KR20140062500A - 바이러스 클리어런스 방법 - Google Patents

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KR20140062500A
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올가 갈페리나
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휴먼 게놈 사이언시즈, 인크.
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    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
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    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
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Abstract

본 발명은 바이러스로부터 관심 폴리펩티드 (예컨대 항체)를 분리하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 관심 폴리펩티드와 공동-용리되는 바이러스의 양을 최소화하는 특정 범위의 전도도 값을 갖는 용리 완충제를 사용하여 단백질 A 수지로부터 관심 폴리펩티드를 용리하는 것을 포함한다.

Description

바이러스 클리어런스 방법 {VIRAL CLEARANCE METHODS}
본 발명은 바이러스 클리어런스(clearance)를 향상시키기 위해 단백질 A(Protein A) 크로마토그래피를 사용하여 폴리펩티드를 정제하는 방법에 관한 것이다.
항체와 같은 관심 폴리펩티드는 종종 살아있는 세포에서 제조된다. 관심 폴리펩티드를 발현하는 세포주는 복합 배지를 통하여 유지되어야 한다. 따라서, 관심 폴리펩티드의 정제는 배지 요소, 세포 성분 및 기타 세포주 부산물로부터의 폴리펩티드의 분리를 포함한다.
특히, 동물 또는 인간 세포주로부터 폴리펩티드가 제조되는 경우, 생물공학 업계는 필연적으로 바이러스 오염을 고려해야 한다. 바이러스는 원료 물질에 존재하거나, 폴리펩티드 제조 과정에 도입되거나, 또는 성장 배지에서 발견될 수 있다 (문헌 [Valdes, R. et al., J. Biotechnol. 96(3):251-8 (2002)]). 최종 생물학적 생성물로부터 바이러스성 불순물이 제거되거나 불활성화되는 것은 중요하다 (문헌 [U.S. Department of Health and Human Services, Guidance for industry: Q5A Viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell line of human or animal origin. 1998]). 따라서, 치료용 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드 생성물로부터 오염 바이러스를 제거하기 위한 개선된 방법이 요구되고 있다.
일반적으로, 본 발명은 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 관심 폴리펩티드로부터 오염 바이러스를 제거하는 방법을 제공한다. 그와 같은 한 측면에서, 본 발명은 바이러스로부터 관심 폴리펩티드를 분리하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 관심 폴리펩티드 및 바이러스가 흡착되어 있는 단백질 A 수지에 약 3.0 내지 약 10 mS/cm의 전도도를 갖는 용리 완충제를 적용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 관심 폴리펩티드 및 바이러스가 흡착되어 있는 단백질 A 수지에 술페이트 (예컨대 약 50 또는 약 100 mM의 나트륨 술페이트)를 포함하는 용리 완충제를 적용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 수지로부터 관심 폴리펩티드를 용리하는 것은 바이러스의 적어도 일부분으로부터 관심 폴리펩티드를 분리시킨다.
한 측면에서, 본 발명은 관심 폴리펩티드를 정제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 관심 폴리펩티드 및 바이러스를 포함하는 용액을, 관심 폴리펩티드가 단백질 A 수지에 결합하는 조건하에서 단백질 A 수지에 적용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 수지는 세척 완충제를 사용하여 세척한다. 일부 실시양태에서, 상기 세척 단계는 수지로부터 1종 이상의 오염물을 용리시킨다. 일부 실시양태에서, 이와 같은 세척 단계가 생략된다. 일부 실시양태에서, 약 3.0 내지 약 10 mS/cm의 전도도를 갖는 용리 완충제를 사용하여 수지로부터 관심 폴리펩티드를 용리함으로써 회수 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 술페이트 (예컨대 약 50 또는 약 100 mM의 나트륨 술페이트)를 포함하는 용리 완충제를 사용하여 수지로부터 관심 폴리펩티드를 용리함으로써 회수 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 또 다른 관심 폴리펩티드를 정제하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 관심 폴리펩티드 및 바이러스를 포함하는 용액을, 관심 폴리펩티드가 단백질 A 수지에 결합하는 조건하에서 단백질 A 수지에 적용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 수지는 세척 완충제를 사용하여 세척한다. 일부 실시양태에서, 상기 세척 단계는 수지로부터 1종 이상의 오염물을 용리시킨다. 일부 실시양태에서, 이와 같은 세척 단계가 생략된다. 일부 실시양태에서, 제1 용리 완충제를 사용하여 수지로부터 관심 폴리펩티드를 용리함으로써 회수 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 회수된 조성물 중 바이러스의 양을 측정한다. 일부 실시양태에서, 측정된 바이러스의 양이 원하는 양에 비해 더 큰 경우, 제1 용리 완충제에 비해 더 높은 전도도를 갖는 제2 용리 완충제를 사용하여 상기 방법을 반복한다. 일부 실시양태에서, 측정된 바이러스의 양이 원하는 양에 비해 더 큰 경우, 제1 용리 완충제에 비해 더 많은 술페이트 (예컨대 나트륨 술페이트)를 갖는 제2 용리 완충제를 사용하여 상기 방법을 반복한다. 일부 실시양태에서, 회수 조성물의 순도를 증가시키기 위하여, 방법의 첫 번째 주기로부터 회수된 조성물을 사용하여 방법을 반복한다. 일부 실시양태에서, 단백질 A 정제에 적용되지 않은 관심 폴리펩티드를 포함하는 용액을 사용하여 방법을 반복한다. 이와 같은 용액은 방법의 첫 번째 주기 동안 정제된 용액과 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명의 임의의 측면의 일부 실시양태에서, 회수 조성물 중 바이러스의 양은 수지에 적용된 용액 중 바이러스의 양에 비해 약 10, 102, 103, 104, 105 또는 106배 중 어느 것 이상 더 적다. 일부 실시양태에서, 회수 조성물 중 바이러스의 양은 수지에 적용된 용액 중 바이러스의 양에 비해 약 102 내지 약 106배, 예컨대 약 103 내지 약 106배, 약 104 내지 약 106배, 또는 약 104 내지 약 105배로 더 적다. 일부 실시양태에서, 2종 이상 바이러스의 양이 감소된다.
본 발명의 임의의 측면의 일부 실시양태에서, 용리 완충제의 전도도는 약 3 내지 약 3.5, 약 3.5 내지 약 4, 약 4 내지 약 4.5, 약 4.5 내지 약 5, 약 5 내지 약 5.5, 약 5.5 내지 약 6, 약 6 내지 약 6.5, 약 6.5 내지 약 7, 약 7 내지 약 7.5, 약 7.5 내지 약 8, 약 8 내지 약 8.5, 약 8.5 내지 약 9, 약 9 내지 약 9.5, 또는 약 9.5 내지 약 10 mS/cm이다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제의 전도도는 약 3.0 내지 약 10 mS/cm, 예컨대 약 3.5 내지 약 9.5, 약 4 내지 약 7, 또는 약 5 내지 약 6 mS/cm이다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제는 나트륨 술페이트, 예컨대 약 50 또는 약 100 mM의 나트륨 술페이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제는 나트륨 시트레이트, 예컨대 약 15, 20 또는 25 mM 중 어느 것의 나트륨 시트레이트를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 용리 완충제는 나트륨 시트레이트 및 나트륨 술페이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제의 pH는 약 2 내지 약 5.5, 예컨대 약 2.5 내지 약 4.5, 또는 약 3 내지 약 4이다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제의 pH는 약 2 내지 약 2.5, 약 2.5 내지 약 3, 약 3.0 내지 약 3.5, 약 3.5 내지 약 4, 약 4 내지 약 4.5, 약 4.5 내지 약 5, 또는 약 5 내지 약 5.5이다.
본 발명의 임의의 측면의 일부 실시양태에서, 관심 폴리펩티드는 항체, 항체 단편, 또는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단백질 A 또는 수지의 고체 지지체 부분과 상호작용하는 바이러스, 또는 단백질 A 또는 고체 지지체에 결합하는 바이러스와 같은 바이러스가 단백질 A 수지에 흡착된다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 포유동물 세포, 예컨대 관심 폴리펩티드를 제조하는 데에 사용되는 세포를 감염시키는 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 레트로바이러스 또는 단일-가닥 DNA 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 바이러스는 파르보바이러스이다.
본원에서 기술되는 다양한 실시양태들의 특성들 중 하나, 일부 또는 전부는 조합되어 본 발명의 다른 실시양태를 형성할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 이하, 본 발명의 이러한 측면들 및 기타 측면들을 추가적으로 상세하게 기술한다.
도 1a는 상이한 용리 완충제 전도도를 사용한 단백질 A 용리 풀에서의 뮤린 미닛 바이러스 (MMV)의 클리어런스를 나타낸다.
도 1b는 가변적인 용리 완충제 전도도를 사용한 단백질 A 용리 풀에서의 친이종 뮤린 백혈병 바이러스 (XMuLV)의 클리어런스를 나타낸다.
본 발명은 바이러스 클리어런스를 향상시키기 위해 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 관심 폴리펩티드를 정제하는 방법에 관한 것이다. 바이러스는 잠재적으로 폴리펩티드를 제조하는 데에 사용되는 세포주, 배양 배지에, 또는 관심 폴리펩티드의 조제 동안 도입될 수 있다 (문헌 [U.S. Department of Health and Human Services, Guidance for industry: Q5A Viral safety evaluation of biotechnology products derived from cell line of human or animal origin. 1998]). 폴리펩티드 샘플이 단백질 A 칼럼에 적용되는 경우, 대부분의 오염 바이러스는 결합 없이 단백질 A 칼럼을 흘러 통과한다. 그러나, 일부 바이러스는 칼럼상에 남는다. 놀랍게도, 용리 완충제의 전도도를 ~1 mS/cm에서 ~6 mS/cm로 증가시키는 것에 의해, 단백질 A 크로마토그래피 동안의 바이러스 클리어런스가 4 로그(log)까지 증가하였다 (표 1). 증가된 용리 완충제 전도도는 단백질 A 칼럼으로부터의 관심 폴리펩티드의 용리에 영향을 주지는 않았다.
어떠한 특정 이론에 의해서도 얽매이고자 하는 것은 아니나, 용리 완충제 중 염이 바이러스와 단백질 A 칼럼 사이의 상호작용 (예컨대 바이러스와 단백질 A 칼럼의 소수성인 부분들 사이의 상호작용)을 촉진하였을 수 있다. 이러한 상호작용 (예컨대 소수성 상호작용 또는 기타 비-특이적 상호작용)으로 인하여, 바이러스는 칼럼에 더 오랫동안 결합 유지될 수 있지만, 관심 폴리펩티드는 칼럼으로부터 용리된다. 원할 경우, 용리 완충제 전도도는 관심 폴리펩티드와 함께 공동-용리되는 바이러스의 양을 추가적으로 감소시키도록 최적화될 수 있다.
Figure pct00001
예시적인 정제 방법
바이러스 클리어런스를 향상시키기 위하여, 약 3.0 내지 약 10 mS/cm의 전도도를 갖는 용리 완충제가 표준 단백질 A 크로마토그래피법 (예컨대 U.S. 특허 7,847,071호 및 4,801,687호; 및 U.S. 공개 2010/0135987호에 기술되어 있는 것들)에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 정제 방법은 수지에 관심 폴리펩티드를 적용하기 전에, 단백질 A 수지를 평형화하는 것을 포함한다. 예를 들어, 관심 폴리펩티드 (및 오염 바이러스)를 함유하는 용액용 수지를 제조하기 위하여, 평형화 완충제가 단백질 A 수지에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 완충제는 약산과 그의 짝염기 또는 약염기와 그의 짝산과 같이, pH의 변화에 저항하는 수용액이다. 예시적인 평형화 완충제용 완충제 성분에는 나트륨 포스페이트, 트리스(Tris) 및 글리신/글리시네이트가 포함된다. 이와 같은 완충제 성분의 예시적인 농도에는 약 15 mM 내지 약 300 mM, 예컨대 약 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200 또는 250 mM 중 어느 것이 포함된다. 또한, 원할 경우, 염이 평형화 완충제에 포함될 수 있다. 예시적인 염에는 산과 염기의 상호작용에 의해 형성되는 것들, 예컨대 나트륨 클로라이드, 나트륨 아세테이트, 나트륨 시트레이트 또는 나트륨 술페이트가 포함된다. 예시적인 염 농도에는 약 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300 또는 400 mM 중 어느 것이 포함된다. 원할 경우, EDTA (예컨대 약 5 또는 10 mM의 EDTA)가 평형화 완충제에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 평형화 완충제는 약 5.0 내지 약 9.0, 예컨대 약 5.1 내지 약 5.7, 또는 약 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 6.0, 7.0, 8.0 또는 9.0 중 어느 것의 pH를 가진다. 예시적인 평형화 완충제는 U.S. 특허 7,847,071호에서 찾아볼 수 있다. 또 다른 예시적인 평형화 완충제는 25 mM 트리스, 25 mM 나트륨 클로라이드, 5 mM EDTA (pH 7.1)이다. 일부 실시양태에서, 이와 같은 평형화 단계는 생략된다.
일부 실시양태에서, 관심 폴리펩티드 (및 오염 바이러스)를 함유하는 용액은, 관심 폴리펩티드가 단백질 A 수지에 결합하는 조건하에서 단백질 A 수지에 적용된다. 일부 실시양태에서, 단백질 A 수지는 세척된다. 일부 실시양태에서, 평형화 완충제를 사용하여 수지가 세척된다. 일부 실시양태에서, 평형화 완충제와 상이한 세척 완충제를 사용하여 수지가 세척된다. 일부 실시양태에서, 2종 이상의 상이한 세척 완충제들이 사용된다. 일부 실시양태에서, 상기 세척 단계는 수지에 비-특이적으로 결합되는 오염물과 같은 1종 이상의 오염물을 수지로부터 용리시킨다. 바람직하게는, 세척 단계는 수지로부터 유의한 양의 관심 폴리펩티드를 용리시키지 않는다. 예시적인 세척 완충제에는 상기한 평형화 완충제들이 포함된다. 일부 실시양태에서, 세척 완충제에는 또한 0.1% 트윈(Tween)-20과 같은 세제가 포함된다. 일부 실시양태에서, 이와 같은 세척 단계가 생략된다.
일부 실시양태에서, 관심 폴리펩티드는 약 3.0 내지 약 10 mS/cm의 전도도를 갖는 용리 완충제를 사용하여 수지로부터 용리된다. 일부 실시양태에서, 상기 용리 완충제는 관심 폴리펩티드의 Fc 영역과 단백질 A 수지 사이의 특이적 상호작용을 붕괴시키는 완충제 용액이다. 다양한 실시양태에서, 용리 완충제의 전도도는 약 3 내지 약 3.5, 약 3.5 내지 약 4, 약 4 내지 약 4.5, 약 4.5 내지 약 5, 약 5 내지 약 5.5, 약 5.5 내지 약 6, 약 6 내지 약 6.5, 약 6.5 내지 약 7, 약 7 내지 약 7.5, 약 7.5 내지 약 8, 약 8 내지 약 8.5, 약 8.5 내지 약 9, 약 9 내지 약 9.5, 또는 약 9.5 내지 약 10 mS/cm이다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제의 전도도는 약 3.0 내지 약 10 mS/cm, 예컨대 약 3.5 내지 약 9.5, 약 4 내지 약 7, 또는 약 5 내지 약 6 mS/cm이다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제의 전도도는 약 5 또는 약 6 mS/cm이다. 용리 완충제의 전도도는 하기에 메트롬 모델(Metrohm Model) 712 전도도측정기에 대하여 기술되는 것들과 같은 표준 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제의 pH는 약 2 내지 약 5.5, 예컨대 약 2.5 내지 약 4.5, 또는 약 3 내지 약 4이다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제의 pH는 약 2 내지 약 2.5, 약 2.5 내지 약 3, 약 3.0 내지 약 3.5, 약 3.5 내지 약 4, 약 4 내지 약 4.5, 약 4.5 내지 약 5, 또는 약 5 내지 약 5.5이다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제의 pH는 약 3.0, 3.2, 3.5 또는 4.0 중 어느 것이다.
예시적인 용리 완충제용 완충제 성분에는 나트륨 포스페이트, 트리스, 글리신/글리시네이트, 시트르산, 아세트산, 인산, 아르기닌 히드로클로라이드, 나트륨 시트레이트, 글리신 히드로클로라이드 및 나트륨 아세테이트 완충제가 포함된다. 이와 같은 완충제 성분의 예시적인 농도에는 약 15 mM 내지 약 300 mM, 예컨대 약 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200 또는 250 mM 중 어느 것이 포함된다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제는 시트레이트 (예컨대 나트륨 시트레이트), 예컨대 약 15, 20 또는 25 mM 중 어느 것의 시트레이트 (예컨대 나트륨 시트레이트)를 포함한다. 또한, 원할 경우, 염이 용리 완충제에 포함될 수 있다. 예시적인 염에는 나트륨 클로라이드, 나트륨 아세테이트, 나트륨 시트레이트 또는 나트륨 술페이트가 포함된다. 예시적인 염 농도에는 약 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300 또는 400 mM 중 어느 것이 포함된다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제는 술페이트 (예컨대 나트륨 술페이트), 예컨대 약 50 또는 약 100 mM의 술페이트 (예컨대 나트륨 술페이트)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용리 완충제는 나트륨 시트레이트 및 나트륨 술페이트를 포함한다.
관심 폴리펩티드가 수지로부터 용리된 후에는, 원할 경우, 단백질 A 수지를 그의 원래의 결합 용량으로 복귀시키기 위하여 재생 또는 세정 완충제가 사용될 수 있다. 예시적인 재생/세정 완충제에는 0.1 M 인산, pH 1.5; 1% 인산; 6 M 구아니딘, pH 7.0; 6 M 우레아, pH 7.0; 및 50 mM 수산화 나트륨, 0.5 M 나트륨 술페이트가 포함된다 (문헌 [Lute, S. et al., J. Chromatogr A. 26:1205(l-2):17-25, 2008]).
재생/세정 후에는, 임의로 저장 완충제가 단백질 A 수지에 적용된다. 상기 저장 완충제는 다음 사용시까지 수지에서 유지된다. 예시적인 저장 완충제에는 100 mM의 나트륨 아세테이트, 2% 벤질 알콜 (pH 5 또는 5.2)이 포함된다.
이러한 정제 방법들에 있어서, 단백질 A 수지는 바람직하게는 칼럼에 도입된다 (문헌 [Liu, H. et al., MAbs. 2(5):480-99, 2010]). 다르게는, 최초 혼합물을 용기 중 수지에 적용하고, 혼합한 후, (예를 들어) 수지를 분리하고, 액체 상을 제거하고, 세척하고, 재-원심분리하고, 용리 완충제를 첨가하고, 재-원심분리한 후, 용리액을 제거하는 것에 의한 것과 같이, 배치 정제가 수행될 수 있다. 때로는 혼성 방법이 사용되는데: 배치 방법에 의해 결합이 수행된 다음, 결합된 관심 단백질을 갖는 수지가 칼럼상에 충진되고, 칼럼에서 세척 및 용리가 수행된다.
예시적인 단백질 A 수지
어떠한 표준 단백질 A 수지도 본 발명의 정제 방법에 사용될 수 있다. 단백질 A는 보통 Fc 영역을 함유하는 폴리펩티드를 정제하는 데에 사용된다. 단백질 A는 스타필로코쿠스 아우레아스(Staphylococcus aureas) 유래의 41 kDa 세포 표면 단백질로써, 고도의 친화도로 항체의 Fc 영역에 결합한다. 단백질 A는 안정하며, 높은 염 조건으로 사용될 수 있다. 자연-발생 형태의 단백질 A 이외에도, 단백질분해성 분해에 대한 증가된 안정성 또는 알칼리 용액에 대한 향상된 내성을 갖는 유전자적으로 변형된 형태의 단백질 A가 가용하다 (U.S. 공개 2005/0282294호). 친화도 크로마토그래피에서 사용시, 단백질 A는 바람직하게는 유리, 실리카, 아가로스 또는 유기 중합체와 같은 고체 지지체상에 고정된다.
시중에서 구입가능한 많은 단백질 A 수지들이 존재한다. 단백질 A 수지 제품의 예에는 밀리포어 코포레이션(Millipore Corp.)의 프로세프(ProSep) vA 및 프로세프 vA 울트라(Ultra); GE 헬스케어(Healthcare)의 마브셀렉트(MabSelect) SuRe 단백질 A 배지 및 하이-트랩(Hi-Trap) r단백질-A FF; 아머샴-바이오사이언시즈(Amersham-Biosciences)로부터 구입가능한 스트림라인(Streamline)™ 및 마브셀렉트™; 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)의 포로스(Poros) A 및 마브캡쳐(MabCapture)가 포함된다. 추가적인 단백질 A 수지 제품을 제공하는 다른 회사로는 젠스크립트(GenScript) 및 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)이 포함된다.
예시적인 관심 폴리펩티드
본 발명의 방법을 사용하여 정제될 수 있는 예시적인 관심 폴리펩티드에는 단백질 A 수지에 결합할 수 있는 모든 폴리펩티드가 포함된다. "폴리펩티드"는 길이, 번역-후 변형 또는 기능에 관계없이, 2개 이상의 아미노산을 갖는 임의의 서열을 의미한다. "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 호환가능하게 사용된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 번역-후 변형 (예컨대 글리코실화 등) 또는 임의의 다른 변형 (예컨대 페길화(PEGylation) 등)과 같은 1종 이상의 변형을 가진다. 폴리펩티드는 하나 이상의 비-자연-발생 아미노산 (예컨대 측쇄 변형을 갖는 아미노산)을 함유할 수 있다. 다양한 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 약 50, 100, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400개 중 어느 것, 또는 그 이상의 아미노산을 가진다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 50 내지 약 600개의 아미노산, 예컨대 약 100 내지 약 500개의 아미노산, 약 150 내지 약 400개의 아미노산, 약 150 내지 약 300개의 아미노산, 또는 약 175 내지 약 200개의 아미노산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 단백질 A와 상호작용하는 이뮤노글로불린 분자 Fc 영역 유래의 아미노산을 함유하는 CH2/CH3 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 CH2/CH3 영역은 무손상 CH2 영역에 이어지는 무손상 CH3 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 이뮤노글로불린의 전체 Fc 영역을 포함한다. CH2/CH3 영역-함유 폴리펩티드의 예에는 항체, 항체 단편, 이뮤노어드헤신(immunoadhesin) (문헌 [Ashkenazi and Chamow, METHODS: A companion to Methods in Enzymology, 8:104-115, 1995]), 및 CH2/CH3 영역에 융합되거나 그와 접합된 관심 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드가 포함된다.
본원에서 사용될 때의 "항체"라는 용어는 이뮤노글로불린 분자, 및 이뮤노글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 일부, 즉 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 지칭한다. 따라서, 항체라는 용어는 전체 항체 분자뿐만 아니라, 항체 단편은 물론, 항체 및 항체 단편의 변이체 (유도체 포함)도 포괄한다. 본원에서 "항체"라는 용어로 기술되는 분자의 예에는 단일 쇄 Fv (scFv), Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 디술피드 연결된 Fv (sdFv), Fv, 및 VL 또는 VH 도메인 중 어느 하나를 포함하거나 아니면 그것으로 구성되는 단편이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본원에서 사용될 때의 "단일 쇄 Fv" 또는 "scFv"라는 용어는 항체의 VL 도메인에 연결된 항체의 VH 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 항체는 이종유래 폴리펩티드, 검출가능 표지 또는 기타 분자를 추가적으로 포함할 수 있다.
예시적인 항체에는 모노클로날, 다중특이적, 인간화, 인간 또는 키메라 항체, 단일 쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 항-이디오타입(anti-idiotypic) (anti-Id) 항체, 세포내-형성 항체 (즉 인트라바디(intrabody)), 및 상기 중 어느 것의 에피토프-결합 단편이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이뮤노글로불린 분자는 임의의 유형 (예컨대 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스 (예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위클래스의 이뮤노글로불린 분자일 수 있다. 한 실시양태에서, 이뮤노글로불린은 IgG1 이소형이다. 또 다른 실시양태에서, 이뮤노글로불린은 IgG4 이소형이다. 이뮤노글로불린은 중쇄 및 경쇄 모두를 가질 수 있다. 일련의 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY 중쇄들은 카파 또는 람다 형태의 경쇄와 쌍을 이룰 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 이종유래 폴리펩티드에 융합된 Fab 단편을 포함한다.
본원에서 사용될 때의 "항체 단편"이라는 용어는 적어도 약 5, 10, 25, 50, 100, 150 또는 200개 중 어느 것의 연속되는 항체 아미노산인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다 (항체 단편을 포함하거나 아니면 그것으로 구성되는 scFv 또는 Fab와 같은 분자들, 또는 이들의 변이체 포함).
기본적인 항체 구조 단위는 사량체를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각 사량체는 2개의 동일한 폴리펩티드 쇄 쌍으로 구성되는데, 각 쌍은 하나의 "경쇄" (약 25 kDa) 및 하나의 "중쇄" (약 50-70 kDa)를 가진다. 각 쇄의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100 내지 110개 이상 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 쇄의 카르복시-말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 한정한다. 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로 분류되며, 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 한정한다. 일반적으로는 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))]을 참조한다. 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역들은 항체 결합 부위를 형성한다. 따라서, 무손상 IgG 항체는 2개의 결합 부위를 가진다. 이관능성 또는 이중특이적 항체를 제외하고는, 상기 2개의 결합 부위는 동일하다.
상기 쇄들은 모두 상보성 결정 영역 또는 CDR로도 지칭되는 3개의 초가변 영역에 의해 연결되는 상대적으로 보존되어 있는 프레임워크 영역 (FR)들의 동일한 일반 구조를 나타낸다. 각 쌍의 중쇄 및 경쇄로부터의 CDR들은 프레임워크 영역들에 의해 정렬되어, 특이적 에피토프에 대한 결합을 가능케 한다. N-말단에서 C-말단으로, 경쇄 및 중쇄 모두는 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에의 아미노산의 할당은 문헌 [Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))], 또는 [Chothia & Lesk J Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]; [Chothia et al, Nature 342:878-883 (1989)]의 정의에 따른다.
이중특이적 또는 이관능성 항체는 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하디브리드 항체이다. 이중특이적 항체는 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결을 포함한 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990)], [Kostelny et al., J Immunol. 148:1547 1553 (1992)]을 참조한다. 또한, 이중특이적 항체는 "디아바디(diabody)" (문헌 [Holliger et al., "'Diabodies': small bivalent and bispecific antibody fragments" PNAS USA 90:6444-6448 (1993)]) 또는 "자누신(janusin)" (문헌 [Traunecker et al., "Bispecific single chain molecules (Janusins) target cytotoxic lymphocytes on HIV infected cells" EMBO J 10:3655-3659 (1991)] 및 [Traunecker et al., "Janusin: new molecular design for bispecific reagents" Int J Cancer Suppl 7:51-52 (1992)])으로 형성될 수 있다.
예시적인 관심 폴리펩티드에는 비제한적으로 중합체, 이종유래 폴리펩티드, 마커 서열, 진단제 및/또는 치료제를 포함한 분자에 재조합으로 융합되거나 화학적으로 접합된 (공유 및 비-공유 접합 모두 포함) 항체 (그의 항체 단편 또는 변이체 포함)가 포괄된다. 또한, 예시적인 폴리펩티드에는 번역후 프로세싱과 같은 자연 과정에 의해, 또는 화학적 변형 기술에 의해 변형된 항체 (그의 항체 단편 또는 변이체 포함)가 포괄되는데, 이들에 대해서는 업계에 잘 알려져 있으며, 본원에서 추가 논의된다.
특정 실시양태에서, 항체는 화학적으로 변형된다. 이와 같은 화학적 변형은 증가된 용해도, 안정성 및 분자 순환 시간, 또는 감소된 면역원성과 같은 추가적인 장점을 제공할 수 있다. 유도체화용 화학 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜 등과 같은 수용성 중합체에서 선택될 수 있다. 항체는 분자 내의 무작위 위치에서, 또는 분자 내의 예정된 위치에서 변형될 수 있으며, 1개, 2개, 3개, 또는 그 이상의 결합된 화학 모이어티를 포함할 수 있다.
중합체는 어떠한 분자량도 가질 수 있으며, 분지형이거나 비분지형일 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜의 경우, 바람직한 분자량은 취급 및 제조상의 용이성을 위하여 약 1 kDa 내지 약 100 kDa이다 ("약"이라는 용어는 폴리에틸렌 글리콜의 제조시 일부 분자가 언급된 분자량보다 더 크거나 더 적을 수 있음을 나타냄). 원하는 치료 프로파일 (예컨대 원하는 지속 방출 기간, 존재할 경우 생물학적 활성에 대한 효과, 취급상의 용이성, 항원성의 정도 또는 결핍, 및 치료용 폴리펩티드 또는 유사체에 대한 폴리에틸렌 글리콜의 다른 알려져 있는 효과)에 따라 다른 크기가 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜은 약 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10,000, 10,500, 11,000, 11,500, 12,000, 12,500, 13,000, 13,500, 14,000, 14,500, 15,000, 15,500, 16,000, 16,500, 17,000, 17,500, 18,000, 18,500, 19,000, 19,500, 20,000, 25,000, 30,000, 35,000, 40,000, 50,000, 55,000, 60,000, 65,000, 70,000, 75,000, 80,000, 85,000, 90,000, 95,000 또는 100,000 kDa 중 어느 것의 평균 분자량을 가질 수 있다.
상기에서 언급된 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜은 분지형 구조를 가질 수 있다. 분지형 폴리에틸렌 글리콜에 대해서는 예를 들어 U.S. 특허 5,643,575호; 문헌 [Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996)]; [Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999)]; 및 [Caliceti et al., Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999)]에 기술되어 있다.
폴리에틸렌 글리콜 분자 (또는 다른 화학 모이어티)는 항체의 기능성 또는 항원성 도메인에 대한 효과를 고려하여 항체에 결합되어야 한다. 업계 숙련자에게 가용한 수많은 결합 방법들이 존재하는 바, 예를 들어 EP 0 401 384호 (G-CSF에 PEG를 결합시킴), 문헌 [Malik et al., Exp. Hematol. 20:1028-1035 (1992)] (트레실 클로라이드를 사용한 GM-CSF의 페길화에 대해 보고)도 참조한다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜은 아미노산 잔기의 반응성 기, 예컨대 유리 아미노 또는 카르복실 기를 통하여 공유 결합될 수 있다. 반응성 기는 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 분자가 결합될 수 있는 것들이다. 유리 아미노 기를 갖는 아미노산 잔기에는 리신 잔기 및 N-말단 아미노산 잔기가 포함될 수 있으며; 유리 카르복실 기를 갖는 것들에는 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기 및 C-말단 아미노산 잔기가 포함될 수 있다. 술피드릴 기 역시 폴리에틸렌 글리콜 분자를 결합시키는 데에 반응성 기로 사용될 수 있다. 치료 목적으로 바람직한 것은 N-말단 또는 리신 기에서의 결합과 같은 아미노 기에서의 결합이다.
상기에서 제시된 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜은 수많은 아미노산 잔기들 중 어떠한 것에 대한 연결을 통해서도 항체에 결합될 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜은 리신, 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산 또는 시스테인 잔기에 대한 공유 결합을 통하여 폴리펩티드에 연결될 수 있다. 폴리펩티드의 특정 아미노산 잔기 (예컨대 리신, 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산 또는 시스테인)에, 또는 폴리펩티드의 1종을 초과하는 유형의 아미노산 잔기 (예컨대 리신, 히스티딘, 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인 및 이들의 조합)에 폴리에틸렌 글리콜을 결합시키는 데에는 1종 이상의 반응 화학이 사용될 수 있다.
N-말단에서 화학적으로 변형된 항체를 특별히 원할 수도 있다. 폴리에틸렌 글리콜을 예로 들면, 다양한 폴리에틸렌 글리콜 분자로부터 (분자량, 분지화 등을 기준으로), 반응 혼합물에서의 폴리펩티드 분자에 대한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 비율, 수행될 페길화 반응의 유형, 및 선택된 N-말단 페길화 폴리펩티드의 수득 방법을 선택할 수 있다. N-말단 페길화 제제의 수득 방법 (즉 필요에 따라 다른 모노페길화 모이어티로부터 이와 같은 모이어티를 분리하는 것)은 페길화된 폴리펩티드 분자들의 군집으로부터의 N-말단 페길화 물질의 정제에 의한 것일 수 있다. N-말단 변형에서 화학적으로 변형된 폴리펩티드를 선택하는 것은 특정 폴리펩티드에서 유도체화에 가용한 상이한 유형의 1급 아미노 기들 (리신 대 N-말단)의 반응성 차이를 활용하는 환원성 알킬화에 의해 달성될 수 있다. 적절한 반응 조건하에서는, 카르보닐 기 함유 중합체를 사용한 N-말단에서의 항체의 실질적으로 선택성인 유도체화가 달성된다.
상기에서 나타낸 바와 같이, 항체의 페길화는 어떠한 수의 수단에 의해서도 달성될 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜은 바로, 또는 개재 링커에 의한 것 중 어느 하나에 의해 항체에 결합될 수 있다. 폴리펩티드에 폴리에틸렌 글리콜을 결합시키기 위한 무링커 시스템에 대해서는 문헌 [Delgado et al., Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992)]; [Francis et al., Intern. J. of Hematol. 68:1-18 (1998)]; U.S. 특허 4,002,531호; U.S. 특허 5,349,052호; WO 95/06058호; 및 WO 98/32466호에 기술되어 있다.
개재 링커 없이 항체의 아미노산 잔기에 바로 폴리에틸렌 글리콜을 결합시키기 위한 한 가지 시스템은 트레실클로라이드 (ClSO2CH2CF3)를 사용한 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜 (MPEG)의 변형에 의해 생성되는 트레실화 MPEG를 사용한다. 트레실화 MPEG와의 폴리펩티드의 반응시, 폴리에틸렌 글리콜은 폴리펩티드의 아민 기에 바로 결합된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드-폴리에틸렌 글리콜 접합체는 항체를 2,2,2-트리플루오레오탄 술포닐 기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 분자와 반응시키는 것에 의해 생성된다.
폴리에틸렌 글리콜은 또한 수많은 상이한 개재 링커를 사용하여 폴리펩티드에 결합될 수 있다. 예를 들어, U.S. 특허 5,612,460호는 폴리에틸렌 글리콜을 폴리펩티드에 연결시키기 위한 우레탄 링커에 대해 개시하고 있다. 링커에 의해 폴리에틸렌 글리콜이 폴리펩티드에 결합되어 있는 폴리펩티드-폴리에틸렌 글리콜 접합체는 폴리펩티드의 MPEG-숙신이미딜숙시네이트, 1,1'-카르보닐디이미다졸에 의해 활성화된 MPEG, MPEG-2,4,5-트리클로로페닐카르보네이트, MPEG-p 니트로페놀카르보네이트 및 다양한 MPEG-숙시네이트 유도체들과 같은 화합물과의 반응에 의해 생성될 수도 있다. 폴리에틸렌 글리콜을 폴리펩티드에 결합시키기 위한 수많은 추가적인 폴리에틸렌 글리콜 유도체 및 반응 화학들이 WO 98/32466호에 기술되어 있다.
임의로 각 항체에 결합되는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티의 수 (즉 치환도)는 가변적일 수도 있다. 예를 들어, 페길화 항체는 평균 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20개 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 연결될 수 있다. 마찬가지로, 평균 치환도는 폴리펩티드 분자 당 1-3, 2-4, 3-5, 4-6, 5-7, 6-8, 7-9, 8-10, 9-11, 10-12, 11-13, 12-14, 13-15, 14-16, 15-17, 16-18, 17-19 또는 18-20개 폴리에틸렌 글리콜 모이어티와 같은 범위 이내이다. 치환도의 측정 방법에 대해서는 예를 들어 문헌 [Delgado et al., Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992)]에 논의되어 있다.
다른 예시적인 항체 (그의 항체 단편 또는 변이체 포함)는 이종유래 폴리펩티드 (예컨대 항체 또는 항체 도메인과 관련이 없는 폴리펩티드) 또는 그의 일부에 재조합으로 융합되거나 화학적으로 접합됨으로써 (공유 및 비-공유 접합 모두 포함), 융합 폴리펩티드를 생성시킨다. 융합이 반드시 직접적일 필요는 없으며, 링커 서열을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 특정 세포 표면 항원에 대하여 특이적이거나, 또는 특정 세포 표면 수용체에 결합하는 항원에 결합하는 항체에 이종유래 폴리펩티드를 웅합시키거나 접합시키는 것에 의해, 항체는 시험관내 또는 생체내 중 어느 하나에서 이종유래 폴리펩티드를 특정 세포 유형 (예컨대 암 세포)에 대하여 표적화하는 데에 사용될 수 있다. 예시적인 항체는 또한 비제한적으로 재조합 인간 혈청 알부민 (예컨대 1999년 3월 2일자 허여 U.S. 특허 5,876,969호, EP 특허 0 413 622호, 및 1998년 6월 16일자 허여 U.S. 특허 5,766,883호 참조)을 포함한 알부민에 융합됨으로써 키메라 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 항체 (그의 단편 또는 변이체 포함)는 인간 혈청 알부민의 아미노산 잔기들을 포함하거나 아니면 그것으로 구성되는 폴리펩티드 단편과 융합된다. 한 실시양태에서, 항체 (그의 단편 또는 변이체 포함)는 인간 혈청 알부민의 성숙한 형태 (즉 EP 특허 0 322 094호의 도 1 및 2에 나타낸 바와 같은 인간 혈청 알부민의 아미노산 1-585)와 융합된다.
또한, U.S. 특허 7,521,424호에 기술되어 있는 바와 같이, 알부민 융합 폴리펩티드의 알부민 폴리펩티드 부분에 해당하는 혈청 알부민 폴리펩티드의 단편에는 전체 길이 폴리펩티드는 물론, 참조 폴리펩티드 아미노산 서열의 아미노 말단으로부터 하나 이상의 잔기가 결실된 폴리펩티드 (즉 혈청 알부민, 또는 알부민 융합 폴리펩티드의 혈청 알부민 부분)도 포함된다.
또한, U.S. 특허 7,521,424호에 기술되어 있는 바와 같이, 예시적인 폴리펩티드에는 알부민 융합 단백질의 알부민 단백질 부분에 해당하는 알부민 단백질 아미노산 서열의 카르복시 말단으로부터 하나 이상의 잔기가 결실된 폴리펩티드 (예컨대 혈청 알부민, 또는 알부민 융합 단백질의 알부민 단백질 부분)가 포함된다.
예시적인 항체 (그의 단편 또는 변이체 포함)는 이종유래 폴리펩티드 (예컨대 인간 혈청 알부민 폴리펩티드)의 N- 또는 C-말단 단부 중 어느 하나에 융합될 수 있다. 이종유래 폴리펩티드는 항체의 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인에 융합될 수 있다. 한 실시양태에서, 이종유래 폴리펩티드는 CH1 또는 Cκ 도메인에 융합된다. 또 다른 실시양태에서, 이종유래 폴리펩티드는 CH1 도메인에 융합된다. 한 실시양태에서, 이종유래 폴리펩티드는 인간 혈청 알부민 유래의 것이다. 그와 같은 융합 폴리펩티드는 예를 들어 생체 내에서의 반감기를 증가시킬 수 있다. 이종유래 폴리펩티드에 융합 또는 접합된 항체는 업계에 알려져 있는 방법을 사용한 시험관내 면역검정에 사용될 수도 있다. 예를 들어, PCT 공개 WO 93/21232호; EP 439,095호; 문헌 [Naramura et al., Immunol. Lett. 39:91-99 (1994)]; U.S. 특허 5,474,981호; 문헌 [Gillies et al., PNAS 89:1428-1432 (1992)]; [Fell et al., J. Immunol. 146:2446-2452 (1991)]을 참조한다.
예시적인 폴리펩티드에는 또한 항체 단편에 융합 또는 접합된 이종유래 폴리펩티드를 포함하거나 아니면 그것으로 구성되는 조성물이 포함된다. 예를 들어, 이종유래 폴리펩티드는 Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, F(ab)2 단편, 또는 이들의 일부에 융합 또는 접합될 수 있다. 항체 일부에 폴리펩티드를 융합 또는 접합시키기 위한 방법에 대해서는 업계에 알려져 있다. 예를 들어, U.S. 특허 5,356,603호; 5,622,929호; 5,359,046호; 5,349,053호; 5,447,851호; 5,112,946호; EP 307,434호; EP 367,166호; PCT 공개 WO 96/04388호; WO 91/06570호; 문헌 [Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539 (1991)]; [Zheng et al., J. Immunol. 154:5590-5600 (1995)]; 및 [Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11357-11341 (1992)]을 참조한다.
추가적인 융합 폴리펩티드는 유전자-셔플링(shuffling), 모티프-셔플링, 엑손-셔플링 및/또는 코돈-셔플링 (집합적으로 "DNA 셔플링"으로 지칭됨) 기술을 통하여 생성될 수 있다. DNA 셔플링은 항체 (그의 항체 단편 또는 변이체를 포함하거나 아니면 그것으로 구성되는 분자 포함)의 활성을 조정하는 데에 사용될 수 있는데, 변경된 활성을 갖는 항체 (예컨대 더 높은 친화도 및 더 낮은 해리 속도를 갖는 항체)를 생성시키는 데에 그와 같은 방법이 사용될 수 있다. 일반적으로는, U.S. 특허 5,605,793호; 5,811,238호; 5,830,721호; 5,834,252호; 및 5,837,458호, 및 문헌 [Patten et al., Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-35 (1997)]; [Harayama, Trends Biotechnol. 16(2):76-82 (1998)]; [Hansson, et al., J. Mol. Biol. 287:265-76 (1999)]; 및 [Lorenzo and Blasco, Biotechniques 24(2):308-13 (1998)]을 참조한다. 한 실시양태에서, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 재조합 전에 오류-빈발(error-prone) PCR, 무작위 뉴클레오티드 삽입 또는 기타 방법에 의한 무작위 돌연변이유발에 적용되는 것에 의해 변경될 수 있다.
예시적인 폴리펩티드에는 또한 진단제 또는 치료제에 접합된 항체 (그의 항체 단편 또는 변이체 포함)가 포괄된다. 상기 항체는 예를 들어 주어진 치료 요법의 효능을 측정하기 위한 임상 시험 절차의 일부로서 종양의 발생 또는 진행을 모니터링 또는 예지하는 데에 진단용으로 사용될 수 있다. 검출은 항체를 검출가능한 물질에 커플링시키는 것에 의해 용이해질 수 있다. 검출가능 물질의 예에는 다양한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사성 물질, 다양한 양전자 방출 단층촬영을 사용하는 양전자 방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 검출가능 물질은 업계에 알려져 있는 기술을 사용하여 항체에 바로, 또는 중간물 (예를 들자면 업계에 알려져 있는 링커)을 통한 간접적인 것 중 어느 하나로 커플링 또는 접합될 수 있다. 진단제로 사용하기 위하여 항체에 접합될 수 있는 금속 이온에 대해서는 예를 들어 U.S. 특허 4,741,900호를 참조한다. 적합한 효소의 예에는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니며; 적합한 보결분자단 복합체의 예에는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니고; 적합한 형광 물질의 예에는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니며; 발광 물질의 예에는 루미놀이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니고; 생물발광 물질의 예에는 루시페라제, 루시페린 및 아에쿠오린이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니며; 적합한 방사성 물질의 예에는 아이오딘 (121I, 123I, 125I, 131I), 탄소 (14C), 황 (35S), 삼중수소 (3H), 인듐 (111In, 112In, 113 mIn, 115 mIn), 테크네튬 (99Tc, 99 mTc), 탈륨 (201Ti), 갈륨 (68Ga, 67Ga), 팔라듐 (103Pd), 몰리브데넘 (99Mo), 크세논 (135Xe), 플루오린 (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh 및 97Ru가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 항체 (그의 항체 단편 또는 변이체를 포함하거나 아니면 그것으로 구성되는 scFv 또는 기타 분자 포함)는 치료용 모이어티, 예컨대 세포독소, 예컨대 세포증식억제제 또는 살세포제, 치료제 또는 방사성 금속 이온, 예컨대 알파-방출제 예를 들자면 213Bi, 또는 기타 방사성동원소 예를 들자면 103Pd, 135Xe, 131I, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 35S, 90Y, 153Sm, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, 90Y, 117Tin, 186Re, 188Re 또는 166Ho에 커플링 또는 접합된다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 단편은 비제한적으로 177Lu, 90Y, 166Ho, 및 153Sm을 포함한 방사성금속 이온을 폴리펩티드에 킬레이팅하는 거대고리형 킬레이팅제에 결합된다. 특정 실시양태에서, 상기 거대고리형 킬레이팅제는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N"'-테트라아세트산 (DOTA)이다. 다른 특정 실시양태에서, DOTA가 링커 분자를 통하여 항체 또는 그의 단편에 결합된다. DOTA를 폴리펩티드에 접합시키는 데에 유용한 링커 분자의 예에 대해서는 업계에 보편적으로 알려져 있는데; 예를 들어 문헌 [DeNardo et al., Clin Cancer Res. 4(10):2483-90, 1998]; [Peterson et al., Bioconjug. Chem. 10(4):553-7, 1999]; 및 [Zimmerman et al., Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50, 1999]을 참조한다.
세포독소 또는 세포독성제에는 세포에 유해한 임의의 작용제가 포함된다. 그 예에는 파클리탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 티미딘 키나제, 엔도뉴클레아제, RNAse 및 퓨로마이신, 및 이들의 단편, 변이체 또는 상동체가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 치료제에는 항대사물질 (예컨대 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예컨대 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스디클로로디아민 백금(II) (DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린 (예컨대 다우노루비신 (구 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (예컨대 닥티노마이신 (구 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신 (AMC)), 및 항-유사분열제 (예컨대 빈크리스틴 및 빈블라스틴)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
항체를 표지하는 데에는 업계에 알려져 있는 기술들이 적용될 수 있다. 그와 같은 기술에는 이관능성 접합제의 사용 (예컨대 U.S. 특허 5,756,065호; 5,714,711호; 5,696,239호; 5,652,371호; 5,505,931호; 5,489,425호; 5,435,990호; 5,428,139호; 5,342,604호; 5,274,119호; 4,994,560호; 및 5,808,003호 참조) 및 직접 커플링 반응 (예컨대 볼튼-헌터(Bolton-Hunter) 및 클로라민(Chloramine)-T 반응)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
치료제 또는 약물 모이어티가 전통적인 화학 치료제에 제한되는 것으로 간주되어서는 아니 된다. 예를 들어, 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩티드일 수 있다. 그와 같은 폴리펩티드에는 예를 들어 독소 예컨대 아브린, 리신 A, 알파 독소, 슈도모나스 외독소, 또는 디프테리아 독소, 사포린, 모모르딘, 젤로닌, 억새풀 항바이러스 단백질, 알파-사르신 및 콜레라 독소; 단백질 예컨대 종양 괴사 인자, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성화제, 세포자멸사 작용제, 예컨대 TNF-알파 (TNF-α), TNF-베타, AIM I (WO 97/35899호), AIM II (WO 97/34911호), Fas 리간드 (문헌 [Takahashi et al., Int. Immunol, 6:1567-1574 (1994)]), VEGI (WO 99/23105호), 혈전 작용제 또는 항-혈관형성제, 예컨대 안지오스타틴 또는 엔도스타틴; 또는 생물학적 반응 변형제 예를 들자면 림포카인, 인터류킨-1 (IL-1), 인터류킨-2 (IL-2), 인터류킨-6 (IL-6), 과립구 포식세포 집락 자극 인자 (GM-CSF), 과립구 집락 자극 인자 (G-CSF), 또는 기타 성장 인자가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
치료 모이어티를 항체에 접합시키는 기술에 대해서는 잘 알려져 있다. 이와 같은 접합은 항체가 정제되기 전 또는 후에 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al., (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)]; [Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al., (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)]; [Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al., (eds.), pp. 475-506 (1985)]; ["Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al., (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)], 및 [Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58 (1982)]을 참조한다.
다르게는, 항체는 제2 항체에 접합됨으로써, 세갈(Segal)의 U.S. 특허 4,676,980호에 기술되어 있는 바와 같은 항체 이종접합체를 형성할 수 있다.
또한, 항체는 예를 들어 비제한적으로 N-연결 또는 O-연결 탄수화물 쇄, N-말단 또는 C-말단 단부의 프로세싱, 아미노산 백본에 대한 화학 모이어티의 결합, N-연결 또는 O-연결 탄수화물 쇄의 화학적 변형, 및 원핵생물 숙주 세포 발현의 결과로서의 N-말단 메티오닌 잔기의 첨가 또는 결실을 포함한 번역-후 변형에 의해 임의로 변형될 수 있다. 변형에는 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 결합, 헴 모이어티의 공유 결합, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 결합, 지질 또는 지질 유도체의 공유 결합, 포스파티딜이노시톨의 공유 결합, 가교-결합, 고리화, 디술피드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교-결합의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 아이오딘화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 페길화, 단백질분해 프로세싱, 인산화, 프레닐화, 라세미체화, 셀레노일화, 황산화, 아르기닐화와 같은 폴리펩티드에의 전달 RNA 매개 아미노산 첨가, 및 유비퀴틴화가 포함될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993)]; [Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983)]; [Seifter et al., Meth Enzymol 182:626-646 (1990)]; [Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48-62 (1992)] 참조). 주어진 항체의 수개 부위에서 동일하거나 가변적인 정도로 동일 유형의 변형이 존재할 수 있다는 것은 알고 있을 것이다. 또한, 주어진 항체가 많은 유형의 변형들을 함유할 수도 있다.
예시적인 항체 제조 방법
본원에서 기술되는 정제 방법에 사용하기 위한 항체는 하기의 항체 제조 방법들 중 어느 것과 같은 임의의 표준 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
파지 디스플레이법에서는, 기능성 항체 도메인들이 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 보유하는 파지 입자의 표면에 디스플레이된다. 특히, 동물 cDNA 라이브러리 (예컨대 림프 조직의 인간 또는 뮤린 cDNA 라이브러리) 또는 합성 cDNA 라이브러리로부터 VH 및 VL 도메인을 코딩하는 DNA 서열이 증폭된다. VH 및 VL 도메인을 코딩하는 상기 DNA는 PCR에 의해 scFv 링커로 서로 연결된 후, 파지미드(phagemid) 벡터 (예컨대 pCANTAB 6 또는 pComb 3 HSS)에 클로닝된다. 상기 벡터는 이. 콜라이(E. coli)로 전기천공되며, 이. 콜라이는 헬퍼 파지에 의해 감염된다. 이러한 방법에 사용되는 파지는 통상적으로 fd 및 M13을 포함한 필라멘트형 파지로써, VH 및 VL 도메인은 보통 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 중 어느 하나에 재조합으로 융합된다. 대상 항원에 결합하는 항원 결합 도메인을 발현하는 파지는 항원, 예컨대 표지된 항원, 또는 고체 표면 또는 비드에 결합 또는 포획된 항원을 사용하여 선택 또는 식별될 수 있다. 항체를 제조하는 데에 사용될 수 있는 파지 디스플레이법의 예에는 문헌 [Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995)]; [Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995)]; [Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994)]; [Persic et al., Gene 187 9-18 (1997)]; [Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994)]; PCT 출원 PCT/GB91/01134호; WO 90/02809호; WO 91/10737호; WO 92/01047호; WO 92/18719호; WO 93/11236호; WO 95/15982호; WO 95/20401호; W0 97/13844호; 및 U.S. 특허 5,698,426호; 5,223,409호; 5,403,484호; 5,580,717호; 5,427,908호; 5,750,753호; 5,821,047호; 5,571,698호; 5,427,908호; 5,516,717호; 5,780,225호; 5,658,727호; 5,735,743호 및 5,969,108호에 개시되어 있는 것들이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
항체의 시험관내 친화도 성숙(affinity maturation)과 같은 일부 용도의 경우에는, 파지 디스플레이 라이브러리에서 하나 이상의 VH 및 VL 도메인을 단일 쇄 항체 또는 Fab 단편으로 발현하는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 향상된 친화도 또는 향상된 탈락률(off rate)과 같은 바람직한 결합 특성을 갖는 VH/VL 조합의 선택을 가능케 하도록, 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 모든 가능합 조합으로 VH 및 VL 도메인을 코딩하는 cDNA가 발현될 수 있다. 또한, VH 및 VL 분절 (예컨대 VH 및 VL 도메인의 CDR 영역)이 시험관 내에서 돌연변이될 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리에서의 "돌연변이" CDR을 갖는 VH 및 VL 도메인의 발현은 향상된 친화도 또는 향상된 탈락률과 같은 바람직한 결합 특성을 갖는 VH/VL 조합의 선택을 가능케 한다. 항체 (항체 단편 또는 변이체 포함)는 업계에 알려져 있는 어떠한 방법에 의해서도 제조될 수 있다. 예를 들어, 하이브리도마 세포주가 아닌 다른 세포주에서 항체가 발현될 수 있다는 것은 알고 있을 것이다. 특정 항체에 대한 cDNA 또는 게놈 클론을 코딩하고 있는 서열은 예를 들어 적합한 포유동물 또는 비포유동물 숙주 세포의 형질전환에, 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 생성시키는 데에 사용될 수 있다. 또한, 항체는 화학적으로 합성되거나, 또는 재조합 발현 시스템의 사용을 통하여 제조될 수 있다.
항체를 제조하는 한 가지 방법은 VH 및/또는 VL 도메인을 클로닝하는 것일 수 있다. 하이브리도마 세포주로부터 VH 및 VL 도메인을 단리하기 위하여, VH 또는 VL 뉴클레오티드 서열에 대하여 상보성인 PCR 프라이머가 하이브리도마 세포주로부터 단리되는 총 RNA에 함유되어 있는 VH 및 VL 서열을 증폭하는 데에 사용될 수 있다. 다음에는, PCR 생성물이 예를 들어 PCR 생성물의 5' 및 3' 말단에 첨가되는 오버행잉 단일 아데닌 뉴클레오티드에 대하여 상보성인 5' 및 3' 단일 T 뉴클레오티드 오버행으로 구성되는 PCR 생성물 클로닝 부위를 갖는 벡터를 사용하여, PCR 반응에 사용되는 많은 DNA 폴리머라제에 의해 클로닝될 수 있다. 다음에는, 업계에 알려져 있는 통상적인 방법을 사용하여, VH 및 VL 도메인이 서열분석될 수 있다. 다르게는, 전체 scFv(VH 도메인, 링커 및 VL 도메인)를 증폭하도록 설계된 벡터 특이적 프라이머를 사용하여 VH 및 VL 도메인이 증폭될 수 있다.
클로닝된 VH 및 VL 유전자는 1종 이상의 적합한 발현 벡터에 위치될 수 있다. 비-제한적 예로써, VH 또는 VL 뉴클레오티드 서열, 제한 부위, 및 제한 부위를 보호하는 플랭킹 서열을 포함하는 PCR 프라이머가 VH 또는 VL 서열을 증폭하는 데에 사용될 수 있다. 업계 숙련자에게 알려져 있는 클로닝 기술을 이용하여, 적절한 이뮤노글로불린 불변 영역, 예컨대 각각 VH 도메인의 경우 인간 IgG1 또는 IgG4 불변 영역을, 그리고 카파 및 람다 VL 도메인의 경우 인간 카파 또는 람다 불변 영역을 발현하는 벡터에 PCR 증폭된 VH 도메인이 클로닝될 수 있다. 바람직하게는, VH 또는 VL 도메인을 발현하기 위한 벡터는 선택된 발현 시스템에서의 중쇄 및 경쇄의 직접 발현에 적합한 프로모터, 분비 신호, 이뮤노글로불린 가변 도메인을 위한 클로닝 부위, 이뮤노글로불린 불변 도메인, 및 선택 마커 예컨대 네오마이신을 포함한다. VH 및 VL 도메인은 필요한 불변 영역을 발현하는 단일 벡터에 클로닝될 수도 있다. 다음에는, 업계 숙련자에게 알려져 있는 기술을 사용하여 중쇄 전환 벡터 및 경쇄 전환 벡터가 세포주에 공동-형질감염됨으로써, 전체-길이 항체 예컨대 IgG를 발현하는 안정하거나 일시적인 세포주를 생성시킨다 (예를 들어 문헌 [Guo et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 82:925-31 (1997)], 및 [Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-86 (1995)] 참조).
항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 수득된 후에는, 업계에 알려져 있는 임의의 방법에 의해 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 확인될 수 있다. 해당 VH 도메인, VL 도메인 및 CDR의 아미노산 서열이 알려져 있는 경우, 이러한 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 업계에 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 확인될 수 있는데, 다시 말하자면, 항체를 코딩하는 핵산을 생성하는 방식으로 특정 아미노산을 코딩하는 것으로 알려져 있는 뉴클레오티드 코돈이 조립된다. 항체를 코딩하는 그와 같은 폴리뉴클레오티드는 (예컨대 문헌 [Kutmeier et al., BioTechniques 17:242 (1994)]에 기술되어 있는 바와 같이) 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드로부터 조립될 수 있는데, 간단하게 말하자면, 항체를 코딩하는 서열의 일부를 함유하는 중첩 올리고뉴클레오티드의 합성, 상기 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 라이게이팅, 그리고 이후의 PCR에 의한 라이게이팅된 올리고뉴클레오티드의 증폭을 포함한다.
다르게는, 항체 (그의 항체 단편 또는 변이체를 포함하거나 아니면 그것으로 구성되는 분자 포함)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 적합한 공급원 유래의 핵산으로부터 생성될 수 있다. 특정 항체를 코딩하는 핵산을 함유하는 클론은 가용하지 않으나 항체 분자의 서열이 알려져 있는 경우에는, 예컨대 항체를 코딩하는 cDNA 라이브러리로부터의 cDNA 클론을 식별하기 위하여, 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성화가능한 합성 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의해, 또는 특정 유전자 서열에 대하여 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용한 클로닝에 의해, 이뮤노글로불린을 코딩하는 핵산이 화학적으로 합성되거나 적합한 공급원 (예컨대 항체 cDNA 라이브러리, 또는 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포, 예컨대 항체를 발현하는 하이브리도마 세포 또는 엡스타인 바르(Epstein Barr) 바이러스 형질전환 B 세포주로부터 생성된 cDNA 라이브러리, 또는 그로부터 단리된 핵산, 바람직하게는 폴리 A + RNA)으로부터 수득될 수 있다. 다음에, PCR에 의해 생성된 증폭된 핵산은 업계에 잘 알려져 있는 임의의 방법을 사용하여 복제가능한 클로닝 벡터로 클로닝될 수 있다.
일단 항체 (그의 항체 단편 또는 변이체를 포함하거나 아니면 그것으로 구성되는 분자 포함)의 뉴클레오티드 서열이 확인되고 나면, 항체의 뉴클레오티드 서열은 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체를 생성시키기 위하여, 예를 들어 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 생성시키기 위하여, 뉴클레오티드 서열 조작용으로 업계에 잘 알려져 있는 방법, 예컨대 재조합 DNA 기술, 부위 지정 돌연변이유발, PCR 등 (예를 들어 문헌 [Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY] 및 [Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY]에 기술되어 있는 기술 참조)을 사용하여 조작될 수 있다.
특정 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄의 VH 및 VL 도메인, 또는 이들의 단편 또는 변이체 중 하나 이상이 업계에 알려져 있는 재조합 DNA 기술을 사용하여 항체 프레임워크 영역 내에 삽입된다. 특정 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄의 CDR, 또는 이들의 단편 또는 변이체 중 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상이 업계에 알려져 있는 재조합 DNA 기술을 사용하여 항체 프레임워크 영역 내에 삽입된다. 상기 프레임워크 영역은 자연 발생 또는 공통 항체 프레임워크 영역, 바람직하게는 인간 항체 프레임워크 영역일 수 있다 (인간 항체 프레임워크 영역의 목록은 예컨대 문헌 [Chothia et al., J. Mol. Biol. 278:457-479 (1998)] 참조). 바람직하게는, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 또는 항체 단편의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 프레임워크 영역 내에서 제조될 수 있는데, 바람직하게는 상기 아미노산 치환은 해당 항원에 대한 항체의 결합을 유의하게 변경시키지 않는다. 또한, 그와 같은 방법은 하나 이상의 쇄간 디술피드 결합이 결핍되어 있는 항체 분자, 또는 항체 단편 또는 변이체를 생성시키기 위하여, 쇄간 디술피드 결합에 참여하는 하나 이상 가변 영역 시스테인 잔기의 아미노산 치환 또는 결실을 구성하는 데에 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 기타 변경들은 업계 일반의 기술에 속한다.
일부 실시양태에서, 하이브리도마 기술을 사용하여 모노클로날 항체가 제조된다 (문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]; [Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976)]; [Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976)]; [Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 571-681 (1981)]; [Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994)]). 간단하게 말하자면, 관심 폴리펩티드를 사용하여 제노마우스(XenoMouse)™ 마우스가 면역화될 수 있다. 면역화 후에는, 해당 마우스의 비장세포가 추출되어, 적합한 골수종 세포주와 융합된다. 어떠한 적합한 골수종 세포주도 본 발명에 따라 사용될 수 있으나; ATCC™로부터 입수가능한 모 골수종 세포주 (SP2O)를 사용하는 것이 바람직하다. 융합 후, 생성되는 하이브리도마 세포는 HAT 배지에서 선택적으로 유지된 다음, 문헌 [Wands et al., (Gastroenterology 80:225-232 (1981))]에 기술되어 있는 바와 같이 제한 희석에 의해 클로닝된다. 다음에, 그와 같은 선택을 통하여 수득된 하이브리도마 세포는 항체를 분비하는 클론을 식별하기 위하여 검정된다.
인간에서의 항체의 생체내 사용 및 시험관내 검출 검정을 포함한 일부 용도에 있어서는, 인간 또는 키메라 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 인간 환자의 치료적 치료에는 완전 인간 항체가 특히 바람직하다. 일부 실시양태에서, 제노마우스™ 균주가 인간 항체를 제조하는 데에 사용된다. 문헌 [Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994)]을 참조한다. U.S. 특허 4,444,887호 및 4,716,111호; 및 WO 98/46645호, WO 98/50435호, WO 98/24893호, W0 98/16654호, WO 96/34096호, WO 96/35735호 및 WO 91/10741호도 참조한다.
키메라 항체는 항체의 상이한 부분들이 상이한 이뮤노글로불린 분자로부터 유래하는 분자, 예컨대 인간 항체로부터 유래하는 가변 영역, 및 비-인간 (예컨대 뮤린) 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 그 반대를 갖는 항체이다. 키메라 항체를 제조하는 방법에 대해서는 업계에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Morrison, Science 229:1202 (1985)]; [Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986)]; [Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191-202 (1989)]; U.S. 특허 5,807,715호; 4,816,567호; 및 4,816,397호를 참조한다. 예를 들어 CDR-그라프팅 (EP 239,400호; WO 91/09967호; U.S. 특허 5,225,539호; 5,530,101호; 및 5,585,089호), 베니어링(veneering) 또는 리서페이싱(resurfacing) (EP 592,106호; EP 519,596호; 문헌 [Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991)]; [Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994)]; [Roguska et al., PNAS 91:969-973 (1994)]), 및 쇄 셔플링 (U.S. 특허 5,565,352호)를 포함한 업계에 알려져 있는 다양한 기술들을 사용하여, 인간 종으로부터의 하나 이상의 CDR 및 비-인간 이뮤노글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역 (예컨대 뮤린, 개 또는 고양이 이뮤노글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역) (또는 그 반대)을 포함하는 키메라 항체가 제조될 수 있다. 종종, 프레임워크 영역의 프레임워크 잔기는 항원 결합을 변경, 바람직하게는 향상시키기 위하여, CDR 공여자 항체로부터의 상응하는 잔기에 의해 치환된다. 이러한 프레임워크 치환은 업계에 잘 알려져 있는 방법에 의해, 예를 들어 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 CDR과 프레임워크 잔기의 상호작용의 모델링, 및 특정 위치에서의 보통 프레임워크 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해 확인된다 (예컨대 퀸(Queen) 등의 U.S. 특허 5,585,089호; 문헌 [Riechmann et al., Nature 352:323 (1988)] 참조).
인트라바디는 재조합 핵산 분자로부터 발현되며 세포내에서 유지되도록 (예컨대 세포질, 내형질 세망(endoplasmic reticulum) 또는 주변세포질에서 유지되도록) 조작된 항체, 종종 scFv이다. 인트라바디는 예를 들어 인트라바디가 결합하는 폴리펩티드의 기능을 제거하는 데에 사용될 수 있다. 인트라바디의 발현은 인트라바디를 포함하는 핵산 발현 벡터에서의 유도가능 프로모터의 사용을 통하여 조절될 수도 있다. 예시적인 인트라바디는 업계에 알려져 있는 방법, 예컨대 문헌 [Chen et al., Hum. Gene Ther. 5:595-601 (1994)]; [Marasco, W.A., Gene Ther. 4:11-15 (1997)]; [Rondon and Marasco, Annu. Rev. Microbiol. 51:257-283 (1997)]; [Proba et al., J. Mol. Biol. 275:245-253 (1998)]; [Cohen et al., Oncogene 17:2445-2456 (1998)]; [Ohage and Steipe, J. Mol. Biol. 291:1119-1128 (1999)]; [Ohage et al., J. Mol. Biol. 291:1129-1134 (1999)]; [Wirtz and Steipe, Protein Sci. 8:2245-2250 (1999)]; [Zhu et al., J. Immunol. Methods 231:207-222 (1999)]; 및 거기에 인용되어 있는 참고문헌들에 개시 및 고찰되어 있는 것들을 사용하여 제조될 수 있다.
관심 폴리펩티드를 제조하기 위한 예시적인 발현 시스템
본 발명의 방법을 사용하여 정제될 수 있는 관심 폴리펩티드를 제조하는 데에는 표준 발현 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 통상적으로 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터(들)의 구성을 포함한다. 벡터는 항체 분자의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며 (예컨대 WO 86/05807호; WO 89/01036호; 및 U.S. 특허 5,122,464호 참조), 전체 중쇄, 전체 경쇄, 또는 전체 중쇄 및 경쇄 모두의 발현을 위하여, 항체의 가변 도메인이 그와 같은 벡터에 클로닝될 수 있다.
상기 발현 벡터(들)는 통상적인 기술에 의해 숙주 세포로 전달되며, 이후 관심 폴리펩티드를 제조하기 위한 통상적인 기술에 의해 형질감염된 세포가 배양된다. 한 실시양태에서, 항체 단편의 발현을 위하여, 중쇄 및 경쇄 모두를 코딩하는 벡터가 항체 단편 발현용 숙주 세포에서 공동-발현될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 전체 항체 분자의 발현을 위하여, 중쇄 및 경쇄 모두를 코딩하는 벡터가 하기에 상술하는 바와 같은 전체 이뮤노글로불린 분자 발현용 숙주 세포에서 공동-발현될 수 있다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템들이 관심 폴리펩티드를 발현시키는 데에 이용될 수 있다. 그와 같은 숙주-발현 시스템은 관심 코딩 서열이 생성되고 이후에 정제될 수 있는 비히클을 나타냄은 물론, 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열에 의해 형질전환되거나 형질감염될 경우 제자리에서 폴리펩티드를 발현할 수 있는 세포를 나타내기도 한다. 여기에는 항체 단편 또는 그의 변이체 (단일 쇄 항체)를 발현하도록 조작된 박테리오파지 입자; 폴리펩티드 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오바지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터에 의해 형질전환된 세균 (예컨대 이. 콜라이, 비. 서브틸리스(B. subtilis))과 같은 미생물; 폴리펩티드 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터에 의해 형질전환된 효모 (예컨대 사카로미세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia)); 폴리펩티드 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예컨대 바큘로바이러스)에 의해 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터 (예컨대 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)를 사용하여 감염되거나, 또는 폴리펩티드 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예컨대 Ti 플라스미드)를 사용하여 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 (예컨대 메탈로티오네인 프로모터), 또는 포유동물 바이러스로부터 (예컨대 아데노바이러스 레이트 프로모터(late promoter), 박시니아 바이러스 7.5 K 프로모터) 유래하는 프로모터를 함유하는 재조합 발현 구축물을 보유하는 포유동물 세포 시스템 (예컨대 COS, CHO, BHK, 293 또는 3T3 세포)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 에스케리키아 콜라이와 같은 세균 세포, 또는 진핵 세포가 재조합 폴리펩티드의 발현에 사용된다. 예를 들어, 강한 프로모터를 갖는 벡터와 함께인 중국 햄스터 난소 세포 (CHO)와 같은 포유동물 세포가 폴리펩티드를 위한 효과적인 발현 시스템이다 (문헌 [Foecking et al., Gene 45:101 (1986)]; [Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)]; [Bebbington et al., Bio/Techniques 10:169 (1992)]; [Keen and Hale, Cytotechnology 18:207 (1996)]).
세균 시스템에서는, 발현되는 관심 폴리펩티드에 대하여 예정된 용도에 따라 수많은 발현 벡터가 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 관심 폴리펩티드의 제약 조성물의 생성을 위하여 대량의 그와 같은 폴리펩티드가 제조되어야 하는 경우, 용이하게 정제되는 고농도의 융합 폴리펩티드 생성물 발현을 유도하는 벡터가 바람직할 수 있다. 그와 같은 벡터에는 폴리펩티드 코딩 서열이 lacZ 코딩 영역과 구조에 맞게(in frame) 개별적으로 벡터에 라이게이팅됨으로써 융합 폴리펩티드가 생성될 수 있는 이. 콜라이 발현 벡터 pUR278 (문헌 [Ruther et al., EMBO 1. 2:1791 (1983)]); pIN 벡터 (문헌 [Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985)]; [Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)]) 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. pGEX 벡터 역시 글루타치온 5-트랜스퍼라제 (GST)와의 융합 폴리펩티드로서 외래 폴리펩티드를 발현하는 데에 사용될 수 있다. 일반적으로, 이와 같은 융합 폴리펩티드는 가용성이어서, 매트릭스 글루타치온 아가로스 비드에의 흡착 및 결합 후 이어지는 유리 글루타치온 존재하에서의 용리에 의해 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함함으로써 클로닝된 표적 유전자 생성물이 GST 모이어티로부터 방출될 수 있도록 설계된다.
곤충 시스템에서는, 오토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 다각체형 바이러스 (AcNPV)가 외래 유전자를 발현하는 벡터로 사용될 수 있다. 상기 바이러스는 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 항체 코딩 서열은 개별적으로 바이러스의 비-필수 영역 (예를 들어 다각체 유전자)에 클로닝된 후, AcNPV 프로모터 (예를 들어 다각체 프로모터)의 조절하에 위치될 수 있다.
포유동물 숙주 세포에서는, 수많은 바이러스-기반 발현 시스템들이 이용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로 사용되는 경우, 관심 폴리펩티드 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/번역 조절 복합체, 예컨대 레이트 프로모터 및 트리파르타이트 리더(tripartite leader) 서열에 라이게이팅될 수 있다. 다음에, 이 키메라 유전자는 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스 게놈의 비-필수 영역 (예컨대 영역 E1 또는 E3)에서의 삽입은 감염된 숙주에서 생존가능하며 항체 분자를 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 생성시킨다 (예컨대 문헌 [Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359 (1984)] 참조). 삽입된 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해서는, 특정 개시 신호가 필요할 수도 있다. 이러한 신호에는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열들이 포함된다. 또한, 전체 삽입물의 번역을 보장하기 위해서는, 개시 코돈이 원하는 코딩 서열의 리딩 프레임과 동위에 있어야 한다. 이러한 외인성 번역 조절 신호 및 개시 코돈은 자연 및 합성 모두인 다양한 기원의 것일 수 있다. 발현의 효율은 적절한 전사 인핸서 요소, 전자 종료자 등의 포함에 의해 강화될 수 있다 (예컨대 문헌 [Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)] 참조).
또한, 삽입된 서열의 발현을 조정하거나, 또는 원하는 특정 양식으로 유전자 생성물을 변형 또는 프로세싱하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 폴리펩티드 생성물의 그와 같은 변형 (예컨대 글리코실화) 및 프로세싱 (예컨대 절단)은 폴리펩티드의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포들은 폴리펩티드 및 유전자 생성물의 번역-후 프로세싱 및 변형을 위한 특징적이며 특별한 기작을 가지고 있다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현되는 외래 폴리펩티드의 올바른 변형 및 프로세싱을 보장하도록 선택될 수 있다. 이를 위해서는, 일차 전사물의 적정한 프로세싱, 글리코실화 및 유전자 생성물의 인산화를 위한 세포 기구들을 보유하는 진핵생물 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이와 같은 포유동물 숙주 세포에는 CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, 특히 예를 들어 BT483, Hs578T, HTB2, BT2O 및 T47D와 같은 유방암 세포주, 및 예를 들어 CRL7O3O 및 HsS78Bst와 같은 정상 포유동물 선 세포주가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
재조합 폴리펩티드의 장기 고-수율 생산을 위해서는, 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 폴리펩티드를 안정하게 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 바이러스 복제 기원을 함유하는 발현 벡터를 사용하기 보다는, 적절한 발현 조절 요소 (예컨대 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종료자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택가능한 마커에 의해 조절되는 DNA를 사용하여 숙주 세포가 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 조작된 세포는 보강 배지 중에서 1-2일 동안 성장된 다음, 선택 배지로 교체될 수 있다. 재조합 플라스미드 중 선택가능한 마커는 선택에 대한 내성을 부여함으로써, 세포가 플라스미드를 안정하게 그의 염색체로 통합시켜 이후 세포주로 클로닝 및 팽창될 수 있는 중심을 형성하도록 성장하는 것을 가능케 한다. 이와 같은 방법은 관심 폴리펩티드를 발현하는 세포주를 조작하는 데에 유리하게 사용될 수 있다. 그와 같이 조작된 세포주는 관심 폴리펩티드와 직간접적으로 상호작용하는 조성물의 스크리닝 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
비제한적으로 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 (문헌 [Wigler et al., Cell 11:223 (1977)]), 히포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (문헌 [Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)]), 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (문헌 [Lowy et al., Cell 22:817 (1980)]) 유전자를 포함한 수많은 선택 시스템들이 사용될 수 있는데, 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에서 사용될 수 있다. 또한, 항대사물질 내성이 하기 유전자들에 대한 선택의 기준으로 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr (문헌 [Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980)]; [O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)]); 미코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt (문헌 [Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)]); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo (문헌 [Clinical Pharmacy 12:488-505]; [Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991)]; [Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993)]; [Mulligan, Science 260:926-932 (1993)]; 및 [Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); TIB TECH 11(5):155-215 (May, 1993)]); 및 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro (문헌 [Santerre et al., Gene 30:147 (1984)]). 재조합 DNA 기술 업계에 통상적으로 알려져 있는 방법들이 원하는 재조합 클론을 선택하는 데에 일상적으로 적용될 수 있는데, 그와 같은 방법들에 대해서는 예를 들어 문헌 [Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)]; [Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)]; 및 [Chapters 12 and 13, Dracopoli et al., (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994)]; [Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981)]에 기술되어 있다.
관심 폴리펩티드의 발현 농도는 벡터 증폭에 의해 증가될 수 있다 (고찰을 위해서는, 문헌 [Bebbington and Hentschel, "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells" in DNA Cloning, Vol.3. (Academic Press, New York, 1987)] 참조). 벡터 시스템 중 마커가 증폭가능한 경우에는, 숙주 세포 배양액에 존재하는 억제제 농도의 증가가 마커 유전자 사본의 수를 증가시킨다. 증폭되는 영역은 폴리펩티드의 코딩 서열과 연관되어 있기 때문에, 폴리펩티드의 생성 역시 증가하게 된다 (문헌 [Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983)]).
일단 관심 폴리펩티드가 재조합으로 발현되고 나면, 본 발명의 방법에 의해 그것이 정제될 수 있다.
실시예
전적으로 본 발명의 예시를 목적으로 하는 것이며 그에 따라 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 아니 되는 실시예로써, 역시 상기에서 논의된 본 발명의 측면 및 실시양태들을 기술 및 상술한다. 다르게 표시되지 않는 한, 압력은 대기압 또는 그 부근이다. 전기의 예 및 상세할 설명은 제한으로써가 아닌 예시 목적으로 제공된 것이다. 본 명세서에서 인용되는 모든 공개, 특허 출원, 특허, 잡지 논문 또는 기타 문헌들은 각 개별 공개, 특허 출원, 특허, 잡지 논문 또는 기타 문헌들이 구체적이고도 개별적으로 그 전체가 참조로써 개재되는 것으로 표시된 것처럼 본원에 참조로써 개재된다. 특히, 본원에서 인용되는 모든 공개는 명시적으로 본 발명과 함께 사용될 수 있는 조성물 및 방법론을 기술 및 개시할 목적으로 본원에 참조로써 개재된다. 전기한 본 발명이 이해를 명확히 하기 위한 목적의 예시 및 예에 의해 약간 상세하게 기술되기는 하였지만, 업계 일반의 숙련자라면 본 발명의 교시에 비추어, 첨부된 청구범위의 기술사상 또는 영역에서 벗어나지 않고도 그에 대해 특정 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 것을 쉽게 알 수 있을 것이다.
실시예 1: 항체 제조
하기의 실시예는 예시적인 대규모 항체 제조 방법 (U.S. 특허 7,064,189호)에 대해 기술한다. 업계 숙련자라면, 하기하는 프로토콜에 대한 일상적인 변형에 대해 알고 있을 것이다.
세포 배양 규모-증대 및 항체 제조
세포 해동시부터 제조 생물반응기로의 규모-증대시까지 무-혈청 및 무-동물 공급원 성장 배지를 사용한다. 배지는 사용시까지 2-8℃에서 저장한다.
MCB 바이알(들)로부터의 세포의 해동
수조에서 37℃로, 대략 16×106개의 세포를 해동시킨다. 세포를 T-225 배양 플라스크(들)로 옮겨, 대략 3.0×105 세포/mL의 접종 밀도를 갖는 대략 50 mL의 작용 부피를 생성한다. 다음에, 배양 플라스크(들)을 5%의 CO2를 포함하는 37℃의 가습 CO2 인큐베이터에 4일 동안 위치시킨다.
스피너 플라스크에서의 배양액의 일차 확대(들)
배양액을 무균으로 500 mL 스피너 플라스크로 확대함으로써, 대략 2.2×105 세포/mL 접종 세포 밀도의 대략 300 mL 작용 부피를 생성한다. 다음에, 스피너 플라스크를 5%의 CO2를 포함하는 37℃의 가습 CO2 인큐베이터 내 자석 교반기에 4일 동안 위치시킨다. 스피너 플라스크의 교반 속도는 80 rpm이다.
배양액을 다시 무균으로 1개 3000 mL 스피너 플라스크로 확대함으로써, 대략 2.2×105 세포/mL 접종 세포 밀도의 대략 1500 mL 작용 부피를 생성한다. 다음에, 스피너 플라스크를 5%의 CO2를 포함하는 37℃의 가습 CO2 인큐베이터 내 자석 교반기에 4일 동안 위치시킨다. 스피너 플라스크의 교반 속도는 80 rpm이다. 시드(seed) 생물반응기를 접종하기에 충분한 양의 세포 배양물이 축적되면, 다음 단계로 진행한다. 그렇지 않을 경우, 시드 생물반응기를 접종하기에 충분한 양의 세포 배양물이 축적될 때까지 총 3 내지 4회 확대 동안 배양액을 다수의 3000 mL 스피너 플라스크로 무균으로 확대한다.
시드 배양
시드 생물반응기에는 2개의 혼합용 임펠러, 용존 산소 프로브, 온도 프로브, pH 프로브, 무균 샘플링(aseptic sampling) 및 추가 시스템들이 장착되어 있다. 세포 배양 과정의 제1 단계는 생물반응기에의 배지의 첨가이다. 배지 온도가 37 ± 0.5℃에 도달한 후, N2 및 CO2의 첨가에 의해 용존 산소 (DO) 및 pH 수준을 안정화함으로써, 용존 산소 농도를 30 ± 5% 공기 포화로 감소시키고, 7.20 ± 0.10의 pH를 수득한다. 교반 속도는 80 rpm이다. 합쳐진 세포 배양액을 무균으로 멸균 성장 배지를 함유하는 15 L 시드 생물반응기로 옮겨 대략 2.2×105 세포/mL의 접종 세포 밀도를 갖는 배양액을 생성한다. 배양 과정 동안, 온도는 가열 블랭킷(heat blanket) 및 냉각 핑거(cooling finger)를 통하여 유지되며, 산소 농도는 스파저(sparger) 및 표면 폭기(surface aeration)를 통하여 유지되고, pH는 pH를 낮추기 위한 CO2 기체의 첨가에 의해 조절된다. 배양 기간은 5-6일이다. 생물반응기 공기 배출구는 소수성의 0.2 ㎛ 배출구 필터로 보호한다.
제조 배양
제조 생물반응기에는 2개의 혼합용 임펠러, 2개의 용존 산소 프로브, 온도 프로브, 2개의 pH 프로브, 무균 샘플링 및 추가 시스템들이 장착되어 있다. 80 L의 성장 배지를 무균으로 100 L 제조 생물반응기로 옮긴다. 성장 배지 온도가 37 ± 0.5℃에 도달한 후, N2 및 CO2의 첨가에 의해 DO 및 pH 수준을 안정화함으로써, 용존 산소 농도를 30 ± 5% 공기 포화로 감소시키고, 7.20 ± 0.10의 pH를 수득한다. 교반 속도는 45 rpm이다. 15 L의 시드 배양액을 무균으로 제조 생물반응기로 옮겨 대략 2.2×105 세포/mL의 접종 세포 밀도를 갖는 배양액을 생성한다. 배양 과정 동안, 온도는 열 교환기를 통하여 유지되며, 산소 농도는 스파저 및 표면 폭기를 통하여 유지되고, pH는 pH를 낮추기 위한 CO2 기체의 첨가에 의해 조절된다. 접종 후 3일차에, 세포 밀도가 대략 1.0×106 세포/mL에 도달하게 되면, 대략 6 L의 유가식 배지를 제조 생물반응기에 공급한다. 항체를 함유하는 제조 배양액은 공급 후 5일차에 수확하였다.
세포 상청액의 수확
세포 상청액 (예컨대 항체를 발현하는 세포로부터의 배양 상청액)은 유가식 세포 배양 과정을 사용하는 최종 제조 생물반응기에서의 최종 공급 후 5 또는 6일차에 수확된다. 수확 과정은 400 mg/L 이상의 항체 농도가 달성되었을 때 개시된다. 수확시에는, 제조 생물반응기에서의 세포 배양 온도를 15℃로 냉각시켜 낮추고, 회수 동안 그 온도로 유지한다. 세포 제거 및 항체 회수에는 심층 여과 과정이 사용된다. 여과 과정 순서는 직렬로 연결된 4.5 ㎛, 0.45 ㎛ 및 0.2 ㎛ 세공 크기의 필터로 구성된다. 작업 동안, 15 psi 이하의 교차-필터-압력 조절을 사용하여 1.00 L/분의 일정한 유량이 유지된다. 0.2 ㎛ 여과 배양 상청액을 프로세스 백(process bag)에 수집하여, 정제용으로 전달한다.
세포 상청액의 정제
상청액은 본원에서 기술되는 단백질 A 크로마토그래피법을 사용하여 정제될 수 있다. 원할 경우에는, 단백질 A 크로마토그래피 단계 전 또는 후에 하나 이상의 정제 단계가 수행될 수 있다 (U.S. 특허 7,064,189호). 예를 들어, 이온 교환, 겔 여과 또는 소수성 전하 상호작용 크로마토그래피가 수행될 수 있다. 또한, 원할 경우, 바이러스 불활성화 단계 (예컨대 낮은 pH에서의 인큐베이션)가 수행될 수 있다 (U.S. 특허 7,064,189호).
실시예 2: 단백질 A 크로마토그래피
하기의 예시적인 단백질 A 크로마토그래피법을 사용하여 관심 폴리펩티드를 정제하였다. 이와 같은 방법은 본원에서 기술되는 어떠한 완충제를 사용하여서도 수행될 수 있다.
저장 완충제 중에 저장된 단백질 A 기재 친화도 칼럼을 2 칼럼 부피 (CV)의 평형화 완충제, 2 CV의 세척 완충제, 2 CV의 용리 완충제 및 2 CV의 재생 완충제를 사용하여 예비-순환시켰다. 다음에, 4 CV의 평형화 완충제를 사용하여 칼럼을 평형화하였다 (350 cm/시간).
관심 폴리펩티드를 함유하는 세포 배양 상청액을 단백질 A 기재 친화도 칼럼에 적재한 다음, 4 CV의 평형화 완충제를 사용하여 세척한 후, 3-4 CV의 세척 완충제를 사용하여 세척하였다. 다르게는, 5 CV의 세척 완충제를 사용하여 하나의 단계로 칼럼을 세척하였다. 3-4 CV의 용리 완충제를 사용하여 관심 폴리펩티드를 용리한 후, OD280에서 수집하였다. 풀의 분취량을 추가 분석시까지 ≤ -65℃에서 저장하였다.
칼럼을 3 CV의 재생 완충제, 이어서 3 CV의 저장 완충제를 사용하여 탈거하였다. 모든 단계는 350 cm/시간으로 수행하였다. 실시예 4 (표 1 및 도 1a 및 1b)에 기술되어 있는 바와 같이 바이러스 클리어런스를 측정하였다.
실시예 3: 완충제 전도도의 측정
완충제 (예컨대 용리 완충제)의 전도도는 하기에 기술되어 있는 것들과 같은 표준 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 본 실시예에서 사용된 장비에는 메트롬 모델 712 전도도측정기, 전도도 전극, 및 통합형 Pt100 온도 센서 (메트롬 부품 번호 6.0908.110)가 구비된 침지 셀이 포함되었다. 먼저, 주 전력 코드를 측정기 및 유출구에 꽂고, 전극을 측정기 후면의 적정한 콘센트(들)에 꽂은 후, 전력 스위치를 켜는 것에 의해 측정기를 설치하였다.
다음에, 적어도 사용 24시간 이내에 측정기를 표준화하였다. 표준화를 위하여, "ref. temp"를 20℃로 설정하고, "TC const"를 2.1%/℃로 설정하였다. 전극 셀 상수를 기록한 다음, WPU 또는 WFI를 사용하여 전극을 세정하였다. 다음에, 전극을 전도도 표준; 예를 들어 10,000 μS/cm 전도도 표준 (P/N 60196)에 침지하였다. 표준화를 개시하기 위하여, 측정기를 측정 모드로 설정하고, 전도도 표준으로부터의 적정한 전도도 값 및 표준 참조 온도 값을 설정하였다. 셀 상수 보정을 수행하고, 그 판독치를 전극 셀 상수 판독치의 것과 비교하였다. 표준화된 셀 상수는 프로브 상수의 ± 0.02 cm-1이어야 한다. 표준 셀 상수가 이 범위를 벗어난 경우, 표준화 절차를 반복하고, 필요할 경우 전극을 교체하였다.
전도도측정기를 표준화한 후, 샘플로부터 측정치를 수득하였다. 측정기를 측정 모드로 설정한 후, WPU 또는 WFI 중 어느 하나로 전극을 세정하였다. 다음에, 전극을 샘플에 침지하고, 판독치가 안정화되고 나면 값을 기록하였다 (도 1a 및 1b).
실시예 4: 바이러스 클리어런스 측정
바이러스 클리어런스의 평가를 위한 모든 바이러스 시험은 바이오릴라이언스(BioReliance) 사에서 그의 내부 SOP (SOP BPBT0957 및 SOP OPBT0979)에 따라 수행하였다. 다르게는, 문헌 [Lute, S. et al., J. Chromatogr A. 26:1205(l-2):17-25, 2008] 또는 [Valdes et al., J. Biotechnology 96:251-258, 2002]에 기술되어 있는 방법과 같은 임의의 표준 방법이 바이러스 클리어런스를 측정하는 데에 사용될 수 있다.
샘플 제조
바이오릴라이언스 사 분자 생물학 실험실에서 시험을 수행하였다. 모든 샘플의 pH는 6-8의 범위 이내이었으며, 그에 따라 추출 전의 조정을 필요로 하지 않았다. 적재 샘플은 1:10으로 희석한 반면, 용리액 샘플은 그대로 시험하였다. 키아앰프(QIAamp)® 바이러스 미니 키트를 사용하여 키트 절차에 개괄되어 있는 바와 같이 샘플 추출물을 제조하였다. 시험 항목 샘플은 2반복으로 추출하였다.
키트 절차에 따라 무-뉴클레아제수를 추출함으로써, 음성 추출 대조군을 제조하였다.
PCR 증폭
친이종 뮤린 류케미스(Leukemis) 바이러스 (X-MuLV) RNA 또는 뮤린 미닛 바이러스 (MMV) DNA에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하여, 각각 XMuLV RNA 20개 사본 (4개 사본/μl) 또는 MMV DNA 50개 사본 (10개 사본/μl)의 검출을 달성하는 데에 최적화된 조건으로, 샘플 및 대조군에서 정량 RT-PCR 또는 PCR을 수행하였다. 각 2반복 시험 항목 샘플에 대하여 3회의 PCR 반응으로, 시험 항목 샘플 당 총 6회의 PCR 반응을 수행하였다. 음성 시험 대조군에 대하여 총 3개의 데이터 점, 및 음성 추출 대조군에 대하여 총 3개의 데이터 점을 분석하였다 (표 1 및 도 1a 및 1b).
실시예 5: 대량 약물 물질의 저장
원할 경우, 정제된 관심 폴리펩티드에 대하여 하기 파라미터들 중 어느 것이 시험될 수 있다. 대량 약물 물질은 임의로 생성물 방출 전에 2-8℃ (단기 저장) 또는 -40℃ 이하 (장기 저장)에서 저장된다. 각 배치에서의 수확시 미처리 제조 생물반응기 배양액의 과정중 시험, 및 정제 과정 동안의 과정중 시험을 수행한다. 생물반응기를 무균으로 샘플링하고, 세포 밀도, 생존력 및 영양소 측정을 위하여 배양 내내 다양한 시점에 배양액을 시험함으로써, 정제용으로 공급되는 물질의 농밀도를 확인한다. 각 단계에서 정제 과정을 모니터링한다. 시각적 검사에 의해 외관을 점검한다. 폴리펩티드 농도는 280 nm에서의 흡광도에 의해 측정한다. 물질의 pH를 점검한다. 순도는 예를 들어 SDS-PAGE 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 점검한다. 해당 항원에 결합하는 항체의 능력을 점검하기 위해서는 ELISA가 수행될 수 있다. 폴리펩티드의 생물학적 활성도 모니터링한다. 잔류 DNA 함량, 내독소 농도 및 생물부하량(bioburden) (폴리펩티드 조제물에 존재하는 생존가능 생물체의 수) 모두를 모니터링하여, 표준의 허용가능한 수준 이하로 유지시킨다. 또한, 올리고당 함량이 분석될 수 있으며; N-말단 서열분석 및 펩티드 매핑(mapping)을 사용하여 펩티드 서열도 분석될 수 있다. 폴리펩티드 안정성의 단기 및 장기 연구 역시 수행될 수 있다.
본 발명이 기술되어 있는 특정 방법론, 프로토콜 및 반응물에 제한되는 것으로 이해되어서는 아니 되는데, 그것들이 달라질 수 있기 때문이다. 업계 숙련자라면, 본원에서 기술되는 것들과 유사하거나 등가인 어떠한 방법 및 물질도 본 발명을 실시 또는 시험하는 데에 사용될 수 있다는 것 역시 알고 있을 것이다. 본 발명이 전기의 상세한 설명 및 실시예에서 구체적으로 기술된 것과 다르게 실시될 수 있다는 것은 분명할 것이다. 본 발명의 수많은 변형 및 변경들은 상기 교시에 비추어 가능한 것이므로, 첨부된 청구범위의 영역에 속하는 것이다.
본원에서 제공되는 표제들은 본 발명의 다양한 측면 또는 실시양태들의 제한이 아니며, 상세한 설명을 전체적으로 참조해야 하는 것일 수 있다.
본원에서 사용시, 분명하게 다르게 표시되지 않는 한, "a", "an" 등의 용어의 사용은 하나 이상을 지칭한다.
본원에서 "약"의 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 자체에 관한 실시양태를 포함(기술)한다. 예를 들어, "약 X"를 지칭하는 기술은 "X"의 기술을 포함한다. 숫자 범위는 범위를 한정하는 숫자를 포함하는 것이다.
본원에서 기술되는 본 발명의 측면 및 실시양태들은 측면 및 실시양태들을 "포함하고", "그것으로 구성되며", "본질적으로 그것으로 구성되는" 것을 포함하는 것으로 이해된다.

Claims (27)

  1. 관심 폴리펩티드 및 바이러스가 흡착되어 있는 단백질 A(Protein A) 수지에 약 3.5 내지 약 9.5 mS/cm의 전도도를 갖는 용리 완충제를 적용하는 것을 포함하며, 수지로부터 관심 폴리펩티드를 용리하여 바이러스의 적어도 일부분으로부터 관심 폴리펩티드를 분리하는 것인, 바이러스로부터 관심 폴리펩티드를 분리하는 방법.
  2. a. 단백질 A 수지에 결합할 수 있는 관심 폴리펩티드 및 바이러스를 포함하는 용액을, 관심 폴리펩티드가 단백질 A 수지에 결합하는 조건하에서 단백질 A 수지에 적용하는 단계;
    b. 세척 완충제를 사용하여 수지를 세척하는 단계; 및
    c. 약 3.5 내지 약 9.5 mS/cm의 전도도를 갖는 용리 완충제를 사용하여 수지로부터 관심 폴리펩티드를 용리함으로써 회수 조성물을 제공하는 단계
    를 포함하는, 단백질 A 수지에 결합할 수 있는 관심 폴리펩티드를 정제하는 방법.
  3. a. 단백질 A 수지에 결합할 수 있는 관심 폴리펩티드 및 바이러스를 포함하는 용액을, 관심 폴리펩티드가 단백질 A 수지에 결합하는 조건하에서 단백질 A 수지에 적용하는 단계;
    b. 세척 완충제를 사용하여 수지를 세척하는 단계;
    c. 제1 용리 완충제를 사용하여 수지로부터 관심 폴리펩티드를 용리함으로써 회수 조성물을 제공하는 단계;
    d. 회수 조성물 중 바이러스의 양을 측정하는 단계; 및
    e. 단계 (d)에서의 바이러스의 양이 원하는 양에 비해 더 큰 경우라면, 단계 (c)에서 사용된 제1 용리 완충제에 비해 더 높은 전도도를 갖는 제2 용리 완충제를 사용하여 단계 (a) 내지 (c)를 반복하는 단계
    를 포함하는, 단백질 A 수지에 결합할 수 있는 관심 폴리펩티드를 정제하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 단계 (a) 내지 (c)를, 회수 조성물을 사용하여 반복하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 단계 (a) 내지 (c)를, 단백질 A 정제에 적용되지 않은 관심 폴리펩티드를 포함하는 용액을 사용하여 반복하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 용리 완충제의 전도도가 약 5 내지 약 6 mS/cm인 방법.
  7. 제2항에 있어서, 용리 완충제의 전도도가 약 5 내지 약 6 mS/cm인 방법.
  8. 제3항에 있어서, 제2 용리 완충제의 전도도가 약 5 내지 약 6 mS/cm인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 용리 완충제가 나트륨 술페이트를 포함하는 것인 방법.
  10. 제2항에 있어서, 용리 완충제가 나트륨 술페이트를 포함하는 것인 방법.
  11. 제3항에 있어서, 제2 용리 완충제가 나트륨 술페이트를 포함하는 것인 방법.
  12. 제2항에 있어서, 회수 조성물 중 바이러스의 양이 단계 (a)에서의 용액 중 바이러스의 양에 비해 104배 이상 더 적은 것인 방법.
  13. 제3항에 있어서, 회수 조성물 중 바이러스의 양이 단계 (a)에서의 용액 중 바이러스의 양에 비해 104배 이상 더 적은 것인 방법.
  14. 제12항에 있어서, 회수 조성물 중 바이러스의 양이 단계 (a)에서의 용액 중 바이러스의 양에 비해 105배 이상 더 적은 것인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 회수 조성물 중 바이러스의 양이 단계 (a)에서의 용액 중 바이러스의 양에 비해 105배 이상 더 적은 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 용리 완충제의 pH가 약 2.5 내지 약 4인 방법.
  17. 제2항에 있어서, 용리 완충제의 pH가 약 2.5 내지 약 4인 방법.
  18. 제3항에 있어서, 제2 용리 완충제의 pH가 약 2.5 내지 약 4인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 관심 폴리펩티드가 항체, 항체 단편, 또는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드인 방법.
  20. 제2항에 있어서, 관심 폴리펩티드가 항체, 항체 단편, 또는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드인 방법.
  21. 제3항에 있어서, 관심 폴리펩티드가 항체, 항체 단편, 또는 항체 또는 항체 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드인 방법.
  22. 제1항에 있어서, 바이러스가 레트로바이러스인 방법.
  23. 제2항에 있어서, 바이러스가 레트로바이러스인 방법.
  24. 제3항에 있어서, 바이러스가 레트로바이러스인 방법.
  25. 제1항에 있어서, 바이러스가 단일-가닥 DNA 바이러스인 방법.
  26. 제2항에 있어서, 바이러스가 단일-가닥 DNA 바이러스인 방법.
  27. 제3항에 있어서, 바이러스가 단일-가닥 DNA 바이러스인 방법.
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