれる。

また、配列番号１由来置換アミノ酸配列のバリアント配列としては、配列番号１由来置
換アミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列も挙げられる。すなわち、本発
明のタンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列において上記例示したアミノ
酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｕ４９ＡｓｐやＰ
ｒｏ６Ｓｅｒなど他のアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列に対して高い相同性を有する
アミノ酸配列を含み、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。
なお、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、前記特定位置におけるアミ
ノ酸置換が残存するように選択されるものとする。すなわち、上記のような相同性の範囲
でのアミノ酸配列の変化は、例えば、前記特定位置以外の位置に生じてよい。また、上記
のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、他のアミノ酸置換が残存するように選
択されてもよい。すなわち、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸配列の変化は、例え
ば、他のアミノ酸置換以外の位置に生じてもよい。また、上記のような相同性の範囲での
アミノ酸配列の変化は、例えば、上記例示したアミノ酸置換から選択される、配列番号１
由来置換アミノ酸配列が有さない１つ以上のアミノ酸置換を含んでいてもよい。前記「相
同性」とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味
してよく、特に同一性を意味してもよい。「アミノ酸配列に対する相同性」とは、アミノ
酸配列全体に対する相同性を意味する。前記「高い相同性」とは、７０％以上、８０％以
上、９０％以上、または９５％以上の相同性を意味してよい。アミノ酸配列間の「同一性
」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率を意味する（
実験医学２０１３年２月号Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．３、羊土社）。アミノ酸配列間の「
類似性」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率と側鎖
の性質が類似したアミノ酸残基の比率の合計を意味する（実験医学２０１３年２月号
Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．３、羊土社）。側鎖の性質が類似したアミノ酸残基については上述
の通りである。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉ
ｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ）やＦＡＳＴＡ等のアラインメントプログラム（
ａｌｉｇｎｍｅｎｔｐｒｏｇｒａｍ）を利用して決定できる。

また、改変型アミノ酸配列としては、上記例示したバリアント配列において、さらに、
上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧ
ｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒなど他のアミノ酸置換）から選択される１つ以上のアミ
ノ酸置換を有するアミノ酸配列も挙げられる。例えば、改変型アミノ酸配列は、少なくと
も前記特定位置におけるアミノ酸置換を有するバリアント配列において、さらに他のアミ
ノ酸置換を有するアミノ酸配列であってよい。

また、非改変型アミノ酸配列としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配
列番号１に記載のアミノ酸配列）のバリアント配列も挙げられる。すなわち、改変型アミ
ノ酸配列としては、上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミ
ノ酸配列）のバリアント配列において、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位
置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒなど他のアミノ
酸置換）を有するアミノ酸配列も挙げられる。すなわち、本発明のタンパク質としては、
上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）のバリア
ント配列を含み、ただし当該バリアント配列において、上記例示したアミノ酸置換（すな
わち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒ
など他のアミノ酸置換）を有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げ
られる。言い換えると本発明のタンパク質は、例えば、上記例示したアミノ酸置換を有す
ること以外は上記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配
列）のバリアント配列と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。なお、上
記例示した非改変型アミノ酸配列（例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列）のバリアン
ト配列は、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ属細菌において実際に存在していてもよく、いなくても
よい。すなわち、「Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ属細菌由来ＰｒｏｔｅｉｎＬの免疫グロブリ
ン結合ドメインのアミノ酸配列（ＦｐＬの免疫グロブリン結合ドメインのアミノ酸配列）
」とは、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ属細菌に実際に存在するＰｒｏｔｅｉｎＬの免疫グロブ
リン結合ドメインのアミノ酸配列に限られず、同アミノ酸配列のバリアント配列であって
Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ属細菌に実際に存在しない（すなわち仮想の）アミノ酸配列も包含
する。以下、配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列の場合を例示して説明す
るが、当該説明は任意の非改変型アミノ酸配列のバリアント配列にも準用できる。

配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列としては、配列番号１に記載のアミ
ノ酸配列において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠
失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列が挙げられる。すなわち、本発明のタ
ンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列に
おいて、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、
および／または付加を含み、さらに上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置に
おけるアミノ酸置換および任意でＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒなど他のアミノ酸置
換）を有し、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。上記のア
ミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は、例えば、前記特定位置以外の位
置に生じてよい。また、上記のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加は
、例えば、他のアミノ酸置換以外の位置に生じてもよい。

配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列としては、配列番号１に記載のアミ
ノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列も挙げられる。すなわち、本発明のタ
ンパク質としては、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ
酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して高い
相同性を有するアミノ酸配列）において、上記例示したアミノ酸置換（すなわち前記特定
位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｕ４９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒなどの他のア
ミノ酸置換）を有し、かつ、免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質も挙げられる。
上記のような相同性の範囲でのアミノ酸残基の変化は、例えば、前記特定位置以外の位置
に生じてよい。また、上記のような相同性の範囲でのアミノ酸残基の変化は、例えば、他
のアミノ酸置換以外の位置に生じてもよい。

その他、配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列については、配列番号１由
来置換アミノ酸配列のバリアント配列についての記載を準用できる。

本明細書において「配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸」とは
、配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端から数えてＸ位の位置に存在するアミノ酸を
意味する。特定のアミノ酸配列における「配列番号１に記載のアミノ酸配列におけるＸ番
目のアミノ酸に相当するアミノ酸残基」とは、当該特定のアミノ酸配列におけるアミノ酸
残基であって、当該特定のアミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列とのアライメント（
ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）において配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＸ番目のアミノ酸
と同一の位置に配列されるアミノ酸残基を意味する。例えば、Ｌｙｓ７Ｇｌｎのアミノ酸
置換の場合、特定のアミノ酸配列における「配列番号１の７番目のリジンに相当するアミ
ノ酸残基」とは、当該特定のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基であって、当該特定のア
ミノ酸配列と配列番号１のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて配列番号１に示すア
ミノ酸配列における７番目のリジンと同一の位置に配列されるアミノ酸残基を意味する。
なお、配列番号１に記載のアミノ酸配列における「配列番号１に記載のアミノ酸配列にお
けるＸ番目のアミノ酸に相当するアミノ酸残基」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列
におけるＸ番目のアミノ酸そのものを意味する。すなわち、上記例示したアミノ酸置換（
すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意で他のアミノ酸置換）の位置は、
必ずしも本発明のタンパク質における絶対的な位置を示すものではなく、配列番号１に記
載のアミノ酸配列に基づく相対的な位置を示すものである。すなわち、例えば、本発明の
タンパク質が、上記例示したアミノ酸置換の位置よりもＮ末端側にアミノ酸残基の挿入、
欠失、または付加を含む場合、それに応じて当該アミノ酸置換の絶対的な位置は変動し得
る。本発明のタンパク質における上記例示したアミノ酸置換の位置は、例えば、前記ドメ
インのアミノ酸配列と配列番号１に記載のアミノ酸配列とのアラインメントで特定できる
。アラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等のアラインメントプログラムを
利用して実施できる。配列番号１に記載のアミノ酸配列のバリアント配列等の任意のアミ
ノ酸配列における上記例示したアミノ酸置換の位置についても同様である。また、上記例
示したアミノ酸置換（すなわち前記特定位置におけるアミノ酸置換および任意でＧｌｕ４
９ＡｓｐやＰｒｏ６Ｓｅｒなど他のアミノ酸置換）の置換前のアミノ酸残基は、配列番号
１に記載のアミノ酸配列における置換前のアミノ酸残基の種類を示すものであって、配列
番号１に記載のアミノ酸配列以外の非改変型アミノ酸配列においては保存されていてもよ
く、保存されていなくてもよい。

本発明のタンパク質は、改変型アミノ酸配列を１個のみ含んでいてもよく、改変型アミ
ノ酸配列を複数個含んでいてもよい。本発明のタンパク質は、例えば、改変型アミノ酸配
列を２個以上、３個以上、４個以上、または５個以上含んでいてもよく、１０個以下、７
個以下、５個以下、４個以下、３個以下、または２個以下含んでいてもよく、それらの矛
盾しない組み合わせの個数含んでいてもよい。本発明のタンパク質が複数個の改変型アミ
ノ酸配列を含む場合、それら複数個の改変型アミノ酸配列のアミノ酸配列は同一であって
もよく、そうでなくてもよい。それら複数個の改変型アミノ酸配列は、直接連結（直結）
させた態様であってもよいし、適切なリンカー（例えば、５以上２５以下のアミノ酸残基
からなるオリゴペプチド）を介して連結させた態様であってもよい。

本発明のタンパク質は、改変型アミノ酸配列からなるものであってもよく、他のアミノ
酸配列をさらに含んでいてもよい。すなわち、本発明のタンパク質は、例えば、そのＮ末
端側またはＣ末端側に他のアミノ酸配列をさらに含んでいてもよい。言い換えると、本発
明のタンパク質においては、例えば、改変型アミノ酸配列のＮ末端側またはＣ末端側に、
他のアミノ酸配列が付加されていてもよい。他のアミノ酸配列としては、オリゴペプチド
があげられる。他のアミノ酸配列として用いられるオリゴペプチドとしては、前記リンカ
ー以外のオリゴペプチドがあげられる。他のアミノ酸配列は、本発明のタンパク質の免疫
グロブリン結合活性や安定性を損なわない限り、特に制限されない。例えば、他のアミノ
酸配列の種類や長さは、本発明のタンパク質の免疫グロブリン結合性や安定性を損なわな
い限り、特に制限されない。

本発明のタンパク質は、例えば、選択した免疫グロブリン結合ドメインに加えて、他の
免疫グロブリン結合ドメインの一部を含んでいてもよい。例えば、本発明のタンパク質が
ＦｐＬのドメインＣ３の改変型アミノ酸配列を含む場合、本発明のタンパク質は、さらに
、ＦｐＬのドメインＣ３のＮ末端側領域（ドメインＣ１、ドメインＣ２）の一部を含んで
いてもよく、ＦｐＬのドメインＣ３のＣ末端側領域（ドメインＣ４）の一部を含んでいて
もよい。

本発明のタンパク質は、例えば、そのＮ末端側またはＣ末端側に、目的物を特異的に検
出または分離する目的で有用なオリゴペプチドを含んでいてもよい。そのようなオリゴペ
プチドとしては、ポリヒスチジンやポリアルギニンが挙げられる。また本発明のタンパク
質は、例えば、そのＮ末端側またはＣ末端側に、本発明のタンパク質をクロマトグラフィ
ー用の支持体等の固相に固定化する際に有用なオリゴペプチドを含んでいてもよい。その
ようなオリゴペプチドとしては、リジンやシステインを含むオリゴペプチドが挙げられる
。

本発明のタンパク質が上記のような他のアミノ酸配列を含む場合、本発明のタンパク質
は、例えば、あらかじめ他のアミノ酸配列を含む形態で製造されてもよいし、別途製造さ
れた上記のような他のアミノ酸配列が付加されてもよい。本発明のタンパク質が上記のよ
うな他のアミノ酸配列を含む場合、典型的には、本発明のタンパク質は、上記のような他
のアミノ酸配列を含む本発明のタンパク質の全長アミノ酸配列をコードするポリヌクレオ
チドから発現させることで製造できる。すなわち、例えば、他のアミノ酸配列をコードす
るポリヌクレオチドと本発明のタンパク質（例えば他のアミノ酸配列を含まないもの）を
コードするポリヌクレオチドとを、他のアミノ酸配列が本発明のタンパク質のＮ末端側ま
たはＣ末端側に付加されるように連結し、本発明のタンパク質を発現させてもよい。また
例えば、化学的に合成した他のアミノ酸配列を本発明のタンパク質（例えば他のアミノ酸
配列を含まないもの）のＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させてもよい。

本発明のタンパク質は、例えば、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドか
ら発現させることで製造できる。本明細書では、本発明のタンパク質をコードするポリヌ
クレオチドを、「本発明のポリヌクレオチド」ともいう。本発明のポリヌクレオチドは、
具体的には、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
であってよい。

本発明のポリヌクレオチドは、例えば、化学合成法やＰＣＲ法等によるＤＮＡ増幅法で
取得できる。ＤＮＡ増幅法は、例えば、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配
列といった、増幅すべきヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを鋳型とし実施できる
。鋳型とするポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質を発現する生物のゲノムＤＮＡ、
本発明のタンパク質のｃＤＮＡ、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが例示できる
。

本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、例えば、本発明のタンパク質のアミ
ノ酸配列からの変換で設計できる。アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際には
、標準のコドンテーブルを使用できるが、本発明のポリヌクレオチドで形質転換する宿主
におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主がＥｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（大腸菌）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／Ａ
ＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）で
はＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それ
ぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避ける
ように変換してよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮ
Ａ研究所のウェブサイトにあるＣｏｄｏｎＵｓａｇｅＤａｔａｂａｓｅなど）を利用
することでも可能である。

本発明のポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドの全長を一括取得してもよく、当
該ポリヌクレオチドの部分配列からなるポリヌクレオチドを取得後連結することで取得し
てもよい。上記のような本発明のポリヌクレオチドを取得する手法についての説明は、そ
の全長配列を一括して取得する場合に限られず、その部分配列を取得する場合にも準用で
きる。

なお、本発明のポリヌクレオチドは、任意のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする
ポリヌクレオチドと連結し、融合型アミノ酸配列をコードするように設計してもよい。

本発明のタンパク質は、例えば、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え宿主（
以下、単に「本発明遺伝子組換え宿主」ともいう）を培養し前記タンパク質を発現させた
後、発現した前記タンパク質を回収することで製造できる。本発明の遺伝子組換え宿主は
、例えば、本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換することで得られる。宿主
は、本発明のポリヌクレオチドで形質転換されることで本発明のタンパク質を発現可能な
ものであれば特に制限されない。宿主の例として、動物細胞、昆虫細胞、微生物が挙げら
れる。このうち動物細胞としては、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ（ＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔｅ
ｒＯｖａｒｙ）細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ２９３細胞が、昆虫細
胞としては、Ｓｆ９細胞、ＢＴＩ－ＴＮ－５Ｂ１－４細胞が、微生物としては、酵母や細
菌が、それぞれ例示できる。さらに酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ等のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母、ＰｉｃｈｉａＰａｓｔｏｒｉ
ｓ等のＰｉｃｈｉａ属酵母、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ等の
Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属酵母が、細菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）等のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属細菌が挙げられる。大腸菌とし
ては、ＪＭ１０９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株が挙げられる。なお、酵母や大腸菌を宿主と
して用いると生産性の面で好ましく、大腸菌を宿主として用いるとさらに好ましい。

本発明の遺伝子組換え宿主において、本発明のポリヌクレオチドは、発現可能に保持さ
れていればよい。具体的には、本発明のポリヌクレオチドは、前記宿主で機能するプロモ
ーターの制御下で発現するように保持されていればよい。前記宿主が大腸菌の場合、宿主
で機能するプロモーターの一例として、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒ
ｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｌｐ
ｐプロモーターが挙げられる。

また本発明の遺伝子組換え宿主において、本発明のポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ
外で自律複製するベクター上に存在していてよい。すなわち、本発明のポリヌクレオチド
を含む発現ベクター（以下、単に「本発明の発現ベクター」ともいう）で宿主を形質転換
して本発明の遺伝子組換え宿主を作製してもよい。本発明の発現ベクターは、例えば、発
現ベクターの適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入して得られる。なお、発現ベ
クターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限されない
。前記宿主が大腸菌の場合、発現ベクターとしては、ｐＥＴプラスミドベクター、ｐＵＣ
プラスミドベクター、ｐＴｒｃプラスミドベクターが例示できる。なお、本発明の発現ベ
クターは、抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカーを備えていてよい。また、前記適切な位
置とは、発現ベクターの複製機能、選択マーカー、伝達性に関わる領域を破壊しない位置
を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要
なプロモーター等の機能性ポリヌクレオチドに連結された状態で挿入すると好ましい。

また本発明の遺伝子組換え宿主において、本発明のポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ
上に導入されてもよい。ゲノムＤＮＡへの本発明のポリヌクレオチドの導入は、例えば、
相同組み換えによる遺伝子導入法を利用して実施できる。相同組み換えによる遺伝子導入
法としては、Ｒｅｄ－ｄｒｉｖｅｎｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ法（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ
．Ａ，ａｎｄＷａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ．，９７：６６４０－６６４５（２０００））等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感
受性複製起点を含むベクターを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないベクタ
ーを用いる方法、ファージを用いたｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ法が例示できる。

本発明の発現ベクター等のポリヌクレオチドを用いた宿主の形質転換は、例えば、当業
者が通常用いる方法で実施できる。例えば、宿主として大腸菌を選択した場合は、コンピ
テントセル法、ヒートショック法、エレクトロポレーション法等で形質転換すればよい。
形質転換後に適切な方法で本発明のポリヌクレオチドを含む宿主をスクリーニングするこ
とで、本発明の遺伝子組換え宿主を取得できる。

なお、各種微生物において利用可能な発現ベクターやプロモーター等の遺伝子工学的手
法に関する情報は、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学、共立出版、１９８７年」
などの公知文献を利用し、取得すればよい。

本発明の遺伝子組換え宿主が本発明の発現ベクターを含む場合、本発明の遺伝子組換え
宿主から本発明の発現ベクターを調製できる。例えば、本発明の遺伝子組換え宿主を培養
して得られる培養物からアルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒ
ｅｐｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）等の市販の抽出キットを用いて本発明の発現ベクター
を調製できる。

本発明の遺伝子組換え宿主を培養することで、本発明のタンパク質を発現できる。また
、本発明の遺伝子組換え宿主を培養することで、本発明のタンパク質を発現させ、発現し
た前記タンパク質を回収することで、本発明のタンパク質を製造できる。すなわち、本明
細書は、本発明の遺伝子組換え宿主を培養することで本発明のタンパク質を発現させる工
程と、発現された前記タンパク質を回収する工程とを含む、本発明のタンパク質の製造方
法を開示する。培地組成や培養条件は、宿主の種類や本発明のタンパク質の特性等の諸条
件に応じて適宜設定すればよい。培地組成や培養条件は、例えば、宿主が増殖でき、かつ
、本発明のタンパク質を発現可能な条件に設定すればよい。培地は、例えば、炭素源、窒
素源、無機塩、その他の各種有機成分や無機成分を適宜含む培地を使用できる。具体的に
は、宿主が大腸菌の場合、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）培
地（トリプトン１％（ｗ／ｖ）、酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）ＮａＣ
ｌ）が好ましい培地の一例として挙げられる。なお、本発明の発現ベクターの導入の有無
により、本発明の遺伝子組換え宿主を選択的に増殖させるために、培地に当該発現ベクタ
ーに含まれる抗生物質耐性遺伝子に対応した抗生物質を添加して培養すると好ましい。例
えば、当該発現ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は培地にカナマイシ
ンを添加すればよい。本発明のポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ上に導入されている場合
も同様である。また、培地は、グルタチオン、システイン、シスタチン、チオグリコレー
トおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでいて
もよい。また培地は、グリシン等の前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促す
試薬を含んでいてもよい。例えば、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（
ｗ／ｖ）以下で添加すると好ましい。培養温度は、例えば、宿主が大腸菌の場合、一般に
１０℃以上４０℃以下、好ましくは２０℃以上３７℃以下、より好ましくは２５℃前後で
ある。培地のｐＨは、例えば、宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８以上ｐＨ７．４以下、好
ましくはｐＨ７．０前後である。また、本発明のタンパク質を誘導性のプロモーターの制
御下で発現する場合は、本発明のタンパク質が良好に発現できるように誘導をかけると好
ましい。発現誘導には、例えば、プロモーターの種類に応じた誘導剤を用いることができ
る。誘導剤としては、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏ
ｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を例示できる。宿主が大腸菌の場合、例えば、培養液の濁度（６
００ｎｍにおける吸光度）が約０．５から１．０となったときに適当量のＩＰＴＧを添加
し、引き続き培養することで、本発明のタンパク質の発現を誘導できる。ＩＰＴＧの添加
濃度は、例えば、０．００５ｍＭ以上１．０ｍＭ以下、好ましくは０．０１ｍＭ以上０．
５ｍＭ以下である。ＩＰＴＧ誘導等の発現誘導は、例えば、当該技術分野において周知の
条件で行なえる。

本発明のタンパク質は、その発現形態に適した方法で培養物から分離し回収すればよい
。なお、本明細書において「培養物」とは、培養で得られた培養液の全体またはその一部
を意味する。当該一部は、本発明のタンパク質を含む部分であれば特に制限されない。当
該一部としては、培養された本発明の形質転換体の細胞や培養後の培地（すなわち培養上
清）などが挙げられる。例えば、本発明のタンパク質が培養上清に蓄積する場合、細胞を
遠心分離操作で分離し、得られる培養上清から本発明のタンパク質を回収すればよい。ま
た、本発明のタンパク質が細胞内（ペリプラズムを含む）に蓄積する場合、細胞を遠心分
離操作で回収後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加して細胞を破砕し、当該破砕物から本
発明のタンパク質を回収すればよい。前述した培養上清や細胞破砕物からの、本発明のタ
ンパク質の回収は、例えば、タンパク質の分離精製に用いられる公知の方法で実施できる
。前記回収方法の一例として、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点
沈殿が挙げられる。

本発明のタンパク質は、例えば、免疫グロブリン（抗体）の分離または分析に使用でき
る。前記目的で使用する際は、例えば、不溶性担体と当該不溶性担体に固定化した本発明
のタンパク質とを含む免疫グロブリン吸着剤（以下、単に「本発明の免疫グロブリン吸着
剤」ともいう）の態様で使用できる。なお、本明細書において、「免疫グロブリンの分離
」とは、夾雑物質共存下の溶液からの免疫グロブリンの分離に限らず、構造、性質、また
は活性等に基づく免疫グロブリン間の分離も含む。不溶性担体は、水溶液に対して不溶性
の担体であれば特に制限されない。不溶性担体としては、アガロース、アルギネート（ア
ルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプ
ン等の多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２
－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタン等の合成高分子を原料とした担体や
、シリカ等のセラミックスを原料とした担体が例示できる。中でも、多糖質を原料とした
担体や合成高分子を原料とした担体が不溶性担体として好ましい。前記好ましい担体の一
例として、トヨパール（東ソー社製）等のヒドロキシ基を導入したポリメタクリレートゲ
ル、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｃｙｔｉｖａ社製）等のアガロースゲル、セルファイン（ＪＮ
Ｃ社製）等のセルロースゲルが挙げられる。不溶性担体の形状は特に制限されない。不溶
性担体は、例えば、カラムに充填できる形状であってよい。不溶性担体は、例えば、粒状
物または非粒状物であってよい。また、不溶性担体は、例えば、多孔性または非多孔性で
あってもよい。

本発明における分離または分析対象の免疫グロブリン（抗体）は、本発明のタンパク質
が結合性を有するものであれば、特に制限されない。免疫グロブリンは、具体的には、κ
軽鎖を有するものであってよい。免疫グロブリンは、κ軽鎖に加えて、Ｆｃ領域等の他の
領域を含んでいてもよく、いなくてもよい。免疫グロブリンは、例えば、シングルチェー
ンＦｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、ＩｇＡ、二重特異性Ｔ細胞誘導（ＢｉＴ
Ｅ）抗体等の、Ｆｃ領域を有しないものであってもよい。免疫グロブリンは、モノクロー
ナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であってもよい。免疫グロブリンは、例え
ば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥのいずれであってもよい。ＩｇＧは
、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４のいずれであってもよい。免
疫グロブリンの由来は、特に制限されない。免疫グロブリンは、単一の生物に由来するも
のであってもよく、２種またはそれ以上の生物の組み合わせに由来するものであってもよ
い。免疫グロブリンとしては、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、それらのバリアント
（例えばアミノ酸置換体）があげられる。また、免疫グロブリンとしては、二重特異性抗
体（バイスペシフィック抗体）、κ軽鎖と他のタンパク質との融合抗体、κ軽鎖と薬物と
の複合体（ＡＤＣ）等の人工的に構造改変した抗体もあげられる。なお、「免疫グロブリ
ン」には、抗体医薬も包含される。

本発明のタンパク質は、例えば、共有結合により不溶性担体に固定化してもよい。具体
例として、不溶性担体が有する活性基を介して、本発明のタンパク質と不溶性担体とを共
有結合させることで、不溶性担体に前記タンパク質を固定化できる。すなわち、前記不溶
性担体は、その表面などに活性基を有していてよい。前記活性基の一例として、Ｎ－ヒド
ロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化エステル基、エポキシ基、カルボキシ基、マレイ
ミド基、ハロアセチル基、トレシル基、ホルミル基、ハロアセトアミドが挙げられる。活
性基を有する不溶性担体としては、例えば、活性基を有する市販の不溶性担体をそのまま
用いてもよいし、不溶性担体に活性基を導入して用いてもよい。活性基を有する市販の担
体としては、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＡＦ－Ｅｐｏｘｙ－６５０Ｍ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ
ＡＦ－Ｔｒｅｓｙｌ－６５０Ｍ（いずれも東ソー社製）、ＨｉＴｒａｐＮＨＳ－ａｃｔ
ｉｖａｔｅｄＨＰＣｏｌｕｍｎｓ、ＮＨＳ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓ
ｅ４ＦａｓｔＦｌｏｗ、Ｅｐｏｘｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅ
６Ｂ（いずれもＣｙｔｉｖａ社製）、ＳｕｌｆｏＬｉｎｋＣｏｕｐｌｉｎｇＲｅｓｉ
ｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）が例示できる。

担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するヒドロキシ基、エポキ
シ基、カルボキシ基、アミノ基等に対して２個以上の活性部位を有する化合物の一方を反
応させる方法が例示できる。

担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にエポキシ基を導入する化合物としては、
エピクロロヒドリン、エタンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジ
ルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテルを例示できる。

また、担体表面に存在するエポキシ基にカルボキシ基を導入する化合物としては、２－
メルカプト酢酸、３－メルカプトプロピオン酸、４－メルカプト酪酸、６－メルカプト酪
酸、グリシン、３－アミノプロピオン酸、４－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸を例示
できる。

また、担体表面に存在するヒドロキシ基、エポキシ基、カルボキシ基、アミノ基にマレ
イミド基を導入する化合物としては、Ｎ－（ε－マレイミドカプロン酸）ヒドラジド、Ｎ
－（ε－マレイミドプロピオン酸）ヒドラジド、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酢
酸ヒドラジド、２－アミノマレイミド、３－アミノマレイミド、４－アミノマレイミド、
６－アミノマレイミド、１－（４－アミノフェニル）マレイミド、１－（３－アミノフェ
ニル）マレイミド、４－（マレイミド）フェニルイソシアナート、２－マレイミド酢酸、
３－マレイミドプロピオン酸、４－マレイミド酪酸、６－マレイミドヘキサン酸、Ｎ－（
α－マレイミドアセトキシ）スクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ
－ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シ
クロヘキサン－１－カルボニル－（６－アミノヘキサン酸）、スクシンイミジル－４－（
マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸、（ｐ－マレイミドベンゾイル）Ｎ
－ヒドロキシスクシンイミドエステル、（ｍ－マレイミドベンゾイル）Ｎ－ヒドロキシス
クシンイミドエステルを例示できる。

また、担体表面に存在するヒドロキシ基やアミノ基にハロアセチル基を導入する化合物
としては、クロロ酢酸、ブロモ酢酸、ヨード酢酸、クロロ酢酸クロリド、ブロモ酢酸クロ
リド、ブロモ酢酸ブロミド、クロロ酢酸無水物、ブロモ酢酸無水物、ヨード酢酸無水物、
２－（ヨードアセトアミド）酢酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、３－（ブロ
モアセトアミド）プロピオン酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、４－（ヨード
アセチル）アミノ安息香酸－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルを例示できる。

また、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するヒドロキシ基や
アミノ基にω－アルケニルアルカングリシジルエーテルを反応させた後、ハロゲン化剤で
ω－アルケニル部位をハロゲン化することで活性化する方法も例示できる。ω－アルケニ
ルアルカングリシジルエーテルとしては、アリルグリシジルエーテル、３－ブテニルグリ
シジルエーテル、４－ペンテニルグリシジルエーテルを例示できる。ハロゲン化剤として
は、Ｎ－クロロスクシンイミド、Ｎ－ブロモスクシンイミド、Ｎ－ヨードスクシンイミド
を例示できる。

また、担体表面に活性基を導入する方法としては、担体表面に存在するカルボキシ基に
対して縮合剤と添加剤を用いて活性基を導入する方法も例示できる。縮合剤としては、１
－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ジシクロヘ
キシルカルボジアミド、カルボニルジイミダゾールを例示できる。添加剤としては、Ｎ－
ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、４－ニトロフェノール、１－ヒドロキシベンズト
リアゾールを例示できる。

本発明のタンパク質の不溶性担体への固定化は、例えば、緩衝液中で実施できる。緩衝
液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、ＭＥＳ（２－Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎ
ｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４－（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈ
ｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ）緩衝液、
トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液を例示できる。固定化させるときの反応温度は、例えば、活
性基の反応性や本発明のタンパク質の安定性等の諸条件に応じて適宜設定できる。固定化
させるときの反応温度は、例えば、５℃以上５０℃以下であってよく、好ましくは１０℃
以上３５℃以下である。

本発明の免疫グロブリン吸着剤は、例えば、前記吸着剤を充填したカラムの態様にする
ことで、免疫グロブリン（抗体）の分離に使用できる。例えば、本発明の免疫グロブリン
吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加して当該免疫グロブリンを前
記吸着剤に吸着させ、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させることで、免疫グ
ロブリンを分離できる。すなわち、本明細書は、本発明の免疫グロブリン吸着剤を充填し
たカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加して当該免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着
させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させる工程とを含む、前記溶
液中に含まれる免疫グロブリンの分離方法を開示する。免疫グロブリンを含む溶液は、例
えば、ポンプ等の送液手段を用いてカラムに添加できる。なお、免疫グロブリンを含む溶
液は、カラムに添加する前に予め適切な緩衝液を用いて溶媒置換してよい。また、免疫グ
ロブリンを含む溶液をカラムに添加する前に、適切な緩衝液を用いてカラムを平衡化して
よい。カラムの平衡化により、例えば、免疫グロブリンをより高純度に分離できると期待
される。溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＥＳ
緩衝液が例示できる。そのような緩衝液には、例えば、さらに、１ｍＭ以上１０００ｍＭ
以下の塩化ナトリウム等の無機塩を添加してもよい。溶媒置換に用いる緩衝液と平衡化に
用いる緩衝液は、同一であってもよく、同一でなくてもよい。また、免疫グロブリンを含
む溶液のカラムへの通液後に夾雑物質等の免疫グロブリン以外の成分がカラムに残存して
いる場合、免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出する前に、そのような
成分をカラムから除去してよい。免疫グロブリン以外の成分は、例えば、適切な緩衝液を
用いてカラムから除去できる。免疫グロブリン以外の成分の除去に用いる緩衝液について
は、例えば、溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液についての記載を準用できる。

免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンは、例えば、免疫グロブリンとリガン
ド（本発明のタンパク質）との相互作用を弱めることで溶出できる。免疫グロブリンとリ
ガンド（本発明のタンパク質）との相互作用を弱める手段としては、ｐＨ変化、カウンタ
ーペプチドの添加、温度上昇、塩濃度変化が例示できる。免疫グロブリンとリガンド（本
発明のタンパク質）との相互作用を弱める手段としては、特に、ｐＨ変化が例示できる。
すなわち、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリンを溶出させる工程としては、特に、前記
吸着剤に吸着した免疫グロブリンをｐＨ変化で溶出させる工程が例示できる。ｐＨ変化と
しては、ｐＨの低下が例示できる。ｐＨの低下としては、緩衝液によるｐＨの低下が例示
できる。免疫グロブリン吸着剤に吸着した免疫グロブリンは、具体的には、例えば、適切
な溶出液を用いて溶出できる。溶出液としては、溶媒置換や平衡化に用いる緩衝液よりも
酸性側の緩衝液が挙げられる。前記酸性側の緩衝液としては、クエン酸緩衝液、グリシン
塩酸緩衝液、酢酸緩衝液を例示できる。すなわち、前記酸性側の緩衝液を利用することで
、ｐＨを低下させることができる。溶出液のｐＨは、例えば、免疫グロブリンの機能（抗
原への結合性等）を損なわない範囲で設定できる。なお、免疫グロブリン吸着剤に吸着し
た免疫グロブリンの溶出を緩衝液によるｐＨの低下で行なう場合、リガンドとして本発明
のタンパク質を用いると、天然型ＦｐＬの免疫グロブリン結合ドメインなど非改変型アミ
ノ酸配列からなる免疫グロブリン結合性タンパク質をリガンドとして用いた場合と比較し
、よりｐＨの高い（中性に近い）条件で免疫グロブリンを溶出できる。すなわち、本発明
の免疫グロブリン吸着剤によれば、非改変型アミノ酸配列からなる免疫グロブリン結合性
タンパク質をリガンドとした免疫グロブリン吸着剤と比較し、より温和なｐＨ条件（すな
わち中性に近い条件）で免疫グロブリン（抗体）を溶出できる。溶出液のｐＨは、例えば
、２．５以上、２．６以上、２．７以上、２．８以上、２．９以上、２．９５以上、３以
上、３．０５以上、３．１以上、３．１５以上、または３．２以上であってもよく、４以
下、３．５以下、３．３以下、３．２以下、３．１以下、または３以下であってもよく、
それらの矛盾しない組み合わせであってもよい。溶出液のｐＨは、具体的には、例えば、
２．５以上４以下、２．８以上４以下、２．９５以上４以下、３以上４以下、または３．
０５以上４以下であってもよい。

前述した方法で免疫グロブリン（抗体）を分離することで、分離された免疫グロブリン
が得られる。すなわち、免疫グロブリンの分離方法は、その一態様において、免疫グロブ
リンの製造方法であってよく、具体的には、分離された免疫グロブリンの製造方法であっ
てよい。免疫グロブリンは、例えば、免疫グロブリンを含有する溶出画分として得られる
。すなわち、溶出された免疫グロブリンを含む画分を分取できる。画分の分取は、例えば
、常法により行なえばよい。画分を分取する方法としては、一定の時間ごとや、一定の容
量ごとに回収容器を交換する方法や、溶出液のクロマトグラムの形状に合わせて回収容器
を換える方法や、オートサンプラー等の自動フラクションコレクター等で画分を分取する
方法が挙げられる。さらに、免疫グロブリンを含む画分から免疫グロブリンを回収するこ
ともできる。免疫グロブリンを含む画分からの免疫グロブリンの回収は、例えば、タンパ
ク質の分離精製に用いられる公知の方法により行なえばよい。

以下、実施例および比較例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれ
ら例に限定されるものではない。なお、参考例は本発明を構成しない。

比較例１天然型ＰｒｏｔｅｉｎＬ免疫グロブリン結合性ドメインＣ３（ＦｐＬ＿Ｃ
３）の調製
（１）ＦｐＬ＿Ｃ３発現ベクターの作製
（１－１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＦｉｎｅｇｏｌｄｉａ属菌（Ｆｉ
ｎｅｇｏｌｄｉａｍａｇｎａ）由来のＰｒｏｔｅｉｎＬ（以下、ＦｐＬ）の免疫グロ
ブリン結合ドメインＣ３（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＡＡＡ６７５０３（配列番号３９）の
３９４番目から４６３番目までのアミノ酸残基、以下「ＦｐＬ＿Ｃ３」とも表記）のアミ
ノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（配列番号２）を合成した。なお、合成する際、
５’末端側には制限酵素ＮｃｏＩの認識配列（５’－ＣＣＡＴＧＧ－３’）を、３’末端
側にはヒスチジン６残基をコードするヌクレオチド配列（５’－ＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡ
ＴＣＡＣＣＡＣ－３’；配列番号４０）、終止コドンおよび制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認
識配列（５’－ＡＡＧＣＴＴ－３’）を、それぞれ付加している。

（１－２）合成により得た配列番号２を含むポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩで処理後、アガロースゲル電気泳動により目的物のサイズのバンドを確
認した。目的バンドを切り出したのち、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏ
ｎｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）によりポリヌクレオチドを精製した。

（１－３）（１－２）で得たポリヌクレオチドと、予め制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩ
ＩＩで消化したプラスミドｐＥＴ－２６ｂをＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ（タカラ
バイオ社製）を用いてライゲーションを行なった。当該ライゲーション産物を用いて大腸
菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ（Ｌｕ
ｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）プレート培地で培養（３７℃、１６時間）した。

（１－４）（１－３）で取得した形質転換体（遺伝子組換え大腸菌）を選択し、５０μ
ｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎ
ｉｐｒｅｐｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）による精製で、配列番号１に記載のＦｐＬ＿Ｃ
３を発現可能なベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３と命名）を取得した。

（１－５）（１－４）で取得した発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３のうち、ＦｐＬ＿
Ｃ３をコードするポリヌクレオチドおよびその周辺領域について、チェーンターミネータ
法に基づくＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ｒｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社
製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩＰ
ｒｉｓｍ３７００ＤＮＡａｎａｌｙｚｅｒ（サーモフィッシャーサイエンティフィ
ック社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお、当該解析の際、配列番号３（５’－
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ－３’）または配列番号４（５’－ＴＡＴＧ
ＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ－３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをシ
ークエンス用プライマーとして使用した。

配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３に、ＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）
をコードするポリヌクレオチド（配列番号２）が挿入されていることを確認した。

（２）ＦｐＬ＿Ｃ３の調製
（２－１）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地（トリプトン１．
６％（ｗ／ｖ）、酵母エキス１％（ｗ／ｖ）、塩化ナトリウム０．５％（ｗ／ｖ））
２ｍＬに、（１）で作製したｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３を含む遺伝子組換え大腸菌を接種し、
前培養した（３０℃、１６時間）。

（２－２）前培養後の培養液２００μＬを、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２×
ＹＴ液体培地２０ｍＬに接種し、３７℃で１．５時間から２時間培養後、０．０５ＭのＩ
ＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）
を４μＬ加えて、さらに２０℃で終夜振とう培養した。

（２－３）培養終了後、遠心分離により培養菌体を回収し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒＰｒ
ｏｔｅｉｎＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（メルクミリポア社製）を用いてタ
ンパク質抽出液を調製した。前記抽出液は遠心分離し、得られた上清をフィルターに通し
、清澄化した。

（２－４）あらかじめ０．５ＭのＮａＣｌと０．０２Ｍイミダゾールとを含む０．０５
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）（以下、洗浄緩衝液と表記）で平衡化したＮｉ－ＮＴＡ
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ（Ｃｙｔｉｖａ社製）を充填したカラムに
、（２－３）で清澄化した上清を添加し、前記カラムに充填した担体の１０倍量の洗浄緩
衝液で洗浄後、０．５ＭのＮａＣｌと０．５Ｍイミダゾールとを含む０．０５Ｍトリス緩
衝液（ｐＨ７．５）を通液することで、ＦｐＬ＿Ｃ３に相当する画分を回収した。

（２－５）回収した画分の吸光度を分光光度計で測定し、当該画分に含まれるＦｐＬ＿
Ｃ３を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動）も実施
し、ＦｐＬ＿Ｃ３が純度よく精製されていることを確認した。

実施例１ＰｒｏｔｅｉｎＬ免疫グロブリン結合性ドメインＣ４（ＦｐＬ＿Ｃ４）ア
ミノ酸置換体の作製
（１）ＦｐＬ＿Ｃ４リジン置換体の調製
（１－１）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるＦｐＬの免疫グロブリン結合ドメ
インＣ４（ＧｅｎＢａｎｋＮｏ．ＡＡＡ６７５０３（配列番号３９）の４６８番目から
５３７番目までのアミノ酸残基、以下「ＦｐＬ＿Ｃ４」とも表記）が有する全てのリジン
残基（具体的には配列番号５の７番目、１３番目、２２番目、２９番目、４８番目および
６７番目のリジン残基）をアルギニン残基に置換した免疫グロブリン結合性タンパク質（
配列番号６、以下「ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲ」とも表記）をコードするポリヌクレオチド（配列
番号７）を合成した。なお、合成する際、５’末端側に制限酵素ＮｃｏＩの認識配列（５
’－ＣＣＡＴＧＧ－３’）を、３’末端側にヒスチジン６残基をコードするヌクレオチド
配列（配列番号４０）、終止コドンおよび制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列（５’－Ａ
ＡＧＣＴＴ－３’）を、それぞれ付加している。

（１－２）比較例１（１－２）と同様の方法で、（１－１）で合成したポリヌクレオチ
ドを精製した。

（１－３）比較例１（１－３）と同様の方法で、（１－２）で得たポリヌクレオチドと
予め制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＥＴ－２６ｂとをライゲ
ーション後、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し
、培養した。

（１－４）（１－３）で取得した形質転換体を、比較例１（１－４）と同様の方法で培
養およびプラスミド精製を行ない、発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲと命名）を
取得後、当該発現ベクターのヌクレオチド配列の解析を、比較例１（１－５）と同様の方
法で行なった。

配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲに、ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲ（配列
番号６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号７）が挿入されていることを確認した
。

（１－５）ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲを含む形質転換体から、比較例１（２）と同様の
方法で、精製されたＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲを調製した。

（２）ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲへの変異導入およびライブラリ作製
（２－１）（１）で取得したｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲを鋳型として、７番目、１３番
目、２２番目および２９番目のアミノ酸残基に対する飽和置換体ライブラリを作製した。
プライマーは、２２ｃ－Ｔｒｉｃｋ法（ＳａｂｒｉｎａＫｉｌｌｅ他，ＡＣＳＳｙｎ
ｔｈｅｔｉｃＢｉｏｌｏｇｙ，２０１３，２，８３－９２）に倣い、変異導入箇所に適
切な混合塩基を配置し、変異導入箇所を中心としたインバースＰＣＲができるように設計
した（配列番号８から３１）。これらのプライマーを一箇所の置換につき６本一組として
、表１および表２の組成で混合し、ＰＣＲＰｒｉｍｅｒ混合液（Ｆｏｒｗａｒｄ／Ｒｅ
ｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒｍｉｘ）を調製した。

（２－２）実施例１で作製したｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲを鋳型としてインバースＰＣ
Ｒによる部位特異的変異導入を行なった。インバースＰＣＲは表３に示す組成の反応液を
調製後、当該反応液を９８℃で２分間熱処理し、９５℃で１０秒間の第１ステップ、５０
℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で６分の第３ステップを１サイクルとする反応を３０
サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。

（２－３）得られたＰＣＲ産物を精製後、当該精製物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３
）株を形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７
℃、１６時間）後、プレート上に形成したコロニーを飽和置換体ライブラリとした。

実施例２ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲアミノ酸置換体のスクリーニング
（１）実施例１（１）で作製したＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲを発現可能な形質転換体、および実
施例１（２）で作製した飽和置換体ライブラリー（形質転換体）を、５０μｇ／ｍＬのカ
ナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地２５０μＬに接種し、９６ディープウェルプレートを
用いて３７℃で終夜振とう培養した。

（２）培養後、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、０．３％（ｗ／ｖ）のグリシン、０．
０１ｍＭのＩＰＴＧを含む２×ＹＴ液体培地５００μＬに５μＬの培養液を植え継ぎ、９
６ディープウェルプレートを用いてさらに２０℃で終夜振とう培養した。

（３）培養後、遠心操作によって得られた培養上清と１．０ＭＮａＯＨとを等量混合
し、３８℃で１５分間アルカリ処理を行なった。

（４）アルカリ処理を行なった時の免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を
下記に示すＥＬＩＳＡ法にて測定し、（３）のアルカリ処理を行なった時の免疫グロブリ
ン結合性タンパク質の抗体結合活性を、（３）のアルカリ処理を行わなかった時の免疫グ
ロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出した。

（４－１）Ｔｒｉｓ－ＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）を用いて１０μｇ／
ｍＬに調製したヒト抗体（ガンマグロブリン製剤、化学及血清療法研究所製）を９６ウェ
ルマイクロプレートの各ウェルに分注し固定化した（４℃、１６時間）。固定化後、ＴＢ
Ｓを用いて２％（ｗ／ｖ）に調製したスキムミルク（ベクトン・ディッキンソン社製）を
用いてブロッキングした。

（４－２）洗浄緩衝液（０．１５ＭＮａＣｌ、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ
２０（商品名）を含む０．０５ＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．５））で９６ウェルマイク
ロプレートの各ウェルを洗浄後、抗体結合活性を評価する免疫グロブリン結合性タンパク
質を含む溶液を添加し、免疫グロブリン結合性タンパク質と固定化ガンマグロブリンとを
反応させた（３０℃、１時間）。

（４－３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、１００ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔ
ｉ－６－ＨｉｓＡｎｔｉｂｏｄｙ（ＢＥＴＨＹＬＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社製）を
１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し反応させた（３０℃、１時間）。

（４－４）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＳ
ｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。次に１Ｍリン酸を
５０μＬ／ｗｅｌｌ添加することで反応を停止し、マイクロプレートリーダー（テカン社
製）にて４５０ｎｍの吸光度を測定した。

（５）約５００株の形質転換体を評価し、その中からＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲ（配列番号６）
と比較してアルカリ安定性が向上した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転
換体を選択した。

（６）（５）で選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐ
ｒｅｐｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。

（７）得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードす
るポリヌクレオチド領域の配列を比較例１（１－５）に記載の方法によりヌクレオチド配
列を解析し、アミノ酸置換箇所を特定した。

（８）（５）で選択した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体を、比
較例１（２－１）から（２－２）と同様の方法で培養し、比較例１（２－３）と同様の方
法でタンパク質抽出液を調製し、清澄化した。

（９）（８）で清澄化したタンパク質抽出液を、比較例１（２－４）に記載の方法で精
製し、免疫グロブリン結合性タンパク質に相当する画分を回収した。

（１０）回収した画分の吸光度を分光光度計で測定し、当該画分に含まれる免疫グロブ
リン結合性タンパク質を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、選択した免疫グロブ
リン結合性タンパク質が純度よく精製されていることを確認した。

実施例３本発明のタンパク質の免疫グロブリン溶出ｐＨ評価
比較例１で作製したＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）、実施例１で作製したＦｐＬ＿Ｃ４Ｋ
Ｒ（配列番号６）または実施例２で取得したＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲアミノ酸置換体に結合した
免疫グロブリンを溶出可能なｐＨ（以下、単に「溶出ｐＨ」とも表記）を以下の方法で測
定した。

（１）免疫グロブリンを固定化した不溶性担体であるＩｇＧＳｅｐｈａｒｏｓｅ６
ＦａｓｔＦｌｏｗ（Ｃｙｔｉｖａ社製）の５０％（ｗ／ｖ）水スラリーを調製し、当
該スラリー０．５ｍＬをＴｒｉｃｏｒｎ５／５０カラム（内径５ｍｍ×長さ５０ｍｍ：
Ｃｙｔｉｖａ社製）に入れた後、ポンプで純水を送液することで、ＩｇＧＳｅｐｈａｒ
ｏｓｅ充填カラムを作製した。

（２）（１）で作製したＩｇＧＳｅｐｈａｒｏｓｅ充填カラムをＡＫＴＡＡＶＡＮ
Ｔ２５（Ｃｙｔｉｖａ社製）に設置した。前記カラムを０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ
６．５）（以下Ａ液）で平衡化し、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ２．２）（以下Ｂ液）
で洗浄後、Ａ液で再度平衡化した。

（３）Ａ液で１ｇ／Ｌに調製したＦｐＬ＿Ｃ３溶液１００μＬを、ＩｇＧＳｅｐｈａ
ｒｏｓｅ充填カラムにアプライし、Ａ液を５カラム体積分送液後、１０分間でＢ液が０％
から１００％となるリニアグラジエント溶出でＦｐＬ＿Ｃ３を溶出させた。得られたクロ
マトグラムを解析し、最も吸光度が高くなる溶出位置でのｐＨを溶出ｐＨとした。

結果を表４に示す。配列番号６に記載のアミノ酸配列において、少なくともＬｙｓ（Ａ
ｒｇ）７Ｇｌｎ（この表記は配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基（配列
番号５では７番目のリジン）が一旦アルギニンに置換後、さらにグルタミンに置換されて
いることを表す；以下、他のアミノ酸置換についても同様に解釈するものとする）、Ｌｙ
ｓ（Ａｒｇ）１３Ｖａｌ、Ｌｙｓ（Ａｒｇ）２２Ｔｈｒ、Ｌｙｓ（Ａｒｇ）２９Ｐｒｏ、
Ｌｙｓ（Ａｒｇ）２９ＶａｌおよびＬｙｓ（Ａｒｇ）２９Ｉｌｅより選択される１つ以上
のアミノ酸置換を有した免疫グロブリン結合性タンパク質は、天然型ＦｐＬ＿Ｃ３（配列
番号１）やＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲ（配列番号６）と比較し溶出ｐＨが増大している、すなわち
免疫グロブリン結合性タンパク質に結合した免疫グロブリン（抗体）をより温和なｐＨ条
件（すなわち中性に近い条件）で溶出できる、といえる。

参考例１
比較例１で作製した発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３のうち、免疫グロブリン結合性
タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分（配列番号２）にエラープローンＰＣＲに
よりランダムに変異を導入した。

（１）比較例１で作製したｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３を鋳型ＤＮＡとして用い、エラープロ
ーンＰＣＲを行なった。エラープローンＰＣＲは表５に示す組成の反応液を調製後、当該
反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、５０℃で３０秒間
の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイク
ル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。前記エラープローンＰＣＲ
によりＦｐＬ＿Ｃ３をコードするポリヌクレオチド（配列番号２）に良好に変異が導入さ
れ、その平均変異導入率は１．６％であった。

（２）得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あ
らかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴ－２６ｂにラ
イゲーションした。

（３）ライゲーション反応終了後、反応液を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質
転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６時
間）した後、プレート上に形成したコロニーをランダム変異体ライブラリとした。

参考例２
（１）参考例１で作製したランダム変異体ライブラリ（形質転換体）または比較例１で
作製したＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）を発現する形質転換体を、実施例２（１）から（２
）と同様な方法で培養後、遠心操作によって得られた培養上清に対し、実施例２（３）に
記載のアルカリ処理を行なった。

（２）アルカリ処理を行なった時の免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を
実施例２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定し、アルカリ処理を行なった時の免疫グロ
ブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行わなかった時の免疫グロブ
リン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出した。

（３）約１６００株の形質転換体を評価し、その中から天然型（アミノ酸置換がない）
ＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）と比較してアルカリ安定性が向上した免疫グロブリン結合性
タンパク質を発現する形質転換体を選択した。

（４）選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐ
ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。

（５）得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードす
るポリヌクレオチド領域の配列を、比較例１（１－５）に記載の方法によりヌクレオチド
配列を解析し、アミノ酸置換箇所を特定した。

（６）（５）で選択した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体を、そ
れぞれ５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ｍＬの２×ＹＴ液体培地に接種し、３７℃
で終夜、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。

（７）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２０ｍＬの２×ＹＴ液体培地に前培養
液を２００μＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。

（８）培養開始から２時間後、培養温度を２０℃に変更し、終濃度０．０１ｍＭとなる
ようＩＰＴＧを添加し、２０℃で終夜、好気的に振とう培養した。

（９）培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒＰｒｏｔｅｉｎＥ
ｘｔｒａｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（メルク社製）を用いてタンパク質抽出液を調製し
た。

（１０）（９）で調製したタンパク質抽出液中の免疫グロブリン結合性タンパク質の抗
体結合活性を、実施例２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。

（１１）各タンパク質の濃度が等しくなるよう、ＴＢＳを用いて希釈した。希釈液を二
等分し、一方には０．２ＭＮａＯＨ（アルカリ処理）を、もう一方にはＴＢＳ（アルカ
リ未処理）を、それぞれ等量添加し混合後、２５℃で５時間静置した。

（１２）１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．０）を４倍量加えた後、アルカリ処理（終濃度０
．１ＭＮａＯＨで２５℃、５時間処理）およびアルカリ未処理のタンパク質溶液の抗体
結合活性を、実施例２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法によって測定した。アルカリ処理した
免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ未処理の免疫グロブリン結
合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価
した。

結果を表６に示す。配列番号１に記載のアミノ酸配列において、少なくともＰｒｏ３Ｓ
ｅｒ（この表記は配列番号１の３番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換
されていることを表す、以下同様）、Ｇｌｕ５Ｖａｌ、Ｇｌｕ８Ｇｌｙ、Ｉｌｅ１７Ｐｈ
ｅ、Ｇｌｕ２７Ｇｌｙ、Ａｌａ４１Ｔｈｒ、Ａｓｎ４４Ｓｅｒ、Ｇｌｕ４９Ｖａｌ、Ａｓ
ｎ５０Ｓｅｒ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ａｓｎ５０Ｌｙｓ、Ａｓｎ５０Ａｓｐ、Ｇｌｕ５２Ｖ
ａｌ、Ｇｌｕ５２Ｇｌｙ、Ｔｈｒ５４Ｉｌｅ、Ａｓｎ６２ＴｙｒおよびＡｓｎ６５Ｔｙｒ
より選択される１以上のアミノ酸置換を有した免疫グロブリン結合性タンパク質は、天然
型ＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）と比較しアルカリ安定性が向上しているといえる。

中でもＡｓｎ５０ＴｙｒおよびＧｌｕ５２Ｇｌｙのアミノ酸置換を有した免疫グロブリ
ン結合性タンパク質（配列番号４７、ＦｐＬ＿Ｃ３２ａと命名）は、顕著なアルカリ安
定性向上を確認した（天然型ＦｐＬ＿Ｃ３：４０％、ＦｐＬ＿Ｃ３２ａ：９４％）。Ｇ
ｌｕ５２Ｇｌｙ単独のアミノ酸置換を有した免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号
５２）でのアルカリ安定性向上が顕著ではないことから（天然型ＦｐＬ＿Ｃ３：４０％、
配列番号５１：４８％）、顕著なアルカリ安定性の向上をもたらすアミノ酸置換はＡｓｎ
５０Ｔｙｒのほうであることが推測される。

参考例３
（１）実施例１で取得した、ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲを鋳型として、７番目および２
９番目のアミノ酸残基に対する飽和置換体ライブラリを作製した。プライマーは、実施例
１（２）と同様、２２ｃ－Ｔｒｉｃｋ法に倣い、変異導入箇所に適切な混合塩基を配置し
、変異導入箇所を中心としたインバースＰＣＲができるように設計した（配列番号５５か
ら６６）。これらのプライマーを一箇所の置換につき６本一組として、表１および表７の
組成で混合し、ＰＣＲＰｒｉｍｅｒ混合液（Ｆｏｒｗａｒｄ／Ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉ
ｍｅｒｍｉｘ）を調製した。

（２）鋳型ＤＮＡとしてｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３を用いた他は、実施例１（２－２）と同
様な方法でインバースＰＣＲを行なった。

（３）得られたＰＣＲ産物を精製後、反応液を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形
質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢプレート培地で培養（３７℃、１６
時間）した後、プレート上に形成したコロニーを部位特異的変異体ライブラリとした。

参考例４
（１）実施例１で作製したＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲ（配列番号６）を発現する形質転換体およ
び参考例３で作製した部位特異的アミノ酸置換体ライブラリ（形質転換体）を実施例２（
１）から（２）と同様な方法で培養後、遠心操作によって得られた培養上清に対し、実施
例２（３）に記載のアルカリ処理を行なった。

（３）約２００株の形質転換体を評価し、その中からＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲ（配列番号６）
と比較してアルカリ安定性が向上した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転
換体を選択した。

（５）得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードす
るポリヌクレオチド領域の配列を比較例１（１－５）に記載の方法によりヌクレオチド配
列を解析し、アミノ酸置換箇所を特定した。

（６）（３）で選択した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体または
参考例１で作製したＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲ（配列番号６）を発現する形質転換体を、参考例２
（６）から（８）と同様な方法で培養し、参考例２（９）と同様な方法でタンパク質抽出
液を調製した。

（７）（６）で調製したタンパク質抽出液中の免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体
結合活性を、実施例２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。

（８）参考例２（１１）に記載の方法でアルカリ処理後、参考例２（１２）と同様な方
法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。

（３）で選択した形質転換体が発現する免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号６
）に対するアミノ酸置換位置およびアルカリ処理したときの残存活性［％］をまとめた結
果を表８に示す。配列番号６に記載のアミノ酸配列において、少なくともＬｙｓ（Ａｒｇ
）７Ａｌａ（この表記は配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基（配列番号
５では７番目のリジン）が一旦アルギニンに置換後、さらにアラニンに置換されているこ
とを表す、以下同様）および／またはＬｙｓ（Ａｒｇ）２９Ｐｒｏのアミノ酸置換を有し
た免疫グロブリン結合性タンパク質は、ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲ（配列番号６）と比較しアルカ
リ安定性が向上しているといえる。

実施例４ＦｐＬ＿Ｃ３アミノ酸置換体の作製
ＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）が有するリジン残基（具体的には配列番号１の７番目、１
３番目、２２番目、２９番目、３８番目、４８番目および６７番目のリジン残基）のうち
、
７番目のリジン残基をアラニン残基に、
１３番目、３８番目、４８番目および６７番目のリジン残基をアルギニン残基に、
２２番目のリジン残基をグルタミン残基に、
２９番目のリジン残基をイソロイシン残基に、
それぞれ置換した免疫グロブリン結合性タンパク質（配列番号６９、以下「ＦｐＬ＿Ｃ３
ＫＸ」とも表記）に対し、参考例２で明らかになった、免疫グロブリン結合性タンパク質
のアルカリ安定性向上に関与するアミノ酸置換を集積した。具体的には、以下に示す免疫
グロブリン結合性タンパク質を設計し、作製した。
ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸに対し、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＡｓｎ６２Ｔｙｒ
のアミノ酸置換を導入したタンパク質（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ３ａと命名）

（１）ｐＥＴ２６ｂおよびＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ３ａ（配列番号７０）をコードするポリ
ヌクレオチド（配列番号７１）を含む発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ３ａのヌ
クレオチド配列を設計し、以下の３領域に分割した。

第一領域：ｐＥＴ２６ｂのヌクレオチド配列、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ３ａの１番目から２０
番目までのアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（配列番号７１の１番目から６０
番目までのヌクレオチド配列）、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ３ａの５３番目から７０番目までの
アミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（配列番号７１の１５７番目から２１０番目
までのヌクレオチド配列）、ヒスチジン６残基をコードするヌクレオチド配列（配列番号
４０）、終止コドンおよび制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列（５’－ＴＡＡＧＣＴＴ－
３’）

第二領域：ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ３ａの１６番目から３７番目までのアミノ酸残基をコード
するヌクレオチド配列（配列番号７２［ｆｏｒｗａｒｄ］および７３［ｒｅｖｅｒｓｅ］
に記載の配列からなるポリヌクレオチド）

第三領域：ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ３ａの３３番目から５７番目までのアミノ酸残基をコード
するヌクレオチド配列（配列番号７４［ｆｏｒｗａｒｄ］および７５［ｒｅｖｅｒｓｅ］
に記載の配列からなるポリヌクレオチド）

（２）インバースＰＣＲにより、前記第一領域のポリヌクレオチドを調製した。インバ
ースＰＣＲは、鋳型ＤＮＡとしてＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲＫ７Ａ（ＦｐＬ＿Ｃ４ＫＲにＬｙｓ
（Ａｒｇ）７Ａｌａのアミノ酸置換を導入した免疫グロブリン結合性タンパク質、配列番
号６７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号７６）を含む発現ベクターｐＥＴ－Ｆ
ｐＬ＿Ｃ４ＫＲＫ７Ａを、ＰＣＲＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒとして配列番号７７
に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒと
して配列番号７８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドとして、表９に示す組成の反
応液を調製後、当該反応液を９８℃で２分間熱処理し、９５℃で１０秒間の第１ステップ
、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で６分の第３ステップを１サイクルとする反応
を３０サイクル行ない、最後に７２℃で７分間熱処理することで行なった。

（３）（２）で調製した前記第一領域のポリヌクレオチド、ならびに（１）で設計した
前記第二領域および前記第三領域のポリヌクレオチド（直接化学合成で作製）をＮＥＢｕ
ｉｌｄｅｒ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）を用いて連結した。なお、前記三
領域（ポリヌクレオチドとしては５種類）のポリヌクレオチドはそれぞれ、反応液中に０
．０５ｐｍｏｌずつ混合した。

（４）（２）で得られたポリヌクレオチドを比較例１（１－２）と同様な方法で精製し
、比較例１（１－３）と同様な方法で形質転換後、比較例１（１－４）と同様な方法で培
養および発現ベクターの抽出を行ない、当該発現ベクターのヌクレオチド配列の解析を比
較例１（１－５）と同様の方法で行なった。

配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ３ａにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
３ａ（配列番号７０）をコードするポリヌクレオチド（配列番号７１）が挿入されている
ことを確認した。

実施例５ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ３ａのアルカリ安定性評価
（１）比較例１で作製した天然型ＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）、ならびに実施例４で作
製した変異型免疫グロブリン結合性タンパク質ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ（配列番号６９）および
ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ３ａ（配列番号７０）のいずれかを発現する形質転換体を、比較例１
（２－１）から（２－２）と同様な方法で培養し、比較例１（２－３）に記載の方法でタ
ンパク質抽出液を調製した。

（２）（１）で調製したタンパク質抽出液中の免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体
結合活性を、実施例２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。

（３）処理に用いたＮａＯＨの濃度を０．４Ｍ（終濃度０．２Ｍ）に、処理時間を１５
時間に、それぞれした他は、参考例２（１１）と同様な方法でアルカリ処理後、参考例２
（１２）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。

結果を表１０に示す。Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｇｌｕ５２ＧｌｙおよびＡｓｎ６２Ｔｙｒの
アミノ酸置換を有した免疫グロブリン結合性タンパク質（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ３ａ）は、
ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸと比較し、アルカリ安定性が向上しているといえる（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
：１０％、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ３ａ：６９％）。

実施例６ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ３ａアミノ酸置換体への変異導入およびライブラリ作製
ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ３ａに対し、Ｖκ３との結合力を付与するアミノ酸置換であるＧｌ
ｕ４９Ａｓｐのアミノ酸置換を導入した、変異型免疫グロブリン結合性タンパク質ＦｐＬ
＿Ｃ３ＫＸ４ｈ（配列番号７９）を発現するベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ４ｈ
のうち、免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分（配列番号
８０）に、参考例１と同様の方法でエラープローンＰＣＲによりランダムに変異を導入し
、ライブラリを作製した。平均変異導入率は１．７％であった。

実施例７ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ４ｈアミノ酸置換体のスクリーニング
（１）実施例６で作製したランダム変異体ライブラリ（形質転換体）を、実施例２（１
）から（２）と同様な方法で培養後、遠心操作によって得られた培養上清を１．０ＭＮ
ａＯＨと等量混合し、４２℃で３０分間、アルカリ処理を行なった。

（３）約９００株の形質転換体を評価し、その中からアルカリ安定性向上免疫グロブリ
ン結合性タンパク質（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ４ｈ）と比較してアルカリ安定性が向上した免
疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。

（５）得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードす
るポリヌクレオチド領域の配列を比較例１（１－５）に記載の方法によりヌクレオチド配
列を解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。

（６）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ４ｈ（配列番号７９）または（５）で選択した免疫グロブリ
ン結合性タンパク質を発現する形質転換体を、比較例１（２－１）から（２－２）と同様
な方法で培養し、比較例１（２－３）と同様な方法でタンパク質抽出液を調製した。前記
抽出液は遠心分離し、得られた上清をフィルターに通し、清澄化した。

（７）あらかじめ０．５ＭのＮａＣｌと０．０２Ｍイミダゾールとを含む０．０５Ｍト
リス緩衝液（ｐＨ７．５）（以下、洗浄緩衝液と表記）で平衡化したＮｉ－ＮＴＡＳｅ
ｐｈａｒｏｓｅ６ＦａｓｔＦｌｏｗ（Ｃｙｔｉｖａ社製）を充填したカラムに、（
６）で清澄化した上清を添加し、前記カラムに充填した担体の１０倍量の洗浄緩衝液で洗
浄後、０．５ＭのＮａＣｌと０．５Ｍイミダゾールとを含む０．０５Ｍトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）を通液することで、免疫グロブリン結合性タンパク質に相当する画分を回収し
た。

（８）回収した画分の吸光度を分光光度計で測定し、当該画分に含まれる免疫グロブリ
ン結合性タンパク質を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、選択した免疫グロブリ
ン結合性タンパク質が純度よく精製されていることを確認した。

（９）処理に用いたＮａＯＨの濃度を１．０Ｍ（終濃度０．５Ｍ）に、処理時間を１５
時間に、それぞれした他は、参考例２（１１）と同様な方法でアルカリ処理後、参考例２
（１２）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。

結果を表１１に示す。配列番号７９に記載のアミノ酸配列において、少なくともＧｌｕ
９Ｖａｌ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ｔｈｒ５４ＭｅｔおよびＡｌａ６９Ｔｈｒより選択される
１以上のアミノ酸置換を有した免疫グロブリン結合性タンパク質は、天然型のＦｐＬ＿Ｃ
３（配列番号１）よりアルカリ安定性が向上したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ４ｈ（配列番号７９
）と比較しても、アルカリ安定性が向上しているといえる。

なお、２０ｍＬ培地で培養したときの精製収量を比較したところ、Ｌｙｓ（Ｇｌｎ）２
２Ａｒｇのアミノ酸置換を導入することで、タンパク質精製収量が顕著に向上することを
確認した。以降、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ４ｈにＬｙｓ（Ｇｌｎ）２２Ａｒｇのアミノ酸置換
を導入した免疫グロブリン結合性タンパク質をＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ４ｉ（配列番号８２）
と命名する。

実施例８ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ４ｉアミノ酸置換集積体の作製
（１）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ４ｉアミノ酸置換集積体の設計
実施例７で明らかになった、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に
関与するアミノ酸置換をＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ４ｉ（配列番号８２）に対し集積することで
、更なる安定性の向上を図った。具体的には、以下に示す免疫グロブリン結合性タンパク
質を設計し、作製した。
ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ４ｉに対し、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅのアミノ酸置換を導入したタンパク質
（配列番号８６、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ５ｅと命名）

（１）インバースＰＣＲを用いた変異導入により、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ５ｅ（配列番号
８６）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。鋳型ＤＮＡと
してインバースＰＣＲはＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ４ｉ（配列番号８２）をコードするポリヌク
レオチド（配列番号８７）を含む発現ベクター（以下、「ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ４
ｉ」とも表記）を、ＰＣＲＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒとして配列番号８８に記載の
オリゴヌクレオチドを、ＰＣＲＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒとして配列番号８９に記
載のオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いた他は実施例４（２）と同様な方法で行なった
。

（２）得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＤｐｎＩで処理後、制限酵素より
産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。

（３）得られた形質転換体を参考例２（４）と同様な方法で培養および発現ベクター（
ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ５ｅと命名）の抽出を行ない、当該発現ベクターのヌクレオ
チド配列の解析を比較例１（１－５）と同様の方法で行なった。

配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ５ｅにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
５ｅ（配列番号８６）をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した。

実施例９ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ４ｈアミノ酸置換体のアルカリ安定性評価
（１）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ４ｈ（配列番号７９）、実施例７で作製したＦｐＬ＿Ｃ３Ｋ
Ｘ４ｉ（配列番号８２）ならびに実施例８で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ５ｅ（配列番
号８９）のいずれかを発現する形質転換体を、比較例１（２－１）から（２－２）と同様
な方法で培養し、比較例１（２－３）と同様な方法でタンパク質抽出液を調製した。前記
抽出液は遠心分離し、得られた上清をフィルターに通し、清澄化した。

（２）（１）で清澄化した上清を、実施例７（７）に記載の方法で精製し、免疫グロブ
リン結合性タンパク質に相当する画分を回収した。

（３）回収した画分の吸光度を分光光度計で測定し、当該画分に含まれる免疫グロブリ
ン結合性タンパク質を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、選択した免疫グロブリ
ン結合性タンパク質が純度よく精製されていることを確認した。

（４）処理に用いたＮａＯＨの濃度を１．０Ｍ（終濃度０．５Ｍ）に、処理温度を５５
℃、処理時間を１５分に、それぞれした他は、参考例２（１１）と同様な方法でアルカリ
処理後、参考例２（１２）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した
。

結果を表１２に示す。実施例８で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ５ｅ（配列番号８６）は
天然型のＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）よりアルカリ安定性が向上したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
４ｈ（配列番号７９）およびＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ４ｉ（配列番号８２）と比較しても、ア
ルカリ安定性が向上しているといえる（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ４ｈ：３４％、ＦｐＬ＿Ｃ３
ＫＸ４ｉ：４８％、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ５ｅ：７３％）。

実施例１０ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ５ｅへの変異導入およびライブラリ作製
実施例８で作製した発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ５ｅのうち、免疫グロブ
リン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分（配列番号９０）に、参考例１
と同様の方法でエラープローンＰＣＲによりランダムに変異を導入し、ライブラリを作製
した。平均変異導入率は１．９％であった。

実施例１１ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ５ｅアミノ酸置換体のスクリーニング
（１）実施例１０で作製したランダム変異体ライブラリ（形質転換体）を実施例２（１
）から（２）と同様な方法で培養後、遠心操作によって得られた培養上清を、実施例７（
１）に記載のアルカリ処理を行なった。

（３）約９００株の形質転換体を評価し、その中からアルカリ安定性向上免疫グロブリ
ン結合性タンパク質（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ５ｅ）と比較してアルカリ安定性が向上した免
疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。

（６）（３）で選択した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体または
実施例２４で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ５ｅ（配列番号８６）を発現する形質転換体を
、比較例１（２－１）から（２－２）と同様な方法で培養し、比較例１（２－３）と同様
な方法でタンパク質抽出液を調製した。前記抽出液は遠心分離し、得られた上清をフィル
ターに通し、清澄化した。

（７）（６）で清澄化した上清を、実施例７（７）に記載の方法で精製し、免疫グロブ
リン結合性タンパク質に相当する画分を回収した。

（９）処理に用いたＮａＯＨの濃度を２．０Ｍ（終濃度１．０Ｍ）に、処理時間を１７
時間に、それぞれした他は、参考例２（１１）と同様な方法でアルカリ処理後、参考例２
（１２）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。

結果を表１３に示す。配列番号８６に記載のアミノ酸配列において、少なくともＧｌｕ
１Ｖａｌ、Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｇｌｙ２１ＡｒｇおよびＧｌｕ（Ｇｌｙ）５２Ａｓｐより選
択される１以上のアミノ酸置換を有した免疫グロブリン結合性タンパク質は、天然型のＦ
ｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）よりアルカリ安定性が向上したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ５ｅ（配列
番号８６）と比較しても、アルカリ安定性が向上しているといえる。

実施例１２ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ５ｅアミノ酸置換集積体作製（その２）
実施例１０で明らかとなった免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性向上に
関与するアミノ酸置換ならびにＶκ３との結合力を付与するアミノ酸置換であるＰｒｏ６
ＳｅｒおよびＬｙｓ（Ａｒｇ）３８ＧｌｕをＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ５ｅに対し集積した。具
体的には、以下に示す免疫グロブリン結合性タンパク質を設計し、作成した。
ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ５ｅに対し、Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｐｒｏ６Ｓｅｒ、Ｌｙｓ（Ａｒｇ）３
８Ｇｌｕ、Ｇｌｕ（Ｇｌｙ）５２Ａｓｐのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号
９６、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄと命名）

（１）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄ（配列番号９６）をコードするポリヌクレオチド（配列
番号９７）を合成した。なお、合成する際、５’末端側には制限酵素ＮｃｏＩの認識配列
（５’－ＣＣＡＴＧＧ－３’）を、３’末端側にはヒスチジン６残基をコードするヌクレ
オチド配列（配列番号４０）、終止コドンおよび制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列（５
’－ＡＡＧＣＴＴ－３’）を、それぞれ付加している。

（２）比較例１（１－２）と同様の方法で、（１）で合成したポリヌクレオチドを精製
した。

（３）比較例１（１－３）と同様な方法で、（２）で得たポリヌクレオチドと予め制限
酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＥＴ－２６ｂとをライゲーション
後、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、培養し
た。

（４）得られた形質転換体を、比較例１（１－４）と同様な方法で培養およびプラスミ
ド精製を行ない、発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ８ａと命名）を取得後、当該
発現ベクターのヌクレオチド配列の解析を、比較例１（１－５）と同様の方法で行なった
。

配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
７ｄ（配列番号９６）をコードするポリヌクレオチド（配列番号９７）が挿入されている
ことを確認した。

実施例１３ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄのアルカリ安定性評価
（１）実施例１０で取得したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ５ｅ（配列番号８６）および実施例１
２で取得したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄ（配列番号９６）、のいずれかを発現する形質転換
体を、比較例１（２－１）から（２－２）と同様な方法で培養し、比較例１（２－３）に
記載の方法でタンパク質抽出液を調製した。前記抽出液は遠心分離し、得られた上清をフ
ィルターに通し、清澄化した。

（４）処理に用いたＮａＯＨの濃度を１．０Ｍ（終濃度０．５Ｍ）に、処理時間を１７
時間に、それぞれした他は、参考例２（１１）と同様な方法でアルカリ処理後、参考例２
（１２）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。

結果を表１４に示す。本実施例で評価したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ８ａ（配列番号９６）は、
ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ５ｅ（配列番号８６）と比較し、残存活性が高くなっており、これら
変異型免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安定性が向上していることが確認され
た。

実施例１４ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄへの変異導入およびライブラリ作製（その１）
実施例１２で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄ（配列番号９６）を発現するベクターｐ
ＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄのうち、免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポ
リヌクレオチド部分（配列番号９７）に、参考例１と同様の方法でエラープローンＰＣＲ
によりランダムに変異を導入し、ライブラリを作製した。平均変異導入率は１．９％であ
った。

実施例１５ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄアミノ酸置換体のスクリーニング（その１）
（１）実施例１２で作製したｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄ（形質転換体）と実施例
１３で作製したランダム変異体ライブラリ（形質転換体）を、実施例２（１）から（２）
と同様な方法で培養した。

（２）培養後、遠心操作によって得られた培養上清を１．０ＭＮａＯＨと等量混合し
３０分、５８℃でアルカリ処理を行なった。

（３）アルカリ処理を行なった時の免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を
実施例２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定し、アルカリ処理を行なった時の免疫グロ
ブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、アルカリ処理を行わなかった時の免疫グロブ
リン結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出した。

（４）約１０００株の形質転換体を評価し、その中からＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄ（配列
番号９６）と比較してアルカリ安定性が向上した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現
する形質転換体を選択した。

（５）選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐ
ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて発現ベクターを調製した。

（６）得られた発現ベクターに挿入された免疫グロブリン結合性タンパク質をコードす
るポリヌクレオチド領域の配列を比較例１（１－５）に記載の方法によりヌクレオチド配
列を解析し、アミノ酸の変異箇所を特定した。

（７）（４）で選択した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体または
実施例１２で作製したｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄ（配列番号９６）を発現する形質
転換体を、比較例１（１－１）から（１－２）と同様な方法で培養し、比較例１（２－３
）と同様な方法でタンパク質抽出液を調製した。前記抽出液は遠心分離し、得られた上清
をフィルターに通し、清澄化した。

（８）（７）で清澄化した上清を、実施例７（７）に記載の方法で精製し、免疫グロブ
リン結合性タンパク質に相当する画分を回収した。

（９）回収した画分の吸光度を分光光度計で測定し、当該画分に含まれる免疫グロブリ
ン結合性タンパク質を定量した。またＳＤＳ－ＰＡＧＥも実施し、選択した免疫グロブリ
ン結合性タンパク質が純度よく精製されていることを確認した。

（１０）処理に用いたＮａＯＨの濃度を１．０Ｍ（終濃度０．５Ｍ）に、処理時間を１
５時間に、それぞれした他は、参考例２（１１）と同様な方法でアルカリ処理後、参考例
２（１２）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。

結果を表１５に示す。配列番号９６に記載のアミノ酸配列において、少なくともＧｌｕ
８Ｖａｌ、Ｇｌｕ３３ＶａｌおよびＡｌａ６９Ｖａｌより選択される１以上のアミノ酸置
換を有した免疫グロブリン結合性タンパク質は、天然型のＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）よ
りアルカリ安定性が向上したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄ（配列番号９６）と比較しても、ア
ルカリ安定性が向上しているといえる。

実施例１６ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄへの変異導入およびライブラリ作製（その２）
（１）実施例１２で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄ（配列番号９６）を発現するベクタ
ーｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄを鋳型として、２３番目、４１番目および５２番目の
アミノ酸残基に対する飽和置換体ライブラリを作製した。プライマーは、実施例１（２）
と同様、２２ｃ－Ｔｒｉｃｋ法に倣い、変異導入箇所に適切な混合塩基を配置し、変異導
入箇所を中心としたインバースＰＣＲができるように設計した（配列番号１００から１０
５、１０７から１１２、ならびに１１５から１２０）。これらのプライマーを一箇所の置
換につき６本一組として、表１および表１６の組成で混合し、ＰＣＲＰｒｉｍｅｒ混合
液（Ｆｏｒｗａｒｄ／Ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒｍｉｘ）を調製した。

（２）ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄを鋳型ＤＮＡとした他は、実施例２（２－２）
と同様な方法でインバースＰＣＲによる部位特異的変異導入を行った。

実施例１７ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ８ａアミノ酸置換体のスクリーニング（その２）
（１）実施例１２で作製したｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄ（形質転換体）および実
施例１６で作製したランダム変異体ライブラリ（形質転換体）で作製した部位特異的アミ
ノ酸置換体ライブラリ（形質転換体）を、実施例２（１）から（２）と同様な方法で培養
後、遠心操作によって得られた培養上清に対し、実施例１５（２）に記載のアルカリ処理
を行なった。

（３）約３００株の形質転換体を評価し、その中からＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄ（配列番
号９６）と比較してアルカリ安定性が向上した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現す
る形質転換体を選択した。

（６）（３）で選択した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体または
実施例１２で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄ（配列番号９６）を発現する形質転換体を
、比較例１（２－１）から（２－２）と同様な方法で培養し、比較例１（２－３）と同様
な方法でタンパク質抽出液を調製した。前記抽出液は遠心分離し、得られた上清をフィル
ターに通し、清澄化した。

結果を表１７に示す。配列番号９６に記載のアミノ酸配列において、少なくともＩｌｅ
２３Ａｒｇ、Ａｌａ４１Ｉｌｅ、Ａｌａ４１Ｔｙｒ、Ｇｌｕ（Ｇｌｙ，Ａｓｐ）５２Ｌｅ
ｕ（この表記は配列番号１の７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基が一旦グリシ
ンに置換し、さらにアスパラギン酸に置換後、ロイシンに置換されたことを表す、以下同
様）およびＧｌｕ（Ｇｌｙ，Ａｓｐ）５２Ｖａｌのアミノ酸置換を有した免疫グロブリン
結合性タンパク質は、天然型のＦｐＬ＿Ｃ３よりアルカリ安定性が向上したＦｐＬ＿Ｃ３
ＫＸ７ｄ（配列番号９６）と比較しても、アルカリ安定性が向上しているといえる。

実施例１８ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄアミノ酸置換体の設計と作製
側鎖の性質が異なるアミノ酸残基への置換、またはドメイン間でアミノ酸配列が異なる
位置における他のドメインのアミノ酸残基への置換を導入する方法で取得した、酸溶出性
が向上したアミノ酸置換である、Ｐｒｏ（Ｓｅｒ）６Ａｌａ、Ｇｌｕ８Ｇｌｙ、Ｇｌｕ８
Ａｒｇ、Ｇｌｙ２１Ａｒｇ、Ｉｌｅ２３Ｐｈｅ、Ｉｌｅ２３Ｌｅｕ、Ｇｌｕ３３Ｖａｌ、
Ｌｙｓ（Ａｒｇ，Ｇｌｕ）３８Ｈｉｓ、Ｌｙｓ（Ａｒｇ，Ｇｌｕ）３８Ｌｅｕ、Ａｓｎ４
４Ｈｉｓ、Ａｓｎ４４Ａｒｇ、Ｌｙｓ（Ａｒｇ）４８Ｈｉｓ、Ａｓｎ（Ｔｙｒ）５０Ｍｅ
ｔ、Ｇｌｕ（Ｇｌｙ，Ａｓｐ）５２Ｔｙｒ、Ｔｙｒ（Ｐｈｅ）５３ＳｅｒのいずれかをＦ
ｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄに対し集積した。

（１）鋳型ＤＮＡとしてＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄ（配列番号９６）をコードするポリヌ
クレオチド（配列番号９７）を含む発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄを、Ｐ
ＣＲＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒおよびＰＣＲＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒの組
み合わせとして表１８の配列番号に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせ
を、それぞれ用いた他は実施例４（２）と同様な方法でインバースＰＣＲを行なった。

（２）（１）で得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＤｐｎＩで処理後、制限
酵素より産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。

（３）得られた形質転換体を比較例１（１－４）と同様な方法で培養および発現ベクタ
ーの抽出を行ない、当該発現ベクターのヌクレオチド配列の解析を比較例１（１－５）と
同様の方法で行なった。結果、いずれの発現ベクターも（１）で得られたポリヌクレオチ
ドが挿入されていることを確認した。

実施例１９ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄアミノ酸置換体の酸溶出性評価
（１）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄおよび実施例１８で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄア
ミノ酸置換体（計１５種類）のいずれかを発現する形質転換体を、比較例１（２－１）か
ら（２－２）と同様な方法で培養し、比較例１（２－３）に記載の方法でタンパク質抽出
液を調製した。前記抽出液は遠心分離し、得られた上清をフィルターに通し、清澄化した
。

（４）各タンパク質の濃度が等しくなるよう、ＴＢＳを用いて希釈した。希釈液を二等
分し、実施例２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法（酸溶出性評価）によって、一方には０．０
５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）（酸処理）を、もう一方にはＴＢＳ（酸
未処理）を添加した際の抗体結合活性を測定した。酸処理した免疫グロブリン結合性タン
パク質の抗体結合活性を、酸未処理の免疫グロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性で
除することで残存活性を算出した。１より残存活性を減ずることで溶出率を算出し、酸溶
出性を評価した。

結果を表１９に示す。本実施例で評価したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅアミノ酸置換体はい
ずれも天然型のＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）よりアルカリ安定性が向上したＦｐＬ＿Ｃ３
ＫＸ７ｄ（配列番号９６）と比較し、溶出率が高くなっており、これら変異型免疫グロ
ブリン結合性タンパク質の酸による溶出性が向上していることが確認された。

実施例２０ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄアミノ酸置換集積体の作製
（１）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄアミノ酸置換集積体の設計
実施例１５および１７で明らかになった、免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ
安定性向上に関与するアミノ酸置換をＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄ（配列番号９６）に対し集
積することで、更なるアルカリ安定性の向上を図った。具体的には、以下の＜ａ＞から＜
ｂ＞に示す２種類の免疫グロブリン結合性タンパク質を設計し、作製した。
（ａｃ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄに対し、Ｇｌｕ（Ｇｌｙ，Ａｓｐ）５２ＶａｌおよびＡ
ｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号１７１、ＦｐＬ＿Ｃ３Ｋ
Ｘ８ａと命名）
（ｂ）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄに対し、Ｇｌｕ（Ｇｌｙ，Ａｓｐ）５２ＬｅｕおよびＡｌ
ａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号１７４、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
８ｂと命名）

（２）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄアミノ酸置換集積体の作製
以下、前記＜ａ＞から＜ｂ＞に示す２種類の免疫グロブリン結合性タンパク質の作製方
法について説明する。

＜ａ＞ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ８ａ
＜ａ－１＞インバースＰＣＲを用いた変異導入により、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ８ａ（配列
番号２７１）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。インバ
ースＰＣＲは、鋳型ＤＮＡとしてＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄ＿Ａ６９Ｖ（ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
７ｄにＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換を導入した免疫グロブリン結合性タンパク質、
配列番号９８）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１６８）を含む発現ベクター（
以下、「ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄ＿Ａ６９Ｖ」とも表記）を、ＰＣＲＦｏｒｗ
ａｒｄＰｒｉｍｅｒとして配列番号１６９に記載のオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲＲ
ｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒとして配列番号１７０に記載のオリゴヌクレオチドを、それ
ぞれ用いた他は実施例４（２）と同様な方法で行なった。

＜ａ－２＞得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＤｐｎＩで処理後、制限酵素
より産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。

＜ａ－３＞得られた形質転換体を比較例１（１－３）から（１－４）と同様な方法で培
養および発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ８ａと命名）の抽出を行ない、当該
発現ベクターのヌクレオチド配列の解析を比較例１（１－５）と同様の方法で行なった。

配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ８ａにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
８ａ（配列番号１７１）をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した
。

＜ｂ＞ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ８ｂ
＜ｂ－１＞インバースＰＣＲを用いた変異導入により、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ８ｂ（配列
番号１７４）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを作製した。鋳型Ｄ
ＮＡとしてインバースＰＣＲは、鋳型ＤＮＡとしてｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄ＿Ａ
６９Ｖを、ＰＣＲＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒとして配列番号１７２に記載のオリゴ
ヌクレオチドを、ＰＣＲＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒとして配列番号１７３記載のオ
リゴヌクレオチドを、それぞれ用いた他は実施例４（２）と同様な方法で行なった。

＜ｂ－２＞得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＤｐｎＩで処理後、制限酵素
より産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。

＜ｂ－３＞得られた形質転換体を比較例１（１－３）から（１－４）と同様な方法で培
養および発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ８ｂと命名）の抽出を行ない、当該
発現ベクターのヌクレオチド配列の解析を比較例１（１－５）と同様の方法で行なった。

配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ８ｂにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
８ｂ（配列番号１７４）をコードするポリヌクレオチドが挿入されていることを確認した
。

実施例２１ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄアミノ酸置換集積体のアルカリ安定性評価
（１）実施例１５で取得したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｄ＿Ａ６９Ｖ（配列番号９８）、な
らびに実施例２０で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ８ａ（配列番号１７１）およびＦｐＬ＿
Ｃ３ＫＸ８ｂ（配列番号１７４）のいずれかを発現する形質転換体を、比較例１（２－
１）から（２－２）と同様な方法で培養し、比較例１（２－３）に記載の方法でタンパク
質抽出液を調製した。前記抽出液は遠心分離し、得られた上清をフィルターに通し、清澄
化した。

（４）処理に用いたＮａＯＨの濃度を１．０Ｍ（終濃度０．５Ｍ）に、処理時間を１５
時間に、それぞれした他は、参考例２（１１）と同様な方法でアルカリ処理後、参考例２
（１２）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。

結果を表２０に示す。ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ８ａ（配列番号１７１）およびＦｐＬ＿Ｃ３
ＫＸ８ｂ（配列番号１７４）は、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ８ａ＿Ａ６９Ｖ（配列番号９８）と
比較し、残存活性が高くなっており、これら変異型免疫グロブリン結合性タンパク質のア
ルカリ安定性が向上していることが確認された。

実施例２２本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質へのアミノ酸置換導入
側鎖の性質が異なるアミノ酸残基への置換、またはドメイン間でアミノ酸配列が異なる
位置における他のドメインのアミノ酸残基への置換を導入する方法で取得した、アルカリ
安定性が向上したアミノ酸置換である、Ｖａｌ１４Ａｌａ、Ｇｌｙ２１Ａｒｇ、Ｉｌｅ２
３Ｔｈｒ、Ａｌａ４１Ａｒｇ、Ａｓｎ４４Ａｓｐ、Ａｓｎ４４Ａｒｇ、Ａｓｎ４４Ｈｉｓ
、Ｇｌｕ５２Ｔｙｒ、Ｇｌｙ６０ＡｒｇおよびＩｌｅ６４ＬｅｕのいずれかをＦｐＬ＿Ｃ
３ＫＸ７ｅ（配列番号１７５）に対し集積した。なおＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅは、天然
型ＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）に対し、Ｇｌｕ４Ｇｌｙ、Ｐｒｏ６Ｓｅｒ、Ｌｙｓ７Ａｌ
ａ、Ｌｙｓ１３Ａｒｇ、Ｌｙｓ２２Ａｒｇ、Ｌｙｓ２９Ｉｌｅ、Ｌｙｓ２９Ｇｌｕ、Ｌｙ
ｓ４８Ａｒｇ、Ｇｌｕ４９Ａｓｐ、Ａｓｎ５０Ｔｙｒ、Ｔｙｒ５３Ｐｈｅ、Ａｓｎ６２Ｔ
ｙｒ、Ｌｙｓ６７ＡｒｇおよびＡｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換を導入した免疫グロブリ
ン結合性タンパク質である。

（１）鋳型ＤＮＡとしてＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅ（配列番号１７５）をコードするポリ
ヌクレオチド（配列番号１７６）を含む発現ベクター（以下、「ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３Ｋ
Ｘ７ｅ」とも表記）を、ＰＣＲＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒおよびＰＣＲＲｅｖ
ｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒの組み合わせとして表２１の配列番号に記載の配列からなるオリ
ゴヌクレオチドの組み合わせを、それぞれ用いた他は実施例４（２）と同様な方法でイン
バースＰＣＲを行なった。

（２）（１）で得られたポリヌクレオチドを精製し、制限酵素ＤｐｎＩで処理後、当該
制限酵素処理産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。

実施例２３ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅアミノ酸置換体のアルカリ安定性評価
（１）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅおよび実施例２２で作製したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅア
ミノ酸置換体（計１０種類）のいずれかを発現する形質転換体を、比較例１（２－１）か
ら（２－２）と同様な方法で培養し、比較例１（２－３）に記載の方法でタンパク質抽出
液を調製した。前記抽出液は遠心分離し、得られた上清をフィルターに通し、清澄化した
。

（４）処理に用いたＮａＯＨの濃度を１．０Ｍ（終濃度０．５Ｍ）に、処理時間を１５
時間に、それぞれした他は、参考例２（１１）と同様な方法でアルカリ処理後、参考例２
（１２）と同様な方法で残存活性を算出し、アルカリ安定性を評価した。
結果を表２２に示す。本実施例で評価したＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅアミノ酸置換体はい
ずれも天然型のＦｐＬ＿Ｃ３（配列番号１）よりアルカリ安定性が向上したＦｐＬ＿Ｃ３
ＫＸ７ｅ（配列番号１７５）と比較しても、アルカリ安定性が向上しているといえる。

実施例２４本発明の免疫グロブリン結合性タンパク質へのアミノ酸置換の集積
（１）アミノ酸置換集積体の設計
実施例１７および２３で明らかになった免疫グロブリン結合性タンパク質のアルカリ安
定性向上に関与するアミノ酸置換、および／または実施例１９で明らかになった免疫グロ
ブリン結合性タンパク質の免疫グロブリン溶出性向上に関与するアミノ酸置換を、ＦｐＬ
＿Ｃ３ＫＸ７ｅ（配列番号１７５）に対し集積した。具体的には、以下の＜ｃ＞から＜
ｉ＞に示す７種類の免疫グロブリン結合性タンパク質を設計し、作製した。
＜ｃ＞ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅに対し、Ｉｌｅ２３ＡｒｇおよびＡｓｎ４４Ａｒｇのアミ
ノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号２０７、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ａと命名）
＜ｄ＞ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅに対し、Ｉｌｅ２３ＡｒｇおよびＡｓｎ４４Ｈｉｓのアミ
ノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号２０８、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｂと命名）
＜ｅ＞ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅに対し、Ｉｌｅ２３ＡｒｇおよびＩｌｅ６４Ｌｅｕのアミ
ノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号２０９、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｃと命名）
＜ｆ＞ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅに対し、Ａｓｎ４４ＡｒｇおよびＩｌｅ６４Ｌｅｕのアミ
ノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号２１０、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｄと命名）
＜ｇ＞ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅに対し、Ａｓｎ４４ＨｉｓおよびＩｌｅ６４Ｌｅｕのアミ
ノ酸置換を導入したタンパク質（配列番号２１１、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｅと命名）
＜ｈ＞ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅに対し、Ｉｌｅ２３Ａｒｇ、Ａｓｎ４４Ａｒｇ、Ｌｙｓ（
Ａｒｇ）４８ＨｉｓおよびＩｌｅ６４Ｌｅｕのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列
番号２１２、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ１０ａと命名）
＜ｉ＞ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅに対し、Ｉｌｅ２３Ａｒｇ、Ａｓｎ４４Ｈｉｓ、Ｌｙｓ（
Ａｒｇ）４８ＨｉｓおよびＩｌｅ６４Ｌｅｕのアミノ酸置換を導入したタンパク質（配列
番号２１３、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ１０ｂと命名）

（２）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅアミノ酸置換集積体の作製
以下、前記＜ｃ＞から＜ｉ＞に示す７種類の免疫グロブリン結合性タンパク質の作製方法
について説明する。

＜ｃ＞ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ａ
＜ｃ－１＞ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ａ（配列番号２０７）をコードするポリヌクレオチド
（配列番号２１４）を合成した。なお、合成する際、５’末端側には制限酵素ＮｃｏＩの
認識配列（５’－ＣＣＡＴＧＧ－３’）を、３’末端側にはヒスチジン６残基をコードす
るヌクレオチド配列（配列番号４０）、終止コドンおよび制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識
配列（５’－ＡＡＧＣＴＴ－３’）を、それぞれ付加している。

＜ｃ－２＞比較例１（１－２）と同様の方法で、＜ｃ－１＞で合成したポリヌクレオチ
ドを精製した。

＜ｃ－３＞比較例１（１－３）と同様な方法で、＜ｃ－２＞で得たポリヌクレオチドと
予め制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＥＴ－２６ｂとをライゲ
ーション後、当該ライゲーション産物を用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し
、培養した。

＜ｃ－４＞得られた形質転換体を、比較例１（１－４）と同様な方法で培養およびプラ
スミド精製を行ない、発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ａと命名）を取得後
、当該発現ベクターのヌクレオチド配列の解析を、比較例１（１－５）と同様の方法で行
なった。

配列解析の結果、発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ａにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
９ａ（配列番号２０７）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２１４）が挿入されて
いることを確認した。

＜ｄ＞ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｂ
免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、ＦｐＬ＿Ｃ３
ＫＸ９ｂ（配列番号２０８）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２１５）を用い
た他は、（ａ）と同様な方法で形質転換体および発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３Ｋ
Ｘ９ｂと命名）を取得した。発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｂのヌクレオ
チド配列解析の結果、ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｂにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｂ（配列
番号２０８）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２１５）が挿入されていることを
確認した。

＜ｅ＞ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｃ
免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、ＦｐＬ＿Ｃ３
ＫＸ９ｃ（配列番号２０９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２１６）を用い
た他は、（ａ）と同様な方法で形質転換体および発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３Ｋ
Ｘ９ｃと命名）を取得した。発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｃのヌクレオ
チド配列解析の結果、ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｅにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｃ（配列番
号２０９）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２１６）が挿入されていることを確
認した。

＜ｆ＞ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｄ
免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、ＦｐＬ＿Ｃ３
ＫＸ９ｄ（配列番号２１０）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２１７）を用い
た他は、（ａ）と同様な方法で形質転換体および発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３Ｋ
Ｘ９ｄと命名）を取得した。発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｄのヌクレオ
チド配列解析の結果、ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｄにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｄ（配列
番号２１０）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２１７）が挿入されていることを
確認した。

＜ｇ＞ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｅ
免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、ＦｐＬ＿Ｃ３
ＫＸ９ｅ（配列番号２１１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２１８）を用い
た他は、（ａ）と同様な方法で形質転換体および発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３Ｋ
Ｘ９ｅと命名）を取得した。発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｅのヌクレオ
チド配列解析の結果、ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｅにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｅ（配列
番号２１１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２１８）が挿入されていることを
確認した。

＜ｈ＞ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ１０ａ
免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、ＦｐＬ＿Ｃ３
ＫＸ１０ａ（配列番号２１２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２１９）を用
いた他は、（ａ）と同様な方法で形質転換体および発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３
ＫＸ１０ａと命名）を取得した。発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ１０ａのヌ
クレオチド配列解析の結果、ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ１０ａにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ１
０ａ（配列番号２１２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２１９）が挿入されて
いることを確認した。

＜ｉ＞ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ１０ｂ
免疫グロブリン結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドとして、ＦｐＬ＿Ｃ３
ＫＸ１０ｂ（配列番号２１３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２２０）を用
いた他は、（ａ）と同様な方法で形質転換体および発現ベクター（ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３
ＫＸ１０ｂと命名）を取得した。発現ベクターｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ１０ｂのヌ
クレオチド配列解析の結果、ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ１０ｂにＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ１
０ｂ（配列番号２１３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２２０）が挿入されて
いることを確認した。

実施例２５ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ８ｂアミノ酸置換体の酸溶出性評価
（１）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅ（配列番号１７５）ならびに実施例２４で作製したＦｐ
Ｌ＿Ｃ３ＫＸ９ａ（配列番号２０７）、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｂ（配列番号２０８）、
ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｃ（配列番号２０９）、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｃ（配列番号２１０
）、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｄ（配列番号２１１）、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ１０ａ（配列番号
２１２）およびＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ１０ｂ（配列番号２１３）のいずれかを発現する形質
転換体を、比較例１（１－１）から（１－２）と同様な方法で培養し、比較例１（２－３
）に記載の方法でタンパク質抽出液を調製した。前記抽出液は遠心分離し、得られた上清
をフィルターに通し、清澄化した。

（４）各タンパク質の濃度が等しくなるよう、ＴＢＳを用いて希釈した。希釈液を二等
分し、実施例２（４）に記載のＥＬＩＳＡ法（酸溶出性評価）によって、一方には０．０
５Ｍクエン酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）緩衝液（ｐＨ３．２）で５分間酸処理し、もう
一方にはＴＢＳ（酸未処理）を添加した際の抗体結合活性を測定した。酸処理した免疫グ
ロブリン結合性タンパク質の抗体結合活性を、酸未処理の免疫グロブリン結合性タンパク
質の抗体結合活性で除することで残存活性を算出した。１より残存活性を減ずることで溶
出率を算出し、酸溶出性を評価した。

結果を表２３に示す。ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ａ（配列番号２０７）、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
９ｂ（配列番号２０８）、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｃ（配列番号２０９）、ＦｐＬ＿Ｃ３
ＫＸ９ｄ（配列番号２１０）、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ｅ（配列番号２１１）、ＦｐＬ＿
Ｃ３ＫＸ１０ａ（配列番号２１２）およびＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ１０ｂ（配列番号２１３
）は、ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅ（配列番号１７５）と比較し、溶出率が高くなっており、
これら変異型免疫グロブリン結合性タンパク質の酸による溶出性が向上していることが確
認された。中でもＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ９ａ（配列番号２０７）およびＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ
１０ａ（配列番号２１２）は、酸に対する溶出性が特に向上していることがわかる。

実施例２６ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅへの変異導入およびライブラリ作製（その３）
（１）ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅ（配列番号１７５）を発現するベクターｐＥＴ－ＦｐＬ
＿Ｃ３ＫＸ７ｅを鋳型として、１５番目および３４番目のアミノ酸残基に対する飽和置
換体ライブラリを作製した。プライマーは、実施例１（２）と同様、２２ｃ－Ｔｒｉｃｋ
法に倣い、変異導入箇所に適切な混合塩基を配置し、変異導入箇所を中心としたインバー
スＰＣＲができるように設計した（配列番号２２１から２３２）。これらのプライマーを
一箇所の置換につき６本一組として、表１および表２４の組成で混合し、ＰＣＲＰｒｉ
ｍｅｒ混合液（Ｆｏｒｗａｒｄ／Ｒｅｖｅｒｓｅｐｒｉｍｅｒｍｉｘ）を調製した。

（２）ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅを鋳型ＤＮＡとした他は、実施例２（２－２）
と同様な方法でインバースＰＣＲによる部位特異的変異導入を行った。

実施例２７ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅアミノ酸置換体のスクリーニング（その３）
（１）ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅ（形質転換体）および実施例２６で作製したラ
ンダム変異体ライブラリ（形質転換体）で作製した部位特異的アミノ酸置換体ライブラリ
（形質転換体）を、実施例２（１）から（２）と同様な方法で培養後、実施例１５（２）
に記載のアルカリ処理を行なった。

（３）約２００株の形質転換体を評価し、その中からＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅ（配列番
号１７５）と比較してアルカリ安定性が向上した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現
する形質転換体を選択した。

（６）（３）で選択した免疫グロブリン結合性タンパク質を発現する形質転換体または
ｐＥＴ－ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅ（配列番号１７５）を発現する形質転換体を、比較例１
（２－１）から（２－２）と同様な方法で培養し、比較例１（２－３）と同様な方法でタ
ンパク質抽出液を調製した。前記抽出液は遠心分離し、得られた上清をフィルターに通し
、清澄化した。

（９）実施例２５（４）と同様な方法で酸溶出性を評価した。

結果を表２５に示す。配列番号１７５記載のアミノ酸配列において、少なくともＡｓｎ
１５Ｖａｌ、Ｇｌｕ３４Ａｓｐ、Ｇｌｕ３４Ｐｈｅ、Ｇｌｕ３４ＬｅｕおよびＧｌｕ３４
Ｖａｌより選択される１以上のアミノ酸置換を有した免疫グロブリン結合性タンパク質は
ＦｐＬ＿Ｃ３ＫＸ７ｅ（配列番号１７５）と比較し、溶出率が高くなっており、これら
変異型免疫グロブリン結合性タンパク質の酸による溶出性が向上していることが確認され
た。

Claims

Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ属細菌由来ＰｒｏｔｅｉｎＬの免疫グロブリン結合ドメインの
アミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、少なくとも以下の（１）から（
１１）より選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し、かつ免疫グロブリン結合活性を有
するタンパク質；
（１）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がグルタミンに置換
（２）配列番号１の１３番目のリジンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（３）配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がバリンまたはイソロイシ
ンに置換
（４）配列番号１の６番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（５）配列番号１の８番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
（６）配列番号１の１５番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（７）配列番号１の２３番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニン
またはロイシンに置換
（８）配列番号１の３４番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアスパラギン酸、
フェニルアラニン、ロイシンおよびバリンのいずれかに置換
（９）配列番号１の３８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置換
（１０）配列番号１の５０番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がメチオニンに置
換
（１１）配列番号１の５３番目のチロシンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換。
以下の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のタンパク質である、請求項１に記載のタン
パク質：
（ａ）配列番号１または５に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列におい
て、少なくとも前記（１）から（１１）より選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し、
かつ免疫グロブリン結合活性を有するタンパク質；
（ｂ）配列番号１または５に記載のアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列におい
て、少なくとも前記（１）から（１１）より選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し、
さらに前記（１）から（１１）以外に１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ
酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含み、かつ免疫グロブリン結合活性を
有するタンパク質；
（ｃ）配列番号１または５に記載のアミノ酸配列またはその部分配列と７０％以上の相同
性を有するアミノ酸配列を含み、ただし当該アミノ酸配列において、少なくとも前記（１
）から（１１）より選択される１つ以上のアミノ酸置換を有し、かつ免疫グロブリン結合
活性を有するタンパク質。
さらに、少なくとも以下の（ｉ）から（ｌｉｉｉ）より選択される１つ以上のアミノ酸
置換を有する、請求項１に記載のタンパク質：
（ｉ）配列番号１の５０番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに置換
（ｉｉ）配列番号１の１番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がグリシンまたはバ
リンに置換
（ｉｉｉ）配列番号１の３番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換
（ｉｖ）配列番号１の４番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がリジンまたはグリ
シンに置換
（ｖ）配列番号１の５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（ｖｉ）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（ｖｉｉ）配列番号１の８番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がグリシンに置換
（ｖｉｉｉ）配列番号１の９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（ｉｘ）配列番号１の１７番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニ
ンに置換
（ｘ）配列番号１の２１番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
（ｘｉ）配列番号１の２７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がグリシンまたは
アルギニンに置換
（ｘｉｉ）配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がプロリンに置換
（ｘｉｉｉ）配列番号１の３１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置
換
（ｘｉｖ）配列番号１の３６番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（ｘｖ）配列番号１の４１番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置換
（ｘｖｉ）配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がセリンまたは
グリシンに置換
（ｘｖｉｉ）配列番号１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がスレオニン
またはイソロイシンに置換
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１の５０番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がセリン、
リジンおよびアスパラギン酸のいずれかに置換
（ｘｉｘ）配列番号１の５１番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（ｘｘ）配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリン、グリシ
ンおよびアスパラギン酸のいずれかに置換
（ｘｘｉ）配列番号１の５３番目のチロシンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニン
に置換
（ｘｘｉｉ）配列番号１の５４番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がイソロイシン
またはメチオニンに置換
（ｘｘｉｉｉ）配列番号１の６２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチジ
ン、アルギニン、ロイシン、メチオニンおよびトリプトファンのいずれかに置換
（ｘｘｉｖ）配列番号１の６５番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がチロシンに
置換
（ｘｘｖ）配列番号１の６９番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置換
（ｘｘｖｉ）配列番号１の２番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がセリンまたはプ
ロリンに置換
（ｘｘｖｉｉ）配列番号１の３番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置
換
（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号１の５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がリジンま
たはアルギニンに置換
（ｘｘｉｘ）配列番号１の２７番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がバリン、リ
ジンおよびイソロイシンのいずれかに置換
（ｘｘｘ）配列番号１の３２番目のフェニルアラニンに相当するアミノ酸残基がロイシン
に置換
（ｘｘｘｉ）配列番号１の３８番目のリジンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（ｘｘｘｉｉ）配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がイソロイ
シンに置換、
（ｘｘｘｉｉｉ）配列番号１の４７番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニン
またはアルギニンに置換
（ｘｘｘｉｖ）配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアスパラ
ギンに置換。
（ｘｘｘｖ）配列番号１の２番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（ｘｘｘｖｉ）配列番号１の５番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアスパラギ
ン酸に置換
（ｘｘｘｖｉｉ）配列番号１の６番目のプロリンに相当するアミノ酸残基がロイシンまた
はスレオニンに置換
（ｘｘｘｖｉｉｉ）配列番号１の７番目のリジンに相当するアミノ酸残基がプロリンに置
換
（ｘｘｘｉｘ）配列番号１の１４番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換
（ｘｌ）配列番号１の２３番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がアルギニンまた
はバリンに置換
（ｘｌｉ）配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニンに
置換
（ｘｌｉｉ）配列番号１の３１番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がメチオニンに
置換
（ｘｌｉｉｉ）配列番号１の３３番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がアスパラ
ギン酸、グリシンおよびバリンのいずれかに置換
（ｘｌｉｖ）配列番号１の３５番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置
換
（ｘｌｖ）配列番号１の３６番目のスレオニンに相当するアミノ酸残基がセリンに置換
（ｘｌｖｉ）配列番号１の３７番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がスレオニンに置
換
（ｘｌｖｉｉ）配列番号１の４１番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がイソロイシン
またはチロシンに置換
（ｘｌｖｉｉｉ）配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基がヒスチ
ジンまたはアルギニンに置換
（ｘｌｖｉｖ）配列番号１の５２番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基がロイシン
またはチロシンに置換
（ｌ）配列番号１の６０番目のグリシンに相当するアミノ酸残基がアルギニンに置換
（ｌｉ）配列番号１の６４番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がロイシンに置換
（ｌｉｉ）配列番号１の６６番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がバリンに置換
（ｌｉｉｉ）配列番号１の６９番目のアラニンに相当するアミノ酸残基がロイシンまたは
バリンに置換。
さらに、少なくとも以下の（Ｉ）から（ＶＩＩ）より選択される１つ以上のリジン残基
がリジン以外の塩基性アミノ酸またはヒドロキシ基を有するアミノ酸残基に置換した、請
求項１に記載のタンパク質：
（Ｉ）配列番号１の７番目に相当するリジン残基
（ＩＩ）配列番号１の１３番目に相当するリジン残基
（ＩＩＩ）配列番号１の２２番目に相当するリジン残基
（ＩＶ）配列番号１の２９番目に相当するリジン残基
（Ｖ）配列番号１の３８番目に相当するリジン残基
（ＶＩ）配列番号１の４８番目に相当するリジン残基
（ＶＩＩ）配列番号１の６７番目に相当するリジン残基。
さらに、配列番号１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のアスパラギン
酸への置換、配列番号１の６番目のプロリンに相当するアミノ酸残基のセリンへの置換、
配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換
、配列番号１の４９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のバリンへの置換、配列
番号１の６２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のチロシンへの置換、配列番号
１の２３番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、および
配列番号１の４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換
より選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する、請求項１に記載のタンパク質。
少なくとも以下の（Ｘ）または（Ｙ）のアミノ酸置換を有する、請求項３に記載のタン
パク質：
（Ｘ）配列番号１の４番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のグリシンへの置換、
配列番号１の６番目のプロリンに相当するアミノ酸残基のセリンへの置換、配列番号１の
７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、配列番号１の１３番目、２
２番目、４８番目および６７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置換
、配列番号１の２３番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置換、
配列番号１の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基のイソロイシンへの置換、配列番
号１の３８番目のリジンに相当するアミノ酸残基のグルタミン酸への置換、配列番号１の
４４番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置換、配列番号１の４
９番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、配列番号１の
５０番目および６２番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のチロシンへの置換、配
列番号１の５３番目のチロシンに相当するアミノ酸残基のフェニルアラニンへの置換なら
びに配列番号１の６９番目のアラニンに相当するアミノ酸残基のバリンへの置換；
（Ｙ）配列番号１の４番目のグルタミン酸に相当するアミノ酸残基のグリシンへの置換、
配列番号１の６番目のプロリンに相当するアミノ酸残基のセリンへの置換、配列番号１の
７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアラニンへの置換、配列番号１の１３番目、２
２番目および６７番目のリジンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置換、配列番号
１の２３番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置換、配列番号１
の２９番目のリジンに相当するアミノ酸残基のイソロイシンへの置換、配列番号１の３８
番目のリジンに相当するアミノ酸残基のグルタミン酸への置換、配列番号１の４４番目の
アスパラギンに相当するアミノ酸残基のアルギニンへの置換、配列番号１の４８番目のリ
ジンに相当するアミノ酸残基のヒスチジンへの置換、配列番号１の４９番目のグルタミン
酸に相当するアミノ酸残基のアスパラギン酸への置換、配列番号１の５０番目および６２
番目のアスパラギンに相当するアミノ酸残基のチロシンへの置換、配列番号１の５３番目
のチロシンに相当するアミノ酸残基のフェニルアラニンへの置換、配列番号１の６４番目
のイソロイシンに相当するアミノ酸残基のロイシンへの置換ならびに配列番号１の６９番
目のアラニンに相当するアミノ酸残基のバリンへの置換。
配列番号２０７または２１２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のタンパク
質。
請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
以下の（Ａ）または（Ｂ）を含む、遺伝子組換え宿主：
（Ａ）請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
；
（Ｂ）請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含む発現ベクター。
宿主がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）である、請求項１０
に記載の遺伝子組換え宿主。
請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含
む遺伝子組換え宿主または該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む遺伝子組換え宿
主を培養し該タンパク質を発現させる工程と、発現した前記タンパク質を回収する工程と
を含む、免疫グロブリン結合性タンパク質の製造方法。
宿主がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）である、請求項１２
に記載の製造方法。
不溶性担体と、当該不溶性担体に固定化した請求項１から７のいずれか１項に記載のタ
ンパク質とを含む、免疫グロブリン吸着剤。
請求項１４に記載の吸着剤を充填したカラムに免疫グロブリンを含む溶液を添加し当該
免疫グロブリンを前記吸着剤に吸着させる工程と、前記吸着剤に吸着した免疫グロブリン
をｐＨ変化で溶出させる工程とを含む、前記溶液中に含まれる免疫グロブリンの分離方法
。
前記ｐＨ変化が、ｐＨの低下である、請求項１５に記載の方法。