KR102552335B1 - 돌연변이된 이뮤노글로불린-결합 폴리펩티드 - Google Patents

돌연변이된 이뮤노글로불린-결합 폴리펩티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 적어도 서열식별번호: 4-7의 위치 11에 해당하는 위치의 아스파라긴 또는 세린 잔기가 글루탐산, 리신, 티로신, 트레오닌, 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 메티오닌, 발린, 알라닌, 히스티딘 및 아르기닌으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산으로 돌연변이되어 있는, 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 51 또는 서열식별번호: 52에 의해 정의되는 바와 같은 스태필로코쿠스 단백질 A (SpA) Fc-결합 도메인의 돌연변이를 포함하는 향상된 알칼리 안정성의 Fc-결합 폴리펩티드에 관한 것이다.

Description

돌연변이된 이뮤노글로불린-결합 폴리펩티드{MUTATED IMMUNOGLOBULIN-BINDING POLYPEPTIDES}
본 발명은 친화성 크로마토그래피 분야, 더 구체적으로는 이뮤노글로불린의 친화성 크로마토그래피에 유용한 단백질 A의 돌연변이된 이뮤노글로불린-결합 도메인에 관한 것이다. 본 발명은 또한 돌연변이된 도메인의 다량체, 및 돌연변이된 도메인 또는 다량체를 함유하는 분리 매트릭스에 관한 것이다.
이뮤노글로불린은 제조나 개발 모두에 있어서 전세계적으로 가장 주력인 생물제약 생성물을 대표한다. 이와 같은 특별한 치료제 시장에 대한 높은 상업적 수요 및 그에 따른 높은 가격은 제약 회사들이 관련 비용을 억제하면서도 해당 각 mAb 제조 공정의 생산성을 최대화하는 것에 중점을 두도록 이끌었다.
친화성 크로마토그래피는 대부분의 경우 단일클론 또는 다클론 항체와 같은 이러한 이뮤노글로불린 분자의 정제에서 핵심 단계들 중 하나로 사용된다. 친화성 시약들 중 특히 흥미로운 클래스는 이뮤노글로불린 분자의 불변 부분에 특이적 결합을 할 수 있는 단백질이며, 그와 같은 상호작용은 항체의 항원-결합 특이성과는 무관하다. 그와 같은 시약들은 비제한적으로 혈청 또는 혈장 제제 또는 세포 배양물 유래의 공급 원료와 같은 여러 샘플로부터의 이뮤노글로불린의 친화성 크로마토그래피 회수에 광범위하게 사용될 수 있다. 그와 같은 단백질의 예로 여러 종으로부터의 IgG 이뮤노글로불린의 Fc 및 Fab 부분에 결합할 수 있는 도메인을 포함하는 스태필로코쿠스 단백질 A가 있다. 상기 도메인은 일반적으로 E-, D-, A-, B- 및 C-도메인으로 지칭된다.
스태필로코쿠스 단백질 A (SpA) 기재의 시약은 그의 고도의 친화성 및 선택성으로 인하여 생물공학 분야, 예컨대 항체의 포획 및 정제는 물론 검출 또는 정량을 위한 친화성 크로마토그래피에서 광범위한 용도가 있다. 현재, SpA-기재 친화성 매체는 산업용 세포 배양 상청액을 포함한 여러 샘플로부터의 단일클론 항체 및 그의 단편의 단리에 가장 광범위하게 사용되고 있는 친화성 매체일 것이다. 이에 따라, 단백질 A-리간드를 포함하는 다양한 매트릭스들이 예를 들면 천연 단백질 A의 형태 (예컨대 단백질 A 세파로스(SEPHAROSE)™, 스웨덴 웁살라 소재 GE 헬스케어(Healthcare) 사) 및 또한 재조합 단백질 A로 구성되는 형태 (예컨대 r단백질 A-세파로스™, GE 헬스케어 사)로 시중에서 구입가능하다. 더 구체적으로 말하자면, 상업용 재조합 단백질 A 생성물에서 수행되고 있는 유전자 조작은 지지체에 대한 그의 결합을 촉진하는 것, 그리고 리간드의 생산성을 증가시키는 것을 목표로 하고 있다.
이러한 적용분야는 다른 친화성 크로마토그래피 적용분야들과 마찬가지로 오염물의 확실한 제거에 대한 포괄적인 주의를 요한다. 그와 같은 오염물은 예를 들면 크로마토그래피 절차에서 고정상 또는 매트릭스에 흡착된 비-용리 분자, 예컨대 단백질, 탄수화물, 지질, 세균 및 바이러스를 포함한 원치 않는 생체분자 또는 미생물일 수 있다. 매트릭스로부터의 그와 같은 오염물의 제거는 보통 차후 사용 전에 매트릭스를 재생시키기 위하여 원하는 생성물의 첫 번째 용리 후 수행된다. 그와 같은 제거는 보통 고정상으로부터 오염물을 용리할 수 있는 작용제가 사용되는 제자리-세척(cleaning-in-place) (CIP)으로 알려져 있는 절차를 포함한다. 자주 사용되는 한 가지 그와 같은 클래스의 작용제는 해당 고정상을 통과하는 알칼리성 용액이다. 현재 가장 광범위하게 사용되고 있는 세척 및 살균 작용제는 NaOH이며, 그의 농도는 오염 정도 및 특성에 따라 0.1 내지 예컨대 1 M의 범위일 수 있다. 이와 같은 전략은 매트릭스를 13이 넘는 pH-값을 가지는 용액에 노출시키는 것과 연관된다. 단백질성의 친화성 리간드를 함유하는 많은 친화성 크로마토그래피 매트릭스에 있어서, 그와 같은 알칼리성 환경은 매우 가혹한 조건이며, 결과적으로 연관되어 있는 높은 pH에 대한 리간드의 불안정성으로 인한 용량 감소를 초래한다.
이에 따라, 광범위한 연구들이 알칼리성 pH-값을 견디는 향상된 용량을 나타내는 조작된 단백질 리간드의 개발에 초점을 맞추어 왔다. 예를 들어, 굴리히(Guelich) 등 (문헌 [Susanne Guelich, Martin Linhult, Per-Åke Nygren, Mathias Uhlen, Sophia Hober, Journal of Biotechnology 80 (2000), 169-178])은 알칼리성 환경에서의 스트렙토코쿠스 알부민-결합 도메인 (ABD)의 안정성 특성을 향상시키기 위한 단백질 조작을 제안하였다. 굴리히 등은 전체 4개의 아스파라긴 잔기들을 류신 (하나의 잔기), 아스파르테이트 (2개의 잔기) 및 리신 (하나의 잔기)으로 대체한 ABD의 돌연변이를 생성시켰다. 또한, 굴리히 등은 그들의 돌연변이가 천연 단백질의 것과 유사한 표적 단백질 결합 거동을 나타내며, 조작된 리간드를 함유하는 친화성 컬럼이 모체인 비-조작 리간드를 사용하여 제조된 컬럼에 비해 알칼리성 조건에의 반복된 노출 후 더 높은 결합 용량을 나타낸다고 보고하고 있다. 이에 따라 여기에서, 전체 4개 아스파라긴 잔기들이 구조 및 기능에 대한 어떠한 상당한 영향 없이 대체될 수 있다는 결론이 내려진다.
최근의 연구는 유사한 특성을 수행하도록 단백질 A (SpA)에도 변화가 이루어질 수 있다는 것을 보여준다. 그 전체가 참조로 포함되는 US 특허 출원 공개 US 2005/0143566호는 적어도 하나의 아스파라긴 잔기가 글루타민 또는 아스파르트산이 아닌 다른 아미노산으로 돌연변이될 경우, 돌연변이는 모체 SpA, 예컨대 SpA의 B-도메인, 또는 SpA의 B-도메인으로부터 유래하는 합성 구성체인 단백질 Z에 비해 약 13-14까지의 pH-값에서 증가된 화학적 안정성을 제공한다고 개시하고 있다 (그 전체가 참조로 포함되는 US 5,143,844호). 상기 저자는 이러한 돌연변이된 단백질이 친화성 리간드로 사용될 경우, 예상대로 분리 매체가 알칼리성 작용제를 사용한 세척 절차를 더 잘 견딜 수 있음을 보여주었다. 알칼리 안정성을 증가시킬 목적의 또 다른 단백질 A 도메인 돌연변이들은 모두 그 전체가 참조로 포함되는 WO 2008/039141호, JP 2006304633A호, EP 1992692A1호, EP 2202310A2호, WO 2010/110288호, WO 2012/086660호, WO 2012/083425호, WO 2012/087230호 및 WO 2014/146350호에도 공개되어 있다. 그러나, 현재 가용한 돌연변이들은 여전히 알칼리성 pH에 대하여 민감성이어서, 세척 동안의 NaOH 농도가 보통 0.1 M로 제한되는데, 이는 완전한 세척이 달성하기가 어렵다는 것을 의미한다. 세척을 향상시키게 될 더 높은 NaOH 농도는 허용되지 않는 용량 손실로 이어진다.
따라서, 본 발명의 분야에는, 알칼리성인 세척 절차에 대하여 더 향상된 안정성을 가지는 단백질 리간드를 함유하는 분리 매트릭스를 수득할 필요성이 여전히 존재하고 있다.
[발명의 개요]
본 발명의 일 측면은 향상된 알칼리성 안정성을 가지는 폴리펩티드를 제공하는 것이다. 이는 청구범위 제1항에 정의되어 있는 바와 같은 폴리펩티드에 의해 달성된다.
한 가지 장점은 이뮤노글로불린 및 다른 Fc-포함 단백질들에 대한 고도로 선택성인 결합은 유지하면서 모체 폴리펩티드에 비해 알칼리성 안정성이 향상된다는 것이다.
본 발명의 두 번째 측면은 다수의 폴리펩티드를 포함하는 향상된 알칼리성 안정성을 가지는 다량체를 제공하는 것이다. 이는 청구범위에 정의되어 있는 바와 같은 다량체에 의해 달성된다.
본 발명의 세 번째 측면은 향상된 알칼리성 안정성을 가지는 폴리펩티드 또는 다량체를 코딩하는 핵산 또는 벡터를 제공하는 것이다. 이는 청구범위에 정의되어 있는 바와 같은 핵산 또는 벡터에 의해 달성된다.
본 발명의 네 번째 측면은 향상된 알칼리성 안정성을 가지는 폴리펩티드 또는 다량체를 발현할 수 있는 발현 시스템을 제공하는 것이다. 이는 청구범위에 정의되어 있는 바와 같은 발현 시스템에 의해 달성된다.
본 발명의 다섯 번째 측면은 이뮤노글로불린 및 다른 Fc-포함 단백질에 선택적으로 결합할 수 있으며 향상된 알칼리성 안정성을 나타낼 수 있는 분리 매트릭스를 제공하는 것이다. 이는 청구범위에 정의되어 있는 바와 같은 분리 매트릭스에 의해 달성된다.
본 발명의 여섯 번째 측면은 이뮤노글로불린 또는 다른 Fc-포함 단백질의 효율적이고도 경제적인 단리 방법을 제공하는 것이다. 이는 청구범위에 정의되어 있는 바와 같은 방법에 의해 달성된다.
본 발명의 다른 적합한 실시양태들은 청구범의의 종속 청구항에서 기술된다.
[정의]
"항체" 및 "이뮤노글로불린"이라는 용어는 본원에서 호환가능하게 사용되며, 항체의 단편, 항체 또는 항체 단편을 포함하는 융합 단백질, 및 항체 또는 항체 단편을 포함하는 접합체도 포함하는 것으로 이해된다.
"Fc-결합 폴리펩티드" 및 "Fc-결합 단백질"이라는 용어는 각각 항체의 결정화가능 부분 (Fc)에 결합할 수 있는 폴리펩티드 또는 단백질을 의미하는데, 예를 들면 단백질 A 및 단백질 G, 또는 상기 결합 특성을 유지하고 있는 이들의 소정 단편 또는 융합 단백질이 포함된다.
"링커"라는 용어는 본원에서 다량체에서 2개의 폴리펩티드 단위, 단량체 또는 도메인을 서로 연결하는 요소를 의미한다.
"스페이서"라는 용어는 본원에서 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 다량체를 지지체에 연결하는 요소를 의미한다.
도 1은 서열식별번호: 1-7 및 51-52에 의해 정의되는 바와 같은 Fc-결합 도메인들의 정렬을 보여준다.
도 2는 SPR 바이오센서 칩에 커플링된 모체 및 돌연변이 사량체 Zvar (서열식별번호: 7) 폴리펩티드 변이체의 알칼리 안정성에 대한 실시예 2의 결과를 보여준다.
도 3은 아가로스 비드에 커플링된 모체 및 돌연변이 사량체 Zvar (서열식별번호: 7) 폴리펩티드 변이체의 알칼리 안정성 (0.5 M NaOH)에 대한 실시예 4의 결과를 보여준다.
도 4는 아가로스 비드에 커플링된 모체 및 돌연변이 사량체 Zvar (서열식별번호: 7) 폴리펩티드 변이체의 알칼리 안정성 (1.0 M NaOH)에 대한 실시예 4의 결과를 보여준다.
일 측면에서, 본 발명은 도 1에 도시되어 있는 바와 같은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1 (E-도메인), 서열식별번호: 2 (D-도메인), 서열식별번호: 3 (A-도메인), 서열식별번호: 22 (변이체 A-도메인), 서열식별번호: 4 (B-도메인), 서열식별번호: 5 (C-도메인), 서열식별번호: 6 (단백질 Z), 서열식별번호: 7 (Zvar), 서열식별번호: 51 (링커 영역 아미노산 1-6이 없는 Zvar) 또는 서열식별번호: 52 (링커 영역 아미노산 1-6이 없는 C-도메인)에 의해 정의되는 바와 같거나 그와 적어도 90 %, 적어도 95 % 또는 적어도 98 %의 동일성을 갖는 스태필로코쿠스 단백질 A (SpA) Fc-결합 도메인의 돌연변이를 포함하거나 본질적으로 이로 이루어지며, 여기서 적어도 서열식별번호: 4-7의 위치 11에 해당하는 위치*의 아스파라긴 (또는 서열식별번호: 2의 경우 세린) 잔기가 글루탐산, 리신, 티로신, 트레오닌, 페닐알라닌, 류신, 이소류신, 트립토판, 메티오닌, 발린, 알라닌, 히스티딘 및 아르기닌으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산으로 돌연변이되어 있는 것인, Fc-결합 폴리펩티드를 개시한다. 단백질 Z (서열식별번호: 6)는 US5143844호에 개시되어 있는 바와 같은 돌연변이된 B-도메인인 반면, 서열식별번호: 7은 본원에서는 Zvar로 지칭되며 돌연변이 N3A, N6D, N23T을 가지는, 단백질 Z의 추가적으로 돌연변이된 변이체를 나타낸다. 서열식별번호: 22는 도 1의 위치 용어를 사용하자면 A46S 돌연변이를 가지는, 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주 N315로부터의 단백질 A A-도메인의 자연상 변이체이다. 이러한 도메인들에서의 N11의 돌연변이는 이뮤노글로불린-결합 특성을 손상시키지 않으면서도 모체 도메인/폴리펩티드에 비해 향상된 알칼리 안정성을 제공한다. 따라서, 상기 폴리펩티드들 역시 Fc- 또는 이뮤노글로불린-결합 폴리펩티드, 또는 대안적으로 Fc- 또는 이뮤노글로불린-결합 폴리펩티드 단위로 기술될 수 있다.
본 상세한 설명 전체에 걸쳐*, 도 1의 아미노산 잔기 위치 번호지정 규정이 사용되는 바, 서열식별번호: 4-7의 것들에 해당하는 바와 같이 위치 번호가 지정된다.
다른 말로 하자면, 본 발명은 하기 서열식별번호: 53에 의해 정의되는 바와 같거나 그와 적어도 90 %, 적어도 95 % 또는 적어도 98 %의 동일성을 가지는 서열을 포함하는 Fc-결합 폴리펩티드를 개시한다.
서열식별번호: 53
Figure 112017045177501-pct00001
(여기서, 서로 개별적으로
X1 = A 또는 Q이며,
X2 = E, K, Y, T, F, L, W, I, M, V, A, H 또는 R이고,
X3 = H 또는 K이며,
X4 = A 또는 N이고,
X5 = A 또는 G이며,
X6 = Q 또는 E이고,
X7 = S 또는 K이며,
X8 = E 또는 D이고,
X9 = Q 또는 V이며,
X10 = K, R 또는 A이고,
X11 = A, E 또는 N이며,
X12 = I 또는 L이고,
X13 = K 또는 R이며,
X14 = L 또는 Y임).
N11 (X2) 돌연변이 (예컨대 N11E 또는 N11K 돌연변이)는 유일한 돌연변이일 수 있거나, 또는 서열식별번호: 4-7의 위치 3, 6, 9, 10, 15, 18, 23, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 42, 43, 44, 47, 50, 51, 55 및 57에 해당하는 위치들 중 적어도 하나에서의 치환과 같은 추가적인 돌연변이를 폴리펩티드가 포함할 수도 있다. 이들 위치 중 하나 이상에서, 원래의 아미노산 잔기는 예를 들면 아스파라긴, 프롤린 또는 시스테인이 아닌 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 원래의 아미노산 잔기는 예를 들면 알라닌, 발린, 트레오닌, 세린, 리신, 글루탐산 또는 아스파르트산에 의해 치환될 수 있다. 또한, 예를 들면 위치 1-6 및/또는 위치 56-58로부터 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호: 4-7의 위치 9에 해당하는 위치의 아미노산 잔기 (X1)는 글루타민, 아스파라긴, 프롤린 또는 시스테인이 아닌 다른 아미노산, 예컨대 알라닌이다. 실시예에서 나타내는 바와 같이, 위치 9 및 11에서의 돌연변이들의 조합은 특히 우수한 알칼리 안정성을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 서열식별번호: 7 중 위치 9의 아미노산 잔기는 알라닌이며, 위치 11의 아미노산 잔기는 리신 또는 글루탐산, 예컨대 리신이다. 위치 9에서의 돌연변이에 대해서는 그 전체가 참조로 포함되는 공동계류 출원 PCT/SE2014/050872호에서도 논의된다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호: 4-7의 위치 50에 해당하는 위치의 아미노산 잔기 (X13)는 아르기닌 또는 글루탐산이다.
소정 실시양태에서는, 서열식별번호: 4-7의 위치 3에 해당하는 위치의 아미노산 잔기가 알라닌이고/거나, 서열식별번호: 4-7의 위치 6에 해당하는 위치의 아미노산 잔기가 아스파르트산이다. 위치 3 및 6의 아미노산 잔기들 중 하나는 아스파라긴일 수 있으며, 대안적인 실시양태에서는, 위치 3 및 6의 양 아미노산 잔기가 아스파라긴일 수도 있다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호: 4-7의 위치 43에 해당하는 위치의 아미노산 잔기 (X11)는 알라닌 또는 글루탐산, 예컨대 알라닌이다. 구체적인 실시양태에서, 서열식별번호: 7 중 위치 9 및 11의 아미노산 잔기는 각각 알라닌 및 리신/글루탐산인 반면, 위치 43의 아미노산 잔기는 알라닌 또는 글루탐산이다.
소정 실시양태에서, 서열식별번호: 4-7의 위치 28에 해당하는 위치의 아미노산 잔기 (X5)는 알라닌 또는 아스파라긴, 예컨대 알라닌이다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호: 4-7의 위치 40에 해당하는 위치의 아미노산 잔기 (X9)는 아스파라긴, 알라닌, 글루탐산 및 발린으로 이루어진 군, 또는 글루탐산 및 발린으로 이루어진 군에서 선택된다. 구체적인 실시양태에서, 서열식별번호: 7 중 위치 9 및 11의 아미노산 잔기는 각각 알라닌 및 글루탐산인 반면, 위치 40의 아미노산 잔기는 발린이다. 그러한 경우, 임의적으로 위치 43의 아미노산 잔기는 알라닌 또는 글루탐산일 수 있다.
소정 실시양태에서, 서열식별번호: 4-7의 위치 42에 해당하는 위치의 아미노산 잔기 (X10)는 알라닌, 리신 또는 아르기닌이다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호: 4-7의 위치 18에 해당하는 위치의 아미노산 잔기 (X3)는 리신 또는 히스티딘, 예컨대 리신이다.
소정 실시양태에서, 서열식별번호: 4-7의 위치 33에 해당하는 위치의 아미노산 잔기 (X7)는 리신 또는 세린, 예컨대 리신이다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호: 4-7의 위치 37에 해당하는 위치의 아미노산 잔기 (X8)는 글루탐산 또는 아스파르트산, 예컨대 글루탐산이다.
소정 실시양태에서, 서열식별번호: 4-7의 위치 51에 해당하는 위치의 아미노산 잔기 (X14)는 티로신 또는 류신, 예컨대 티로신이다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호: 4-7의 위치 44에 해당하는 위치의 아미노산 잔기 (X12)는 류신 또는 이소류신이다. 구체적인 실시양태에서, 서열식별번호: 7 중 위치 9 및 11의 아미노산 잔기는 각각 알라닌 및 리신/글루탐산인 반면, 위치 44의 아미노산 잔기는 이소류신이다. 그러한 경우, 임의적으로 위치 43의 아미노산 잔기는 알라닌 또는 글루탐산일 수 있다.
일부 실시양태에서, 서열식별번호: 4-7의 위치 1, 2, 3 및 4 또는 위치 3, 4, 5 및 6에 해당하는 위치의 아미노산 잔기들은 결실되어 있다. 이러한 실시양태들의 구체적인 변이체에서, 모체 폴리펩티드는 단백질 A의 C 도메인 (서열식별번호: 5)이다. 천연 C 도메인에 대한 이러한 결실들의 효과에 대해서는 그 전체가 참조로 포함되는 US9018305호 및 US8329860호에 기술되어 있다.
소정 실시양태에서, 서열식별번호: 4-7, 예컨대 서열식별번호: 7에서의 돌연변이는 하기로 이루어진 군에서 선택된다: N11K; N11E; N11Y; N11T; N11F; N11L; N11W; N11I; N11M; N11V; N11A; N11H; N11R; N11E, Q32A; N11E, Q32E, Q40E; N11E, Q32E, K50R; Q9A, N11E, N43A; Q9A, N11E, N28A, N43A; Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43E, L44I; Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I; N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y; Q9A, N11E, N28A, Q40V, A42K, N43A, L44I; Q9A, N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y; N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I; Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I; Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R; Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R; Q9A, N11E, D37E, Q40V, A42K, N43A, L44I; 및 Q9A, N11E, D37E, Q40V, A42R, N43A, L44I. 이들 돌연변이는 특히 높은 알칼리성 안정성을 제공한다. 서열식별번호: 4-7, 예컨대 서열식별번호: 7에서의 돌연변이는 N11K; N11Y; N11F; N11L; N11W; N11I; N11M; N11V; N11A; N11H; N11R; Q9A, N11E, N43A; Q9A, N11E, N28A, N43A; Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43E, L44I; Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I; Q9A, N11E, N28A, Q40V, A42K, N43A, L44I; N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y; Q9A, N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y; N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I; Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I; 및 Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R로 이루어진 군에서 선택될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 하기로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진다: 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24, 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 28, 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38, 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47, 서열식별번호: 48, 서열식별번호: 49 및 서열식별번호: 50. 그것은 예를 들면 하기로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어질 수 있다: 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24, 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 28 및 서열식별번호: 29. 그것은 또한 하기로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어질 수 있다: 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24, 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 28, 서열식별번호: 38, 서열식별번호: 40; 서열식별번호: 41; 서열식별번호: 42; 서열식별번호: 43, 서열식별번호: 44, 서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46, 서열식별번호: 47 및 서열식별번호: 48. 폴리펩티드는 예를 들면 상기 군들 또는 상기 군들의 하위세트에서 선택되는 서열로 정의될 수 있지만, 그것이 N- 및/또는 C-말단 단부에 추가적인 아미노산 잔기, 예를 들면 N-말단 단부의 리더 서열 및/또는 C-말단 단부의 미부(tail) 서열을 포함할 수도 있다.
서열식별번호: 8 Zvar (Q9A, N11E, N43A)
Figure 112017045177501-pct00002
서열식별번호: 9 Zvar (Q9A, N11E, N28A, N43A)
Figure 112017045177501-pct00003
서열식별번호: 10 Zvar (Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43E, L44I)
Figure 112017045177501-pct00004
서열식별번호: 11 Zvar (Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)
Figure 112017045177501-pct00005
서열식별번호: 12 Zvar (N11E, Q32A)
Figure 112017045177501-pct00006
서열식별번호: 13 Zvar (N11E)
Figure 112017045177501-pct00007
서열식별번호: 14 Zvar (N11E, Q32E, Q40E)
Figure 112017045177501-pct00008
서열식별번호: 15 Zvar (N11E, Q32E, K50R)
Figure 112017045177501-pct00009
서열식별번호: 16 Zvar (N11K)
Figure 112017045177501-pct00010
서열식별번호: 23 Zvar (N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y)
Figure 112017045177501-pct00011
서열식별번호: 24 Zvar (Q9A, N11E, N28A, Q40V, A42K, N43A, L44I)
Figure 112017045177501-pct00012
서열식별번호: 25 Zvar (Q9A, N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y)
Figure 112017045177501-pct00013
서열식별번호: 26 Zvar (N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I)
Figure 112017045177501-pct00014
서열식별번호: 27 Zvar (Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I)
Figure 112017045177501-pct00015
서열식별번호: 28 Zvar (Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R)
Figure 112017045177501-pct00016
서열식별번호: 29 Zvar (Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R)
Figure 112017045177501-pct00017
서열식별번호: 36 B (Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)
Figure 112017045177501-pct00018
서열식별번호: 37 C (Q9A, N11E, E43A)
Figure 112017045177501-pct00019
서열식별번호: 38 Zvar (N11Y)
Figure 112017045177501-pct00020
서열식별번호: 39 Zvar (N11T)
Figure 112017045177501-pct00021
서열식별번호: 40 Zvar (N11F)
Figure 112017045177501-pct00022
서열식별번호: 41 Zvar (N11L)
Figure 112017045177501-pct00023
서열식별번호: 42 Zvar (N11W)
Figure 112017045177501-pct00024
서열식별번호: 43 Zvar (N11I)
Figure 112017045177501-pct00025
서열식별번호: 44 Zvar (N11M)
Figure 112017045177501-pct00026
서열식별번호: 45 Zvar (N11V)
Figure 112017045177501-pct00027
서열식별번호: 46 Zvar (N11A)
Figure 112017045177501-pct00028
서열식별번호: 47 Zvar (N11H)
Figure 112017045177501-pct00029
서열식별번호: 48 Zvar (N11R)
Figure 112017045177501-pct00030
서열식별번호: 49 Zvar (Q9A, N11E, D37E, Q40V, A42K, N43A, L44I)
Figure 112017045177501-pct00031
서열식별번호: 50 Zvar (Q9A, N11E, D37E, Q40V, A42R, N43A, L44I)
Figure 112017045177501-pct00032
두 번째 측면에서, 본 발명은 상기에서 개시된 임의의 실시양태에서 정의된 바와 같은 다수의 폴리펩티드 단위들을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어진 다량체를 개시한다. 상기 다량체는 예를 들면 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체 또는 구량체일 수 있다. 그것은 다량체 내의 모든 단위가 동일한 단일다량체일 수 있거나, 또는 그것은 적어도 하나의 단위가 다른 것과 상이한 이종다량체일 수 있다. 유리하게는, 다량체 내의 모든 단위는 예컨대 상기에서 개시된 돌연변이들을 포함하는 것에 의해, 알칼리 안정성이다. 폴리펩티드들은 폴리펩티드들의 C-말단과 N-말단 단부 사이의 펩티드 결합에 의해 직접적으로 서로 연결될 수 있다. 대안적으로, 다량체 내의 2개 이상 단위는 올리고머성 또는 중합체성 종을 포함하는 링커, 예컨대 15 또는 30개 이하의 아미노산, 예컨대 1-5, 1-10 또는 5-10개 아미노산을 포함하는 요소에 의해 연결될 수 있다. 이는 서열식별번호: 51 및 52의 돌연변이, 그리고 서열식별번호: 53 폴리펩티드의 경우에 특히 그러한데, 여기서 링커의 구체적인 예는 예를 들면 VDAKFD 또는 ADNKFN, 예컨대 VDAKFD일 수 있다. 그와 같은 링커의 특성은 바람직하게는 단백질 단위들의 공간적 입체형태를 불안정화하지 않아야 한다. 이는 예를 들면 링커 내의 프롤린의 존재를 회피하는 것에 의해 달성될 수 있다. 또한, 상기 링커는 바람직하게는 또한 알칼리성 환경에서 충분히 안정해서, 돌연변이된 단백질 단위들의 특성을 손상시키지 않아야 한다. 이와 같은 목적으로는, 링커가 아스파라긴을 포함하지 않으면 유리하다. 링커가 글루타민을 포함하지 않는 것 또한 유리할 수 있다. 다량체는 추가적으로 N-말단 단부에 예를 들면 클로닝 과정에서 기원하거나 절단 제거된 신호전달 서열로부터의 잔기를 구성하는 다수의 아미노산 잔기들을 포함할 수 있다. 추가적인 아미노산 잔기의 수는 예를 들면 15개 이하, 예컨대 10개 이하 또는 5개 이하일 수 있다. 구체적인 예로서, 다량체는 N-말단 단부에 AQ 서열을 포함할 수 있다.
소정 실시양태에서, 다량체는 하기로 이루어진 군에서 선택되는 서열을 포함하거나 본질적으로 이로 이루어질 수 있다: 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 34 및 서열식별번호: 35. 이들 서열을 하기에 열거하는 바, 모체 (돌연변이)n으로 명명하였는데, 여기서 n은 다량체 내 단량체 단위의 수이다.
서열식별번호: 17 Zvar (Q9A, N11E, N43A)4
Figure 112017045177501-pct00033
서열식별번호: 18 Zvar (Q9A, N11E, N28A, N43A)4
Figure 112017045177501-pct00034
서열식별번호: 19 Zvar (Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43E, L44I)4
Figure 112017045177501-pct00035
서열식별번호: 20 Zvar (Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)4
Figure 112017045177501-pct00036
서열식별번호: 30 Zvar (N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y)4
Figure 112017045177501-pct00037
서열식별번호: 31 Zvar (Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R)4
Figure 112017045177501-pct00038
Figure 112017045177501-pct00039
서열식별번호: 32 Zvar (Q9A, N11E, N28A, Q40V, A42K, N43A, L44I)4
Figure 112017045177501-pct00040
서열식별번호: 33 Zvar (Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)6
Figure 112017045177501-pct00041
서열식별번호: 34 Zvar (Q9A, N11E, D37E, Q40V, A42K, N43A, L44I)4
Figure 112017045177501-pct00042
서열식별번호: 35 Zvar (Q9A, N11E, D37E, Q40V, A42R, N43A, L44I)4
Figure 112017045177501-pct00043
일부 실시양태에서, 폴리펩티드 및/또는 다량체는 상기에서 개시된 바와 같이 추가적으로 C-말단 또는 N-말단 단부에 하나 이상의 시스테인 잔기, 다수의 리신 잔기 및 다수의 히스티딘 잔기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 커플링 요소를 포함한다. 상기 커플링 요소(들)는 C-말단 또는 N-말단 단부로부터 1-5개 아미노산 잔기 이내, 예컨대 1-3 또는 1-2개 아미노산 잔기 이내에 위치될 수도 있다. 커플링 요소는 예를 들면 C-말단 단부의 단일 시스테인일 수 있다. 커플링 요소(들)는 C- 또는 N-말단 단부에 직접적으로 연결될 수 있거나, 또는 15개 이하의 아미노산, 예컨대 1-5, 1-10 또는 5-10개 아미노산을 포함하는 연장체를 통하여 그것/그들이 연결될 수도 있다. 이와 같은 연장체 역시 바람직하게는 알칼리성 환경에서 충분히 안정해서, 돌연변이된 단백질의 특성을 손상시키지 않아야 한다. 이와 같은 목적으로는, 연장체가 아스파라긴을 포함하지 않으면 유리하다. 연장체가 글루타민을 포함하지 않는 것 또한 유리할 수 있다. C-말단 시스테인을 포함하는 것의 장점은 시스테인 티올의 지지체상 친전자성 기와의 반응을 통하여 단백질의 말단점(endpoint) 커플링이 달성될 수 있다는 것이다. 이는 커플링된 단백질의 뛰어난 이동성을 제공하는데, 이는 결합 용량에 있어서 중요하다.
폴리펩티드 또는 다량체의 알칼리 안정성은 예를 들면 NHS- 또는 말레이미드 커플링 화학을 사용하여 그것을 SPR 칩, 예컨대 실시예에서 기술되는 바와 같은 비아코어(Biacore) CM5 센서 칩에 커플링하고, 특정 온도, 예컨대 22 +/- 2 ℃에서의 알칼리성 용액 중 인큐베이션 전 및 후에 통상적으로 다클론 인간 IgG를 사용하여 칩의 이뮤노글로불린-결합 용량을 측정하는 것에 의해 평가될 수 있다. 인큐베이션은 예를 들면 0.5 M NaOH 중에서 다수의 10분 주기, 예컨대 100, 200 또는 300 주기 동안 수행될 수 있다. 22 +/- 2 ℃에서의 0.5 M NaOH 중 100회 10분 인큐베이션 주기 후 매트릭스의 IgG 용량은 인큐베이션 전 IgG 용량의 적어도 55, 예컨대 적어도 60, 적어도 80 또는 적어도 90 %일 수 있다. 대안적으로, 상기와 같이 측정된 특정 돌연변이에서의 100 주기 후 잔존 IgG 용량은 모체 폴리펩티드/다량체에서의 잔존 IgG 용량과 비교될 수 있다. 이와 같은 경우, 돌연변이의 잔존 IgG 용량은 모체 폴리펩티드/다량체의 적어도 105 %, 예컨대 적어도 110 %, 적어도 125 %, 적어도 150 % 또는 적어도 200 %일 수 있다.
세 번째 측면에서, 본 발명은 상기에서 개시된 임의의 실시양태에 따른 폴리펩티드 또는 다량체를 코딩하는 핵산을 개시한다. 이에 따라, 본 발명은 폴리펩티드 또는 다량체를 코딩하는 RNA 및 DNA와 같은 모든 형태의 본 발명 핵산 서열들을 포괄한다. 본 발명은 코딩 서열에 더하여 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 다량체의 발현에 필요한 신호 서열들도 포함하는 벡터, 예컨대 플라스미드를 포괄한다. 일 실시양태에서, 상기 벡터는 본 발명에 따른 다량체를 코딩하는 핵산을 포함하는데, 여기서 각 단위를 코딩하는 별도의 핵산들은 동종유래이거나 이종유래인 DNA 서열들을 가질 수 있다.
네 번째 측면에서, 본 발명은 상기에서 개시된 바와 같은 핵산 또는 벡터를 포함하는 발현 시스템을 개시한다. 상기 발현 시스템은 예를 들면 본 발명의 폴리펩티드 또는 다량체를 발현하도록 변형된 그람-양성 또는 그람-음성 원핵 숙주 세포 시스템, 예컨대 이. 콜리 (E. coli ) 또는 바실루스 (Bacillus) 종일 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 발현 시스템은 진핵 숙주 세포 시스템, 예컨대 효모, 예를 들면 피치아 파스토리스 ( Pichia pastoris ) 또는 사카로마이세스 세레비시아 에(Saccharomyces cerevisiae), 또는 포유동물 세포, 예를 들면 CHO 세포이다.
다섯 번째 측면에서, 본 발명은 상기에서 개시된 임의의 실시양태에 따른 다수의 폴리펩티드 또는 다량체가 고체 지지체에 커플링되어 있는 분리 매트릭스를 개시한다. 그와 같은 매트릭스는 이뮤노글로불린 또는 다른 Fc-포함 단백질의 분리에 유용하며, 폴리펩티드/다량체의 향상된 알칼리 안정성으로 인하여 매트릭스가 세척 동안 고도로 알칼리성인 조건을 견디게 되는데, 이는 생물공정 분리 환경에서 장기간 반복되는 사용에 있어서 필수적이다. 매트릭스의 알칼리 안정성은 특정 온도, 예컨대 22 +/- 2 ℃에서의 알칼리성 용액 중 인큐베이션 전 및 후에 통상적으로 다클론 인간 IgG를 사용하여 이뮤노글로불린-결합 용량을 측정하는 것에 의해 평가될 수 있다. 인큐베이션은 예를 들면 0.5 M 또는 1.0 M NaOH 중에서 다수의 15분 주기, 예컨대 25, 50 또는 75시간의 총 인큐베이션 시간에 해당하는 100, 200 또는 300 주기 동안 수행될 수 있다. 22 +/- 2 ℃에서의 0.5 M NaOH 중 96-100회의 15분 인큐베이션 주기 또는 24 또는 25시간의 총 인큐베이션 시간 후 매트릭스의 IgG 용량은 인큐베이션 전 IgG 용량의 적어도 80, 예컨대 적어도 85, 적어도 90 또는 적어도 95 %일 수 있다. 22 +/- 2 ℃에서의 1.0 M NaOH 중 24시간의 총 인큐베이션 시간 후 매트릭스의 용량은 인큐베이션 전 IgG 용량의 적어도 70, 예컨대 적어도 80 또는 적어도 90 %일 수 있다.
통상의 기술자라면 이해할 바와 같이, 발현되는 폴리펩티드 또는 다량체는 지지체에 고정되기 전에 적절한 정도까지 정제되어야 한다. 그와 같은 정제 방법에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있으며, 지지체에의 단백질-기재 리간드의 고정은 표준 방법을 사용하여 용이하게 수행된다. 적합한 방법 및 지지체에 대해서는 하기에서 더 상세하게 논의될 것이다.
본 발명에 따른 매트릭스의 고체 지지체는 임의의 적합한 잘 알려져 있는 종류의 것일 수 있다. 통상적인 친화성 분리 매트릭스는 종종 유기 특성의 것으로, 친수성인 표면을 사용되는 수성 매체에 노출하는 중합체, 즉 그의 외부, 및 존재할 경우 또한 내부 표면상의 히드록시 (-OH), 카르복시 (-COOH), 카르복스아미도 (-CONH2, N-치환된 형태일 수 있음), 아미노 (-NH2, 치환된 형태일 수 있음), 올리고- 또는 폴리에틸렌옥시 기를 노출하는 중합체를 기재로 한다. 고체 지지체는 적합하게는 다공성일 수 있다. 다공성은 예를 들면 문헌 [Gel Filtration Principles and Methods, Pharmacia LKB Biotechnology 1991, pp 6-13]에 기술되어 있는 방법에 따라 역 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정되는 Kav 또는 Kd 값 (특정 크기의 탐침 분자에 가용한 세공 부피의 분율)으로 표현될 수 있다. 정의에 따르면, Kd 및 Kav 값 양자는 항상 0-1 범위 내에 존재한다. 탐침 분자로 Mw 110 kDa의 덱스트란을 사용하여 측정하였을 때, Kav 값은 유리하게는 0.6-0.95, 예컨대 0.7-0.90 또는 0.6-0.8일 수 있다. 이의 장점은 지지체가 본 발명의 폴리펩티드/다량체 및 폴리펩티드/다량체에 결합하는 이뮤노글로불린 모두를 수용하고 결합 부위로 및 그로부터의 이뮤노글로불린의 물질 수송을 제공할 수 있는 커다란 세공 분율을 가진다는 것이다.
폴리펩티드 또는 다량체는 예를 들면 리간드에 존재하는 티올, 아미노 및/또는 카르복시 기를 이용하는 통상적인 커플링 기술을 통하여 지지체에 결합될 수 있다. 비스에폭시드, 에피클로로히드린, CNBr, N-히드록시숙신이미드 (NHS) 등은 잘 알려져 있는 커플링 반응물들이다. 지지체와 폴리펩티드/다량체 사이에는, 스페이서로 알려져 있는 분자가 도입되어, 폴리펩티드/다량체의 가용성을 향상시키고 지지체에 대한 폴리펩티드/다량체의 화학적 커플링을 촉진할 수 있다. 폴리펩티드/다량체의 특성 및 커플링 조건에 따라, 커플링은 다지점 커플링 (예컨대 다수의 리신을 통함) 또는 단일 지점 커플링 (예컨대 단일 시스테인을 통함)일 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드/다량체는 물리적 흡착 또는 생물특이적(biospecific) 흡착과 같은 비-공유 결합에 의해 지지체에 결합될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 매트릭스는 5-25, 예컨대 5-20 mg/ml, 5-15 mg/ml, 5-11 mg/ml 또는 6-11 mg/ml의 지지체에 커플링된 폴리펩티드 또는 다량체를 포함한다. 커플링되는 폴리펩티드/다량체의 양은 커플링 과정에 사용되는 폴리펩티드/다량체의 농도, 사용되는 활성화 및 커플링 조건, 및/또는 사용되는 지지체의 세공 구조에 의해 조절될 수 있다. 일반적으로, 매트릭스의 절대 결합 용량은 적어도 커플링된 폴리펩티드/다량체에 의해 세공이 상당히 억제되게 되는 시점까지 커플링되는 폴리펩티드/다량체의 양에 따라 증가한다. 높은 커플링 수준에서는 커플링된 폴리펩티드/다량체 mg 당 상대적인 결합 용량이 감소하게 되므로, 비용-이익 최적치는 상기에서 상술한 범위 내에 있게 된다.
소정 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 다량체는 티오에테르 결합을 통하여 지지체에 커플링된다. 그와 같은 커플링을 수행하기 위한 방법에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있어서, 표준 기술 및 장비를 사용하여 관련 기술분야 통상의 기술자에 의해 용이하게 수행된다. 티오에테르 결합은 유연성이고 안정해서, 일반적으로 친화성 크로마토그래피에서 사용하기에 적합하다. 특히 티오에테르 결합이 폴리펩티드 또는 다량체상의 말단 또는 말단-부근 시스테인 잔기를 통하는 경우, 커플링되는 폴리펩티드/다량체의 이동성이 강화되며, 이는 향상된 결합 용량 및 결합 동역학을 제공한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드/다량체는 상기한 바와 같이 단백질상에 제공되는 C-말단 시스테인을 통하여 커플링된다. 이는 티오에테르 가교 커플링을 초래하는 지지체상 친전자성 기, 예컨대 에폭시드 기, 할로히드린 기 등에의 시스테인 티올의 효율적인 커플링을 가능케 한다.
소정 실시양태에서, 지지체는 다당류와 같은 폴리히드록시 중합체를 포함한다. 다당류의 예에는 예를 들면 덱스트란, 전분, 셀룰로스, 풀룰란, 아가, 아가로스 등이 포함된다. 다당류는 본질적으로 낮은 비특이적 상호작용 정도를 가지는 친수성이어서, 높은 반응성 (활성화가능) 히드록실 기 함량을 제공하며, 일반적으로 생물공정에 사용되는 알칼리성 세척 용액에 안정성이다.
일부 실시양태에서, 지지체는 아가 또는 아가로스를 포함한다. 본 발명에 사용되는 지지체는 역 현탁액 젤화 (문헌 [S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964)])와 같은 표준 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있다. 대안적으로, 바탕 매트릭스는 세파로스™ FF (GE 헬스케어 사)라는 명칭으로 판매되고 있는 가교결합된 아가로스 비드와 같은 시중에서 구입가능한 생성물이다. 대-규모 분리에 특히 유리한 일 실시양태에서는, 지지체가 그 전체가 참조로 포함되는 US6602990호 또는 US7396467호에 기술되어 있는 방법을 사용하여 그의 강성이 증가하도록 개조됨으로써, 매트릭스가 고유량에 더 적합하게 된다.
소정 실시양태에서, 다당류 또는 아가로스 지지체와 같은 지지체는 예컨대 히드록시알킬 에테르 가교결합을 사용하여 가교결합된다. 그와 같은 가교결합을 생성시키는 가교결합제 반응물은 예를 들면 에피클로로히드린과 같은 에피할로히드린, 부탄디올 디글리시딜 에테르와 같은 디에폭시드, 알릴 할로겐화물 또는 알릴 글리시딜 에테르와 같은 알릴화 반응물일 수 있다. 가교결합은 지지체의 강성에 유익하며, 화학적 안정성을 향상시킨다. 히드록시알킬 에테르 가교결합은 알칼리 안정성이며, 상당한 비특이적 흡착을 야기하지 않는다.
대안적으로, 고체 지지체는 폴리비닐 알콜, 폴리히드록시알킬 아크릴레이트, 폴리히드록시알킬 메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드 등과 같은 합성 중합체를 기재로 한다. 디비닐 및 모노비닐-치환 벤젠을 기재로 하는 매트릭스와 같은 소수성 중합체의 경우, 상기에서 정의된 바와 같은 친수성 기들을 둘러싸고 있는 수성 액체에 노출시키기 위하여, 매트릭스의 표면이 종종 친수화된다. 그와 같은 중합체는 표준 방법에 따라 용이하게 제조되는데, 예를 들면 문헌 ["Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization" (R Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70-75 (1988))]을 참조하라. 대안적으로, 소스(SOURCE)™ (GE 헬스케어 사)와 같은 시중에서 구입가능한 생성물이 사용된다. 또 다른 대안에서, 본 발명에 따른 고체 지지체는 무기 특성의 지지체, 예컨대 실리카, 산화 지르코늄 등을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 고체 지지체는 표면, 칩, 모세관 또는 필터 (예컨대 멤브레인 또는 심층 필터(depth filter) 매트릭스)와 같은 또 다른 형태로 존재한다.
본 발명에 따른 매트릭스의 형상과 관련하여, 일 실시양태에서, 매트릭스는 다공성 단일체의 형태로 존재한다. 대안적인 실시양태에서, 매트릭스는 다공성이거나 비-다공성일 수 있는 비드화된 형태 또는 입자 형태이다. 비드화된 형태 또는 입자 형태인 매트릭스는 충진 상으로, 또는 현탁된 형태로 사용될 수 있다. 현탁된 형태에는 입자 또는 비드가 자유롭게 움직이는 팽창 상 및 순수 현탁액으로 알려져 있는 것들이 포함된다. 단일체형, 충진 상 및 팽창 상의 경우, 분리 절차는 보통 농도 구배를 사용하는 통상적인 크로마토그래피에 따른다. 순수 현탁액의 경우, 배치식 모드가 사용되게 된다.
여섯 번째 측면에서, 본 발명은 상기에서 개시된 바와 같은 분리 매트릭스가 사용되는 이뮤노글로불린의 단리 방법을 개시한다.
소정 실시양태에서, 상기 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
a) 이뮤노글로불린을 포함하는 액체 샘플을 상기에서 개시된 바와 같은 분리 매트릭스와 접촉시키는 단계,
b) 세정액을 사용하여 상기 분리 매트릭스를 세정하는 단계,
c) 용리액을 사용하여 분리 매트릭스로부터 이뮤노글로불린을 용리시키는 단계, 및
d) 대안적으로는 제자리-세척 (CIP)액으로 지칭될 수 있는 세척액을 사용하여 예를 들면 적어도 10분의 접촉 (인큐베이션) 시간으로 상기 분리 매트릭스를 세척하는 단계.
상기 방법은 단계 a) 전에, 상기한 실시양태들 중 어느 것에 따른 친화성 분리 매트릭스를 제공하고, 이뮤노글로불린 및 적어도 하나의 다른 물질을 포함하는 용액을 액체 샘플로서 제공하는 단계, 그리고 단계 c) 후에, 용출액을 회수하고, 임의적으로 예를 들면 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 다중모드 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 추가적인 분리 단계에 상기 용출액을 적용하는 단계를 포함할 수도 있다. 액체 샘플, 세정액 및 용리액의 적합한 조성은 물론, 분리를 수행하기 위한 일반적인 조건들에 대해서는 친화성 크로마토그래피의 관련 기술분야, 특히 단백질 A 크로마토그래피의 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. Fc-포함 단백질 및 적어도 하나의 다른 물질을 포함하는 액체 샘플은 숙주 세포 단백질 (HCP), 예컨대 CHO 세포, 이 콜리 또는 효모 단백질을 포함할 수 있다. CHO 세포 및 이 콜리 단백질의 함량은 해당 단백질들에 대한 면역검정법, 예를 들면 시그너스 테크놀로지스(Cygnus Technologies) 사의 CHO HCP 또는 이 콜리 HCP 엘리사(ELISA) 키트에 의해 편리하에 측정될 수 있다. 숙주 세포 단백질 또는 CHO 세포/이 콜리 단백질들은 단계 b) 동안 탈착될 수 있다.
용리는 단백질 A 매체로부터의 용리에 사용되는 임의의 적합한 용액을 사용하여 수행될 수 있다. 그것은 예를 들면 pH 5 이하, 예컨대 pH 2.5-5 또는 3-5의 용액 또는 완충제일 수 있다. 일부 경우에는, 그것이 pH 11 이상, 예컨대 pH 11-14 또는 pH 11-13의 용액 또는 완충제일 수도 있다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제 또는 용리 완충제 구배는 적어도 하나의 일-, 이- 또는 삼관능성 카르복실산 또는 그와 같은 카르복실산의 염을 포함한다. 소정 실시양태에서, 용리 완충제 또는 용리 완충제 구배는 아세테이트, 시트레이트, 글리신, 숙시네이트, 포스페이트 및 포르미에이트로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 음이온 종을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세척액은 예컨대 pH 13-14의 알칼리성이다. 그와 같은 용액은 특히 간격의 상단부에서 매트릭스의 효율적인 세척을 제공한다.
소정 실시양태에서, 세척액은 0.1-2.0 M NaOH 또는 KOH, 예컨대 0.5-2.0 또는 0.5-1.0 M NaOH 또는 KOH를 포함한다. 이는 효율적인 세척 용액으로, 특히 NaOH 또는 KOH 농도가 0.1 M 초과 또는 적어도 0.5 M인 경우에 그러하다. 본 발명 폴리펩티드의 높은 안정성은 그와 같은 강 알칼리성인 용액의 사용을 가능케 한다.
상기 방법은 예를 들면 퍼옥시드, 예컨대 수소 퍼옥시드 및/또는 과산, 예컨대 퍼아세트산 또는 퍼포름산을 포함할 수 있는 살균액을 사용하여 매트릭스를 살균하는 단계를 포함할 수도 있다.
일부 실시양태에서, 단계 a)-d)는 적어도 10회, 예컨대 적어도 50회, 50-200, 50-300 또는 50-500회 반복된다. 이는 매트릭스가 여러번 재사용될 수 있다는 점에서 공정 경제성에 중요하다.
다수의 단계 c) 사례 후 단계 d)가 수행됨으로써 단계 d)는 적어도 10회, 예컨대 적어도 50회 수행되면서, 단계 a)-c)는 적어도 10회, 예컨대 적어도 50회, 50-200, 50-300 또는 50-500회 반복될 수도 있다. 단계 d)는 예를 들면 단계 c) 2 내지 20번째 사례마다 수행될 수 있다.
[ 실시예 ]
단백질의 돌연변이유발
돌연변이를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 사용한 2-단계 PCR에 의해 위치-지정 돌연변이유발을 수행하였다. 주형으로는, Z, B 또는 C 중 어느 하나의 단일 도메인을 포함하는 플라스미드를 사용하였다. PCR 단편들을 이. 콜리 발현 벡터로 라이게이션시켰다. DNA 서열분석을 사용하여 삽입된 단편의 올바른 서열을 확인하였다.
돌연변이들의 다량체를 형성시키는 데에는, 아미노산 VD에 해당하는, B, C 또는 Z 도메인의 개시 코돈에 위치하는 AccI 부위 (GTA GAC)를 사용하였다. AccI를 사용하여 단량체 도메인들을 위한 벡터를 분해하고, 포스파타제로 처리하였다. 각 변이체에 특이적인 AccI 점착-말단(sticky-end) 프라이머를 설계하고, 각 주형으로부터 2종의 중복되는 PCR 생성물을 생성시켰다. 상기 PCR 생성물을 정제하고, 2 % 아가로스 겔상에서 PCR 생성물을 비교함으로써 농도를 산정하였다. 라이게이션 완충제 중에서 동일량의 쌍을 이룬 PCR 생성물들을 혼성화하였다 (45분 이내에 90 ℃ → 25 ℃). 생성되는 생성물은 AccI 부위로 라이게이션될 가능성이 있는 단편들의 대략 1/4에 해당하였다 (올바른 PCR 단편 및/또는 분해된 벡터). 라이게이션 및 형질전환 후, 집락을 PCR 스크리닝함으로써, 원하는 돌연변이를 포함하는 구성체를 확인하였다. DNA 서열분석에 의해 양성 클론을 확인하였다.
구성체 발현 및 정제
표준 배지에서 이. 콜리 K12의 발효에 의해 세균 주변세포질에서 구성체를 발현시켰다. 발효 후, 세포를 열-처리하여, 주변세포질 내용물을 배지로 방출시켰다. 0.2 ㎛ 세공 크기를 가지는 멤브레인을 사용한 미세여과에 의해, 배지로 방출된 구성체를 회수하였다.
여과 단계에서 투과액에 존재하게 된 각 구성체를 친화성에 의해 정제하였다. 고정된 IgG (IgG 세파로스 6FF, GE 헬스케어 사)를 함유하는 크로마토그래피 매체상에 투과액을 적재하였다. 적재된 생성물을 포스페이트 완충된 식염수로 세정하고, pH를 낮춤으로써 용리하였다.
용리 풀(pool)을 중성 pH (pH 8)로 조정하고, 디티오트레이톨의 첨가에 의해 환원시켰다. 다음에, 샘플을 음이온 교환기에 적재하였다. 세정 단계 후, NaCl 구배하에서 구성체를 용리함으로써, 임의의 오염물로부터 그것을 분리하였다. 용리 풀을 한외여과에 의해 40-50 mg/ml로 농축하였다. 고정된 IgG 매체에서의 구성체의 성공적인 친화성 정제는 문제의 구성체가 IgG에 대하여 높은 친화성을 가진다는 것을 표시함에 주목해야 한다.
정제된 리간드를 RPC LC-MS로 분석함으로써, 순도를 측정하고, 분자량이 예상치 (아미노산 서열 기준)에 상응한다는 것을 확인하였다.
실시예 1
N-말단의 AQGT 리더 서열 및 C 말단의 시스테인을 추가적으로 포함하는 하기 표 1에 열거되어 있는 정제된 단량체 리간드들을 GE 헬스케어 사의 아민 커플링 키트 (칩상 카르복시메틸 기에 대한 아민의 카르보디이미드 커플링용)를 사용하여 비아코어(Biacore) 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기기 (GE 헬스케어 사, 스웨덴 소재)에서 약 200-1500 RU의 신호 강도를 생성시키기에 충분한 양으로 비아코어 CM5 센서 칩 (GE 헬스케어 사, 스웨덴 소재)상에 고정하였다. 고정된 표면의 IgG 결합 용량을 추적하기 위하여, 1 mg/ml의 인간 다클론 IgG (감마놈(Gammanorm))를 칩상으로 유동시킨 후, 신호 강도 (결합량에 비례)를 기록하였다. 다음에, 표면을 제자리-세척 (CIP)하였는데, 다시 말하자면 실온 (22 +/- 2 ℃)에서 500 mM NaOH를 사용하여 10분 동안 플러싱하였다. 이를 96-100 주기 동안 반복하고, 각 주기 후 잔존 IgG 결합 용량 (신호 강도)으로 고정 리간드 알칼리성 안정성을 추적하였다. 결과를 표 1에 나타내었는데, 적어도 리간드 Zvar (N11K)1, Zvar (N11E)1, Zvar (N11Y)1, Zvar (N11T)1, Zvar (N11F)1, Zvar (N11L)1, Zvar (N11W)1, ZN11I)1, Zvar (N11M)1, Zvar (N11V)1, Zvar (N11A)1, Zvar (N11H1), Zvar (N11R)1, Zvar (N11E, Q32A)1, Zvar (N11E, Q32E, Q40E)1 및 Zvar (N11E, Q32E, K50R)1, Zvar (Q9A, N11E, N43A)1, Zvar (Q9A, N11E, N28A, N43A)1, Zvar (Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43E, L44I)1, Zvar (Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)1, Zvar (Q9A, N11E, N28A, Q40V, A42K, N43A, L44I)1, Zvar (N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y)1, Zvar (Q9A, N11K, H18K, S33K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R, L51Y)1, Zvar (N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I)1, Zvar (Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I)1 및 Zvar (Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R)1은 참조로 사용된 모체 구조 Zvar1에 비해 향상된 알칼리 안정성을 가진다는 것을 표시하였다. 또한, 리간드 B (Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)1 및 C (Q9A, N11E, E43A)1가 참조로 사용된 모체 B 및 C 도메인에 비해 향상된 안정성을 가졌다.
<표 1>
단량체 리간드들, 비아코어에 의해 평가 (0.5 M NaOH).
Figure 112017045177501-pct00044
실시예 2
하기 표 2에 열거되어 있는 정제된 사량체 및 육량체 리간드들을 GE 헬스케어 사의 아민 커플링 키트 (칩상 카르복시메틸 기에 대한 아민의 카르보디이미드 커플링용)를 사용하여 비아코어 기기 (GE 헬스케어 사, 스웨덴 소재)에서 약 200-1500 RU의 신호 강도를 생성시키기에 충분한 양으로 비아코어 CM5 센서 칩 (GE 헬스케어 사, 스웨덴 소재)상에 고정하였다. 고정된 표면의 IgG 결합 용량을 추적하기 위하여, 1 mg/ml의 인간 다클론 IgG (감마놈)를 칩상으로 유동시킨 후, 신호 강도 (결합량에 비례)를 기록하였다. 다음에, 표면을 제자리-세척 (CIP)하였는데, 다시 말하자면 실온 (22 +/- 2 ℃)에서 500 mM NaOH를 사용하여 10분 동안 플러싱하였다. 이를 300 주기 동안 반복하고, 각 주기 후 잔존 IgG 결합 용량 (신호 강도)으로 고정 리간드 알칼리성 안정성을 추적하였다. 결과를 표 2 및 도 2에 나타내었는데, 적어도 리간드 Zvar (Q9A, N11E, N43A)4, Zvar (Q9A, N11E, N28A, N43A)4, Zvar (Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43E, L44I)4 및 Zvar (Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)4, Zvar (Q9A, N11E, D37E, Q40V, A42K, N43A, L44I)4 및 Zvar (Q9A, N11E, D37E, Q40V, A42R, N43A, L44I)4는 참조로 사용된 모체 구조 Zvar4에 비해 향상된 알칼리 안정성을 가진다는 것을 표시하였다. 육량체 리간드 Zvar (Q9A, N11E, Q40V, A42K, N43A, L44I)6 역시 참조로 사용된 모체 구조 Zvar6에 비해 향상된 알칼리 안정성을 가졌다.
<표 2>
사량체 및 육량체 리간드, 비아코어에 의해 평가 (0.5 M NaOH).
Figure 112017045177501-pct00045
실시예 3
실시예 2에서와 같은 500 mM 대신 1 M NaOH를 사용한 3종 리간드의 100 CIP 주기를 사용하여 실시예 2를 반복하였다. 결과를 하기 표 3에 나타내었는데, 전체 3종 리간드가 참조로 사용된 모체 구조 Zvar4에 비해 1 M NaOH에서도 향상된 알칼리 안정성을 가진다는 것을 나타내었다.
<표 3>
사량체 리간드, 비아코어에 의해 평가 (1 M NaOH).
Figure 112017045177501-pct00046
실시예 4
표 2의 정제된 사량체 리간드들 (모두 추가적인 N-말단 시스테인을 포함함)을 하기하는 방법을 사용하여 아가로스 비드상에 고정하고, 용량 및 안정성에 대하여 평가하였다. 결과를 하기 표 4 및 도 3에 나타내었다.
<표 4>
사량체 리간드를 사용한 매트릭스, 컬럼에서 평가 (0.5 M NaOH).
Figure 112017045177501-pct00047
활성화
사용된 바탕 매트릭스는 US6602990호의 방법에 따라 제조되며, 문헌 [Gel Filtration Principles and Methods, Pharmacia LKB Biotechnology 1991, pp 6-13]에 기술되어 있는 방법에 따른 Mw 110 kDa의 덱스트란에 대한 역 겔 여과 크로마토그래피 Kav 값 0.70에 해당하는 세공 크기를 가지는, 직경 중앙값 85 마이크로미터 (부피-가중, d50V)의 강성 가교-결합 아가로스 비드였다.
25 mL (g)의 배수된 바탕 매트릭스, 10.0 mL의 증류수 및 2.02 g의 NaOH (s)를 100 mL 플라스크에서 25 ℃로 10분 동안 기계식으로 교반하면서 혼합하였다. 4.0 mL의 에피클로로히드린을 첨가하고, 2시간 동안 반응을 진행하였다. 10 젤 침강 부피(GV)의 물을 사용하여 활성화된 젤을 세정하였다.
커플링
50 ml 팔콘(Falcon) 튜브 중 20 mL의 리간드 용액 (50 mg/mL)에, 169 mg의 NaHCO3, 21 mg의 Na2CO3, 175 mg의 NaCl 및 7 mg의 EDTA를 첨가하였다. 롤러 테이블상에 5-10분 동안 팔콘 튜브를 위치시킨 다음, 77 mg의 DTE를 첨가하였다. >45분 동안 환원을 진행시켰다. 다음에, 세파덱스(Sephadex) G-25가 충진된 PD10 컬럼에서 리간드 용액을 탈염하였다. 276 nm UV 흡광을 측정함으로써, 탈염된 용액 중 리간드 함량을 측정하였다.
활성화된 젤을 3-5 GV {0.1 M 포스페이트/1 mM EDTA pH 8.6}로 세정한 다음, US6399750호에 기술되어 있는 방법에 따라 리간드를 커플링시켰다. 실험에 사용된 모든 완충제는 적어도 5-10분 동안 질소 기체에 의해 배기하였다. 젤의 리간드 함량은 리간드 용액의 양 및 농도를 변화시키는 것에 의해 조절될 수 있었다.
고정 후, 증류수를 사용하여 3×GV로 젤을 세정하였다. 젤 + 1 GV {0.1 M 포스페이트/1 mM EDTA/10% 티오글리세롤 pH 8.6}를 혼합하고, 진탕 테이블에서 실온으로 밤새 튜브를 유지하였다. 다음에, 달리 3×GV {0.1 M 트리스(TRIS)/0.15 M NaCl pH 8.6} 및 0.5 M HAc를 사용하여, 그리고 다음에 8-10×GV로 증류수를 사용하여 젤을 세정하였다. 아미노산 분석을 위하여 젤 샘플을 외부 실험실로 송부하고, 총 아미노산 함량으로부터 리간드 함량 (mg/ml 젤)을 계산하였다.
단백질
평형화 완충제 중에 2 mg/ml으로 희석된 감마놈 165 mg/ml (옥타파르마(Octapharma) 사).
평형화 완충제
PBS 포스페이트 완충제 10 mM + 0.14 M NaCl + 0.0027 M KCl, pH 7,4 (메디카고(Medicago) 사).
흡착 완충제
PBS 포스페이트 완충제 10 mM + 0.14 M NaCl + 0.0027 M KCl, pH 7,4 (메디카고 사).
용리 완충제
100 mM 아세테이트 pH 2.9.
동적 결합 용량
트리콘(TRICORN)™ 5 100 컬럼에 2 ml의 수지를 충진하였다. 악타익스플로러(AKTAExplorer) 10 시스템을 사용하여 6분의 체류 시간 (0.33 ml/분의 유량)으로 관류 용량(breakthrough capacity)을 측정하였다. 안정한 기준선이 수득될 때까지 우회 컬럼을 통하여 평형화 완충제를 전개시켰다. 이는 자동 영점조정 전에 수행하였다. 100 % UV 신호가 수득될 때까지 샘플을 컬럼에 적용하였다. 다음에, 다시 안정한 기준선이 수득될 때까지 평형화 완충제를 적용하였다.
최대 흡광도 85 %의 UV 신호에 도달할 때까지 샘플을 컬럼상에 적재하였다. 다음에, 5 컬럼 부피 (CV)의 평형화 완충제를 사용하여 0.5 ml/분의 유량으로 컬럼을 세정하였다. 5 CV의 용리 완충제를 사용하여 0.5 ml/분의 유량으로 단백질을 용리하였다. 다음에, 0.5 M NaOH를 사용하여 0.2 ml/분의 유량으로 컬럼을 세척하고, 평형화 완충제를 사용하여 재-평형화하였다.
10 %에서의 관류 용량의 계산에는, 하기의 수학식을 사용하였다. 그것은 컬럼 유출액 중 IgG 농도가 공급물 중 IgG 농도의 10 %가 될 때까지 컬럼상에 적재되는 IgG의 양이다.
Figure 112017045177501-pct00048
A100% = 100 % UV 신호이며;
Asub = 비-결합 IgG 하위클래스로부터의 흡광도 기여이고;
A(V) = 주어진 적용 부피에서의 흡광도이며;
Vc = 컬럼 부피이고;
Vapp = 10 % 관류까지 적용된 부피이며;
Vsys = 시스템 불감 부피이고;
C0 = 공급 농도이다.
10 % 관류에서의 동적 결합 용량 (DBC)을 계산하였다. 동적 결합 용량 (DBC)은 10 및 80 % 관류에 대하여 계산하였다.
CIP - 0.5 M NaOH
알칼리성 세척 용액에의 반복되는 노출 전 및 후 모두에서 10 % 관류 DBC (Qb10)을 측정하였다. 각 주기는 20분 동안 0.5/분의 속도로 컬럼을 통하여 펌핑되는 0.5 M NaOH를 사용하는 CIP 단계를 포함하였으며, 그 후에는 4시간 동안 컬럼을 방치 유지하였다. 노출은 실온 (22 +/- 2 ℃)에서 이루어졌다. 이와 같은 인큐베이션 후, 평형화 완충제를 사용하여 0.5 ml/분의 유량으로 20분 동안 컬럼을 세정하였다. 표 4는 절대 수 및 개시 용량에 대한 대비 둘 다로 나타낸 6회 4시간 주기 (즉 0.5 M NaOH에의 24시간의 누적 노출 시간) 후의 잔존 용량을 나타낸다.
실시예 5
CIP 단계에서 0.5 M 대신 1.0 M NaOH가 사용된 것 이외에는, 하기 표 5에 나타낸 사량체 리간드들을 사용하여 실시예 4를 반복하였다. 결과를 표 5 및 도 4에 나타내었다.
<표 5>
사량체 리간드를 사용한 매트릭스, 컬럼에서 평가 - 1.0 M NaOH.
Figure 112017045177501-pct00049
본 상세한 설명은 실시예를 사용하여 최적 모드를 포함한 본 발명을 개시하였으며, 또한 임의의 장치 또는 시스템을 구성하고 사용하는 것 및 임의의 관련 방법을 수행하는 것을 포함하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자가 본 발명을 실시하는 것을 가능케 하였다. 본 발명의 특허가능한 영역은 청구범위에 의해 정의되는 바, 관련 기술분야 통상의 기술자에게 떠오르게 될 다른 예들을 포함할 수 있다. 그와 같은 다른 예들은 그것이 청구범위의 문자상 내용과 다르지 않은 구조적 요소를 가지는 경우, 또는 그것이 청구범위의 문자상 내용과 실질적이지 않은 차이를 가지는 등가의 구조적 요소를 포함하는 경우, 청구범위의 영역에 속하는 것으로 하고자 한다. 본문에서 언급된 모든 특허 및 특허 출원들은 그것이 개별적으로 포함되는 것처럼 그 전체가 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> GE Healthcare Bio-Sciences AB <120> MUTATED IMMUNOGLOBULIN-BINDING POLYPEPTIDES <130> PU1457 2 <160> 53 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 51 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 1 Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn 1 5 10 15 Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser 20 25 30 Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln 35 40 45 Ala Pro Lys 50 <210> 2 <211> 61 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 2 Ala Asp Ala Gln Gln Asn Lys Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe 1 5 10 15 Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly 20 25 30 Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu 35 40 45 Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 60 <210> 3 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 3 Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 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Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 7 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 7 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 8 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 8 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 9 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 9 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 10 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 10 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 11 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 11 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 12 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 12 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Ala 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 13 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 13 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 14 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 14 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Glu 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Glu Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 15 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 15 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Glu 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Arg Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 16 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 16 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Lys Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 17 <211> 237 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 17 Ala Gln Gly Thr Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala 1 5 10 15 Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn 20 25 30 Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Ala Leu 35 40 45 Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp 50 55 60 Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His 65 70 75 80 Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu 85 90 95 Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys 100 105 110 Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp 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Glu Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln Ser Leu 85 90 95 Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys 100 105 110 Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu 115 120 125 Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 130 135 140 Glu Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala 165 170 175 Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr 180 185 190 Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Ala Ala Phe 195 200 205 Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Ala Leu Leu Ala 210 215 220 Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Cys 225 230 235 <210> 19 <211> 237 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 19 Ala Gln Gly Thr Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala 1 5 10 15 Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn 20 25 30 Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile 35 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Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala 1 5 10 15 Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn 20 25 30 Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile 35 40 45 Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp 50 55 60 Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His 65 70 75 80 Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu 85 90 95 Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys 100 105 110 Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu 115 120 125 Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 130 135 140 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val 145 150 155 160 Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala 165 170 175 Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr 180 185 190 Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe 195 200 205 Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala 210 215 220 Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Cys 225 230 235 <210> 21 <211> 237 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 21 Ala Gln Gly Thr Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Asn Ala 1 5 10 15 Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn 20 25 30 Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu 35 40 45 Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp 50 55 60 Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His 65 70 75 80 Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu 85 90 95 Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys 100 105 110 Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu 115 120 125 Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 130 135 140 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala 165 170 175 Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr 180 185 190 Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe 195 200 205 Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala 210 215 220 Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Cys 225 230 235 <210> 22 <211> 58 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 22 Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ser Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 23 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 23 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Lys Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu Lys Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Lys Leu Lys Asp Glu Pro Ser Gln Ser Arg Ala Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Arg Tyr Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 24 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 24 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 25 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 25 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Lys Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu Lys Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Lys Leu Lys Asp Glu Pro Ser Gln Ser Arg Ala Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Arg Tyr Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 26 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 26 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Lys Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu Lys Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Glu Pro Ser Gln Ser Arg Ala Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 27 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 27 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Lys Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu Lys Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Glu Pro Ser Gln Ser Arg Ala Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 28 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 28 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Lys Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu Lys Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Glu Pro Ser Gln Ser Arg Ala Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Arg Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 29 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 29 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Lys Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu Lys Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Glu Pro Ser Gln Ser Arg Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 30 <211> 237 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 30 Ala Gln Gly Thr Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Lys 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Ala Phe Tyr 180 185 190 Glu Ile Leu Lys Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe 195 200 205 Ile Gln Ser Leu Lys Asp Glu Pro Ser Gln Ser Arg Asn Leu Leu Ala 210 215 220 Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Cys 225 230 235 <210> 32 <211> 237 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 32 Ala Gln Gly Thr Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala 1 5 10 15 Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Ala 20 25 30 Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile 35 40 45 Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp 50 55 60 Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His 65 70 75 80 Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln Ser Leu 85 90 95 Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys 100 105 110 Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu 115 120 125 Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 130 135 140 Glu Gln Arg Ala Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val 145 150 155 160 Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala 165 170 175 Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr 180 185 190 Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Ala Ala Phe 195 200 205 Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala 210 215 220 Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Cys 225 230 235 <210> 33 <211> 353 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 33 Ala Gln Gly Thr Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala 1 5 10 15 Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn 20 25 30 Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile 35 40 45 Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp 50 55 60 Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His 65 70 75 80 Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu 85 90 95 Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys 100 105 110 Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu 115 120 125 Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu 130 135 140 Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val 145 150 155 160 Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala 165 170 175 Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr 180 185 190 Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe 195 200 205 Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala 210 215 220 Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Lys 225 230 235 240 Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro 245 250 255 Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp 260 265 270 Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn 275 280 285 Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln 290 295 300 Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln 305 310 315 320 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Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala 165 170 175 Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr 180 185 190 Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe 195 200 205 Ile Gln Ser Leu Lys Asp Glu Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala 210 215 220 Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Cys 225 230 235 <210> 35 <211> 237 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 35 Ala Gln Gly Thr Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala 1 5 10 15 Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn 20 25 30 Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Glu Pro Ser Val Ser Arg Ala Ile 35 40 45 Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp 50 55 60 Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His 65 70 75 80 Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu 85 90 95 Lys Asp Glu Pro Ser Val Ser Arg Ala Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys 100 105 110 Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu 115 120 125 Ala Gln 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Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 38 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 38 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Tyr Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 39 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 39 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Thr Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 40 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 40 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Phe Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 41 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 41 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Leu Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 42 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 42 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Trp Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 43 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 43 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Ile Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 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Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 47 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 47 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln His Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 48 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 48 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Gln Gln Arg Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 49 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 49 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Glu Pro Ser Val Ser Lys Ala Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 50 <211> 58 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 50 Val Asp Ala Lys Phe Asp Lys Glu Ala Gln Glu Ala Phe Tyr Glu Ile 1 5 10 15 Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln 20 25 30 Ser Leu Lys Asp Glu Pro Ser Val Ser Arg Ala Ile Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys 50 55 <210> 51 <211> 52 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 51 Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu 1 5 10 15 Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro 20 25 30 Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 35 40 45 Gln Ala Pro Lys 50 <210> 52 <211> 52 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 52 Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu 1 5 10 15 Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro 20 25 30 Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala 35 40 45 Gln Ala 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Gln Arg Xaa Xaa Phe Ile Xaa Xaa Leu Lys Asp Xaa Pro 20 25 30 Ser Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Leu Ala Glu Ala Lys Xaa Xaa Asn Asp Ala 35 40 45 Gln Ala Pro Lys 50

Claims (49)

  1. 스태필로코쿠스 단백질 A (SpA) Fc-결합 도메인의 돌연변이를 포함하는 Fc-결합 폴리펩티드이며,
    상기 폴리펩티드는 서열식별번호: 8 내지 16, 23 내지 28, 및 36 내지 48로 이루어지는 군으로부터 선택되는, Fc-결합 폴리펩티드.
  2. 제1항에 의해 정의되는 바와 같은 다수의 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어진 다량체로서, 선택적으로
    a) 폴리펩티드들이 15개 이하의 아미노산을 포함하는 링커에 의해 연결되고;
    b) 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체 또는 구량체이고/이거나;
    c) 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33, 서열식별번호: 34 및 서열식별번호: 35에 의해 정의되는 서열들의 군에서 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어진 다량체.
  3. 제1항에 있어서, C-말단 또는 N-말단에, 또는 그로부터 1-5개 아미노산 잔기 이내에, 하나 이상의 시스테인 잔기, 다수의 리신 잔기 및 다수의 히스티딘 잔기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 커플링 요소를 추가적으로 포함하는 폴리펩티드.
  4. 제1항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
  5. 제4항에 따른 핵산을 포함하는 발현 시스템.
  6. 제1항에 따른 다수의 폴리펩티드가 고체 지지체에 커플링되어 있는 것인 분리 매트릭스.
  7. 제6항에 있어서,
    a) 폴리펩티드 또는 다량체가 티오에테르 결합을 통하여 고체 지지체에 커플링되어 있는 것이고;
    b) 고체 지지체가 다당류이고;
    c) 22 +/- 2 ℃에서의 0.5 M NaOH 중 24 인큐베이션 후 매트릭스의 IgG 용량이 인큐베이션 전 IgG 용량의 적어도 80, 적어도 85, 적어도 90, 또는 적어도 95 %이고/이거나,
    d) 22 +/- 2 ℃에서의 1.0 M NaOH 중 24 인큐베이션 후 매트릭스의 IgG 용량이 인큐베이션 전 IgG 용량의 적어도 70, 적어도 80, 또는 적어도 90 %인 분리 매트릭스.
  8. 제6항 또는 제7항에 따른 분리 매트릭스가 사용되는, 이뮤노글로불린의 단리 방법.
  9. 하기의 단계들을 포함하는 이뮤노글로불린의 단리 방법:
    a) 이뮤노글로불린을 포함하는 액체 샘플을 제6항 또는 제7항에 따른 분리 매트릭스와 접촉시키는 단계,
    b) 세정액을 사용하여 상기 분리 매트릭스를 세정하는 단계,
    c) 용리액을 사용하여 분리 매트릭스로부터 이뮤노글로불린을 용리시키는 단계, 및
    d) 세척액을 사용하여 분리 매트릭스를 세척하는 단계로서, 선택적으로 세척액이 13-14의 pH를 갖는 알칼리성이고/이거나 세척액이 0.1-1.0 M NaOH 또는 KOH, 또는 0.5-1.0 M NaOH 또는 KOH를 포함하는, 세척하는 단계.
  10. 제9항에 있어서,
    ⅰ) 단계 a)-d)가 적어도 10회, 또는 적어도 50회, 또는 50-200회 반복되는 것이고/이거나
    ⅱ) 단계 a)-c)가 적어도 10회, 또는 적어도 50회, 또는 50-200회 반복되고, 단계 d)가 다수의, 적어도 10 또는 적어도 50회의 단계 c) 인스턴스 후에 수행되는 것인 방법.
  11. 제1항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 벡터.
  12. 제2항에 있어서, C-말단 또는 N-말단에, 또는 그로부터 1-5개 아미노산 잔기 이내에, 하나 이상의 시스테인 잔기, 다수의 리신 잔기 및 다수의 히스티딘 잔기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 커플링 요소를 추가적으로 포함하는 다량체.
  13. 제2항 또는 제12항에 따른 다량체를 코딩하는 핵산.
  14. 제2항 또는 제12항에 따른 다량체를 코딩하는 벡터.
  15. 제2항 또는 제12항에 따른 다량체가 고체 지지체에 커플링되어 있는 것인 분리 매트릭스.
  16. 제15항에 따른 분리 매트릭스가 사용되는, 이뮤노글로불린의 단리 방법.
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