CN109311948B - 清洁和/或消毒分离基质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及清洁和/或消毒分离基质的方法，所述分离基质包含与多孔载体共价偶联的免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体。所述方法包含以下步骤：a)任选地使用分离基质纯化包含第一免疫球蛋白的混合物；b)提供包含至少50%体积的水性碱金属氢氧化物溶液的清洁液；和c)通过使清洁液与分离基质接触预定的接触时间来清洁和/或消毒分离基质。所述碱稳定的蛋白A结构域包含由SEQ ID NO 51或SEQ ID NO 52定义的葡萄球菌蛋白A(SpA)的亲本Fc‑结合结构域的突变体，其中SEQ ID NO 51或52的位置13和44处的氨基酸残基是天冬酰胺，和其中至少SEQ ID NO 51或52的位置3处的天冬酰胺残基已被突变为选自谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、组氨酸和精氨酸的氨基酸。

Description

清洁和/或消毒分离基质的方法
技术领域
本发明涉及清洁和/或消毒分离基质的方法，所述分离基质包含与多孔载体共价偶联的免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体。本发明还涉及在采用分离基质纯化免疫球蛋白中防止遗留(carryover)的方法，所述分离基质包含与多孔载体共价偶联的免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体，以及涉及包含至少70%体积的水性碱金属氢氧化物溶液的清洁液用于消毒分离基质的用途。
背景技术
免疫球蛋白代表全世界生产或开发的最普遍的生物制药产品。对于这种特定治疗市场的高商业需求以及由此的价值已导致重点放在制药公司上，以使它们各自的免疫球蛋白生产过程的生产力最大化，同时控制相关的成本。
亲和色谱在大多数情况下作为这些免疫球蛋白分子，例如单克隆抗体(mAb)或多克隆抗体(pAb)的纯化中的关键步骤之一而使用。一类特别感兴趣的亲和试剂是能够特异性结合免疫球蛋白分子的不变部分的蛋白，这样的相互作用是独立于抗体的抗原-结合特异性的。这样的试剂可广泛用来从不同的样品(例如但不限于血清或血浆制备物或细胞培养物来源的原料)亲和色谱回收免疫球蛋白。这样的蛋白的例子是葡萄球菌蛋白A，其含有能够结合来自不同物种的IgG免疫球蛋白的Fc和Fab部分的结构域。这些结构域通常被称为E-、D-、A-、B-和C-结构域。
基于葡萄球菌蛋白A (SpA)的试剂由于它们的高亲和性和选择性，已发现广泛用于生物技术领域，例如用于抗体的捕获和纯化的亲和色谱以及用于检测或定量。目前，基于SpA的亲和介质很可能是最广泛使用的从不同的样品(包括工业细胞培养上清液)分离单克隆抗体及其片段的亲和介质。因此，包含蛋白A-配体的各种基质是可市售获得的，例如，以天然蛋白A的形式(例如Protein A SEPHAROSE™, GE Healthcare, Uppsala, Sweden)，并且还包含重组蛋白A (例如rProtein-A SEPHAROSE™, GE Healthcare)。更特别地，在商业重组蛋白A产品中进行的基因操纵旨在促进其附接于载体和提高配体的生产力。
这些应用，像其它亲和色谱应用，需要综合考虑污染物的确切去除。这样的污染物可以例如是在色谱程序中吸附在固定相或基质上的未洗脱的分子，例如非-希望的生物分子或微生物，包括例如蛋白质、碳水化合物、脂质、内毒素、细菌和病毒。从基质除去这样的污染物通常在第一次洗脱所需产物后进行，以在随后使用之前使基质再生。清洁污染物基质通常涉及称为原位清洁(CIP)的程序，其中能够从固定相洗脱污染物的试剂被使用。微生物的灭活通常涉及称为原位消毒(SIP)的程序，其中使用能够灭活微生物的试剂。一些试剂能够清洁和消毒分离基质，这取决于试剂的浓度和与分离基质的接触时间。经常使用的一类这样的试剂是通过所述固定相的碱性溶液。目前用于大多数分离基质的最广泛使用的清洁和消毒剂是NaOH，且其浓度可在从0.1至最多例如1 M的范围内，这取决于污染的程度和性质。然而，该策略与基质暴露于具有13以上的pH-值的溶液有关。对于许多含有蛋白质亲和配体的亲和色谱基质，这样的碱性环境是非常苛刻的条件且由于配体对所涉及的高pH的不稳定性，因此导致能力下降。
因此，广泛的研究已经集中于工程改造的蛋白配体的开发，所述配体表现出改进的耐碱性pH-值的能力。例如，Gülich等(Susanne Gülich, Martin Linhult, Per-ÅkeNygren, Mathias Uhlén, Sophia Hober, Journal of Biotechnology 80 (2000), 169-178)提出蛋白工程改造以改进链球菌白蛋白-结合结构域(ABD)在碱性环境中的稳定性特性。Gülich等创建一种ABD突变体，其中所有4个天冬酰胺残基已被亮氨酸(1个残基)、天冬氨酸(2个残基)和赖氨酸(1个残基)替代。此外，Gülich等报告他们的突变体表现出一种类似于天然蛋白的靶蛋白结合行为，并且含有工程改造的配体的亲和柱在重复暴露于碱性条件后显示出比使用亲本的非-工程改造的配体制备的柱更高的结合能力。因此，从中得出结论，所有4个天冬酰胺残基可被替代，而对结构和功能无任何显著的影响。
最近的工作显示，也可对蛋白A (SpA)进行修改以实现类似的特性。美国专利申请公布US 2005/0143566，其通过引用以其整体结合到本文中，公开当至少一个天冬酰胺残基被突变为并非谷氨酰胺或天冬氨酸的氨基酸时，该突变赋予在至多约13-14的pH-值时，与亲本SpA，例如SpA的B-结构域，或蛋白Z (一种源自SpA的B-结构域的合成构建体)相比，增加的化学稳定性(US 5,143,844，通过引用以其整体结合在此)。作者表明当这些突变的蛋白用作亲和配体时，分离介质如所期望的可更好地耐受使用碱性试剂的清洁程序。为增加碱稳定性目的，蛋白A结构域的另外的突变还已经公开于US 8,329,860、JP 2006304633A、US 8,674,073、US 2010/0221844、US 2012/0208234、US 9,051,375、US 2014/0031522、US2013/0274451和WO 2014/146350中，其全部通过引用以其整体结合到本文中。然而，目前可获得的突变体仍然是对碱性pH敏感的，并且在清洁期间的NaOH浓度通常被限制在0.1 M，这意味着完全的清洁难以实现。而且，这种浓度的NaOH本身不足以有效地对亲和分离基质进行消毒，因此通常使用包含醇例如乙醇或异丙醇的溶液进行消毒。较高的NaOH浓度(其将改善清洁和消毒)导致亲和分离基质的不可接受的能力丧失。
因此，本领域仍有获得含有蛋白配体的分离基质的需要，所述蛋白配体具有对碱性清洁和消毒程序的进一步改进的稳定性。对这样的分离基质也存在需要，所述分离基质具有改进的结合能力，以允许治疗性抗体的经济有效纯化。
发明内容
本发明的发明人已经认识到醇溶液对于亲和分离基质的消毒是次优的。醇类易燃，经受监管，且难以处理。此外，本发明的发明人已经认识到，为使分离基质可用于纯化各种不同的免疫球蛋白产物，低浓度NaOH，例如0.1M NaOH，提供不充分的清洁。相反，分离基质通常仅用于纯化单个产品的单独批次，以防止杂质从一种产品遗留到另一种产品。发明人已经认识到水性碱金属氢氧化物浓溶液作为清洁和储存溶液具有许多优点。碱金属氢氧化物浓溶液具有抑菌作用，并且可以使大多数病毒、细菌、酵母、真菌和内毒素失活。它们能够有效地将具有杂质的分离基质剥离到这样的程度，使得相同的分离基质可用于纯化多种免疫球蛋白。这有利于使用分离基质作为分离平台。此外，碱金属氢氧化物浓溶液相对便宜，易于处理，并且从分离基质中的除去易于使用pH和/或导电率测量而检测。
因此，本发明的一个目的是提供清洁和消毒用于纯化免疫球蛋白的亲和分离基质的方法，这允许使用碱金属氢氧化物浓溶液。
该目的通过根据随附权利要求的清洁和/或消毒分离基质的方法实现，所述分离基质包含与多孔载体共价偶联的免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体。碱稳定的蛋白A结构域包含葡萄球菌蛋白A (SpA)的亲本Fc-结合结构域的突变体，所述突变体由SEQ ID NO 51或SEQ ID NO 52定义，或与其具有至少80%例如至少90%、95%或98%同一性，其中SEQ ID NO 51或52的位置13和44的氨基酸残基是天冬酰胺和其中至少SEQ ID NO 51或52的位置3的天冬酰胺残基已被突变为选自谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、组氨酸和精氨酸的氨基酸。所述方法包含以下步骤：
a)任选地使用分离基质纯化包含第一免疫球蛋白的混合物；
b)提供包含至少50%体积的水性碱金属氢氧化物溶液的清洁液；和
c)通过使清洁液与分离基质接触预定的接触时间来清洁和/或消毒分离基质。
通过使用如上定义的包含免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体的分离基质，获得具有高动态结合能力的高碱稳定性的分离基质。本发明的发明人已经观察到这种分离基质当浸渍到水性碱金属氢氧化物浓溶液中时相对稳定，并且在与这种碱金属氢氧化物浓溶液接触后基本上保持动态结合能力。这意味着这种分离基质适合于采用碱金属氢氧化物浓溶液进行清洁和/或消毒。
对免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的进一步突变可以提供进一步增强的性质，例如增强的碱稳定性。例如，SEQ ID NO 51或52的位置1的谷氨酰胺残基可被突变为丙氨酸；和/或SEQ ID NO 51或52的位置35的天冬酰胺或谷氨酸残基可被突变为丙氨酸。
免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体可为选自二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体或九聚体的同多聚体。通过使用合适的多聚体，可增加分离基质的免疫球蛋白结合能力和碱稳定性。
免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体可各自包含C-末端半胱氨酸残基，以共价偶联至多孔载体。免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体可经由硫醚键偶联至多孔载体。这提供了一种稳定的，碱稳定且经过充分证明的将配体连接到固体载体上的方法。
分离基质可包含至少11 mg/ml，例如至少15 mg/ml的与多孔载体共价偶联的免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体。这确保了具有良好结合能力的分离基质。
多孔载体可包含具有56-70微米的体积加权的中位直径(d50,v)和55-80 mg/ml的干固体重量的交联聚合物颗粒。多孔载体可例如是高度交联的琼脂糖珠。
用于清洁液的水性碱金属氢氧化物溶液可为氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或其混合物，优选氢氧化钠溶液。氢氧化钠溶液相对便宜，容易获得并且被广泛接受用作清洁和消毒溶液。水性碱金属氢氧化物溶液可具有500 mM-5 M，例如1 M-2 M的摩尔浓度。这确保了具有良好杀菌特性的溶液。
在一些情况下，清洁液还可包含C2 – C7醇，例如乙醇、异丙醇或苯甲醇。组合醇和碱金属氢氧化物的清洁液可以更有效地灭活某些微生物，例如一些形成孢子的细菌。
清洁液可包含至少70%体积的水性碱金属氢氧化物溶液，例如至少90%体积的水性碱金属氢氧化物溶液，优选至少99%体积的水性碱金属氢氧化物溶液.
在一些情况下，清洁液可由水性碱金属氢氧化物溶液组成，或基本上由其组成。
预定的接触时间可以是足以提供分离基质中的内毒素浓度和/或微生物浓度6-log10降低的时间。预定的接触时间可以是10分钟-50小时，例如30分钟-24小时，或例如1小时-12小时。这种接触时间通常足以灭活多种微生物。
上述方法的步骤a)-c)可重复至少10次，例如至少50次或50-200次。因此，分离基质可以重复使用多次，同时仍然保持足够的能力以实现可接受的纯化。
本发明的目的进一步通过所附权利要求定义的防止采用分离基质纯化免疫球蛋白中的遗留的方法，所述分离基质包含与多孔载体共价偶联的免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体。所述方法包括通过进行上述清洁和/或消毒分离基质的方法的步骤a) – c)纯化第一免疫球蛋白和清洁和消毒分离基质的步骤。所述方法还包括步骤d)使用分离基质纯化包含第二免疫球蛋白的混合物，其中第二免疫球蛋白不同于第一免疫球蛋白。
所述碱稳定的蛋白A结构域包含葡萄球菌蛋白A (SpA)的亲本Fc-结合结构域的突变体，所述突变体由SEQ ID NO 51或SEQ ID NO 52定义，或与其具有至少80%例如至少90%、95%或98%同一性，其中SEQ ID NO 51或52的位置13和44的氨基酸残基是天冬酰胺和其中至少SEQ ID NO 51或52的位置3的天冬酰胺残基已被突变为选自谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、组氨酸和精氨酸的氨基酸。
根据以下详细描述，本发明的其它目的、优点和新颖特征对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
定义
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用，并被理解为也包括抗体的片段、包含抗体或抗体片段的融合蛋白和包含抗体或抗体片段的缀合物。
术语“Fc-结合多肽”、“Fc-结合结构域”和“Fc-结合蛋白”分别指能够结合抗体的可结晶部分(Fc)的多肽、结构域或蛋白并包括例如蛋白A和蛋白G，或维持所述结合特性的其任何片段或融合蛋白。
术语“接头”在本文中意指使多聚体中的两个多肽单位、单体或结构域彼此连接的元件。
术语“间隔区”在本文中指将多肽或多肽多聚体连接于载体的元件。
关于氨基酸序列的比较，术语“%同一性”通过标准比对算法例如Altshul等(1990)J. Mol. Biol., 215: 403-410描述的Basic Local Alignment Tool (BLASTTM)确定。为此基于网络的软件可自由获自US National Library of Medicine的http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Figure DEST_PATH_IMAGE002
PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome。此处，算法“blastp (蛋白-蛋白BLAST)”用于询问序列与主题序列的比对和确定例如%同一性。
如本文使用的，术语"包含(comprises)"、"包含(comprising)"、"含有"、"具有"等可具有在美国专利法中属于它们的含义和可意指"包括(including)"、"包括(including)"等；"基本上由……组成"或"基本上包括"同样具有美国专利法中给予的含义，和该术语是开放式的，允许存在超过所列举的对象，只要所列举的对象的基本或新特征并未由于存在超过所列举对象而改变，但不包括现有技术实施方案。
附图简述
为了更全面地理解本发明及其进一步的目的和优点，下面给出的详细描述应该结合附图一起阅读，并且在附图中：
图1显示如由SEQ ID NO:1-7和51-52定义的Fc-结合结构域的比对。
图2显示来自实施例2的、对于偶联于SPR生物传感器芯片的亲本和突变的四聚体Zvar (SEQ ID NO 7)多肽变体的碱稳定性的结果。
图3显示来自实施例4的、对于偶联于琼脂糖珠的亲本和突变的四聚体Zvar (SEQID NO 7)多肽变体的碱稳定性(0.5 M NaOH)的结果。
图4显示来自实施例4的、对于偶联于琼脂糖珠的亲本和突变的四聚体Zvar (SEQID NO 7)多肽变体的碱稳定性(1.0 M NaOH)的结果。
图5显示来自实施例7的、对于偶联有不同量的突变的多聚体变体(SEQ ID NO.20)的琼脂糖珠的碱稳定性(1.0 M NaOH)的结果。结果作为相对剩余动态能力(Qb10%，6min停留时间)与在1 M NaOH中的孵育时间作图。
图6显示来自实施例7的、对于偶联有不同量的突变的多聚体变体(SEQ ID NO.20)的琼脂糖珠的碱稳定性(1.0 M NaOH)的结果。结果作为在1 M NaOH中孵育31 h后的相对剩余动态能力(Qb10%，6 min停留时间)与原型的配体含量作图。
图7显示从a) 参考基质MabSelect SuRe LX和b) 根据本发明的基质，多克隆人IgG的pH梯度洗脱的结果。
图8显示来自图7的色谱图的流分中IgG1、IgG2和IgG4组分的分析。a) 参考基质和b) 根据本发明的基质。对于每个流分，第一个条柱(蓝色)代表IgG1，第二个条柱(红色)代表IgG 4和第三个条柱(绿色)代表IgG 2。
图9显示对于参考基质MabSelect SuRe LX (MSS LX)和根据本发明的基质，来自用1 M NaOH孵育的加速碱稳定性测量的结果。稳定性表示为在孵育后剩余的10%穿透能力的百分比。
图10显示使用2M NaOH作为参考基质MabSelect SuRe(MSS)和根据本发明的分离基质(Inv.Ex)的清洁液的重复CIP循环的结果。各分离基质相对于初始能力(确定为35％穿透DBC时的加载量)的能力显示为循环数的函数。
图11显示用1M NaOH孵育参考基质MabSelect SuRe LX(MSS LX)和根据本发明的分离基质(Inv.Ex)的结果。对于各孵育0、16和32小时的设定时间的分离基质，显示由于标记的hIgG结合而作为时间的函数的相对荧光。
图12显示用1M NaOH孵育参考基质MabSelect SuRe LX(MSS LX)和根据本发明的分离基质(Inv.Ex)的结果。对于各孵育长达32小时的设定时间的分离基质，显示由于标记的hIgG结合而作为时间的函数的相对荧光。
图13显示使用包含1M NaOH的清洁液使枯草芽孢杆菌孢子失活的结果。
实施方案的详细描述
本发明的一方面涉及清洁和/或消毒分离基质的方法，所述分离基质包含与多孔载体共价偶联的免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体。
在整个详细描述中，可以使用两种单独的编号约定。除非另有说明，否则使用图1的氨基酸残基位置编号约定，并且将位置编号指定为对应于SEQ ID NO 4-7中的那些。这也适用于多聚体，其中位置编号表示根据图1的约定的多肽单位或单体中的位置，除非另有说明。然而，在整个权利要求书，发明内容以及有时在详细描述中，使用对应于SEQ ID NO 51和52的位置编号的位置编号。注意，SEQ ID NO 51或SEQ ID NO 52的位置1对应于SEQ IDNO 4-7的位置9，并且以这种方式，可以相互转换不同的编号约定。
本发明的免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域，亦称为“多肽”，包含葡萄球菌蛋白A (SpA)的亲本Fc-结合结构域的突变体，基本上由其组成，或由其组成，所述突变体由SEQ ID NO 51或SEQ ID NO 52定义，或与其具有至少80%例如至少90%、95%或98%同一性，其中SEQ ID NO 51或52的位置13和44的氨基酸残基是天冬酰胺和其中至少SEQ ID NO 51或52的位置3的天冬酰胺残基已被突变为选自谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、组氨酸和精氨酸的氨基酸。
SEQ ID NO 51 (截短的Zvar)
QQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQ
SEQ ID NO 52 (截短的C结构域)
QQ NAFYEILHLP NLTEEQRNGF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQ
这样的免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域可包含葡萄球菌蛋白A (SpA)的亲本Fc-结合结构域的突变体，基本上由其组成，或由其组成，所述突变体由以下序列定义或与以下序列具有至少90%、至少95%或至少98%同一性：如在图1中说明的SEQ ID NO: 1(E-结构域)、SEQ ID NO: 2 (D-结构域)、SEQ ID NO:3 (A-结构域)、SEQ ID NO:22 (变体A-结构域)、SEQ ID NO: 4 (B-结构域)、SEQ ID NO: 5 (C-结构域)、SEQ ID NO:6 (蛋白Z)、SEQ ID NO:7 (Zvar)、SEQ ID NO 51 (Zvar，无接头区氨基酸1-8和56-58)或SEQ ID NO52 (C-结构域，无接头区氨基酸1-8和56-58)，其中至少在对应于SEQ ID NO:4-7的位置11的位置的天冬酰胺(或丝氨酸，在SEQ ID NO 2的情况下)残基已被突变为选自谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、组氨酸和精氨酸的氨基酸，和其中对应于SEQ ID NO:4-7的位置21和52(SEQ ID NO 51或52的位置13和44 )的天冬酰胺残基是保守的。
上文列举的许多Fc-结合结构域在图1中显示比对。亲本，即非工程改造的葡萄球菌蛋白A (SpA)包含5个Fc-结合结构域，称为结构域 E (SEQ ID NO 1)、D (SEQ ID NO 2)、A (SEQ ID NO 3)、B (SEQ ID NO 4)和C (SEQ ID NO 5)。蛋白Z (SEQ ID NO:6)是如在US5143844 (通过引用以其整体并入本文)中公开的突变的B-结构域。SEQ ID NO 7表示蛋白Z的另外突变的变体，在此称为Zvar，具有突变N3A、N6D、N23T。SEQ ID NO:22 (在图1中未显示)是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌株N315的蛋白A的A-结构域的天然变体(具有A46S突变，使用图1的位置术语)。SEQ ID NO 51是在位置1-8和56-58没有接头区氨基酸的Zvar (SEQ ID NO 7)。SEQ ID NO 52是没有接头区氨基酸1-8和56-58的蛋白A的C-结构域，如在图1中说明的。
这些结构域中的N11 (SEQ ID NO 51:52的N3)连同天冬酰胺残基N21和N52 (SEQID NO 51:52的N13和N44)的保守突变赋予与亲本结构域/多肽比较的改进的碱稳定性，而不损害免疫球蛋白-结合特性。因此，该多肽也可被描述为Fc-或免疫球蛋白-结合多肽，或者备选地描述为Fc-或免疫球蛋白-结合多肽单位。
用备选语言描述，免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域可包含由SEQ ID NO53定义的序列或与其具有至少90%、至少95%或至少98%同一性的序列，基本上由其组成，或由其组成。
SEQ ID NO 53
X1Q X2AFYEILX3LP NLTEEQRX4X5F IX6X7LKDX8PSX9 SX10X11X12LAEAKX13 X14NX15AQ
其中彼此独立地：
X1=A、Q或被缺失
X2=E、K、Y、T、F、L、W、I、M、V、A、H或R
X3=H或K
X4=A或N
X5=A、G、S、Y、Q、T、N、F、L、W、I、M、V、D、E、H、R或K、例如S、Y、Q、T、N、F、L、W、I、M、V、D、E、H、R或K
X6=Q或E
X7=S或K
X8=E或D
X9=Q、V或被缺失
X10=K、R、A或被缺失
X11=A、E、N或被缺失
X12=I或L
X13=K或R
X14=L或Y
X15=D、F、Y、W、K或R
特别地，SEQ ID NO 53中的氨基酸残基可彼此独立地为：
X1 = A或被缺失
X2 = E
X3 = H
X4 = N
X6 = Q
X7 = S
X8 = D
X9 = V或被缺失
X10 = K或被缺失
X11 = A或被缺失
X12 = I
X13 = K
X14 = L
在某些实施方案中，SEQ ID NO 53中的氨基酸残基可为：
X1=A、X2 = E、X3 = H、X4 = N、X6 = Q、X7 = S、X8 = D、X9 = V、X10 = K、X11 = A、X12= I、X13 = K、X14 = L。在一些实施方案中X2 = E、X3 = H、X4 = N、X5=A、X6 = Q、X7 = S、X8 =D、X12 = I、X13 = K、X14 = L和X15=D和X1、X9、X10和X11中的一个或多个被缺失。在进一步的实施方案中，X1=A、X2 = E、X3 = H、X4 = N、X5= S、Y、Q、T、N、F、L、W、I、M、V、D、E、H、R或K 、X6 =Q、X7 = S、X8 = D、X9 = V、X10 = K、X11 = A、X12 = I、X13 = K、X14 = L和X15=D，或备选地，X1=A、X2 = E、X3 = H、X4 = N、X5=A、X6 = Q、X7 = S、X8 = D、X9 = V、X10 = K、X11 = A、X12 = I、X13 = K、X14 = L和X15= F、Y、W、K或R。
在一些实施方案中、氨基酸残基可彼此独立地为：
a) X1 = A或被缺失、X2 = E、X3 = H、X4 = N、X6 = Q、X7 = S、X8 = D、X9 = V或被缺失、X10 = K或被缺失、X11 = A或被缺失、X12 = I、X13 = K、X14 = L;
b) X1=A、X2 = E、X3 = H、X4 = N、X5=A、X6 = Q、X7 = S、X8 = D、X9 = V、X10 = K、X11= A、X12 = I、X13 = K、X14 = L和X15=D;
c) X1为A、X2 = E、X3 = H、X4 = N、X6 = Q、X7 = S、X8 = D、X9 = V、X10 = K、X11 =A、X12 = I、X13 = K、X14 = L和X15=D; 或
d) X1为A、X3 = H、X4 = N、X5=A、X6 = Q、X7 = S、X8 = D、X9 = V、X10 = K、X11 = A、X12 = I、X13 = K、X14 = L和X15=D。
N11 (X2)突变(如N11E或N11K突变)可以是唯一的突变或多肽还可包含另外的突变，例如对应于SEQ ID NO:4-7的位置3、6、9、10、15、18、23、28、29、32、33、36、37、40、42、43、44、47、50、51、55和57的至少一个位置的取代。在这些位置的一个或多个中，原始氨基酸残基可以例如用不是天冬酰胺、脯氨酸或半胱氨酸的氨基酸取代。原始氨基酸残基可以例如用丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸取代。而且，一个或多个氨基酸残基可以例如从位置1-6和/或从位置56-58缺失。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:4-7的位置9的位置的氨基酸残基(X1)是并非谷氨酰胺、天冬酰胺、脯氨酸或半胱氨酸的氨基酸，例如丙氨酸，或者其可被缺失。在位置9和11的突变的组合提供特别好的碱稳定性，如由实施例显示的。在特定的实施方案中，在SEQ ID NO: 7中，在位置9的氨基酸残基是丙氨酸和在位置11的氨基酸残基是赖氨酸或谷氨酸，例如赖氨酸。在位置9的突变在同时待审的申请PCT/SE2014/050872中也有讨论，其通过引用以其整体结合到本文中。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:4-7的位置50的位置的氨基酸残基(X13)是精氨酸或谷氨酸。
在某些实施方案中，对应于SEQ ID NO:4-7的位置3的位置的氨基酸残基是丙氨酸和/或对应于SEQ ID NO:4-7的位置6的位置的氨基酸残基是天冬氨酸。在位置3和6的氨基酸残基之一可以是天冬酰胺，而在可供选择的实施方案中，在位置3和6的两个氨基酸残基可以是天冬酰胺。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:4-7的位置43的位置的氨基酸残基(X11)是丙氨酸或谷氨酸，例如丙氨酸，或者其可被缺失。在特定的实施方案中，在SEQ ID NO: 7的位置9和11的氨基酸残基分别是丙氨酸和赖氨酸/谷氨酸，而在位置43的氨基酸残基是丙氨酸或谷氨酸。
在某些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:4-7的位置28的位置的氨基酸残基(X5)是丙氨酸或天冬酰胺，例如丙氨酸。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:4-7的位置40的位置的氨基酸残基(X9)选自天冬酰胺、丙氨酸、谷氨酸和缬氨酸，或选自谷氨酸和缬氨酸，或缬氨酸，或者其可被缺失。在特定的实施方案中，在SEQ ID NO: 7的位置9和11的氨基酸残基分别是丙氨酸和谷氨酸，而在位置40的氨基酸残基是缬氨酸。任选地，在位置43的氨基酸残基则可以是丙氨酸或谷氨酸。
在某些实施方案中，对应于SEQ ID NO:4-7的位置42的位置的氨基酸残基(X10)是丙氨酸、赖氨酸或精氨酸，或者其可被缺失。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:4-7的位置18的位置的氨基酸残基(X3)是赖氨酸或组氨酸，例如赖氨酸。
在某些实施方案中，对应于SEQ ID NO:4-7的位置33的位置的氨基酸残基(X7)是赖氨酸或丝氨酸，例如赖氨酸。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:4-7的位置37的位置的氨基酸残基(X8)是谷氨酸或天冬氨酸，例如谷氨酸。
在某些实施方案中，对应于SEQ ID NO:4-7的位置51的位置的氨基酸残基(X14)是酪氨酸或亮氨酸，例如酪氨酸。
在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:4-7的位置44的位置的氨基酸残基(X12)是亮氨酸或异亮氨酸。在特定的实施方案中，在SEQ ID NO: 7的位置9和11的氨基酸残基分别是丙氨酸和赖氨酸/谷氨酸，而在44位的氨基酸残基是异亮氨酸。任选地，在43位的氨基酸残基则可以是丙氨酸或谷氨酸。
在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO: 4-7的位置1、2、3和4或位置3、4、5和6的位置的氨基酸残基已被缺失。在这些实施方案的特定变体中，亲本多肽是蛋白A的C结构域(SEQ ID NO: 5)。天然C结构域上的这些缺失的作用在US9018305和US8329860中描述，其通过引用以其整体结合到本文中。
在某些实施方案中，在SEQ ID NO 4-7 (例如在SEQ ID NO 7)中的突变选自：N11K；N11E；N11Y；N11T；N11F；N11L；N11W；N11I；N11M；N11V；N11A；N11H；N11R；N11E,Q32A；N11E,Q32E,Q40E；N11E,Q32E,K50R；Q9A,N11E,N43A；Q9A,N11E,N28A,N43A；Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43E,L44I；Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I； N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y；Q9A,N11E,N28A,Q40V,A42K,N43A,L44I；Q9A,N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y；N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I；Q9A, N11K, H18K,D37E, A42R, N43A, L44I； Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R；Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R；Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42K,N43A,L44I和Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42R,N43A,L44I。这些突变提供特别高的碱稳定性。在SEQ ID NO 4-7，例如在SEQ ID NO 7中的突变，也可选自N11K；N11Y；N11F；N11L；N11W；N11I；N11M；N11V；N11A；N11H；N11R；Q9A,N11E,N43A；Q9A,N11E,N28A,N43A；Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43E,L44I；Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I；Q9A,N11E,N28A,Q40V,A42K,N43A,L44I；N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y；Q9A,N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y；N11K, H18K,D37E, A42R, N43A, L44I；Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I和Q9A, N11K,H18K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R。
在一些实施方案中，该多肽包含以下序列，或基本上由其组成：由选自以下的氨基酸序列定义，或与其具有至少90%、95%或98%同一性的序列：SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQID NO 16、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 27、SEQID NO 28、SEQ ID NO 29、SEQ ID NO 36、SEQ ID NO 37、SEQ ID NO 38、SEQ ID NO 39、SEQID NO 40、SEQ ID NO 41、SEQ ID NO 42、SEQ ID NO 43、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 45、SEQID NO 46、SEQ ID NO 47、SEQ ID NO 48、SEQ ID NO 49和SEQ ID NO 50。它可例如包含以下序列，或基本上由其组成：由选自以下的氨基酸序列定义，或与其具有至少90%、95%或98%同一性的序列：SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO 26、SEQ ID NO 27、SEQ ID NO 28和SEQ ID NO 29。它也可包含以下序列，或基本上由其组成：由选自以下的氨基酸序列定义，或与其具有至少90%、95%或98%同一性的序列：SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 24、SEQ ID NO 25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO 28、SEQ ID NO 38、SEQ ID NO 40；SEQ ID NO 41；SEQ ID NO 42；SEQ NO43、SEQ ID NO 44、SEQ ID NO 45、SEQ ID NO 46、SEQ ID NO 47和SEQ ID NO 48。
在某些实施方案中，该多肽包含以下序列，或基本上由其组成：由选自SEQ ID NO54-70的氨基酸序列定义，或与其具有至少90%、95%或98%同一性的序列；包含以下序列，或基本上由其组成：由选自SEQ ID NO 71-75的氨基酸序列定义，或与其具有至少90%、95%或98%同一性的序列；或其可包含以下序列，或基本上由其组成：由选自SEQ ID NO 76-79的氨基酸序列定义，或与其具有至少90%、95%或98%同一性的序列。其还可包含以下序列，或基本上由其组成：由选自SEQ ID NO 89-95的氨基酸序列定义，或与其具有至少90%、95%或98%同一性的序列。
多肽可例如由选自以上各组或选自这些组的亚集的序列定义，但它还可包含另外的N-和/或C-末端的氨基酸残基，如在N-末端的前导序列和/或在C-末端的尾序列。
SEQ ID NO 8 Zvar(Q9A,N11E,N43A)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 9 Zvar(Q9A,N11E,N28A,N43A)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 10 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43E,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 11 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 12 Zvar(N11E,Q32A)
VDAKFDKEQQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IASLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 13 Zvar(N11E)
VDAKFDKEQQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 14 Zvar(N11E,Q32E,Q40E)
VDAKFDKEQQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IESLKDDPSE SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 15 Zvar(N11E,Q32E,K50R)
VDAKFDKEQQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IESLKDDPSQ SANLLAEAKR LNDAQAPK
SEQ ID NO 16 Zvar(N11K)
VDAKFDKEQQ KAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 23 Zvar(N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)
VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK
SEQ ID NO 24 Zvar(Q9A,N11E,N28A,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 25 Zvar(Q9A,N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRAAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK
SEQ ID NO 26 Zvar(N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I)
VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 27 Zvar(Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 28 Zvar(Q9A, N11K, H18K, D37E, A42R, N43A, L44I, K50R)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRAILAEAKR LNDAQAPK
SEQ ID NO 29 Zvar(Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R)
VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 36 B(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
ADNKFNKEAQ EAFYEILHLP NLNEEQRNGF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 37 C(Q9A,N11E,E43A)
ADNKFNKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNGF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 38 Zvar(N11Y)
VDAKFDKEQQ YAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 39 Zvar(N11T)
VDAKFDKEQQ TAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 40 Zvar(N11F)
VDAKFDKEQQ FAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 41 Zvar(N11L)
VDAKFDKEQQ LAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 42 Zvar(N11W)
VDAKFDKEQQ WAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 43 Zvar(N11I)
VDAKFDKEQQ IAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 44 Zvar(N11M)
VDAKFDKEQQ MAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 45 Zvar(N11V)
VDAKFDKEQQ VAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 46 Zvar(N11A)
VDAKFDKEQQ AAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 47 Zvar(N11H)
VDAKFDKEQQ HAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 48 Zvar(N11R)
VDAKFDKEQQ RAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 49 Zvar(Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 50 Zvar(Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42R,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 54 Zvar(Q9A,N11E,A29G,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNGF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 55 Zvar(Q9A,N11E,A29S,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNSF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 56 Zvar(Q9A,N11E,A29Y,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNYF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 57 Zvar(Q9A,N11E,A29Q,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNQF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 58 Zvar(Q9A,N11E,A29T,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNTF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 59 Zvar(Q9A,N11E,A29N,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNNF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 60 Zvar(Q9A,N11E,A29F,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNFF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 61 Zvar(Q9A,N11E,A29L,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNLF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 62 Zvar(Q9A,N11E,A29W,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNWF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 63 Zvar(Q9A,N11E,A29I,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNIF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 64 Zvar(Q9A,N11E,A29M,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNMF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 65 Zvar(Q9A,N11E,A29V,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNVF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 66 Zvar(Q9A,N11E,A29D,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNDF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 67 Zvar(Q9A,N11E,A29E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNEF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 68 Zvar(Q9A,N11E,A29H,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNHF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 69 Zvar(Q9A,N11E,A29R,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNRF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 70 Zvar(Q9A,N11E,A29K,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNKF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 71 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,D53F)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNFAQAPK
SEQ ID NO 72 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,D53Y)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNYAQAPK
SEQ ID NO 73 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,D53W)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNWAQAPK
SEQ ID NO 74 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,D53K)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNKAQAPK
SEQ ID NO 75 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,D53R)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNRAQAPK
SEQ ID NO 76 Zvar(Q9del,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKE_Q EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 77 Zvar(Q9A,N11E,Q40del,A42K,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPS_ SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 78 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42del,N43A,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV S_AILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 79 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43del,L44I)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SK_ILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 89 Zvar(D2del,A3del,K4del,Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
V___FDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 90 Zvar(V1del,D2del,Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,K58del)
__AKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAP_
SEQ ID NO 91 Zvar(K4del,F5del,D6del,K7del,E8del,Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
VDA_____AQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 92 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,A56del,P57del,K58del)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQ___
SEQ ID NO 93 Zvar(V1del,,D2del,A3del,Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
___KFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 94 Zvar(V1del,D2del,A3del,K4del,F5del,D6del,K7del,E8del,Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)
________AQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK
SEQ ID NO 95 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I,K58_insYEDG)
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKYE DG
分离基质包含免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体。这样的多聚体包含多个由上文公开的任何实施方案定义的免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域(多肽单位)，基本上由其组成，或由其组成。多聚体的使用可增加免疫球蛋白结合能力，和多聚体还可具有比单体更高的碱稳定性。多聚体可例如是二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体或九聚体。多聚体可以是同多聚体，其中多聚体中的所有单位是相同的，或者它可以是异多聚体，其中至少一个单位与其它不同。有利的是，多聚体中的所有单位是碱稳定的，例如通过包含上文公开的突变/保守。多肽可通过多肽的C-末端和N-末端之间的肽键直接彼此连接。或者，多聚体中两个或更多个单位可通过包含寡聚体或多聚体物类的接头，例如包含具有至多25或30个氨基酸、例如3-25或3-20个氨基酸的肽的接头连接。接头可例如包含由以下氨基酸序列定义或与所述氨基酸序列具有至少90%同一性或至少95%同一性的肽序列，或基本上由所述肽序列组成：选自APKVDAKFDKE、APKVDNKFNKE、APKADNKFNKE、APKVFDKE、APAKFDKE、AKFDKE、APKVDA、VDAKFDKE、APKKFDKE、APK、APKYEDGVDAKFDKE和YEDG，或备选地选自APKADNKFNKE、APKVFDKE、APAKFDKE、AKFDKE、APKVDA、VDAKFDKE、APKKFDKE、APKYEDGVDAKFDKE和YEDG的氨基酸序列。它们也可基本上由以下肽序列组成：所述肽序列由选自APKADNKFNKE、APKVFDKE、APAKFDKE、AKFDKE、APKVDA、VDAKFDKE、APKKFDKE、APK和APKYEDGVDAKFDKE的氨基酸序列定义，或与其具有至少90%同一性或至少95%同一性。在一些实施方案中，接头不由肽APKVDAKFDKE或APKVDNKFNKE组成，或备选地，不由肽APKVDAKFDKE、APKVDNKFNKE 、APKFNKE、APKFDKE、APKVDKE或APKADKE组成。
这样的接头的性质应优选地不使蛋白单位的空间构象失去稳定。这可例如通过避免在接头中存在脯氨酸来实现。此外，所述接头还应优选地在碱性环境中足够稳定，以不损害突变的蛋白单位的特性。为此目的，如果接头不含有天冬酰胺，则是有利的。如果接头不含有谷氨酰胺，则可另外是有利的。多聚体可进一步在N-末端包含多个氨基酸残基，例如源自克隆过程的氨基酸残基，或构成来自裂解的信号序列的残基的氨基酸残基。另外的氨基酸残基的数量可例如是20或更少、例如15或更少、例如10或更少、或5或更少。作为具体的实例，多聚体可在N-末端包含AQ、AQGT、VDAKFDKE、AQVDAKFDKE或AQGTVDAKFDKE序列。
在某些实施方案中，多聚体可包含选自SEQ ID NO 80-87的序列，或基本上由其组成。这些和另外的序列在下文列出，和命名为亲本(突变)n，其中n是多聚体中单体单位的数量。
SEQ ID NO 17 Zvar(Q9A,N11E,N43A)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPKVDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQEAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLPNLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 18 Zvar(Q9A,N11E,N28A,N43A)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPKVDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQEAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLPNLTEEQRAAF IQSLKDDPSQ SAALLAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 19 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43E,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPKVDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQEAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLPNLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKEILAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 20 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKVDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQEAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLPNLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 30 Zvar(N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)4
AQGT VDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPKVDAKFDKEQQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK VDAKFDKEQQKAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPK VDAKFDKEQQ KAFYEILKLPNLTEEQRNAF IQKLKDEPSQ SRAILAEAKR YNDAQAPKC
SEQ ID NO 31 Zvar(Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R)4
AQGT VDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPKVDAKFDKEAQ KAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQKAFYEILKLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ KAFYEILKLPNLTEEQRNAF IQSLKDEPSQ SRNLLAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 32 Zvar(Q9A,N11E,N28A,Q40V,A42K,N43A,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKVDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQEAFYEILHLP NLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLPNLTEEQRAAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 33 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)6
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKVDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQEAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLPNLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAFIQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSVSKAILAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 34 Zvar(Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42K,N43A,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKVDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQEAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLPNLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 35 Zvar(Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42R,N43A,L44I)4
AQGT VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPKVDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQEAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPK VDAKFDKEAQ EAFYEILHLPNLTEEQRNAF IQSLKDEPSV SRAILAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 80 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)2，其中接头中的D2、A3和K4缺失
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKVFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 81 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)2，其中接头中的K58、V1和D2缺失
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 82 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)2，其中接头中的P57、K58、V1、D2和A3缺失
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 83 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)2，其中接头中的K4、F5、D6、K7和E8缺失
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK VDAAQEAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 84 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)2，其中接头中的A56、P57和K58缺失
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQVDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 85 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)2，其中接头中的V1、D2和A3缺失
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 86 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)2，其中接头中的V1、D2、A3、K4、F5、D6、K7和E8缺失
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK AQEAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 87 Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)2，其中在接头的K58和V1之间插入YEDG
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPK YEDGVDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
SEQ ID NO 88 Zvar2
VDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKVDAKFDKEAQ EAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSV SKAILAEAKK LNDAQAPKC
在一些实施方案中，如上文公开的多肽和/或多聚体还包含在C-末端或N-末端的一个或多个偶联元件，其选自一个或多个半胱氨酸残基、多个赖氨酸残基和多个组氨酸残基。偶联元件还可位于距C-末端或N-末端的1-5个氨基酸残基内，例如1-3或1-2个氨基酸残基内。偶联元件可以例如是在C-末端的单一半胱氨酸。偶联元件可直接连接于C-或N-末端，或它/它们可通过包含至多15个氨基酸，例如1-5、1-10或5-10个氨基酸的一段序列(stretch)连接。这段序列优选在碱性环境中应该也是足够稳定的，不损害突变蛋白的特性。为此目的，如果这段序列不含天冬酰胺，则是有利的。如果这段序列不含谷氨酰胺，则可另外是有利的。具有C-末端半胱氨酸的优点是蛋白的终点偶联可通过半胱氨酸硫醇与载体上的亲电子基团的反应完成。这提供对于结合能力是重要的偶联蛋白的优越移动性。
多肽或多聚体的碱稳定性可通过使之偶联于表面等离子体共振(SPR)芯片，例如如在实施例中所述，使用例如NHS-或马来酰亚胺偶联化学反应偶联于Biacore CM5传感器芯片，并在指定温度下，例如22 +/- 2℃，在碱性溶液中孵育之前和之后，通常使用多克隆人IgG测量芯片的免疫球蛋白-结合能力来评价。孵育可例如在0.5 M NaOH中进行许多个10min的循环，例如100、200或300个循环。于22 +/- 2℃，在0.5 M NaOH中在100个10 min的孵育循环后，基质的IgG能力可以是孵育前IgG能力的至少55%，例如至少60%、至少80%或至少90%。或者，对于如上测量的特定突变体在100个循环后的剩余IgG能力可与对亲本多肽/多聚体的剩余的IgG能力比较。在这种情况下，对于突变体的剩余的IgG能力可以是亲本多肽/多聚体的至少105%，例如至少110%、至少125%、至少150%或至少200%。
免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域和/或其多聚体可由核酸序列编码，例如编码多肽或多聚体的RNA序列或DNA序列。载体，例如质粒，其除了编码序列，还包含信号序列，可用于表达多肽或多聚体。载体可包含编码上述多聚体的核酸，其中编码各个单位的独立的核酸可具有同源或异源的DNA序列。
表达系统，其包含如上公开的核酸或载体，可用于表达多肽或多聚体。表达系统可以例如是革兰氏阳性或革兰氏阴性原核宿主细胞系统，例如大肠杆菌(E.coli)或芽孢杆菌(Bacillus sp)，其已被修饰为表达本发明的多肽或多聚体。或者，表达系统可以是真核宿主细胞系统，例如酵母，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或哺乳动物细胞，例如CHO细胞。
分离基质包含与多孔载体共价偶联的如上文所述的免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体，基本上由其组成，或由其组成。
分离基质可包含至少11、例如11-21、15-21或15-18 mg/ml与多孔载体共价偶联的Fc-结合配体，其中：
a) 配体包含碱稳定的蛋白A结构域的多聚体，
b) 多孔载体包含具有56-70、例如56-66微米的体积加权的中位直径(d50,v)和55-80、例如60-78或65-78 mg/ml的干固体重量的交联聚合物颗粒。交联聚合物颗粒还可具有对于Mw 110 kDa的葡聚糖，对应于0.69-0.85、例如0.70-0.85或0.69-0.80的反相凝胶过滤色谱Kd值的孔径。多聚体可例如包含碱稳定的蛋白A结构域的四聚体、五聚体、六聚体或七聚体，例如碱稳定的蛋白A结构域的六聚体。高配体含量与粒度范围、干固体重量范围和任选的Kd范围组合，提供高的结合能力，例如使得对于IgG的10%穿透动态结合能力在2.4min停留时间时是至少45 mg/ml，例如至少50或至少55 mg/ml。备选地或另外地，对于IgG的10%穿透动态结合能力在6 min停留时间时可以是至少60 mg/ml，例如至少65、至少70或至少75 mg/ml。
碱稳定的蛋白A结构域多聚体对IgG具有高度选择性，和分离基质在20 mM磷酸盐缓冲液、180 mM NaCl、pH 7.5中可合适地对人IgG2具有低于0.2 mg/ml、例如低于0.1 mg/ml的离解常数。这可根据描述于N Pakiman等: J Appl Sci 12, 1136-1141 (2012)的吸附等温线方法测定。
在某些实施方案中，分离基质包含至少15、例如15-21或15-18 mg/ml与多孔载体共价偶联的Fc-结合配体，其中配体包含碱稳定的蛋白A结构域的多聚体。这些多聚体可合适地如上文描述的任何实施方案所公开，或如下文所列举的。
在一些实施方案中，基质包含5-25，例如5-20 mg/ml、5-15 mg/ml、5-11 mg/ml或6-11 mg/ml的偶联于载体的多肽或多聚体。偶联的多肽/多聚体的量可受在偶联过程中所用的多肽/多聚体的浓度，受所用的激活和偶联条件和/或受所用载体的孔结构的控制。作为一般规则，基质的绝对结合能力随着偶联多肽/多聚体的量增加，至少达到其中孔变得受偶联的多肽/多聚体显著阻塞的点。不受理论的约束，似乎对于载体所述的Kd值，孔被偶联配体的阻塞具有较低的重要性。每mg偶联的多肽/多聚体的相对结合能力将在高偶联水平上降低，导致在以上指定范围内的成本-效益最优。
这样的分离基质可用来分离免疫球蛋白或其它含有Fc的蛋白，并且由于多肽/多聚体的改进的碱稳定性，基质将耐受在清洁期间的高碱性的条件，这对于长期重复用于生物处理分离装置是至关重要的。基质的碱稳定性可通过通常于特定的温度下，例如22 +/-2℃，在碱性溶液中孵育之前和之后，使用多克隆人IgG测量免疫球蛋白-结合能力来评价。孵育可例如在0.5 M或1.0 M NaOH中进行多个15 min循环，例如100、200或300个循环，对应于25、50或75 h的总孵育时间。于22 +/- 2℃，在0.5 M NaOH中经96-100个15 min孵育循环或24或25 h的总孵育时间后，基质的IgG能力可以是孵育前IgG能力的至少80，例如至少85、至少90或至少95%。于22 +/- 2℃，在1.0 M NaOH中经24 h的总孵育时间后，基质的能力可以是孵育前IgG能力的至少70，例如至少80或至少90%。在22 +/- 2 C下在1.0 M水性NaOH中孵育31 h后，在2.4 min或6 min停留时间时对于IgG的10%穿透动态结合能力(Qb10%)可例如减少少于20 %。
如技术人员应该理解的，表达的多肽或多聚体在被固定到载体之前，应被纯化至合适的程度。这样的纯化方法是本领域熟知的，且基于蛋白的配体固定于载体容易使用标准方法进行。合适的方法和载体将在下文更详细地讨论。
分离基质的多孔载体可以是任何合适的熟知的种类。常规亲和分离基质通常具有有机性质并基于将亲水性表面暴露于所用的水性介质的聚合物，即暴露羟基(-OH)、羧基(-COOH)、羧酰氨基(-CONH2，可能呈现为N-取代的形式)、氨基(-NH2，可能呈现为取代的形式)、寡-或聚氧乙烯基团在它们的外表面和(如果存在)也在内表面上。载体的孔隙率可以表示为Kav或Kd值(特定尺寸的探针分子可用的孔体积的分数)，其通过反相尺寸排阻色谱，例如根据在Gel Filtration Principles and Methods, Pharmacia LKB Biotechnology1991, pp 6-13中描述的方法测量。Kav作为比率(Ve-V0)/(Vt-V0)测定，其中Ve是探针分子(例如葡聚糖110 kD)的洗脱体积，V0是柱的空隙容积(例如，高Mw空隙标志物、例如粗葡聚糖的洗脱体积)和Vt是柱的总体积。Kd可作为(Ve-V0)/Vi测定，其中Vi是能够进入除了基质体积(由基质聚合物分子占据的体积)之外的所有体积的盐(例如NaCl)的洗脱体积。按照定义，Kd和Kav值二者总是在0-1范围内。Kav值可有利地为0.6-0.95，例如0.7-0.90或0.6-0.8，如用Mw 110 kDa的葡聚糖作为探针分子测量的。用Mw 110 kDa的葡聚糖测量的Kd值可合适地是0.68-0.90，例如0.68-0.85或0.70-0.85。其优点是载体具有大分数的孔，所述孔能够容纳本发明的多肽/多聚体和结合于多肽/多聚体的免疫球蛋白并提供免疫球蛋白朝向结合位点和离开结合位点的质量运输。
多肽或多聚体可经由常规偶联技术，利用存在于配体中的例如硫醇基、氨基和/或羧基，附接于多孔载体。双环氧化物(Bisepoxides)、表氯醇、CNBr、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等是熟知的偶联试剂。在载体和多肽/多聚体之间，可引入一种称为间隔区的分子，其改进多肽/多聚体的可利用性并促进多肽/多聚体化学偶联于载体。取决于多肽/多聚体的性质和偶联条件，偶联可以是多点偶联(例如经由多个赖氨酸)或单点偶联(例如经由单一半胱氨酸)。
在某些实施方案中，多肽或多聚体通过硫醚键偶联于载体。执行这样的偶联的方法是本领域熟知的并由本领域技术人员使用标准技术和设备容易地进行。硫醚键是柔性和稳定的，且一般适用于亲和色谱。特别是当硫醚键经由多肽或多聚体上的末端或接近-末端的半胱氨酸残基时，偶联的多肽/多聚体的移动性增加，这提供了改进的结合能力和结合动力学。在一些实施方案中，多肽/多聚体经由如上所述的蛋白上提供的C-末端半胱氨酸偶联。这允许半胱氨酸硫醇有效偶联于载体上的亲电子基团，例如环氧化物基团、卤代醇基团等，导致硫醚桥偶联。
在某些实施方案中，载体包含多羟基聚合物，例如多糖。多糖的例子包括例如葡聚糖、淀粉、纤维素、支链淀粉、琼脂、琼脂糖等。多糖是固有亲水的，具有低程度的非特异性相互作用，它们提供高含量的反应性(可激活的)羟基且它们对用于生物处理的碱性清洁溶液一般是稳定的。
在一些实施方案中，载体包含琼脂或琼脂糖。用于本发明的载体可根据标准方法，例如逆悬浮凝胶化(inverse suspension gelation) (S Hjertén: Biochim BiophysActa 79(2), 393-398 (1964)容易地制备。或者，基础基质是可市售获得的产品，例如以SEPHAROSE™ FF (GE Healthcare)商品名销售的交联的琼脂糖珠。在对于大规模分离是特别有利的实施方案中，使用在US6602990或US7396467 (通过引用以其整体结合到本文中)中描述的方法，载体经修改以增加其刚性，因而使基质更适合于高流速。
在某些实施方案中，载体，例如聚合物、多糖或琼脂糖载体被交联，例如用羟烷基醚交联。产生这样的交联的交联剂可以是例如表卤代醇像表氯醇、双环氧化物像丁二醇二缩水甘油醚、烷基化剂像烯丙基卤化物或烯丙基缩水甘油醚。交联对于载体的刚性是有益的并改进化学稳定性。羟烷基醚交联是碱稳定性的且不引起显著非特异性吸附。
或者，多孔载体是基于合成的聚合物，例如聚乙烯醇、聚羟基烷基丙烯酸酯、聚羟基烷基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺等。在疏水性聚合物，例如基于二乙烯基和单乙烯基-取代的苯的基质的情况下，基质的表面常常被亲水化，以使如上定义的亲水性基团暴露于周围的水性液体。这样的聚合物根据标准方法，见例如“Styrene basedpolymer supports developed by suspension polymerization” (R Arshady: Chimicae L'Industria 70(9), 70-75 (1988))容易地生产。或者，使用可市售获得的产品，例如SOURCE™ (GE Healthcare)。在另一个替代中，根据本发明的多孔载体包含无机性质的载体，例如二氧化硅、氧化锆等。
在再另一个实施方案中，固体载体呈现为另一种形式，例如表面、芯片、毛细管或滤器(如膜或深度过滤基质)。
关于根据本发明的基质的形状，在一个实施方案中，基质呈现为多孔的整料的形式。在可供选择的实施方案中，基质以可以是多孔或无孔的串珠或粒子形式呈现。以串珠或粒子形式呈现的基质可用作填充床或以悬浮的形式使用。悬浮的形式包括称为膨胀床和纯粹的悬浮液的那些，其中颗粒或珠自由移动。在整料、填充床和膨胀床的情况下，分离程序通常遵循具有浓度梯度的常规色谱。在纯粹的悬浮液的情况下，使用分批的模式。
如上公开的分离基质具有优异的碱稳定性并且可以碱性清洁液清洁和/或消毒。清洁和/或消毒分离基质的方法包括以下步骤：
a)任选地使用分离基质纯化包含第一免疫球蛋白的混合物；
b)提供包含至少50%体积的水性碱金属氢氧化物溶液的清洁液；和
c)通过使清洁液与分离基质接触预定的接触时间来清洁和/或消毒分离基质。
可以对先前未使用的分离基质进行清洁和/或消毒，以便在使用前消毒基质，例如在第一次装填包含分离基质的柱之后。在使用分离基质纯化免疫球蛋白后，也可以进行清洁和/或消毒，即上述方法的步骤a)。可以重复使用分离基质纯化免疫球蛋白并随后清洁和/或消毒分离基质的步骤，以最大化分离基质的使用。这些步骤可以重复至少10次，例如至少50次或50-200次。清洁/消毒的步骤c)可以在纯化免疫球蛋白的每个步骤a)之后进行，或者可以较不频繁地进行，例如在每两次纯化后，或在每十次纯化后进行。不需要每次使用相同的条件进行清洁和/或消毒分离基质的步骤c)。例如，可以在每个纯化步骤之后使用第一组条件清洁分离基质，并且在每n次纯化之后使用更严格的条件对其进行消毒。
因为水性碱金属氢氧化物溶液是有效的清洁剂并且本身具有杀菌作用，通过使用包含这种水性碱金属氢氧化物溶液的清洁液进行清洁和消毒，不太需要使用醇作为清洁和消毒剂。与醇相比，碱金属氢氧化物相对便宜并且受到更少监管负担。而且，它们不易燃且易于处理。
分离基质是如上公开的分离基质，包含与多孔载体共价偶联的免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体，其中碱稳定的蛋白A结构域包含葡萄球菌蛋白A (SpA)的亲本Fc-结合结构域的突变体，如由SEQ ID NO 51或SEQ ID NO 52定义的或与其具有至少80%，例如至少90%、95%或98%同一性，其中SEQ ID NO 51或52的位置13和44的氨基酸残基是天冬酰胺，和其中至少SEQ ID NO 51或52的位置3的天冬酰胺残基已被突变为选自谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、组氨酸和精氨酸的氨基酸。免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域可包含另外的突变。例如，SEQ ID NO 51或52的位置1的谷氨酰胺残基可被突变为丙氨酸；和/或SEQ ID NO 51或52的位置35的天冬酰胺或谷氨酸残基可被突变为丙氨酸。
由于碱稳定的蛋白A结构域的高碱性稳定性，即使碱金属氢氧化物浓溶液，分离基质也可以耐受广泛的清洁和消毒程序，而不会过度损失结合能力。例如，分离基质在清洁和/或消毒后可保持其原始动态结合能力的至少80％。
清洁液包含至少50%体积的水性碱金属氢氧化物溶液。水性碱金属氢氧化物溶液可包含单一碱金属氢氧化物或碱金属氢氧化物的混合物，例如氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化钠和氢氧化钾的混合物。水性碱金属氢氧化物溶液可具有500 mM-5 M、例如1 M-2 M的摩尔浓度，如果使用碱金属氢氧化物的混合物，表示为碱金属氢氧化物的总组合浓度。清洁液可基本上由水性碱金属氢氧化物溶液其组成，或由其组成。然而，在一些实施方案中清洁液还可包含另外组分。这样的另外组分可包括醇，例如C2 – C7醇，例如乙醇、异丙醇或苯甲醇。这样的另外组分可包括盐，例如氯化钠。在清洁液中使用醇和/或盐可增加清洁液抑制或灭活某些微生物的功效，例如形成孢子的细菌。
清洁液的非限制性实例包括：
氢氧化钠溶液 (0.5 M、1 M、2 M或5 M);
氢氧化钾溶液 (0.5 M、1 M、2 M或5 M);
氢氧化钠溶液 (0.5 M、1 M、2 M或5 M)具有10-20%体积乙醇;
氢氧化钠溶液 (0.5 M、1 M、2 M或5 M)具有10-50%体积异丙醇;
氢氧化钠溶液 (0.5 M、1 M、2 M或5 M)具有1-5%体积苯甲醇;
氢氧化钾溶液 (0.5 M、1 M、2 M或5 M)具有10-20%体积乙醇;
氢氧化钾溶液 (0.5 M、1 M、2 M或5 M)具有10-50%体积异丙醇; 或
氢氧化钾溶液 (0.5 M、1 M、2 M或5 M)具有1-5%体积苯甲醇。
使用相对浓的碱金属氢氧化物溶液，例如0.5M-5M溶液，可以很好地去除蛋白质和核酸等基质污染物，以及快速有效地灭活病毒、细菌、酵母和真菌。通常应用的消毒功效的量度是测量的微生物或污染物的6-log10降低。用碱金属氢氧化物浓溶液消毒能够提供大多数微生物和内毒素的6-log10降低。
在清洁分离基质期间，清洗液应以合适的流速通过分离基质，以从基质冲洗污染物。在消毒期间，清洁液首先以合适的流速通过分离基质，直到分离基质完全被清洁液渗透。在整个消毒步骤期间，清洁液优选以合适的流速通过分离基质。然而，如果需要，一旦分离基质完全被清洁液渗透，就可以停止清洁液通过分离基质的流动。这减少了执行消毒步骤所需的清洁液量，但是，与施加恒定流动的清洁液的程序相比，提供了较差的分离基质清洁。
因为水性碱金属氢氧化物溶液在从分离基质中除去污染物方面非常有效，所以分离基质可以用作纯化各种免疫球蛋白的纯化平台，具有较低的宿主细胞蛋白污染或遗留风险。在纯化第一免疫球蛋白产物后，首先使用包含水性碱金属氢氧化物溶液的清洁液彻底清洁和消毒分离基质，然后用于纯化第二免疫球蛋白产物。
实施例
蛋白的诱变
位点定向诱变通过两-步骤PCR，使用编码突变的寡核苷酸进行。作为模板，使用含有Z、B或者C的单一结构域的质粒。PCR片段被连接到大肠杆菌表达载体。使用DNA测序以验证插入片段的正确序列。
为形成突变体的多聚体，使用位于B、C或Z结构域的起始密码子(GTA GAC)的Acc I位点，其对应于氨基酸VD。用Acc I和磷酸酶处理，消化用于单体结构域的载体。设计对每个变体特异性的Acc I粘性-末端引物，两个重叠的PCR产物从每个模板生成。纯化PCR产物并通过在2%琼脂糖凝胶上比较PCR产物估测浓度。等量的成对PCR产物在连接缓冲液中杂交(90℃-> 25℃，45min)。生成的产物组成可能被连接到Acc I位点的大约¼的片段(正确的PCR片段和/或消化的载体)。连接和转化后，集落经PCR筛选以鉴定含有所需突变体的构建体。通过DNA测序验证阳性克隆。
构建体表达和纯化
构建体通过大肠杆菌K12在标准培养基中的发酵在细菌周质中表达。发酵后，细胞经热处理以释放周质内容物到培养基中。释放到培养基中的构建体用具有0.2 µm孔径的膜，通过微滤回收。
每个构建体，现在在来自过滤步骤的渗透液中，通过亲和纯化。将渗透液装载到含有固定化IgG的色谱介质(IgG Sepharose 6FF, GE Healthcare)上。装载的产物用磷酸盐缓冲盐水洗涤并通过降低pH洗脱。
将洗脱池调节至中性pH (pH 8)并通过加入二硫苏糖醇还原。然后将样品装载到阴离子交换剂中。洗涤步骤后，在NaCl梯度中洗脱构建体以使其与任何污染物分离。洗脱池通过超滤被浓缩至40-50 mg/ml。应该注意到，固定化IgG介质上的构建体的成功亲和纯化表明所述的构建体具有对IgG的高亲和力。
纯化的配体用RPC LC-MS分析以确定纯度并确定分子量对应于期望值(基于氨基酸序列)。
实施例1
表1中列出的纯化的单体配体(对于SEQ ID NO 8-16、23-28和36-48，还包含在N-末端的AQGT前导序列和在C末端的半胱氨酸)，使用GE Healthcare的胺偶联试剂盒(用于芯片上羧甲基上的胺的碳二亚胺偶联)，以足以在Biacore表面等离子体共振(SPR)仪器(GEHealthcare, Sweden)中给出约200-1500 RU的信号强度的量，在Biacore CM5传感器芯片(GE Healthcare, Sweden)上固定化。为跟踪固定化表面的IgG结合能力，使1mg/ml人多克隆IgG (Gammanorm)流过芯片并记录信号强度(与结合的量成比例)。然后表面经原位清洁(CIP)，即于室温(22 +/- 2℃)下，用500mM NaOH冲洗10分钟。重复96-100个循环并在每个循环后按剩余的IgG结合能力(信号强度)跟踪固定化配体碱稳定性。结果示于表1中并表明至少配体Zvar(N11K)1、Zvar(N11E)1、Zvar(N11Y)1、Zvar(N11T)1、Zvar(N11F)1、Zvar(N11L)1、Zvar(N11W)1、ZN11I)1、Zvar(N11M)1、Zvar(N11V)1、Zvar(N11A)1、Zvar(N11H1)、Zvar(N11R)1、Zvar(N11E,Q32A)1、Zvar(N11E,Q32E,Q40E)1和Zvar(N11E,Q32E,K50R)1、Zvar(Q9A,N11E,N43A)1、Zvar(Q9A,N11E,N28A,N43A)1、Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43E,L44I)1、Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)1、Zvar(Q9A,N11E,N28A,Q40V,A42K,N43A,L44I)1、Zvar(N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)1、Zvar(Q9A,N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)1、Zvar(N11K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I)1、Zvar(Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I)1和Zvar(Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R)1，以及Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)1在位置29具有G,S,Y,Q,T,N,F,L,W,I,M,V,D,E,H,R或K的变体、Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)1在位置53具有F,Y,W,K或R的变体和其中Q9、Q40、A42或N43已被缺失的Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)1的变体，具有与亲本结构Zvar1 (用作参考)比较的改进的碱稳定性。此外，配体B(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)1和C(Q9A,N11E,E43A)1具有与用作参考的亲本B和C结构域比较的改进的稳定性。
表1. 用Biacore (0.5 M NaOH)评价的单体配体。
Figure DEST_PATH_IMAGE004
Figure DEST_PATH_IMAGE006
Figure DEST_PATH_IMAGE008
Figure DEST_PATH_IMAGE010
Biacore实验还可用于测定配体和IgG之间的结合和离解速率。这用如上文所述的装置和用IgG1单克隆抗体作为探针分子使用。对于参考Zvar1，结合速率(105 M-1s-1)是3.1和离解速率(105 s-1)是22.1，得到713 pM的亲和力(离解速率/结合速率)。对于Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)1 (SEQ ID NO. 11)，结合速率是4.1和离解速率是43.7，亲和力为1070 pM。因此对于突变的变体而言，IgG亲和力略微更高。
实施例2
表2中列出的纯化的二聚体、四聚体和六聚体配体，使用GE Healthcare的胺偶联试剂盒(用于芯片上羧甲基上的胺的碳二亚胺偶联)，以足以在Biacore仪器(GEHealthcare, Sweden)中给出约200-1500 RU的信号强度的量，在Biacore CM5传感器芯片(GE Healthcare, Sweden)上固定化。为跟踪固定化表面的IgG结合能力，使1mg/ml人多克隆IgG (Gammanorm)流过芯片并记录信号强度(与结合的量成比例)。然后表面经原位清洁(CIP)，即于室温(22 +/- 2℃)下，用500mM NaOH冲洗10分钟。重复300个循环并在每个循环后按剩余的IgG结合能力(信号强度)跟踪固定化配体碱稳定性。结果示于表2和图2中并表明至少配体Zvar(Q9A,N11E,N43A)4、Zvar(Q9A,N11E,N28A,N43A)4、Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43E,L44I)4和Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)4、Zvar(Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42K,N43A,L44I)4和 Zvar(Q9A,N11E,D37E,Q40V,A42R,N43A,L44I)4具有与亲本结构Zvar4 (其用作参考)比较的改进的碱稳定性。六聚体配体Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)6也具有与用作参考的亲本结构Zvar6比较的改进的碱稳定性。此外，具有来自两个单体单位之间的接头区的a) D2,A3,K4; b) K58,V1,D2; c) P57,K58,V1,D2,A3; d)K4,F5,D6,K7,E8; e) A56,P57,K58; V1,D2,A3或f) V1,D2,A3,K4,F5,D6,K7,E8的缺失的Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)二聚体具有与用作参考的亲本结构Zvar2比较的改进的碱稳定性。具有在接头区在K58和V1之间的YEDG插入的Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)二聚体也具有与Zvar2比较的改进的碱稳定性。
表2. 用Biacore (0.5M NaOH)评价的二聚体、四聚体和六聚体配体
Figure DEST_PATH_IMAGE012
Figure DEST_PATH_IMAGE014
实施例3
使用1 M NaOH代替在实施例2中的500 mM，用3个配体的100个CIP循环重复实施例2。结果示于表3并表明所有3个配体在1M NaOH中也具有与用作参考的亲本结构Zvar4比较的改进的碱稳定性。
表3. 用Biacore (1M NaOH)评价的四聚体配体。
配体 序列 100个循环的剩余能力(%) 相对于参考100个循环的能力
Zvar4 SEQ ID NO 21 27 1
Zvar(Q9A,N11E,N28A,N43A)4 SEQ ID NO 18 55 2.04
Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43E,L44I)4 SEQ ID NO 19 54 2.00
Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)4 SEQ ID NO 20 56 2.07
实施例4
表2的纯化的四聚体配体(全部具有另外的N-末端半胱氨酸)使用下面描述的方法在琼脂糖珠上固定化并对能力和稳定性进行评价。结果示于表4和图3。
表4. 在柱(0.5 M NaOH)中评价的具有四聚体配体的基质。
配体 SEQ IDNO. 配体含量(mg/ml) 初始IgG能力Qb10 (mg/ml) 6个4 h循环后的剩余IgG能力 Qb10 (mg/ml) 6个4 h循环后的剩余IgG能力(%) 6个4 h循环后相对于参考的能力保留
Zvar4 21 7 52.5 36.5 60 1
Zvar4 21 12 61.1 43.4 71 1
Zvar(Q9A,N11E,N28A,N43A)4 18 7.0 49.1 44.1 90 1.50
Zvar(Q9A,N11E,N28A,N43A)4 18 12.1 50.0 46.2 93 1.31
Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)4 20 7.2 49.0 44.2 90 1.50
Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)4 20 12.8 56.3 53.6 95 1.34
Zvar(N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)4 30 9.7 56.3 52.0 92 1.53
Zvar(Q9A,N11K,H18K,D37E,A42R)4 31 10.8 56.9 52.5 92 1.30
激活
所用的基础基质是根据US6602990 (通过引用以其整体结合到本文中)的方法制备的85微米(体积-加权的，d50V)中位直径的刚性交联琼脂糖珠，并且根据在GelFiltration Principles and Methods, Pharmacia LKB Biotechnology 1991, pp 6-13中描述的方法，对于Mw 110 kDa的葡聚糖具有对应于反相凝胶过滤色谱Kav值0.70的孔径。
于25℃，将25 mL (g)排干的基础基质、10.0 mL蒸馏水和2.02 g NaOH在带有机械搅拌的100 mL烧瓶中混合10 min。加入4.0 mL表氯醇并进行反应2小时。激活的凝胶用10个凝胶沉降体积(GV)的水洗涤。
偶联
向在50 ml Falcon试管中的20 mL配体溶液(50 mg/mL)中加入169 mg NaHCO3、21mg Na2CO3、175 mg NaCl和7 mg EDTA。将Falcon试管置于辊式摇床上5-10 min，然后加入77mg DTE。还原进行>45 min。然后将配体溶液在用Sephadex G-25填充的PD10柱上脱盐。脱盐溶液中的配体含量通过测量276 nm UV吸收来确定。
激活的凝胶用3-5 GV {0.1 M磷酸盐/1 mM EDTA pH 8.6}洗涤，然后根据在US6399750 (通过引用以其整体结合到本文中)中描述的方法偶联配体。用于实验的所有缓冲液用氮气脱气至少5-10 min。凝胶的配体含量可通过改变配体溶液的量和浓度控制。
固定后，凝胶用蒸馏水洗涤3xGV。混合凝胶 + 1 GV {0.1 M磷酸盐/1 mM EDTA/10%硫代甘油pH 8.6}，在室温下，将试管放置于摇床上过夜。然后用3xGV {0.1 M TRIS/0.15 M NaCl pH 8.6}和0.5 M HAc交替洗涤凝胶，然后用8-10xGV蒸馏水洗涤。将凝胶样品送至外部实验室用于氨基酸分析并从总氨基酸含量计算配体含量(mg/ml凝胶)。
蛋白
Gammanorm 165 mg/ml (Octapharma)，在平衡缓冲液中稀释至2mg/ml。
平衡缓冲液
PBS磷酸盐缓冲液10 mM + 0.14 M NaCl + 0.0027 M KCl, pH 7,4 (Medicago)
吸附缓冲液
PBS磷酸盐缓冲液10 mM + 0.14 M NaCl + 0.0027 M KCl, pH 7,4 (Medicago)
洗脱缓冲液
100 mM乙酸盐pH 2.9
动态结合能力
将2 ml树脂填充到TRICORN™5 100柱中。穿透能力用ÄKTAExplorer 10系统，以6分钟的停留时间(0.33 ml/min流速)测定。使平衡缓冲液通过旁路柱，直到获得稳定的基线。这在自动归零之前进行。将样品施加于柱直至获得100% UV信号。然后，再次应用平衡缓冲液直至获得稳定的基线。
将样品装载于柱直至达到85%的最大吸光度的UV信号。然后用5个柱体积(CV)的平衡缓冲液，以0.5ml/min的流速洗涤柱。蛋白用5 CV洗脱缓冲液，以0.5 ml/min的流速洗脱。然后柱用0.5M NaOH，以0.2 ml/min的流速清洁并用平衡缓冲液再平衡。
为计算在10%时的穿透能力，采用以下方程。即是，装载到柱中直至柱流出液中的IgG浓度是进料中IgG浓度的10%的IgG的量。
Figure DEST_PATH_IMAGE016
A100% = 100% UV信号；
Asub = 来自非-结合IgG亚类的吸光度的贡献；
A(V) = 以给定的施加体积的吸光度；
Vc = 柱体积；
Vapp= 直至10%穿透的施加体积；
Vsys= 系统死体积；
C0 = 进料浓度。
计算在10%穿透时的动态结合能力(DBC)。对10和80%穿透，计算动态结合能力(DBC)。
CIP - 0.5 M NaOH
在重复暴露于碱性清洁溶液之前和之后测定10%穿透DBC (Qb10)。每个循环包括用0.5 M NaOH，以0.5/min的速率泵送通过柱20 min的CIP步骤，此后柱静置4 h。暴露在室温(22 +/- 2℃)下发生。在该孵育后，用平衡缓冲液，以0.5 ml/min的流速洗涤柱20 min。表4显示6个4 h的循环(即暴露于0.5 M NaOH的24 h累积时间)后的剩余能力，以绝对数值和相对于初始能力表示。
实施例5
用示于表5中的四聚体配体重复实施例4，但用用于CIP步骤的1.0 M NaOH代替0.5M。结果示出于表5和图4中。
表5. 在柱-1.0 M NaOH中评价的具有四聚体配体的基质
配体 SEQ IDNO. 配体含量(mg/ml) 初始IgG能力 Qb10(mg/ml) 6个4 h循环后的剩余IgG能力Qb10 (mg/ml) 6个4 h循环后的剩余IgG能力(%) 6个4 h循环后相对于参考的能力保留
Zvar4 21 12 60.1 33.5 56 1
Zvar(Q9A,N11E,Q40V,A42K,N43A,L44I)4 20 12.8 60.3 56.0 93 1.67
Zvar(N11K,H18K,S33K,D37E,A42R,N43A,L44I,K50R,L51Y)4 30 9.7 62.1 48.1 77 1.44
实施例6
基础基质
使用的基础基质是根据US6602990的方法制备的一组59-93微米(体积加权的，d50V)中位直径(在Malvern Mastersizer 2000激光衍射仪器上测定)的刚性交联琼脂糖珠样品，并且根据上述方法，使用用在0.2 M NaCl中的原型装填的HR10/30柱(GEHealthcare)和用一定范围的葡聚糖级分作为探针分子(流速0.2 ml/min)，对于Mw 110kDa的葡聚糖具有对应于反相凝胶过滤色谱Kd值0.62-0.82的孔径。珠样品的干重量范围为53-86 mg/ml，如通过在105°C干燥1.0 ml沥干滤饼样品过夜和称重测定的。
表6. 基础基质样品
基础基质 Kd d50v (µm) 干重量(mg/ml)
A18 0.704 59.0 56.0
A20 0.70 69.2 55.8
A27 0.633 87.2 74.2
A28 0.638 67.4 70.2
A29 0.655 92.6 57.5
A32 0.654 73.0 70.5
A33 0.760 73.1 55.5
A38 0.657 70.9 56.2
A39 0.654 66.0 79.1
A40 0.687 64.9 74.9
A41 0.708 81.7 67.0
A42 0.638 88.0 59.4
A43 0.689 87.5 77.0
A45 0.670 56.6 66.0
A52 0.620 53.10 63.70
A53 0.630 52.6 86.0
A54 0.670 61.3 75.3
A55 0.640 62.0 69.6
A56 0.740 61.0 56.0
A56-2 0.740 51.0 56.0
A62a 0.788 48.8 70.1
A62b 0.823 50.0 46.9
A63a 0.790 66.8 59.6
A63b 0.765 54.0 79.0
A65a 0.796 58.0 60.0
A65b 0.805 57.3 46.0
B5 0.793 69.0 84.4
C1 0.699 71.0 73.4
C2 0.642 66.5 81.1
C3 0.711 62.0 82.0
C4 0.760 62.0 82.0
H31 0.717 82.0 59.0
H35 0.710 81.1 61.0
H40 0.650 52.8 65.0
I1 0.640 50.0 67.0
41 0.702 81.6 60.6
偶联
将100 ml基础基质用10个凝胶体积的蒸馏水在玻璃滤器上洗涤。将凝胶称重(1 g= 1 ml)和与30 ml蒸馏水和8.08 g NaOH (0.202 mol)在250 ml具有搅动器的烧瓶中混合。在水浴中将温度调整至27 +/- 2 °C。在90 +/- 10分钟期间在剧烈搅拌(约250 rpm)下加入16 ml表氯醇(0.202 mol)。使反应继续另外80 +/- 10分钟，然后用>10个凝胶体积的蒸馏水在玻璃滤器上洗涤凝胶，直到达到中性pH。该激活的凝胶直接用于如下所述的偶联。
向在50 ml Falcon试管中的16.4 mL配体溶液(50 mg/mL)中加入139 mg NaHCO3、17.4 mg Na2CO3、143.8 mg NaCl和141 mg EDTA。将Falcon试管置于辊式摇床上5-10 min，然后加入63 mg DTE。还原进行>45 min。然后将配体溶液在用Sephadex G-25填充的PD10柱上脱盐。脱盐溶液中的配体含量通过测量276 nm UV吸收来确定。
激活的凝胶用3-5 GV {0.1 M磷酸盐/1 mM EDTA pH 8.6}洗涤，然后根据US6399750 5.2.2中描述的方法偶联配体，尽管具有显著更高的配体量(见下文)。用于实验的所有缓冲液用氮气脱气至少5-10 min。凝胶的配体含量通过改变配体溶液的量和浓度，添加5-20 mg配体/ml凝胶而控制。配体是碱稳定的突变体的四聚体(SEQ ID NO. 20)或六聚体(SEQ ID NO. 33)。
固定后，凝胶用蒸馏水洗涤3xGV。将凝胶 + 1 GV {0.1 M磷酸盐/1 mM EDTA/10%硫代甘油pH 8.6}混合，和在室温下，将试管放置于摇床上过夜。然后用3xGV {0.1 M TRIS/0.15 M NaCl pH 8.6}和0.5 M HAc交替洗涤凝胶，然后用8-10xGV蒸馏水洗涤。将凝胶样品送至外部实验室用于氨基酸分析并从总氨基酸含量计算配体含量(mg/ml凝胶)。
评价
以2.4和6 min停留时间，对于多克隆人IgG的Qb10%动态能力如实施例4所述进行测定。
表7. 原型结果
原型 基础基质 配体含量(mg/ml) 多聚体 Qb10% 2.4 min (mg/ml) Qb10% 6 min (mg/ml)
N1 A38 7.45 四聚体 44.4 58.25
N2 A20 7.3 四聚体 45.12 57.21
N3 A42 6.72 四聚体 33.56 50.02
N4 A29 7.3 四聚体 36.34 51.8
N5 A28 7.9 四聚体 42.38 58.25
N6 A39 6.96 四聚体 41.88 54.67
N7 A27 7.5 四聚体 29.19 48.73
N8 A43 6.99 四聚体 33.43 49.79
N9 A38 11.34 四聚体 48.1 72.78
N10 A20 10.6 四聚体 50.66 70.07
N11 A42 11.1 四聚体 32.25 57.78
N12 A29 11 四聚体 34.85 64.68
N13 A28 11.9 四聚体 39.92 63.75
N14 A39 10.48 四聚体 44.37 64.79
N15 A27 12.1 四聚体 24.8 55.56
N16 A43 10.51 四聚体 31.82 58.04
N17 A41 8.83 四聚体 38.5 56.8
N18 A41 8.83 四聚体 37.84 58.6
N19 A41 8.83 四聚体 35.06 57.23
N20 A41 5.0 四聚体 35.64 46.04
N21 A41 13.0 四聚体 34.95 62.23
N22 A40 13.15 四聚体 56.85 71.09
N23 A33 7.33 四聚体 48.69 55.76
N24 A40 11.03 四聚体 54.96 73.8
033A A38 7.5 四聚体 44 58
033B A38 11.3 四聚体 48 73
097A A20 7.3 四聚体 45 57
097B A20 10.6 四聚体 51 70
003A A28 7.9 四聚体 42 58
003B A28 11.9 四聚体 40 64
003C A28 15.8 四聚体 37 67
038A A39 7.0 四聚体 42 55
038B A39 10.5 四聚体 44 65
074 A40 13.2 四聚体 57 71
093 A33 7.3 四聚体 49 56
058A A40 11.0 四聚体 55 74
077 A18 8.2 四聚体 52 59
010 A32 10.7 四聚体 40 57
099 A32 13.3 四聚体 37 66
030A B5 6.3 四聚体 32 38
030B B5 9.6 四聚体 45 47
293A C1 5.4 四聚体 38 47
293B C1 10.8 四聚体 43 60
294A C2 5.1 四聚体 39 46
294B C2 10.5 四聚体 42 57
336A H40 5.6 四聚体 47 52
336B H40 9.1 四聚体 52 67
091 A18 13.4 四聚体 N/A 63
092 A20 12.8 四聚体 49 67
080 A33 9.4 四聚体 51 58
089 A40 6.1 四聚体 49 59
688A A62a 6.6 四聚体 41 46
688B A62a 14.8 四聚体 55 62
871 A62a 9.7 四聚体 48 60
934A A63a 6.6 四聚体 40 44
934B A63a 14.0 四聚体 48 56
017B A65a 13.1 四聚体 56 64
041A A62b 5.2 四聚体 40 N/A
041B A62b 11.1 四聚体 52 N/A
116A A65b 5.8 四聚体 42 46
116B A65b 8.8 四聚体 49 56
017A A65a 6.1 四聚体 40 44
387A A62a 6.4 四聚体 43 45
387B A62a 7.5 四聚体 47 56
432 A63a 6.1 四聚体 39 44
433A A65a 6.6 四聚体 42 47
433B A65a 13.6 四聚体 52 61
579A I1 6.1 四聚体 45 51
579B I1 11.2 四聚体 57 68
064A C3 5.9 四聚体 44 52
064B C3 9.0 四聚体 49 62
064C C3 14.3 四聚体 51 70
352A C4 10.1 四聚体 55 63
352B C4 14.4 四聚体 59 67
066A C3 6.8 六聚体 48 59
066B C3 11.9 六聚体 51 73
066C C3 15.1 六聚体 43 61
353A C4 11.2 六聚体 62 74
353B C4 15.2 六聚体 57 82
872A A62a 9.6 六聚体 56 72
872B A62a 14.5 六聚体 62 84
869A H40 6.9 六聚体 50 56
869B H40 14.3 六聚体 56 75
869C H40 23.0 六聚体 41 65
962A H35 6.8 六聚体 36 49
962B H35 12.3 六聚体 31 54
962C H35 20.3 六聚体 20 43
112A A56 7.9 六聚体 47 55
112B A56 12.4 六聚体 57 73
112C A56 19.2 六聚体 55 80
113A A56 7.1 六聚体 48 57
113B A56 12.4 六聚体 53 73
113C A56 15.2 六聚体 48 76
212A H31 6.5 六聚体 37 38
212B H31 10.4 六聚体 50 61
212C H31 20.0 六聚体 31 52
213A A33 6.5 六聚体 44 53
213B A33 10.9 六聚体 50 65
213C A33 11.1 六聚体 50 68
432A A20 6.4 六聚体 41 56
432B A20 12.4 六聚体 38 64
432C A20 21.1 六聚体 44 43
433A A38 5.9 六聚体 47 57
433B A38 11.6 六聚体 48 72
433C A38 15.8 六聚体 36 62
742A A54 6.7 六聚体 38 46
742B A54 12.6 六聚体 45 52
742C A54 21.1 六聚体 38 65
726A A63b 6.4 六聚体 42 46
726B A63b 10.6 六聚体 49 60
726C A63b 16.7 六聚体 53 69
793A A56-2 6.8 六聚体 50 58
793B A56-2 12.5 六聚体 59 72
793C A56-2 19.2 六聚体 61 82
实施例7
如上制备的具有不同配体含量(四聚体，SEQ ID NO:20)的一系列原型在1 M NaOH中在22 +/- 2 °C孵育4、8和31小时，在孵育之前和之后测量动态IgG能力(Qb10%，6 min停留时间)。原型显示于表8和结果显示于图5和6。可见到，对这种苛刻的碱处理的稳定性随配体含量的增加而增加。
表8. 在1 M NaOH中孵育的样品
原型 配体含量(mg/ml) Qb10%，6 min，孵育前(mg/ml)
N1 12 78
LE28 13 79
N17 16 73
N16 20 73
实施例8
如上制备的具有不同配体含量(六聚体，SEQ ID NO:33)、珠中位直径(d50,v) 62µm和对Mw 110 kD的葡聚糖的Kd 0.70的两种交联琼脂糖珠原型用真实mAb进料评价。原型A的配体含量是14.3 mg/ml和原型B的配体含量是18.9 mg/ml。为比较，使用商业产品MabSelect SuRe® LX (GE Healthcare Life Sciences)。树脂在Tricorn柱(GEHealthcare Life Sciences)中装填至床高度10 cm，得到床体积2 ml，和该柱显示具有在0.8-1.5个间隔内的峰不对称性。加载的样品是在生理pH下含4.9 mg/ml单克隆IgG1抗体的经澄清的CHO细胞上清液，和实验条件列于下表9中(CV =柱体积，RT = 停留时间)。
表9. 用真实进料的评价条件
平衡: 3 CV 20 mM磷酸盐、150 mM NaCl pH 7.4，RT=3.4 min
样品加载: 43 mg mAb/ml树脂，RT=6 min
洗涤1: 5 CV 20 mM磷酸盐、500 mM NaCl pH 7.4，在RT=6min时1.5 CV和在RT=3.4 min时3.5 CV
洗涤2: 1 CV 50 mM乙酸盐pH 6.0，RT=3.4 min
洗脱: 3 CV 50 mM乙酸盐pH 3.5，RT=6 min，在150 mAU-150 mAU之间收集峰
剥离(strip): 2 CV 100 mM乙酸盐，RT=3.4 min
CIP: 3 CV 0.1 M NaOH，RT=6 min
再平衡: 5 CV 20 mM磷酸盐、150 mM NaCl pH 7.4，RT=3.4 min
使用UV监视功能收集mAb峰和mAb的浓度通过280 nm的UV测量确定(消光系数1.5)。使用分光光度计进行所有吸光测定，包括用于产量计算的测量。
用于HCP (宿主细胞蛋白)分析的样品通过在每次运行后直接添加10%保存缓冲液(0.2 M NaH2PO4*H2O (5.3%)、0.2 M Na2HPO4*12 H2O (94.7%)、0.5% Tween 20、1% BSA pH8)至样品(例如50 µl保存缓冲液至450 µl样品)制备。HCP含量使用市售的抗-CHO抗体(Cygnus Technologies)和Gyrolab (Gyros AB, Sweden)工作站测量。
结果在下表10中提供，和显示原型的性能在与商业产品相同的范围内。进料中的HCP含量是331 000 ppm。
表10. 来自真实进料评价的结果
树脂 产量(%) 洗脱池(CV) 池中的HCP (ppm)
MabSelect SuRe LX 90 1.5 914
MabSelect SuRe LX 95 1.6 1021
原型A 96 1.3 1076
原型A 95 1.3 1105
原型B 96 1.3 1040
原型B 93 1.3 1104
实施例9
如上制备的具有14.5 mg/ml配体(六聚体，SEQ ID NO:33)、珠中位直径(d50,v)57.4 µm、对于Mw 110 kD的葡聚糖Kd 0.72和干重量70.3 mg/ml的交联琼脂糖珠基质原型，对于用两种真实mAb进料(mAb1 2.4 g/l和mAb2 4.9 g/l) IgG1的洗脱pH、生理pH和多克隆人IgG的样品(Gammanorm, Octapharma)进行评价。为比较，使用商业产品MabSelect SuRe® LX (GE Healthcare Life Sciences)。将树脂在Tricorn柱(GE Healthcare LifeSciences)中装填至床高度10 cm，得到床体积2 ml和该柱显示具有在0.8-1.5个间隔内的峰不对称性。加载的样品是在生理pH具有IgG1 mAb的经澄清的CHO细胞上清液，和实验条件列于下表11 (CV =柱体积，RT = 停留时间)。
表11. 洗脱pH评价的条件
平衡: 5 CV 20 mM磷酸盐、150 mM NaCl pH 7.4，RT=3.4 min
样品加载: 10 mg mAb/ml树脂，RT=6 min
洗涤: 6 CV 20 mM磷酸盐、150 mM NaCl pH 7.4，RT=3.4 min
洗脱: 30 CV 100 mM柠檬酸盐pH 6-3梯度，RT=6 min
CIP: 3 CV 0.1 M NaOH，RT=6 min
再平衡: 8 CV 20 mM磷酸盐、150 mM NaCl pH 7.4，RT=3.4 min
结果显示于下表12和表明抗体以与参考类似的pH水平洗脱，尽管根据特定的抗体-树脂组合具有一些单独的变化。
表12. 洗脱pH评价的结果
Figure DEST_PATH_IMAGE018
还关于IgG1、IgG2和IgG4含量，使用Biacore SPR仪器(GE Healthcare LifeSciences)，用针对在CM5 Biacore芯片上固定的四个不同IgG类型的抗体，分析了来自多克隆IgG的pH-梯度洗脱的流分。
在参考和原型上对多克隆IgG的色谱图显示于图7和IgG类型分析显示于图8。数据显示所有三个类型以类似的方式结合两种树脂，和第一个峰主要包含IgG2，而IgG1和IgG4主要在第二个峰中洗脱。抗-IgG3抗体与IgG4交叉反应，因此对IgG3未获得可靠结果。IgG3通常已知显示对蛋白A不结合或仅弱结合。
实施例10
如上制备的具有12.6 mg/ml配体(四聚体，SEQ ID NO:20)、84.9 µm珠中位直径(d50,v)、对于葡聚糖Mw 110 kD的Kd 0.71和62.2 mg/ml干重量的交联琼脂糖珠基质原型，使用商业产品MabSelect SuRe LX作为参考，对于碱稳定性进行评价。用树脂装填至10 cm床高度的Tricorn 5柱用3个柱体积的1 M NaOH冲洗。然后停止流动240分钟(对应于15min/循环的16个正常CIP循环)，然后通过3个柱体积的PBS缓冲液洗出NaOH溶液。然后测量对多克隆IgG (Gammanorm, Octapharma)的动态结合能力，和该过程以另一次注射1 MNaOH重复。在各自用1 M NaOH的240 min孵育周期后测量动态能力。在能力测量中，柱用PBS缓冲液平衡，然后加载2 mg/ml样品(停留时间6 min)，直到达到最大吸光度的85%的UV信号。然后将柱用PBS缓冲液洗涤，用500 mM乙酸pH 3.0洗脱和再平衡。在10%和80%穿透的动态结合能力如上文所述计算。结果显示于图9，和它们表明原型比商业产品显著更稳定。
实施例11
使用2 M NaOH，测试根据本发明的分离基质对重复CIP循环的耐受性。将本发明实施例(Inv.Ex.)与作为参考的商业产品MabSelect SuRe(MSS)进行比较。该研究使用GEHealthcare的ÄKTA4-柱周期逆流(PCC)色谱装置进行50个循环。
每个柱使用20％乙醇+ 0.2M NaCl溶液填充，流速为3.5ml/min，持续10分钟。取出填料管和顶部过滤器，将适配器放在柱顶部。在3.5ml/min的进一步填充流速10分钟后，将适配器相对于床表面调节。本发明实施例的填充柱体积Vc为1.04ml，相比之下，MabSelectSuRe为1.02ml。
然后使用以下条件运行PCC装置：
平衡: 3柱体积(CV) 20 mM磷酸盐、150 mM NaCl pH 7.4
样品加载: mAb 4.28 mg/ml; 加载直至35%穿透DBC; RT=2.4 min
洗涤1: 1.5 CV 20 mM磷酸盐、500 mM NaCl pH 7.0 200 cm/h + 3.5 CV
洗涤2: 1 CV 50 mM乙酸盐pH 6.0
洗脱: 3 CV 50 mM乙酸盐pH 3.5
剥离: 2 CV 100 mM乙酸pH 2.9
CIP: 3 CV 2 M NaOH (接触时间15 min)
再平衡: 10 CV 20 mM磷酸盐、150 mM NaCl pH 7.4
结果如图10所示，其中各基质35％穿透动态结合能力时的加载量相对于其35％DBC时的加载量标准化。可以看出，商业参考MabSelect SuRe(MSS)在每个循环中失去其一部分免疫球蛋白结合能力，并且在16个循环后保留其原始能力的小于80％。另一方面，本发明实施例(Inv.Ex.)显示出几乎没有结合能力的损失，并且在50个CIP循环后在2M NaOH中，相当于750分钟的接触时间，保留其原始结合能力的超过95％。
实施例12
使用共聚焦显微术研究了根据本发明的分离基质对1M和2M NaOH的配体稳定性。将本发明实施例(Inv.Ex.)与作为参考的商业产品MabSelect SuRe LX(MSS LX)进行比较。该研究如下进行：
分离基质制备
通过离心将分离基质凝胶从其储存溶液中洗涤至水，得到1: 1凝胶浆料。对于每种凝胶，将2ml 1: 1浆料/水加入50mL Falcon管中，离心并倾析。向每个管中加入19ml 1M或2M NaOH (2个分离基质 * 2 [NaOH]浓度 → 总共4个管)。将凝胶在室温下在Heidolph振荡器(1300rpm)上振荡孵育。在孵育2、4、6、8、16、24和32小时后取出1500μl凝胶浆料样品，并通过离心(13000rpm，Eppendorf离心机)在2ml Eppendorf管中洗涤。洗涤步骤如下：
2x1.8mL MQ水
1x1.8mL HAc缓冲液
2x1.8mL Tris缓冲液
2x1.8mL PBS缓冲液。
最后倾析后，将凝胶用75μl PBS缓冲液重悬，得到约1: 1 PBS凝胶浆料。
预孵育
将未在NaOH中孵育的每种凝胶的样品，即原始的1: 1凝胶水浆料交换，得到1: 1PBS浆料。将16μl每种凝胶浆料样品加入到500μl Cy5-hIgG溶液(Cy5标记的人免疫球蛋白G)中并在室温下立式圆筒混合过周末，用锡箔覆盖。
显微镜设置
使用Leica SP8共聚焦显微镜进行研究。使用本发明实施例确定显微镜设置，并使用MSS LX检查以确保使用任一凝胶未获得饱和。
物镜: 63x/130 Glyc 21C (Leica)
激光: 638 nm
检测器PTM增益: 629.6 V
检测器偏移: -0.8%
扫描速度: 400 Hz
像幅: 512x512像素
幅均值: 2
动力学实验(凝胶中hIgG的吸附作为时间的函数)
将15μl 各NaOH孵育并洗涤的1: 1凝胶浆料的样品加入到500μl Cy5-hIgG，得到>300mg Ab/ml凝胶的混合物。将这些混合物在室温下在Heidolph振荡器上以1300rpm孵育。在预定时间(5、10、15、30、60、90、120、180和240分钟)，取出15μl样品并使用显微镜成像。共聚焦图像被整合并且通过计算每个珠的相对荧光Qrel获得吸附曲线，参见公式1。
Figure DEST_PATH_IMAGE020
其中，rout和rin表示珠的荧光区域的外部和内部边界半径(使用显微镜软件中的线工具LAS-X确定)和
Figure DEST_PATH_IMAGE022
其中F环是珠的荧光区域的总荧光，使用LAS-X中的圆形工具测定。将公式1和2组合得到公式3：
Figure DEST_PATH_IMAGE024
。
该程序遵循A. Ljunglöf、J. Thömmes J. Chromatogr. A 813 (1998) 387-395中展示的操作。
结果、分析和结论
在1M NaOH中孵育后，确定的分离基质的相对荧光Qrel随时间的变化如图11aMabSelect SuRe LX)和11b(本发明实施例)所示。可以看出，MSS LX(图11a)丧失其原始结合能力的约50％并且在与参考(无碱处理，即0小时)相比在1M NaOH中孵育16小时后更快地达到饱和。在1M NaOH中孵育32小时后，它几乎丧失了所有Ig结合能力。相反，本发明实施例的分离基质(图11b)对于在1M NaOH中孵育是稳定的并且在实验变化范围内在1M NaOH中孵育32小时后保持其原始结合能力。
在2M NaOH中孵育后，确定的分离基质的相对荧光Qrel随时间变化如图12aMabSelect SuRe LX)和12b(本发明实施例)所示。可以看出，MSS LX(图12a)的能力损失速率在2M NaOH中孵育时加速。孵育8小时后，大约50％的Ig结合能力丧失，并且在2M NaOH中孵育16小时后，几乎丧失了所有Ig结合能力。相反，本发明实施例(图12b)对碱相对稳定，并且至少在实验变化范围内，在2M NaOH中孵育16小时或更短时间后保持其原始结合能力。然而，可以看出，在2M NaOH中孵育24小时或更长时间后，本发明实施例已丧失结合能力，并且在孵育32小时后约50％的结合能力已经丧失。此外，随着结合能力丧失，更快达到饱和，最明显的是采用32小时孵育的样品所看到的。
这些结果表明，本发明实施例的分离基质比MabSelect SuRe LX明显更加碱稳定，并且显示承受2M NaOH孵育长达16 h而不显著影响质量传递和结合能力。
实施例13
使用根据本发明的各种清洁液研究枯草芽孢杆菌孢子的灭活。已知孢子形成的枯草芽孢杆菌(ATCC No.6633)是对NaOH消毒的抗性较强的微生物之一。将枯草芽孢杆菌的菌落与各种清洗液(1M NaOH，1M NaOH与2％BnOH和1M NaOH与40％IPA)一起孵育，并在各种预定的孵育时间确定菌落形成单位(CFU/ml)数目。图13显示作为孵育时间和清洁液的函数的CFU/ml的研究结果。可以看出，即使在24小时消毒后，使用1M NaOH本身也不足以完全灭活枯草芽孢杆菌。向清洁液中加入2％苯甲醇不会提供任何显著的改善。然而，使用1M NaOH与40％异丙醇作为清洁液可使处理4小时后枯草芽孢杆菌减少至可检测水平以下。
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Claims (31)

1.一种清洁和/或消毒分离基质的方法，所述分离基质包含与多孔载体共价偶联的免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体，其中所述方法包含以下步骤：
a)任选地使用分离基质纯化包含第一免疫球蛋白的混合物；
b)提供包含至少50%体积的水性碱金属氢氧化物溶液的清洁液，其中水性碱金属氢氧化物溶液的摩尔浓度为500 mM-5 M；和
c)通过使清洁液与分离基质接触预定的接触时间来清洁和/或消毒分离基质；
其中所述碱稳定的蛋白A结构域由SEQ ID NO 51所示的葡萄球菌蛋白A (SpA)的亲本Fc-结合结构域的突变体组成，其中SEQ ID NO 51的位置13和44处的氨基酸残基是天冬酰胺，和其中至少SEQ ID NO 51的位置3处的天冬酰胺残基已被突变为选自谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、组氨酸和精氨酸的氨基酸。
2.权利要求1的方法，其中所述突变体还包含在SEQ ID NO 51的位置1、2、7、10、15、20、21、24、25、28、29、32、34、35、36、39、42和43的一个或多个处的突变。
3.权利要求1或2的方法，其中SEQ ID NO 51的位置1处的谷氨酰胺残基已被突变为丙氨酸。
4.权利要求1或2的方法，其中SEQ ID NO 51的位置35处的天冬酰胺或谷氨酸残基已被突变为丙氨酸。
5.权利要求1或2的方法，其中免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体是选自二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体或九聚体的同多聚体。
6.权利要求1或2的方法，其中免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体各自包含C-末端半胱氨酸残基以共价偶联至多孔载体。
7.权利要求1或2的方法，其中免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体经由硫醚键偶联至多孔载体。
8.权利要求1或2的方法，其中分离基质包含至少11 mg/ml的与多孔载体共价偶联的免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体。
9.权利要求1或2的方法，其中分离基质包含至少15 mg/ml的与多孔载体共价偶联的免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体。
10.权利要求1或2的方法，其中分离基质包含15-21 mg/ml的与多孔载体共价偶联的免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体。
11.权利要求1或2的方法，其中分离基质包含17-21 mg/ml的与多孔载体共价偶联的免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体。
12.权利要求1或2的方法，其中分离基质包含18-20 mg/ml的与多孔载体共价偶联的免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体。
13.权利要求1或2的方法，其中多孔载体是高度交联的琼脂糖珠。
14.权利要求1或2的方法，其中水性碱金属氢氧化物溶液是氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或其混合物。
15.权利要求1或2的方法，其中水性碱金属氢氧化物溶液的摩尔浓度为1 M-2 M。
16.权利要求1或2的方法，其中清洁液还包含C2 – C7醇。
17.权利要求1或2的方法，其中清洁液还包含乙醇、异丙醇或苯甲醇。
18.权利要求1或2的方法，其中清洁液包含至少70%体积水性碱金属氢氧化物溶液。
19.权利要求1或2的方法，其中清洁液包含至少90%体积水性碱金属氢氧化物溶液。
20.权利要求1或2的方法，其中清洁液包含至少99%体积水性碱金属氢氧化物溶液。
21.权利要求1或2的方法，其中预定的接触时间是足以提供分离基质中内毒素浓度和/或微生物浓度的6-log10降低的时间。
22.权利要求1或2的方法，其中预定的接触时间是10分钟-50小时。
23.权利要求1或2的方法，其中预定的接触时间是30分钟-24小时。
24.权利要求1或2的方法，其中预定的接触时间是1小时-12小时。
25.权利要求1或2的方法，其中步骤a)–c)重复至少10次。
26.权利要求1或2的方法，其中步骤a)–c)重复至少50次。
27.权利要求1或2的方法，其中步骤a)–c)重复50–200次。
28.一种在采用分离基质纯化免疫球蛋白中防止遗留的方法，所述分离基质包含与多孔载体共价偶联的免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体，其中碱稳定的蛋白A结构域由SEQ ID NO 51所示的葡萄球菌蛋白A (SpA)的亲本Fc-结合结构域的突变体组成，其中SEQ ID NO 51的位置13和44的氨基酸残基是天冬酰胺和其中至少SEQ ID NO 51的位置3的天冬酰胺残基已被突变为选自谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、组氨酸和精氨酸的氨基酸；和其中所述方法包括：
通过进行权利要求1-27中任一项的清洁和/或消毒分离基质的方法的步骤a) – c)，纯化第一免疫球蛋白和清洁和消毒分离基质；和还包括以下步骤
d)使用分离基质纯化包含第二免疫球蛋白的混合物，其中第二免疫球蛋白不同于第一免疫球蛋白。
29.权利要求1、2或28的方法，其中在步骤c)后分离基质保留其原始动态结合能力的至少80%。
30.权利要求1、2或28的方法，其中在步骤c)后分离基质保留其原始动态结合能力的至少90%。
31.包含至少70%体积的水性碱金属氢氧化物溶液的清洁液用于消毒分离基质的用途，所述分离基质包含与多孔载体共价偶联的免疫球蛋白结合的碱稳定的蛋白A结构域的多聚体，其中水性碱金属氢氧化物溶液的摩尔浓度为500 mM-5 M，其中所述碱稳定的蛋白A结构域由SEQ ID NO 51所示的葡萄球菌蛋白A (SpA)的亲本Fc-结合结构域的突变体组成，其中SEQ ID NO 51的位置13和44处的氨基酸残基是天冬酰胺，和其中至少SEQ ID NO 51的位置3处的天冬酰胺残基已被突变为选自谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、丙氨酸、组氨酸和精氨酸的氨基酸。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201904125D0 (en) 2019-03-26 2019-05-08 Ge Healthcare Bio Sciences Ab Method for sanitization of a chromatography column
GB202018588D0 (en) * 2020-11-26 2021-01-13 Cytiva Bioprocess R & D Ab Separation matrix

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1524957A (zh) * 2003-02-26 2004-09-01 本元正阳基因技术股份有限公司 重组蛋白a基因及其表达产物的制备与应用
WO2012083425A1 (en) * 2010-12-21 2012-06-28 The University Of Western Ontario Novel alkali-resistant variants of protein a and their use in affinity chromatography
CN104059133A (zh) * 2013-03-18 2014-09-24 南京金斯瑞生物科技有限公司 一类突变的具有高耐碱特性的蛋白a及其应用
WO2015005859A1 (en) * 2013-07-10 2015-01-15 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
CN105481954A (zh) * 2014-09-16 2016-04-13 浙江健能隆生物医药有限公司 一种重组蛋白a及其应用
WO2016079033A1 (en) * 2014-11-17 2016-05-26 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides

Family Cites Families (178)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE451946B (sv) 1982-12-10 1987-11-09 Gambro Lundia Ab Anordning for avlegsnande av en eller flera fraktioner ur helblod, plasma eller liknande kroppsvetskor
US4704366A (en) 1984-06-22 1987-11-03 Bio-Rad Laboratories, Inc. Process for binding IgG to protein A
SE8505922D0 (sv) 1985-12-13 1985-12-13 Kabigen Ab Construction of an igg binding protein to facilitate downstream processing using protein engineering
US4801687A (en) 1986-10-27 1989-01-31 Bioprobe International, Inc. Monoclonal antibody purification process using protein A
ATE120761T1 (de) 1987-05-21 1995-04-15 Creative Biomolecules Inc Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung.
US5011686A (en) 1987-09-21 1991-04-30 Creative Biomolecules, Inc. Thrombus specific conjugates
US5084398A (en) 1987-11-20 1992-01-28 Creative Biomolecules Selective removal of immune complexes
US4933435A (en) 1989-04-05 1990-06-12 Bioprobe International Antibody purification process
JP2500329B2 (ja) 1991-05-09 1996-05-29 工業技術院長 クラウン化合物残基を有するα−アミノ酸重合体及びその製造方法
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
SE9503925D0 (sv) 1995-11-07 1995-11-07 Pharmacia Biotech Ab Separationsmedium för IgG
SE9601368D0 (sv) 1996-04-11 1996-04-11 Pharmacia Biotech Ab Process for the production of a porous cross-linked polysaccharide gel
EP1864999B1 (en) 1996-11-27 2009-03-18 Genentech, Inc. Affinity purification of polypeptide on protein a matrix
AU2003210802B2 (en) 2002-02-05 2009-09-10 Genentech Inc. Protein purification
SE0200943D0 (sv) 2002-03-25 2002-03-25 Amersham Biosciences Ab Mutant protein
US7709209B2 (en) 2002-03-25 2010-05-04 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Protein ligands
US7220356B2 (en) 2002-09-13 2007-05-22 Biogen Idec Inc. Method of purifying polypeptides by simulated moving bed chromatography
JP2006507839A (ja) 2002-11-27 2006-03-09 ジーティーシー バイオセラピューティックス インコーポレイテッド 乳中に安定して産生される改変抗体およびその製造方法
RU2006114694A (ru) 2003-10-03 2007-11-10 Брихэм Энд Уимен`З Хоспитал (Us) Tim-3-полипептиды
US8084032B2 (en) 2004-01-21 2011-12-27 Ajinomoto Co., Inc. Purification method which prevents denaturation of an antibody
SE0400274D0 (sv) 2004-02-09 2004-02-09 Affibody Ab New polypeptide
SE0402322D0 (sv) 2004-09-22 2004-09-22 Amersham Biosciences Ab Method of preparing a chromatography matrix
JP2006304633A (ja) 2005-04-26 2006-11-09 Apro Life Science Institute Inc イムノグロブリン結合タンパク質
AU2006250120A1 (en) 2005-05-24 2006-11-30 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Regeneration of a chromatography matrix
EA015148B1 (ru) 2005-06-17 2011-06-30 Элан Фарма Интернэшнл Лимитед СПОСОБЫ ОЧИСТКИ Aβ-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА, СОДЕРЖАЩЕГО ОБЛАСТЬ FC
MX2008002101A (es) 2005-08-12 2008-04-19 Schering Corp Fusiones de la proteina-1 quimiotactica de monocito.
WO2007081906A2 (en) 2006-01-06 2007-07-19 Amgen Inc. Purification by column-chromatography using eluants containing organic solvents
CN102626610B (zh) 2006-01-06 2014-10-01 Emd密理博公司 亲和层析基质及其制备和使用方法
KR20080094064A (ko) 2006-01-17 2008-10-22 바이오렉스 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 식물에서 ｎ-글리칸의 인간화 및 최적화 조성물 및 방법
EP1992692B1 (en) 2006-02-21 2013-01-09 Protenova Co., Ltd. Immunoglobulin affinity ligand
US8263750B2 (en) 2006-03-16 2012-09-11 Amgen Inc. Method for purifying a protein using protein-A affinity chromatography using an intermediate wash step
SI2004683T1 (sl) 2006-03-24 2016-09-30 Biogen Hemophilia Inc. Pc5 kot encim za obdelavo propeptida faktorja ix
US8377448B2 (en) 2006-05-15 2013-02-19 The Board Of Trustees Of The Leland Standford Junior University CD47 related compositions and methods for treating immunological diseases and disorders
WO2007144476A1 (fr) 2006-06-16 2007-12-21 Groupe Novasep Procede de separation sequence multicolonnes
RS51544B (en) 2006-06-30 2011-06-30 Conaris Research Institute Ag. POBOLJŠANI SGP 130FC DIMERI
WO2008025747A1 (en) 2006-08-28 2008-03-06 Ares Trading S.A. Process for the purification of fc-fusion proteins
CN101511387A (zh) 2006-09-08 2009-08-19 惠氏公司 使用亲和色谱法纯化蛋白质的精氨酸洗涤液
CN106422418B (zh) 2006-09-29 2022-03-01 思拓凡生物工艺研发有限公司 用于抗体分离的包含来自金黄色葡萄球菌a蛋白的结构域c的层析配体
US8853371B2 (en) 2006-10-19 2014-10-07 Janssen Biotech, Inc. Process for preparing unaggregated antibody Fc domains
US20080167450A1 (en) 2007-01-05 2008-07-10 Hai Pan Methods of purifying proteins
WO2008137471A2 (en) 2007-05-02 2008-11-13 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
CN101687119B (zh) 2007-06-15 2013-06-12 通用电气健康护理生物科学股份公司 色谱方法
US20110117605A1 (en) 2008-04-23 2011-05-19 Symphogen A/S Methods for Manufacturing a Polyclonal Protein
US8592555B2 (en) 2008-08-11 2013-11-26 Emd Millipore Corporation Immunoglobulin-binding proteins with improved specificity
CN102171237A (zh) 2008-08-14 2011-08-31 默沙东公司 使用蛋白a亲和色谱法纯化抗体的方法
JP5229888B2 (ja) 2008-09-30 2013-07-03 独立行政法人産業技術総合研究所 弱酸性域での易解離性を向上したプロテインａ変異型タンパク質及び抗体捕捉剤
WO2010044885A2 (en) 2008-10-17 2010-04-22 Whitehead Institute For Biomedical Research Soluble mtor complexes and modulators thereof
WO2010062399A2 (en) 2008-11-26 2010-06-03 Five Prime Therapeutics, Inc. Csf1r extracellular domain fusion molecules and treatments using same
WO2010062401A2 (en) 2008-11-26 2010-06-03 Five Prime Therapeutics, Inc. Treatment of osteolytic disorders and cancer using csf1r extracellular domain fusion molecules
SG195555A1 (en) 2008-12-24 2013-12-30 Emd Millipore Corp Caustic stable chromatography ligands
JP2012515160A (ja) 2009-01-12 2012-07-05 ジーイー・ヘルスケア・バイオサイエンス・アクチボラグ アフィニティークロマトグラフィーマトリックス
EP2208681B1 (en) 2009-01-16 2013-07-03 Tetra Laval Holdings & Finance S.A. A unit for sterilizing a web of packaging material for a machine for packaging food products
JPWO2010110288A1 (ja) 2009-03-24 2012-09-27 株式会社カネカ 免疫グロブリンに親和性を有するタンパク質および免疫グロブリン結合性アフィニティーリガンド
US8728479B2 (en) 2009-03-31 2014-05-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Antigen-binding proteins comprising recombinant protein scaffolds
CA2756244A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
BRPI1015019A2 (pt) 2009-04-20 2018-02-14 Pfizer controle de glicosilação de proteína e composições e métodos relacionada a ele.
AU2010265933B2 (en) 2009-06-26 2015-05-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
US20120091063A1 (en) 2009-06-26 2012-04-19 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method in a chromatography system
JP2013503140A (ja) 2009-08-27 2013-01-31 ノヴォ ノルディスク アー／エス 活性化血小板に対する組織因子の標的化
CN102574921B (zh) 2009-09-29 2016-05-04 罗切格利卡特公司 双特异性死亡受体激动型抗体
WO2011073389A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Novartis Ag Wash solution and method for affinity chromatography
US9284347B2 (en) 2010-01-22 2016-03-15 Boehringer Ingelheim International Gmbh Chromatographic method for purifying FC-containing proteins
JP5917417B2 (ja) 2010-03-05 2016-05-11 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗体の選択的強化
US10273270B2 (en) 2010-03-24 2019-04-30 Kaneka Corporation Protein capable of binding specifically to immunoglobulin, and immunoglobulin-binding affinity ligand
FR2958936A1 (fr) 2010-04-14 2011-10-21 Sanofi Aventis Proteine de fusion robo1-fc et son utilisation dans le traitement des tumeurs
AU2011239689A1 (en) 2010-04-15 2012-11-08 Amgen Inc. Human FGF receptor and beta-Klotho binding proteins
ES2617777T5 (es) 2010-04-23 2022-10-13 Hoffmann La Roche Producción de proteínas heteromultiméricas
KR101152036B1 (ko) 2010-04-27 2012-06-08 (주)셀트리온 컬럼 순환 및 시료 연속주입법을 이용한 단백질 ａ 크로마토그래피 정제 방법
US20130231464A1 (en) 2010-04-28 2013-09-05 Oncolmmune, Inc. Methods of use of soluble cd24 for therapy of rheumatoid arthritis
KR20130066631A (ko) 2010-05-06 2013-06-20 노파르티스 아게 치료적 저밀도 지단백질-관련 단백질 ６ （ｌｒｐ６） 다가 항체에 대한 조성물 및 사용 방법
EP2580238A1 (en) 2010-06-09 2013-04-17 Zymogenetics, Inc. Dimeric vstm3 fusion proteins and related compositions and methods
JP5873016B2 (ja) 2010-06-21 2016-03-01 協和発酵キリン株式会社 アミノ酸を利用したタンパク質の精製方法
US8883134B2 (en) 2010-10-20 2014-11-11 Handok Pharmaceuticals, Inc. Human interleukin-1 receptor antagonist—hybrid Fc fusion protein
US20120263722A1 (en) 2010-11-04 2012-10-18 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
CA2813411C (en) 2010-11-05 2016-08-02 Rinat Neuroscience Corporation Engineered polypeptide conjugates and methods for making thereof using transglutaminase
JP6092782B2 (ja) 2010-11-16 2017-03-08 エクセリミューン， インコーポレイテッド 組換えタンパク質の製造方法
EP2646126A4 (en) 2010-11-29 2014-12-17 Ge Healthcare Bio Sciences Ab AFFINITY CHROMATOGRAPHY MATRIX
TWI424121B (zh) 2010-12-10 2014-01-21 Prosol Corp 渦輪分子泵浦之葉片結構改良
WO2012087230A1 (en) 2010-12-20 2012-06-28 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Affinity chromatography matrix
JP5974343B2 (ja) 2010-12-20 2016-08-23 ジーイー・ヘルスケア・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ アフィニティークロマトグラフィーマトリックス
KR101461772B1 (ko) 2010-12-21 2014-12-03 제이에스알 가부시끼가이샤 친화성 크로마토그래피용 담체 및 면역 글로불린을 단리하는 방법
CA2823066A1 (en) 2010-12-27 2012-07-05 Alexion Pharma International Sarl Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof
WO2012125735A1 (en) 2011-03-15 2012-09-20 Abott Laboratories An integrated approach to the isolation and purification of antibodies
JPWO2012133349A1 (ja) 2011-03-25 2014-07-28 株式会社カネカ アフィニティー分離マトリックス用タンパク質
JP5933526B2 (ja) 2011-03-25 2016-06-08 株式会社カネカ 免疫グロブリン結合性新規ポリペプチド
EP2691411B1 (en) 2011-03-29 2020-02-26 GlaxoSmithKline LLC Buffer system for protein purification
CN103596968B (zh) 2011-06-01 2018-05-15 诺华股份有限公司 用于亲和层析的洗涤溶液和方法
EP2728000B1 (en) 2011-06-03 2018-12-05 National Institute of Advanced Industrial Science And Technology Protein a mutant protein having reduced affinity in acidic region, and antibody capture agent
SG186552A1 (en) 2011-06-08 2013-01-30 Emd Millipore Corp Chromatography matrices including novel staphylococcus aureus protein a based ligands
WO2013006244A1 (en) 2011-06-08 2013-01-10 Arizona Board Of Regents, A Body Corporate Of The State Of Arizona Acting For And On Behalf Of Arizona State University Bispecific monoclonal antibody therapeutics against west nile virus with improved cns penetration
SG195077A1 (en) 2011-06-22 2013-12-30 Hoffmann La Roche Removal of target cells by circulating virus-specific cytotoxic t-cells using mhc class i comprising complexes
CA2840552A1 (en) 2011-07-01 2013-01-10 Bayer Intellectual Property Gmbh Relaxin fusion polypeptides and uses thereof
DK2729482T3 (en) 2011-07-08 2018-05-07 Merck Sharp & Dohme PROCEDURE FOR CLEANING FC-FUSION PROTEIN
US20140148390A1 (en) 2011-07-08 2014-05-29 Bayer Intellectual Property Gmbh Fusion proteins releasing relaxin and uses thereof
KR20140062500A (ko) 2011-09-01 2014-05-23 휴먼 게놈 사이언시즈, 인크. 바이러스 클리어런스 방법
MX2014002996A (es) 2011-09-23 2014-05-28 Roche Glycart Ag Anticuerpos anti - egfr/anti - igf-1r bisespecificos.
CA2848520C (en) 2011-09-29 2019-11-26 Seattle Genetics, Inc. Intact mass determination of protein conjugated agent compounds
EP2578286A1 (en) 2011-10-04 2013-04-10 Merck Patent GmbH Method and apparatus for chromatographic purification
CN104114579B (zh) 2011-10-27 2020-01-24 健玛保 异二聚体蛋白的生成
WO2013075740A1 (en) 2011-11-23 2013-05-30 Sanofi Antibody purification method
US9657055B2 (en) 2011-11-30 2017-05-23 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Affinity chromatography matrix
CA2858389A1 (en) 2011-12-15 2013-06-20 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Soluble igf receptor fc fusion proteins and uses thereof
CN104220461A (zh) 2011-12-29 2014-12-17 Atyr医药公司 天冬氨酰-tRNA合成酶-FC缀合物
JP6420756B2 (ja) 2012-03-28 2018-11-07 ジーイー・ヘルスケア・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ アフィニティークロマトグラフィーマトリックス
SG11201406238UA (en) 2012-04-05 2014-10-30 Hoffmann La Roche Bispecific antibodies against human tweak and human il17 and uses thereof
EP2656892A1 (en) 2012-04-23 2013-10-30 Merck Patent GmbH Chromatography method
US20140154270A1 (en) 2012-05-21 2014-06-05 Chen Wang Purification of non-human antibodies using kosmotropic salt enhanced protein a affinity chromatography
ES2672974T3 (es) 2012-06-01 2018-06-19 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Complejos multiméricos con estabilidad in vivo, farmacocinética y eficacia mejoradas
EP2682168A1 (en) 2012-07-02 2014-01-08 Millipore Corporation Purification of biological molecules
HUE056217T2 (hu) 2012-07-13 2022-02-28 Roche Glycart Ag Bispecifikus anti-VEGF/anti-ANG-2 antitestek és ezek alkalmazása szemészeti érbetegségek kezelésében
CN104684928A (zh) 2012-08-02 2015-06-03 Jn生物科学有限责任公司 通过半胱氨酸突变和μ尾端多聚化的抗体或融合蛋白
BR112015002263A2 (pt) 2012-08-02 2017-12-12 Hoffmann La Roche polipeptídeo de fusão, polipeptídeo de fusão dimérico, método para a produção de um receptor fc solúvel, uso de um polipeptídeo de fusão imobilizado e composição farmacêutica
MX2015000683A (es) 2012-08-02 2015-04-10 Hoffmann La Roche Metodo para producir moleculas monomericas y multimericas y uso de las mismas.
US9315567B2 (en) 2012-08-14 2016-04-19 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
MY172863A (en) 2012-09-13 2019-12-13 Bristol Myers Squibb Co Fibronectin based scaffold domain proteins that bind to myostatin
AU2013318928A1 (en) 2012-09-21 2015-04-09 Kaneka Corporation Protein ligand for affinity isolation matrix
US9107960B2 (en) 2012-12-13 2015-08-18 Immunimedics, Inc. Antibody-SN-38 immunoconjugates with a CL2A linker
WO2014124326A1 (en) 2013-02-08 2014-08-14 Stem Centrx, Inc. Novel multispecific constructs
EP2772289B1 (en) 2013-03-01 2015-05-06 ChromaCon AG Chromatographic process for enrichment and isolation
WO2014159064A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Emd Millipore Corporation Methods of increasing protein purity using protein a based chromatography
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
TR201809571T4 (tr) 2013-03-15 2018-07-23 Hoffmann La Roche Ll-22 polipeptidleri ile ıl-22 fc füzyon proteinleri ve kullanım yöntemleri.
DK3460054T3 (da) 2013-03-15 2021-01-18 Atyr Pharma Inc Histidyl-tRNA-syntetase-Fc-konjugater
AU2013203043B2 (en) 2013-03-15 2016-10-06 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods to produce a human plasma-derived igg preparation enriched in brain disease-related natural iggs
JP6192390B2 (ja) 2013-07-05 2017-09-06 キヤノン株式会社 光電変換装置、光電変換システム
EP2994164B1 (en) 2013-05-08 2020-08-05 Zymeworks Inc. Bispecific her2 and her3 antigen binding constructs
CA2910065C (en) 2013-05-15 2023-09-19 Medimmune Limited Purification of recombinantly produced polypeptides
JP6147340B2 (ja) 2013-05-29 2017-06-14 Jsr株式会社 洗浄用組成物、タンパク質精製方法、及びタンパク質
CA2915960A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 Asana Biosciences, Llc 5t4-targeted immunofusion molecule and methods
JP6283411B2 (ja) 2013-07-09 2018-02-21 エービーエルバイオ Ｄｌｌ４とｖｅｇｆに特異的に結合する新規二重標的タンパク質とこれの用途
BR112016001376A2 (pt) 2013-07-25 2017-10-24 Novartis Ag bioconjugados de polipeptídeos de apelin sintéticos
RU2675516C2 (ru) 2013-08-02 2018-12-19 Пфайзер Инк. Anti-cxcr4 антитела и конъюгаты антитело-лекарство
WO2015035180A1 (en) 2013-09-05 2015-03-12 Genentech, Inc. Method for chromatography reuse
EP3048899B1 (en) 2013-09-25 2021-09-08 Bioverativ Therapeutics Inc. On-column viral inactivation methods
US10221211B2 (en) 2013-09-27 2019-03-05 Kaneka Corporation Process for producing porous cellulose beads using alkali aqueous solution
US11103593B2 (en) 2013-10-15 2021-08-31 Seagen Inc. Pegylated drug-linkers for improved ligand-drug conjugate pharmacokinetics
MX2016006572A (es) 2013-11-27 2016-12-09 Zymeworks Inc Construcciones de union a antigenos biespecificas dirigidas a her2.
KR102178323B1 (ko) 2013-11-29 2020-11-13 삼성전자주식회사 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체
AU2014364812B2 (en) 2013-12-17 2017-05-25 Novartis Ag Cytotoxic peptides and conjugates thereof
MY180257A (en) 2014-01-27 2020-11-26 Pfizer Bifunctional cytotoxic agents
US20160152725A1 (en) 2014-02-25 2016-06-02 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Antigen-binding proteins specific for hla-a2-restricted wilms tumor 1 peptide
EP3119885B1 (en) 2014-03-17 2021-06-02 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Antibody-fynomer conjugates
AU2015237176A1 (en) 2014-03-28 2016-10-20 New York University FGF23 fusion proteins
HUE049622T2 (hu) 2014-04-25 2020-09-28 Rinat Neuroscience Corp Magas drog-töltöttségû ellenanyag-drog konjugátumok
EP3137186B1 (en) 2014-04-30 2021-01-27 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of proteins using caprylic acid
BR112016025056A2 (pt) 2014-05-14 2018-02-20 F. Hoffmann-La Roche Ag uso de pelo menos um polipeptídeo, anticorpo biespecífico, anticorpo biespecífico isolado, anticorpo her3/her2 biespecífico, célula hospedeira, método de produção do anticorpo biespecífico her3/her2, imunoconjugado e formulação farmacêutica
EA201692476A1 (ru) 2014-05-28 2017-07-31 Займворкс Инк. Модифицированные антигенсвязывающие полипептидные конструкции и их применение
CA2951368A1 (en) 2014-06-13 2015-12-17 Novartis Ag Auristatin derivatives and conjugates thereof
CN106536565A (zh) 2014-06-13 2017-03-22 鲁宾有限公司 一种用于纯化TNFR‑Fc融合蛋白的方法
US9777073B2 (en) 2014-07-21 2017-10-03 Wuhan Yzy Biopharma Co., Ltd. Construction and application of bispecific antibody EpCAM×CD3
AR101262A1 (es) 2014-07-26 2016-12-07 Regeneron Pharma Plataforma de purificación para anticuerpos biespecíficos
KR102259232B1 (ko) 2014-08-25 2021-05-31 삼성전자주식회사 항 c-Met/항 Ang2 이중 특이 항체
HUE049325T2 (hu) 2014-08-28 2020-09-28 Pfizer Stabilitás modulátor linker antitest-hatóanyag konjugátumokhoz történõ alkalmazásra
US11279771B2 (en) 2014-09-17 2022-03-22 Novo Nordisk A/S Antibodies capable of binding two epitopes on tissue factor pathway inhibitor (1-161)
JP6369807B2 (ja) 2014-10-21 2018-08-08 株式会社プロテイン・エクスプレス プロテインｌ変異体
JP2016079153A (ja) 2014-10-21 2016-05-16 株式会社プロテイン・エクスプレス プロテインｇ変異体
SG11201607162QA (en) 2014-10-24 2016-10-28 Gemtier Medical Shanghai Inc Disposable Safe Vein Transfusion Puncture Needle
JP2018502839A (ja) 2014-12-09 2018-02-01 アッヴィ・インコーポレイテッド Ｂｃｌ−ｘＬ阻害性化合物およびこれを含む抗体薬物コンジュゲート
BR112017012377A2 (pt) 2014-12-09 2018-04-24 Abbvie Inc conjugados anticorpo-fármaco com inibidores de bcl-xl permeáveis à célula
WO2016097300A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Genmab A/S Rodent bispecific heterodimeric proteins
CA2975410A1 (en) 2015-04-07 2016-10-13 Immunomedics, Inc. Y-90-labeled anti-cd22 antibody (epratuzumab tetraxetan) in refractory/relapsed adult cd22+ b-cell acute lymphoblastic leukemia
US11820807B2 (en) 2015-06-12 2023-11-21 Ubi Pharma Inc Immunoglobulin fusion proteins and uses thereof
WO2017011342A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 Abbvie Inc. Igm-or-ige-modified binding proteins and uses thereof
DK3322721T3 (da) 2015-07-16 2022-03-14 Navigo Proteins Gmbh Nye immunglobulin-bindende proteiner og deres anvendelse i affinitetsoprensning
JP2017037070A (ja) 2015-08-10 2017-02-16 三菱化学株式会社 分離剤及び液体クロマトグラフィー用カラム
GB201515339D0 (en) 2015-08-28 2015-10-14 Ge Healthcare Bio Sciences Ab A seperation matrix and a method of seperating antibodies
JP6861702B2 (ja) 2015-09-25 2021-04-21 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ソルターゼ・コンジュゲート化ループを含む組換え免疫グロブリン重鎖およびそのコンジュゲート
US20170096485A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific t cell activating antigen binding molecules
BR112018002570A2 (pt) 2015-10-02 2018-10-16 Hoffmann La Roche molécula de ligação ao antígeno biespecífica, anticorpo biespecífico, polinucleotídeos, anticorpo que se liga especificamente ao ox40, composição farmacêutica e método para inibir o crescimento de células tumorais em um indivíduo
AU2016334623A1 (en) 2015-10-07 2018-02-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies with tetravalency for a costimulatory TNF receptor
US20170216452A1 (en) 2015-11-30 2017-08-03 Pfizer Inc. Antibodies and antibody fragments for site-specific conjugation
US10730908B2 (en) 2016-05-11 2020-08-04 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10654887B2 (en) 2016-05-11 2020-05-19 Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab Separation matrix
US10703774B2 (en) 2016-09-30 2020-07-07 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
EP3455242B1 (en) 2016-05-11 2021-06-23 Cytiva BioProcess R&D AB Separation method
US10889615B2 (en) 2016-05-11 2021-01-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
ES2874974T3 (es) 2016-05-11 2021-11-05 Cytiva Bioprocess R & D Ab Matriz de separación
CN109311949B (zh) 2016-05-11 2022-09-16 思拓凡生物工艺研发有限公司 储存分离基质的方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1524957A (zh) * 2003-02-26 2004-09-01 本元正阳基因技术股份有限公司 重组蛋白a基因及其表达产物的制备与应用
WO2012083425A1 (en) * 2010-12-21 2012-06-28 The University Of Western Ontario Novel alkali-resistant variants of protein a and their use in affinity chromatography
CN103403020A (zh) * 2010-12-21 2013-11-20 Jsr株式会社 蛋白a的新型耐碱变体及其在亲和色谱中的用途
CN104059133A (zh) * 2013-03-18 2014-09-24 南京金斯瑞生物科技有限公司 一类突变的具有高耐碱特性的蛋白a及其应用
WO2015005859A1 (en) * 2013-07-10 2015-01-15 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
CN105377880A (zh) * 2013-07-10 2016-03-02 通用电气健康护理生物科学股份公司 突变的免疫球蛋白结合多肽
CN105481954A (zh) * 2014-09-16 2016-04-13 浙江健能隆生物医药有限公司 一种重组蛋白a及其应用
WO2016079033A1 (en) * 2014-11-17 2016-05-26 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Engineering of novel Staphylococcal Protein A ligands to enablemilder elution pH and high dynamic binding capacity;Timothy M. Pabsta等;《Journal of Chromatography A》;20141003;第1362卷;第180-185页 *
耐碱蛋白A的表达及相关蛋白的分离纯化研究;都晓君;《中国优秀硕士学位论文 基础科学辑》;20150731;第1-20页 *
葡萄球菌蛋白A 活性机制与现代应用;梁浩等;《生命化学》;20081215;第28卷(第6期);第748-751页 *

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