KR20220002325A - 단백질 A에 결합할 수 있는 Fc 영역이 없는 항체 또는 항체 단편을 분리하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 단계를 포함하는, 항체 또는 항체 단편을 분리하는 방법을 개시한다:
a) VH3 영역을 갖고 단백질 A에 결합할 수 있는 Fc 영역이 없는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 피드를 제공하는 단계;
b) 피드를 공유 커플링된 리간드를 갖는 분리 수지와 접촉시키는 단계이며, 여기서 리간드는 서열식별번호: 1에 의해 정의된 바와 같은 폴리펩티드를 포함하고, 항체 또는 항체 단편은 분리 수지에 결합하는 것인 단계;
c) 임의적으로, 분리 수지를 세척액으로 세척하는 단계;
d) 항체 또는 항체 단편을 분리 수지로부터 용리액으로 용리시키고 항체 또는 항체 단편을 회수하는 단계.

Description

단백질 A에 결합할 수 있는 Fc 영역이 없는 항체 또는 항체 단편을 분리하는 방법

본 발명은 면역글로불린의 분리, 보다 특히 VH3 영역을 갖고 단백질 A에 결합할 수 있는 Fc 영역이 없는 항체 또는 항체 단편을 분리하는 방법에 관한 것이다.

단백질 A 친화성 크로마토그래피는 치료 항체와 같은 면역글로불린의 분리에 광범위하게 사용된다. 단백질 A 리간드는 면역글로불린의 Fc 영역에 선택적으로 결합하여 매우 효율적인 포획 단계를 가능하게 한다. Fc 영역이 결여된 항체 구축물, 예컨대 항체 단편에 대해, 또는 단백질 A에 결합하지 않는 Fc 영역 변이체를 갖는 면역글로불린, 예컨대 IgG3 또는 IgM에 대해, 천연 단백질 A는 면역글로불린의 VH3 영역에도 결합한다는 점에서 여전히 유용할 수 있다. 그러나, 천연 단백질 A는 바이오프로세싱에 이용되는 알칼리성 세정 조건 하에서 안정하지 않으며, 알칼리-안정화된 단백질 A 변이체는 일반적으로 VH3 상호작용을 억제하는 돌연변이를 갖는다 (예컨대, 전문이 참조로 본원에 포함된 US20060194950 참조). 이 문헌은 시판 제품인 맵실렉트(MabSelect)^TM 수레 (SuRe)에 사용된 단백질 A Fc-결합 B 도메인에서 G29A 돌연변이에 의한 VH3 상호작용의 억제에 대해 논의한다. Fc 영역이 결여된 항체/단편에 결합할 수 있는 대안적 리간드는 단백질 L, 단백질 G 및 낙타류 항체를 포함한다. 그러나, 이들은 모두 알칼리성 세정 조건에 매우 민감하다.

따라서, 알칼리 세정을 견디는 분리 수지를 사용하는, 단백질 A에 결합할 수 있는 Fc 영역을 갖지 않는 항체 또는 항체 단편의 친화성 크로마토그래피 분리 방법이 필요하다.

본 발명의 일 측면은 항체 또는 항체 단편을 분리하는 방법을 제공하는 것이다. 이는 하기 단계를 포함하는 방법으로 달성된다:

a) VH3 영역을 갖고 단백질 A에 결합할 수 있는 Fc 영역이 없는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 피드 (feed)를 제공하는 단계;

b) 피드를 지지체에 공유 커플링된 리간드를 갖는 분리 수지와 접촉시키는 단계이며, 여기서 리간드는 하기 서열식별번호 (SEQ ID NO): 1에 의해 정의된 바와 같은 폴리펩티드를 포함하고, 항체 또는 항체 단편은 분리 수지에 결합하는 것인 단계:

상기 식에서,

X₁ = E,K,Y,T,F,L,W,I,M,V,A,H 또는 R,

X₂ = H 또는 K,

X₃ = N 또는 A,

X₄ = D, F, Y, W, K 또는 R;

c) 임의적으로, 분리 수지를 세척액으로 세척하는 단계; 및

d) 항체 또는 항체 단편을 분리 수지로부터 용리액으로 용리시키고 항체 또는 항체 단편을 회수하는 단계.

하나의 이점은, 이 방법은 단백질 A에 결합할 수 있는 Fc 영역 없이 항체/항체를 분리할 수 있다는 것이다. 추가 이점은 리간드 및 수지가 알칼리에 안정하고 최대 2 M NaOH로 반복되는 세정 주기를 견딘다는 것이다.

본 발명의 추가의 적합한 실시양태는 종속항에 기재되어 있다.

도 1은 a) 전형적인 IgG 항체 및 b) Fab 단편의 구조를 나타낸다.
도 2는 a) 맵실렉트 엑스트라 (Xtra); b) 맵실렉트 수레; c) 프로토타입 1 상의 10 mg VHH-EgA1의 크로마토그램을 나타낸다.
도 3은 프로토타입 1 상의 30 mg/mL VHH의 크로마토그램을 나타낸다.

정의

용어 "항체" 및 "면역글로불린"은 본원에서 상호교환 가능하게 사용되며, 항체의 단편, 항체 또는 항체 단편을 포함하는 융합 단백질 및 항체 또는 항체 단편을 포함하는 접합체도 포함하는 것으로 이해된다.

용어 "Fc-결합 폴리펩티드" 및 "Fc-결합 단백질"은 각각 항체의 결정화 가능한 부분 (Fc)에 결합할 수 있는 폴리펩티드 또는 단백질을 의미하며, 예컨대 단백질 A 및 단백질 G, 또는 상기 결합 특성을 유지하는 이의 임의의 단편 또는 융합 단백질을 포함한다.

본원에서 용어 "단백질 A에 결합할 수 있는 Fc 영역이 없는 항체 또는 항체 단편"은 Fc 영역이 결여된 항체 또는 항체 단편 또는 단백질 A에 결합하지 않는 Fc 영역을 갖는 항체/항체 단편을 의미한다. Fc 영역이 결여된 항체/항체 단편의 예는 Fab 단편, 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 도메인 항체, 나노바디 및 이중-특이적 T-세포 인게이저 (BiTe)를 포함한다. 단백질 A에 결합하지 않는 Fc 영역을 갖는 항체의 예는 IgG3 항체, IgM 항체, 낙타류 V_HH 단일-도메인 항체 및 단백질 A에 결합하지 않는 방식으로 조작된 Fc 영역을 갖는 임의의 항체를 포함한다. 특정 항체/단편이 단백질 A에 결합할 수 있는 Fc 영역을 갖는지의 여부에 대한 실제 시험은, 이를 20 mM 포스페이트, 500 mM NaCl, pH 7 로딩 버퍼에서 비-VH3-결합 단백질 A 수지인 맵실렉트^TM 수레 (GE 헬스케어 (GE Healthcare))로 패킹된 컬럼에 로딩하고, 컬럼을 먼저 로딩 버퍼로 세척한 다음 50 mM 시트레이트 pH6 세척 버퍼로 세척하고, 컬럼을 50 mM 시트레이트 pH 2.5 용리 버퍼로 용리시키는 것이다. 항체/단편이 단백질 A에 결합할 수 있는 Fc 영역을 갖지 않는 경우, 이는 주로 로딩 통과액 및/또는 세척 버퍼에서 발견될 것이다. 이러한 Fc 영역을 갖는 경우, 주로 용리물에서 발견될 것이다.

본원에서 용어 "링커"는 다량체에서 2개의 폴리펩티드 단위, 단량체 또는 도메인을 서로 연결하는 요소를 의미한다.

본원에서 용어 "스페이서"는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 다량체를 지지체에 연결하는 요소를 의미한다.

아미노산 서열의 비교에 대한 용어 "동일성 %"는, 예컨대 문헌 (Altshul et al. (1990) J. Mol. Biol., 215: 403-410)에 기재된 기본 국소 정렬 도구 (블라스트(BLAST)^TM)와 같은 표준 정렬 알고리즘에 의해 결정된다. 이를 위한 웹-기반 소프트웨어는 미국 국립 의학 도서관으로부터 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome에서 자유롭게 이용 가능하다. 여기에서, 알고리즘 "blastp (단백질-단백질 블라스트)"는 쿼리 서열과 대상 서열을 정렬하고 i.a. 동일성 %를 결정하는데 이용된다.

본원에서 용어 "천연 단백질 A"는, 서열식별번호: 31에 의해 정의된 바와 같이, 서로 직접적으로 연결된 5개의 천연 면역글로불린-결합 도메인 E, D, A, B, C를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 폴리펩티드는 N-말단 끝에 리더 서열 및 C-말단 또는 N-말단 끝에 커플링 요소를 추가로 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "포함하다", "포함하는", "함유하는", "갖는" 등은 미국 특허법에서 이들에게 부여된 의미를 가질 수 있고, "포함하다", "포함하는" 등을 의미할 수 있고; "본질적으로 ~ 로 이루어진" 또는 "본질적으로 이루어진" 등은 미국 특허법에서 부여된 의미를 가지며, 용어는 인용된 것의 기본 또는 신규 특징이 인용된 것보다 많은 것의 존재에 의해 변화되지 않는 한 인용된 것보다 많은 존재를 허용할 수 있는 개방형이나 선행 기술의 실시양태는 배제한다.

실시양태의 상세한 설명

일 측면에서, 본 발명은 스타필로코쿠스 (Staphylococcus) 단백질 A에 결합할 수 있는 Fc 영역을 갖지 않는 항체 또는 항체 단편을 분리하는 방법을 개시한다. 방법은 하기 단계를 포함한다:

a) VH3 영역을 갖고 단백질 A에 결합할 수 있는 Fc 영역이 없는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 피드, 예컨대 정화된 세포 배양 상청액을 제공하는 단계. 특히, 분리할 피드에서 표적 종은 VH3 영역을 갖고 Fc 영역이 없는 항체 단편일 수 있다. 이들은, 예컨대 Fab, scFv, 도메인 항체, 나노바디 및 BiTe로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: 분리할 피드에서 표적 종은 또한 VH3 영역 및 단백질 A에 결합하지 않는 Fc 영역을 갖는 항체일 수 있다. 이들은, 예컨대 IgG3, IgM 및 낙타류 V_HH 단일-도메인 항체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 전반적으로, 항체 또는 항체 단편은 VH3 영역을 통해 천연 단백질 A에 결합할 수 있다. 비-Fc 항체/단편의 경우, 상기 정의에 따라 공유 커플링된 천연 단백질 A 리간드를 포함하는 맵실렉트^TM 또는 맵실렉트 엑스트라 수지 (GE 헬스케어)에 결합하는지를 점검하여 이를 쉽게 시험할 수 있다.

b) 피드를 지지체에 공유 커플링된 리간드를 갖는 분리 수지와 접촉시키는 단계이며, 여기서 리간드는 서열식별번호: 1에 의해 정의되거나 이에 적어도 85%, 예컨대 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하고, 항체 또는 항체 단편은 분리 수지에 결합하는 것인 단계:

상기 식에서,

X₁ = E,K,Y,T,F,L,W,I,M,V,A,H 또는 R,

X₂ = H 또는 K,

X₃ = N 또는 A,

X₄ = D, F, Y, W, K 또는 R.

분리 수지에 대한 항체 또는 항체 단편의 결합 강도는 나노몰 범위 또는 더 강할 수 있다.

c) 임의적으로, 분리 수지를 세척액으로 세척하여 오염물 및/또는 불순물을 제거하는 단계. 세척액은, 예컨대 pH 5-7의 버퍼일 수 있다.

d) 항체 또는 항체 단편을 분리 수지로부터 용리액으로 용리시키고 항체 또는 항체 단편을 회수하는 단계. 용리액은 적절하게는 pH 2-5의 버퍼일 수 있다.

단계 d) 이후에, 방법은 pH 13 또는 그 초과의 세정액으로 상기 분리 수지를 세정하는 단계 e)를 추가로 포함할 수 있다. 세정액은 0.1 - 2 M, 예컨대 0.5 - 2 M의 알칼리 금속 수산화물, 예컨대 NaOH를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 단계 a) - e)는 적어도 50회, 예컨대 적어도 200회 반복된다.

특정 실시양태에서, X₁ = E, X₂ = H, X₃ = N 및/또는 X₄ = D이다. 이러한 실시양태의 예는 하기를 포함한다:

일부 실시양태에서, 리간드는 폴리펩티드 P의 다량체를 포함한다. 이러한 다량체는 0-25개의 아미노산 잔기, 예컨대 0-15개의 아미노산 잔기를 포함하는 링커 영역 L에 의해 적합하게 연결될 수 있고, 예컨대 구조 (P - L)_n-1 - P 또는 L-(P - L)_n-1 - P를 가질 수 있다. 다량체는, 예컨대 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체 또는 구량체일 수 있다. 이는 다량체의 모든 단위가 동일한 동종다량체일 수 있거나 적어도 하나의 단위가 다른 단위와 상이한 이종다량체일 수 있다. 유리하게는, 다량체의 모든 단위는, 예컨대 상기 개시된 돌연변이를 포함함으로써 알칼리에 안정하다. 폴리펩티드는 폴리펩티드의 C-말단과 N-말단 끝 사이의 펩티드 결합에 의해 서로 직접적으로 연결될 수 있다. 대안적으로, 다량체의 2개 이상의 단위는 올리고머 또는 중합체 종을 포함하는 링커, 예컨대 3-25, 3-20 또는 3-15개 아미노산 잔기와 같은 최대 25개 또는 30개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드를 포함하는 링커에 의해 연결될 수 있다. 링커는, 예컨대 APKVDAKFDKE, APKVDNKFNKE, APKADNKFNKE, APKVFDKE, APAKFDKE, AKFDKE, APKVDA, VDAKFDKE, APKKFDKE, APK, APKYEDGVDAKFDKE 및 YEDG로 이루어진 군으로부터 선택되는 또는 대안적으로 APKADNKFNKE, APKVFDKE, APAKFDKE, AKFDKE, APKVDA, VDAKFDKE, APKKFDKE, APKYEDGVDAKFDKE 및 YEDG로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 의해 정의되거나 이와 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일성을 갖는 펩티드 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어질 수 있다. 이들은 또한 APKADNKFNKE, APKVFDKE, APAKFDKE, AKFDKE, APKVDA, VDAKFDKE, APKKFDKE, APK 및 APKYEDGVDAKFDKE로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열에 의해 정의되거나 이와 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일성을 갖는 펩티드 서열로 본질적으로 이루어질 수 있다.

이러한 링커의 특성은 바람직하게는 단백질 단위의 공간적 입체구조를 불안정하게 하지 않아야 한다. 이들은, 예컨대 링커에서 프롤린의 존재를 피함으로써 달성될 수 있다. 또한, 링커는 바람직하게는 돌연변이된 단백질 단위의 특성을 손상시키지 않도록 알칼리성 환경에서도 충분히 안정해야 한다. 이를 위해, 링커가 아스파라긴을 함유하지 않는 것이 유리하다. 링커가 글루타민을 함유하지 않는 경우, 추가로 유리할 수 있다. 다량체는, 예컨대 클로닝 과정으로부터 유래하거나 절단된 신호전달 서열로부터의 잔기를 구성하는 복수의 아미노산 잔기를 N-말단 끝에 추가로 포함할 수 있다. 추가 아미노산 잔기의 수는, 예컨대 20개 이하, 예컨대 15개 이하, 예컨대 10개 이하 또는 5개 이하일 수 있다. 구체적인 예로서, 다량체는 N-말단 끝에 AQ, AQGT, VDAKFDKE, AQVDAKFDKE 또는 AQGTVDAKFDKE 서열 (리더 서열로도 불림)를 포함할 수 있다. 다량체는, 예컨대 서열식별번호: 7에 의해 정의되거나 이와 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나 이로 본질적으로 이루어질 수 있다.

일부 실시양태에서, 상기 개시된 바와 같은 폴리펩티드 및/또는 다량체는 C-말단 또는 N-말단 끝에 하나 이상의 시스테인 잔기, 복수의 리신 잔기 및 복수의 히스티딘 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 커플링 요소를 추가로 포함한다. 커플링 요소(들)는 또한 C-말단 또는 N-말단 끝으로부터 1-5개의 아미노산 잔기 내, 예컨대 1-3개 또는 1-2개의 아미노산 잔기 내에 위치될 수 있다. 커플링 요소는, 예컨대 C-말단 끝의 단일 시스테인일 수 있다. 커플링 요소(들)는 C- 또는 N-말단 끝에 직접적으로 연결될 수 있거나, 이는 최대 15개의 아미노산, 예컨대 1-5, 1-10 또는 5-10개의 아미노산을 포함하는 스트레치를 통해 연결될 수 있다. 이 스트레치는 바람직하게는 돌연변이된 단백질의 특성이 손상되지 않도록 알칼리성 환경에서도 충분히 안정해야 한다. 이를 위해, 스트레치는 아스파라긴을 함유하지 않는 것이 유리하다. 스트레치가 글루타민을 함유하지 않는 경우, 추가로 유리할 수 있다. C-말단 시스테인을 갖는 것의 이점은, 단백질의 종점 커플링이 시스테인 티올과 지지체 상의 친전자성 기의 반응을 통해 달성될 수 있다는 것이다. 이는 결합 용량에 중요한 커플링된 단백질의 우수한 이동성을 제공한다.

폴리펩티드 또는 다량체는, 예컨대 리간드에 존재하는 티올 (시스테인 내), 아미노 (리신 또는 N-말단 내) 및/또는 카르복시 (아스파르트산 또는 글루탐산 또는 C-말단 내) 기를 활용하는 통상적인 커플링 기술을 통해 지지체에 부착될 수 있다. 비세폭시드, 에피클로로히드린, CNBr, N-히드록시숙신이미드 (NHS) 등은 널리 골지된 커플링 시약이다. 지지체와 폴리펩티드/다량체 사이에 스페이서로 공지된 분자가 도입될 수 있으며, 이는 폴리펩티드/다량체의 유용성을 개선하고 지지체에 대한 폴리펩티드/다량체의 화학적 커플링을 용이하게 한다. 폴리펩티드/다량체의 특성 및 커플링 조건에 따라, 커플링은 다점 커플링 (예컨대, 복수의 리신을 통해) 또는 단일점 커플링 (예컨대, 단일 시스테인을 통해)일 수 있다.

특정 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 다량체는 티오에테르 결합을 통해 지지체에 커플링된다. 이러한 커플링을 수행하는 방법은 이 분야에 널리 공지되어 있으며, 표준 기술 및 장비를 사용하여 이 분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 수행된다. 티오에테르 결합은 유연하고 안정적이며 일반적으로 친화성 크로마토그래피에 사용하기에 적합하다. 특히, 티오에테르 결합이 폴리펩티드 또는 다량체 상의 말단 또는 근-말단 시스테인 잔기를 통하는 경우, 커플링된 폴리펩티드/다량체의 이동성이 향상되어 개선된 결합 용량 및 결합 동역학을 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드/다량체는 상기 기재된 바와 같이 단백질 상에 제공된 C-말단 시스테인을 통해 커플링된다. 이는 시스테인 티올을 지지체 상의 친전자성 기, 예컨대 에폭시드기, 할로히드린기 등에 효율적으로 커플링시켜 티오에테르 브릿지 커플링을 생성한다.

특정 실시양태에서, 지지체는 다당류와 같은 폴리히드록시 중합체를 포함한다. 다당류의 예는, 예컨대 덱스트란, 전분, 셀룰로스, 풀루란, 한천, 아가로스 등을 포함한다. 다당류는 내재적으로 비특이적 상호작용의 정도가 낮은 친수성이며, 높은 함량의 반응적 (활성화 가능한) 히드록실기를 제공하고, 일반적으로 바이오프로세싱에 사용되는 알칼리성 세정 용액에 대해 안정하다.

일부 실시양태에서, 지지체는 한천 또는 아가로스를 포함한다. 본 발명에 사용되는 지지체는 역현탁 겔화 (S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964))와 같은 표준 방법에 따라 쉽게 제조될 수 있다. 대안적으로, 기본 매트릭스는 시판 제품, 예컨대 세파로스(SEPHAROSE)^TM FF (GE 헬스케어)라는 이름으로 판매되는 가교된 아가로스 비드이다. 대규모 분리에 특히 유리한 일 실시양태에서, 지지체는 US6602990 또는 US7396467 (전문이 참조로 본원에 포함됨)에 기재된 방법을 사용하여 강성을 증가시키도록 조정되었으며, 따라서 매트릭스를 높은 유속에 더 적합하게 만든다.

특정 실시양태에서, 중합체, 다당류 또는 아가로스 지지체와 같은 지지체는 히드록시알킬 에테르 가교와 같이 가교된다. 이러한 가교를 생성하는 가교제 시약은, 예컨대 에피클로로히드린과 같은 에피할로히드린, 부탄디올 디글리시딜 에테르와 같은 디에폭시드, 알릴 할라이드 또는 알릴 글리시딜 에테르와 같은 알릴화 시약일 수 있다. 가교는 지지체의 강성에 유익하고, 화학적 안정성을 개선한다. 히드록시알킬 에테르 가교는 알칼리에 안정하고, 유의한 비특이적 흡착을 일으키지 않는다.

일부 실시양태에서, 고체 지지체는 필터 (예컨대, 막 또는 심층 필터 매트릭스) 형태이다. 특히, 지지체는 예컨대, US9802979, US20160288089 및 PCT/EP2019/050227 (전문이 참조로 본원에 포함됨)에 기재된 바와 같이 셀룰로스 나노섬유의 하나 이상의 시트 또는 막을 포함할 수 있다. 셀룰로스 나노섬유는 화학적 및 기계적 안정성 개선을 위해 적절하게 가교될 수 있다.

실시예

실시예 1: 단일 중쇄 가변 도메인 (V _H H)의 발현

나노바디로도 공지된 카멜리대 (Camelidae) 기원으로부터의 단일 중쇄 가변 도메인 (V_HH)이 에쉐리키아 콜라이 (Escherichia coli) (이. 콜라이 (E.coli))에서 이종성으로 발현되었다. V_HH 단편은 문헌 (K R Schmitz et al:, Structure 21, 1214-1224, (2013))으로부터의 서열, 하기 서열식별번호: 23을 기반으로 하였다:

>4KRN:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCE

이 서열은 OmpA 신호-펩티드 (이. 콜라이, 외부 막 단백질 A, UniProt P0A910)를 사용하여 주변세포질 발현을 위해 변형되었으며, 신호-펩티드 절단 부위가 디-펩티드 AQ로 도입된 후 KpnI에 대한 효소적 제한 부위 (아미노산 VD)가 도입되었다. 신호-펩티드 프로세싱 후의 최종 단백질은 하기 서열식별번호: 24에서 발견되는 서열을 가졌다:

이 서열은 이. 콜라이 발현으로부터 독점적인 코돈 최적화를 이용하여 DNA 합성 회사 아툼 (ATUM) (미국 캘리포니아주)에 의해 생성되었고, IPTG 유도 프로모터를 함유하는 발현 벡터 (플라스미드)에 클로닝되었다. 플라스미드는 화학적으로 적격인 이. 콜라이 K12 세포로 형질전환되었다. 플라스미드를 20 ng/μl의 농도로 25 mM 트리스 pH 8.5에 용해시켰다. 1 μl의 플라스미드를 얼음조에서 50 μl의 해동된 적격 세포에 첨가하고, 20분 동안 차갑게 유지하였다. 42℃에서 60초 동안 열 쇼크를 가한 다음, 얼음조에서 2분 동안 냉각시켰다. 세포를 얼음 상에서 식힌 후, 950 μl 루리아 (Luria) 브로쓰 (LB)를 첨가하고, 세포를 쉐이크-후드에서 225 rpm에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 각각의 플레이트에 100 μl 씩 루리아 한천 (LA) 플레이트에 플레이팅하고, 플레이트를 37℃로 설정된 오븐에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 단일 콜로니를 선택하고, LB에서 최종 OD 600 nm가 1이 되도록 성장시킨 다음, 15% 글리세롤을 첨가하고, 추가 사용까지 -80℃에서 동결시켰다. 동결된 세포 은행을 해동시키고, 100 μl를 50 mg/L 카나마이신이 보충된 100 mL 테리픽 (Terrific) 브로쓰 (TB)의 접종에 사용하고, 쉐이크-후드에서 37℃에서 밤새 성장시켰다. 다음 날, 10 mL의 밤샘 배양물을 50 mg/L 카나마이신이 보충된 750 mL의 발효 배지의 접종에 사용하였다. 600 nm에서 측정한 광학 밀도(OD)가 80에 도달했을 때, 최종 농도 1 mM IPTG로 배양물을 유도하였다. 배양물을 유도 후 통기 및 교반 하에 12시간 동안 일정한 온도 및 pH에서 유지하였다. 발효는 24시간 후에 종료되었고, 세포는 30분 동안 2500 x g에서 원심분리에 의해 상청액으로부터 분리되었다. 상청액을 붓고, 세포를 600 mL PBS에 재현탁시키고, 48℃에서 3시간 동안 열 인큐베이션하여 주변세포질 발현된 단백질을 방출하였다. 열 처리된 현탁액을 10,000 x g에서 30분 동안 원심분리한 다음, 0.2 μm 필터를 사용하여 멸균 여과하였다. 정화된 상청액을 20 mM 포스페이트 pH 7, 500 mM NaCl로 평형화된 24 mL 맵실렉트^TM 수지 (GE 헬스케어, 스웨덴 웁살라)로 패킹된 하이스케일 (HiScale) 16 컬럼 (GE 헬스케어, 스웨덴 웁살라)에 로딩하였다. 컬럼을 50 mM 시트레이트 pH 6으로 세척하여 용리 풀의 전도도를 감소시킨 다음, 50 mM 시트레이트 pH 2.5로 용리시켰다. 정제된 V_HH 단편은 11 mL 풀 부피에서 7.7 g/L의 농도를 가졌다. 2 M 트리스 염기를 첨가하여 용리 풀을 pH 7로 조정하였다.

실시예 2: 상이한 크로마토그래피 수지 상의 V _H H 항체 단편의 VH3 결합

실시예 1에서 생성된 VHH 단편을 상이한 크로마토그래피 수지, 맵실렉트^TM 엑스트라 (GE 헬스케어, 스웨덴 웁살라), 맵실렉트^TM 수레 (GE 헬스케어, 스웨덴 웁살라) 및 프로토타입 1: US20180094024 (전문이 참조로 본원에 포함됨)에 기재된 방법에 따라 서열식별번호: 7의 육량체 리간드와 커플링된 중앙 비드 직경 (d50,v) 57 μm의 고도로 가교된 아가로스 비드에 대한 결합에 대해 시험하였다. 모든 실험은 AKTA 퓨어 150 FPLC 시스템 (GE 헬스케어, 스웨덴 웁살라)을 사용하여 수행되었다. 맵실렉트^TM 엑스트라 및 맵실렉트^TM 수레는 미리 패킹된 1 mL 하이트랩(HiTrap)^TM 컬럼 (GE 헬스케어, 스웨덴 웁살라)을 사용하여 시험되었다. 프로토타입 1은 컬럼 부피 (CV)가 1.94 mL인 트리콘 (Tricorn) 5 컬럼 (GE 헬스케어, 스웨덴 웁살라)에 패킹되었다. 모든 크로마토그래피 실행은 실행 버퍼로 20 mM 포스페이트, 500 mM NaCl, pH 7 및 50 mM 시트레이트 pH 6으로 이루어진 제2 버퍼, 및 용리 버퍼로 50 mM 시트레이트 pH 2.5를 사용하여 수행되었다. 상이한 수지에 대한 결합을 시험하기 위해, 실시예 1에서 생성된 10 mg V_HH 단편을 7 mL 실행 버퍼 (20 mM 포스페이트 pH 7, 500 mM NaCl)에 희석시키고, 1 mL 맵실렉트^TM 엑스트라, 수레 또는 프로토타입 1 컬럼에 로딩하였다. 크로마토그래피 실행의 결과는 도 2a)-c)에 나타나 있다. V_HH 단편은 73%의 회수율로 맵실렉트^TM 엑스트라 컬럼에 결합되었고 86%의 회수율로 프로토타입 1에 결합되었다. 그러나, 단편은 단지 4%의 회수율로 맵실렉트^TM 수레 수지에 매우 약하게 결합하였으며, 대부분의 단백질은 로딩 또는 세척 단계에서 발견되었다. 또한, 프로토타입 1에 대한 동적 결합 용량을 6분 체류 시간을 사용하여 10% 파과 (breakthrough)에 도달할 때까지 로딩함으로써 V_HH 단편에 대해 측정하였다. 트리콘 5/100 컬럼은 프로토타입 1로 1.98 mL CV로 패킹되었다. 용량 측정은 실행 버퍼로 20 mM 포스페이트, 150 mM NaCl pH 7.4 및 50 mM 아세테이트 pH 3.5를 갖는 용리 버퍼 B로 수행되었다. 컬럼은 0.5 M NaOH를 사용하여 실행 사이에 재생되었다. V_HH 단편을 50 mL 실행 버퍼에 2.3 mg/mL로 희석시키고, 스테리벡스 (Sterivex) 0.22 μm 필터로 여과하였다. 최종 농도는 280 nm에서 UV 측정에 의해 결정되었다. 컬럼을 실행을 시작하기 전에 1 mL/분의 유속으로 평형화하였다. 샘플의 최대 흡광도는 샘플을 바이패스로 실행하여 측정되었다. 샘플 적용은 280 nm에서의 흡광도가 최대 흡광도의 10%에 도달할 때까지 0.33 mL/min (6분 체류 시간)의 유속으로 수행되었다. 세척 단계를 10 CV 동안 1 mL/min의 유속으로 수행한 다음, 버퍼 B로 등용매 용리를 수행하였다. CIP를 3 CV 동안 1 mL/min의 유속으로 0.5 M NaOH로 수행되었다. 100 mAU보다 큰 피크는 선택된 배출구에서 수집되었다. 프로토타입 1 수지에 대한 동적 결합 용량은 6분 체류 시간을 사용하여 10% 파과 (Q_B10)에서 36 mg/mL였다.

도 2a)

컬럼: 맵실렉트^TM 엑스트라

샘플: 10 mg VHH-EgA1 (서열식별번호: 25)

버퍼: 출발: 20 mM 포스페이트, 500 mM NaCl, pH 7

세척 2: 50 mM 시트레이트 pH 6

용리: 50 mM 시트레이트 pH 2.5

도 2b)

컬럼: 맵실렉트^TM 수레

샘플: 10 mg VHH-EgA1 (서열식별번호: 25)

버퍼: 출발: 20 mM 포스페이트, 500 mM NaCl, pH 7

세척 2: 50 mM 시트레이트 pH 6

용리: 50 mM 시트레이트 pH 2.5

도 2c)

컬럼: 프로토타입 1

샘플: 10 mg VHH-EgA1 (서열식별번호: 25)

버퍼: 출발: 20 mM 포스페이트, 500 mM NaCl, pH 7

세척 2: 50 mM 시트레이트 pH 6

용리: 50 mM 시트레이트 pH 2.5

실시예 3: Fab의 VH3 결합

VH3 유형 Fab는 파파인을 사용한 절단에 의해 전장 모노클로날 항체 (mAb)로부터 생성되었다. mAb 용액 (54 ml, 1836 mg)을 2 M 트리스 염기를 첨가하여 pH 7.5로 조정한 다음, 분해 버퍼 (25 mM Na-포스페이트, 1 mM EDTA, 5 mM 머캅토에탄올, pH 7.5)에 1:1로 희석시켰다. 파파인 결정을 용액에 첨가하였다 (21 mg). 용액을 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 400 μl의 안티파인 (파파인 억제제)을 분해된 mAb에 첨가하였다. 용액을 하이스케일 26/135 캅토 L 컬럼 (GE 헬스케어, 스웨덴 웁살라)에 적용하여 절단된 Fab 단편을 정제하였다. 분해된 풀을 25 mM 트리스 pH 8로 평형화된 캅토 L 컬럼에 로딩한 다음, 50 mM Na-시트레이트 pH 5.0을 사용하여 제2 세척 및 50 mM Na-시트레이트 pH 2.3을 사용하여 용리를 수행하였다. Fab를 mAb의 완전한 절단을 확인하기 위해 슈퍼덱스(Superdex)^TM 200 인크리즈 (Increase) (GE 헬스케어, 스웨덴 웁살라)를 사용하여 SEC로 분석하였다. 프로토타입 1에 대한 동적 결합 용량을 6분 체류 시간을 사용하여 10% 파과에 도달할 때까지 로딩함으로써 Fab에 대해 측정하였다. 트리콘 5/100 컬럼을 프로토타입 1로 1.98 mL CV로 패킹하였다. 용량 측정은 실행 버퍼로 20 mM 포스페이트, 150 mM NaCl pH 7.4 및 50 mM 아세테이트 pH 3.5를 갖는 용리 버퍼 B로 수행되었다. 컬럼은 0.5 M NaOH를 사용하여 실행 사이에 재생되었다. Fab를 100 mL 실행 버퍼에 2.25 mg/mL로 희석시키고, 스테리벡스 0.22 μm 필터로 여과하였다. 최종 농도는 280 nm에서 UV 측정에 의해 결정되었다. 컬럼을 실행을 시작하기 전에 1 mL/분의 유속으로 평형화하였다. 샘플의 최대 흡광도는 샘플을 바이패스로 실행하여 측정되었다. 샘플 적용은 280 nm에서의 흡광도가 최대 흡광도의 10%에 도달할 때까지 0.33 mL/min (6분 체류 시간)의 유속으로 수행되었다. 세척 단계를 10 CV 동안 1 mL/min의 유속으로 수행한 다음, 버퍼 B로 등용매 용리를 수행하였다. CIP를 3 CV 동안 1 mL/min의 유속으로 0.5 M NaOH로 수행하였다. 100 mAU보다 큰 피크를 선택된 배출구에서 수집하였다. 프로토타입 1 수지에 대한 동적 결합 용량은 6분 체류 시간에 10% 파과 (QB10)에서 106 mg/mL였다.

실시예 4: 단일 중쇄 가변 도메인 (V _H H) 단편 서열의 점 돌연변이

단백질 A와 단일 중쇄 가변 도메인 (V_HH) 단편 간의 상호작용의 견고성을 시험하기 위해, 점 돌연변이 세트를 만든 다음, 맵실렉트^TM 엑스트라, 수레 및 프로토타입 1에 대한 보유 친화성을 시험하였다. V_HH 서열은 이. 콜라이 발현에 대한 독점적인 코돈 최적화를 이용하여 DNA 합성 회사 아툼 (미국 캘리포니아주)에 의해 생성되었고, IPTG 유도된 프로모터를 함유하는 발현 벡터 (플라스미드)로 클로닝되었다. 플라스미드는 화학적으로 적격인 이. 콜라이 K12 세포로 형질전환되었다. 플라스미드를 20 ng/μl의 농도로 25 mM 트리스 pH 8.5에 용해시켰다. 1 μl의 플라스미드를 얼음조에서 50 μl의 해동된 적격 세포에 첨가하고, 20분 동안 차갑게 유지하였다. 이어서, 42℃에서 60초 동안 열 쇼크를 가한 다음, 얼음조에서 2분 동안 냉각시켰다. 세포를 얼음 상에서 식힌 후, 950 μl 루리아 브로쓰 (LB)를 첨가하고, 세포를 쉐이크-후드에서 225 rpm에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 각각의 플레이트에 100 μl 씩 루리아 한천 (LA) 플레이트에 플레이팅하고, 플레이트를 37℃로 설정된 오븐에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 단일 콜로니를 선택하고, LB에서 최종 OD 600 nm가 1이 되도록 성장시킨 다음, 15% 글리세롤을 첨가하고, 추가 사용까지 -80℃에서 동결시켰다. 동결된 세포 은행을 해동시키고, 500 μl를 50 mg/L 카나마이신이 보충된 100 mL 테리픽 브로쓰 (TB)의 접종에 사용하였다. 배양물을 OD 600 nm가 1에 도달할 때까지 37℃에서 성장시킨 후, 1 mM IPTG의 최종 농도로 유도하였다. 유도 후, 배양물을 37℃에서 밤새 성장시키고, 2300 x g에서, 20분 원심분리하여 다음 날 아침에 중단시켰다. 펠릿을 25 mM 트리스-HCl, 500 mM NaCl pH 8.0에 재현탁시킨 다음, 초음파 처리하고 (40% 진폭, 2분, 5초 켜기/3초 끄기), 10,000 xg에서, 10분 원심분리하고, 0.2 μm 필터를 통해 여과하였다. 이어서, 샘플을 맵실렉트^TM 엑스트라, 맵실렉트^TM 수레 및 프로토타입 1 컬럼에 적용하여 결합을 확인하였다. 용리 피크가 확인될 때까지 통과 분획을 수집하였다. 피크가 얻어지지 않는 경우, 실행 버퍼로 25 mM 트리스 pH 8.0 및 50 mM 트리스, 250 mM 이미다졸 pH 8.0을 갖는 5 CV 구배에서의 용리를 이용하여 통과 분획에 대해 Ni-세파로스 FF 컬럼 (GE 헬스케어, 스웨덴 웁살라)을 실행하였다.

Y = 확인된 결합 있음, N = 확인된 결합 없음.

본 명세서의 설명은 최상의 모드를 포함하여 본 발명을 개시하고, 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자가 임의의 장치 또는 시스템을 만들고 사용하고 임의의 포함된 방법을 수행하는 것을 포함하여 본 발명을 실시할 수 있도록 하기 위해 예를 사용한다. 본 발명의 특허 가능한 범위는 청구범위에 의해 정의되며, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 발생하는 다른 예를 포함할 수 있다. 이러한 다른 예는, 청구범위의 문자 그대로의 언어와 상이하지 않은 구조적 요소를 갖거나 청구범위의 문자 그대로의 언어와 실질적으로 차이가 없는 동등한 구조적 요소를 포함하는 경우, 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 본문에 언급된 모든 특허 및 특허 출원은 개별적으로 포함되는 것과 같이 전체가 참조로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> GE Healthcare Bioprocess R&D AB <120> METHOD OF SEPARATION <130> 502312-WO-2 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ligand consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 Ala Gln Xaa Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Xaa Leu Pro Asn Leu Thr Glu 1 5 10 15 Glu Gln Arg Xaa Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val 20 25 30 Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Xaa Ala Gln 35 40 45 <210> 2 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ligand example <400> 2 Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 1 5 10 15 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val 20 25 30 Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln 35 40 45 <210> 3 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ligand example <400> 3 Ala Gln Lys Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 1 5 10 15 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val 20 25 30 Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln 35 40 45 <210> 4 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ligand example <400> 4 Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Lys Leu Pro Asn Leu Thr Glu 1 5 10 15 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val 20 25 30 Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln 35 40 45 <210> 5 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ligand example <400> 5 Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 1 5 10 15 Glu Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val 20 25 30 Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln 35 40 45 <210> 6 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ligand example <400> 6 Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 1 5 10 15 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val 20 25 30 Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Trp Ala Gln 35 40 45 <210> 7 <211> 352 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hexameric ligand <400> 7 Ala Gln Gly Thr Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala 1 5 10 15 Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn 20 25 30 Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile 35 40 45 Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp 50 55 60 Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His 65 70 75 80 Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu 85 90 95 Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys 100 105 110 Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu 115 120 125 Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 130 135 140 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val 145 150 155 160 Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala 165 170 175 Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr 180 185 190 Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe 195 200 205 Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala 210 215 220 Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Lys 225 230 235 240 Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro 245 250 255 Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp 260 265 270 Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn 275 280 285 Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln 290 295 300 Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln 305 310 315 320 Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys 325 330 335 Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 340 345 350 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 8 Ala Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu 1 5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 9 Ala Pro Lys Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 10 Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu 1 5 10 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 11 Ala Pro Lys Val Phe Asp Lys Glu 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 12 Ala Pro Ala Lys Phe Asp Lys Glu 1 5 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 13 Ala Lys Phe Asp Lys Glu 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 14 Ala Pro Lys Val Asp Ala 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 15 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 16 Ala Pro Lys Lys Phe Asp Lys Glu 1 5 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 17 Ala Pro Lys Tyr Glu Asp Gly Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu 1 5 10 15 <210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 18 Tyr Glu Asp Gly 1 <210> 19 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader <400> 19 Ala Gln Gly Thr 1 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader <400> 20 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu 1 5 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader <400> 21 Ala Gln Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu 1 5 10 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader <400> 22 Ala Gln Gly Thr Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu 1 5 10 <210> 23 <211> 138 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH <400> 23 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Ala Leu Pro Gln 100 105 110 Arg Pro Leu Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val 115 120 125 Ser Ser Leu Glu His His His His His His 130 135 <210> 24 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-EgA1 <400> 24 Ala Gln Val Asp Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu 35 40 45 Phe Val Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Ala Leu 100 105 110 Pro Gln Arg Pro Leu Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser Leu Glu His His His His His His 130 135 140 <210> 25 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-EgA1 (T57K) <400> 25 Ala Gln Val Asp Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu 35 40 45 Phe Val Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Tyr Lys Tyr Tyr Thr Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Ala Leu 100 105 110 Pro Gln Arg Pro Leu Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser Leu Glu His His His His His His 130 135 140 <210> 26 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-EgA1 (T57K,K64R) <400> 26 Ala Gln Val Asp Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu 35 40 45 Phe Val Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Tyr Lys Tyr Tyr Thr Asp 50 55 60 Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Ala Leu 100 105 110 Pro Gln Arg Pro Leu Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser Leu Glu His His His His His His 130 135 140 <210> 27 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-EgA1 (T57P) <400> 27 Ala Gln Val Asp Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu 35 40 45 Phe Val Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Tyr Pro Tyr Tyr Thr Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Ala Leu 100 105 110 Pro Gln Arg Pro Leu Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser Leu Glu His His His His His His 130 135 140 <210> 28 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-EgA1 (T57S) <400> 28 Ala Gln Val Asp Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu 35 40 45 Phe Val Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Tyr Ser Tyr Tyr Thr Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Ala Leu 100 105 110 Pro Gln Arg Pro Leu Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser Leu Glu His His His His His His 130 135 140 <210> 29 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-EgA1 (T57R) <400> 29 Ala Gln Val Asp Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu 35 40 45 Phe Val Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Tyr Arg Tyr Tyr Thr Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Ala Leu 100 105 110 Pro Gln Arg Pro Leu Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser Leu Glu His His His His His His 130 135 140 <210> 30 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VHH-EgA1 (S70T) <400> 30 Ala Gln Val Asp Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu 35 40 45 Phe Val Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ala Thr Tyr Leu Ser Ser Asp Tyr Ser Arg Tyr Ala Leu 100 105 110 Pro Gln Arg Pro Leu Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser Leu Glu His His His His His His 130 135 140 <210> 31 <211> 286 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 31 Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn 1 5 10 15 Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser 20 25 30 Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln 35 40 45 Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln Gln Asn Lys Phe Asn Lys Asp Gln Gln 50 55 60 Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln 65 70 75 80 Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr 85 90 95 Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 100 105 110 Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 115 120 125 Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 130 135 140 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 145 150 155 160 Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn 165 170 175 Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu 180 185 190 Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro 195 200 205 Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 210 215 220 Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala 225 230 235 240 Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn 245 250 255 Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile 260 265 270 Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 275 280 285

Claims (21)

1. 하기 단계를 포함하는, 항체 또는 항체 단편을 분리하는 방법:
   a) VH3 영역을 갖고 단백질 A에 결합할 수 있는 Fc 영역이 없는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 피드를 제공하는 단계;
   b) 상기 피드를 지지체에 공유 커플링된 리간드를 갖는 분리 수지와 접촉시키는 단계이며, 여기서 상기 리간드는 하기 서열식별번호: 1에 의해 정의된 바와 같은 폴리펩티드를 포함하고, 상기 항체 또는 항체 단편은 상기 분리 수지에 결합하는 것인 단계:
   

   

   
   상기 식에서,
   X₁ = E,K,Y,T,F,L,W,I,M,V,A,H 또는 R,
   X₂ = H 또는 K,
   X₃ = N 또는 A,
   X₄ = D, F, Y, W, K 또는 R;
   c) 임의적으로, 상기 분리 수지를 세척액으로 세척하는 단계; 및
   d) 상기 항체 또는 항체 단편을 상기 분리 수지로부터 용리액으로 용리시키고 상기 항체 또는 항체 단편을 회수하는 단계.
2. 제1항에 있어서, X₁ = E인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, X₂ = K인 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, X₃ = N인 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, X₄ = D인 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드가 0-15개의 아미노산 잔기를 포함하는 링커 영역에 의해 연결된 상기 폴리펩티드의 다량체를 포함하는 것인 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 다량체가 사량체, 오량체 또는 육량체인 방법.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 다량체가 상기 다량체 상의 C-말단 시스테인으로부터 유래된 티오에테르 연결을 통해 상기 지지체에 커플링되는 것인 방법.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지지체가 가교된 아가로스 비드를 포함하는 것인 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지지체가 가교된 셀룰로스 나노섬유를 포함하는 것인 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피드가 정화된 세포 배양 상청액인 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 VH3 영역을 갖고 Fc 영역이 없는 항체 단편인 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편이 Fab, scFv, 도메인 항체, 나노바디 및 BiTe로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 단편의 상기 분리 수지에 대한 결합 강도가 나노몰 범위 또는 더 강한 것인 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편이 VH3 영역을 통해 천연 단백질 A에 결합할 수 있는 것인 방법.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 단계 c)를 포함하고, 오염물 및/또는 불순물이 단계 c)에서 제거되는 것인 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 세척액이 pH 5-7의 버퍼인 방법.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리액이 pH 2-5의 버퍼인 방법.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d) 후에, 상기 분리 수지를 pH 13 또는 그 초과의 세정액으로 세정하는 단계 e)를 추가로 포함하는 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 세정액이 0.5 - 2 M의 알칼리 금속 수산화물을 포함하는 것인 방법.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a) - e)가 적어도 50회 반복되는 것인 방법.

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