TW202400640A

TW202400640A - 親液劑用於提高親和層析純化步驟的產率之用途

Info

Publication number: TW202400640A
Application number: TW112122788A
Authority: TW
Inventors: 安柏斯Ｊ威廉斯; 尼希特Ｃ西塔帕拉; 車民政
Original assignee: 美商建南德克公司
Priority date: 2022-06-17
Filing date: 2023-06-17
Publication date: 2024-01-01
Also published as: WO2023245105A1

Abstract

本揭露提供使用包括在緩衝液背景中的親液劑鹽之蛋白 L 層析材料來純化包含 VL 域的抗原結合蛋白之方法及套組。

Description

親液劑用於提高親和層析純化步驟的產率之用途

本揭露一般涉及純化包含 VL 區的抗原結合蛋白之方法，該方法包含：將多肽與蛋白 L 層析材料結合，用包含親液劑的緩衝液洗滌層析材料，以及在低 pH 處溶析抗原結合蛋白。

蛋白 L 為一種親和配體，其可用於抗體以及一些抗體片段 (諸如 Fab、scFv 及 VHH) 的層析純化。該三者都缺乏 Fc 域，並且因此與蛋白 A 不相容。蛋白 L 對 κ 輕鏈的 VL 域具有親和力，該域為三個互補決定區 (CDR) 所位於之同一域，這可能會以特定於分子序列的方式改變結合效能。蛋白 L 層析樹脂在珠子的表面上帶有蛋白 L 配體，並且通常在與蛋白 A 層析相近的條件下操作 (平衡、負載高度不純的原料、洗滌，然後溶析以回收純化的蛋白質)。需要的是一種經改進的蛋白 L 層析之方法。

在本文中引用的所有參考文獻，包括專利申請和公開，是藉由引用方式全部併入。

本文提供了一種純化包含 VL 域的抗原結合蛋白之方法，該方法包含：a) 將抗原結合蛋白與蛋白 L 層析材料結合，b) 用洗滌緩衝液洗滌蛋白 L 層析材料，其中洗滌緩衝液包含平衡緩衝液及親液劑，以及 c) 用溶析緩衝液自蛋白 L 層析材料溶析抗原結合蛋白。

本文還提供了一種改進包含 VL 域的抗原結合蛋白之蛋白 L 純化之方法，該方法包含：a) 將抗原結合蛋白與蛋白 L 層析材料結合，b) 用洗滌緩衝液洗滌蛋白 L 層析材料，其中洗滌緩衝液包含平衡緩衝液及親液劑，以及 c) 用溶析緩衝液自蛋白 L 層析材料溶析抗原結合蛋白。

在一些實施例中，與其中洗滌緩衝液不包含親液劑的蛋白 L 層析相比，抗原結合蛋白之產率及/或純度增加。

在任何此類實施例中的一些實施例中，平衡緩衝液包含 Tris、MES、MOPS 或 EDTA。在任何此類實施例中的一些實施例中，平衡緩衝液包含 Tris 及 NaCl。在任何此類實施例中的一些實施例中，Tris 以約 10 mM 至約 50 mM、或約 25 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中。在任何此類實施例中的一些實施例中，NaCl 以約 10 mM 至約 50 mM、或約 25 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中。在任何此類實施例中的一些實施例中，平衡緩衝液具有約 4 至約 10 之 pH。在任何此類實施例中的一些實施例中，平衡緩衝液具有約 6.5 至約 8.5、或約 7.7 之 pH。在任何此類實施例中的一些實施例中，平衡緩衝液具有約 7 至約 8 之 pH。

在任何此類實施例中的一些實施例中，洗滌緩衝液具有約 4 至約 10 之 pH。在任何此類實施例中的一些實施例中，洗滌緩衝液具有約 4 至約 10、約 4 至約 9.5、約 4 至約 9、約 4 至約 8.5、約 4 至約 8、約 4 至約 7.5、約 5 至約 10、約 5 至約 9.5、約 5 至約 9、約 5 至約 8.5、約 5 至約 8、約 5 至約 7.5、約 6 至約 10、約 6 至約 9.5、約 6 至約 9、約 6 至約 8.5、約 6 至約 8、或約 6 至約 7.5 之 pH。在任何此類實施例中的一些實施例中，洗滌緩衝液具有約 4、約 4.5、約 5、約 5.5、約 6、約 6.5、約 7、約 7.5、約 8、約 8.5、約 9、約 9.5 或約 10 之 pH。在任何此類實施例中的一些實施例中，洗滌緩衝液具有約 7.0、約 7.1、約 7.2、約 7.3、約 7.4、約 7.5、約 7.6、約 7.7、約 7.8、約 7.9 或約 8.0 之 pH。

在任何此類實施例中的一些實施例中，抗原結合蛋白以宿主細胞培養上清液在步驟 a) 中經負載到蛋白 L 層析材料上。

在任何此類實施例中的一些實施例中，抗原結合蛋白以純化的多肽溶液在步驟 a) 中經負載到蛋白 L 層析材料上。

在任何此類實施例中的一些實施例中，抗原結合蛋白以來自先前純化步驟的混合物在步驟 a) 中經負載到蛋白 L 層析材料上。

在任何此類實施例中的一些實施例中，抗原結合蛋白在步驟 a) 中負載到蛋白 L 層析材料上之前係配製在平衡緩衝液中。

在任何此類實施例中的一些實施例中，抗原結合蛋白在步驟 a) 中負載到蛋白 L 層析材料上之前係配製在平衡緩衝液及親液劑中。

在任何此類實施例中的一些實施例中，親液劑為磷酸鹽或硫酸鹽。在任何此類實施例中的一些實施例中，親液劑為磷酸鉀、硫酸鈉或硫酸銨。

在任何此類實施例中的一些實施例中，在平衡緩衝液或洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 100 mM 至約 800 mM。在任何此類實施例中的一些實施例中，在平衡緩衝液及洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 100 mM 至約 800 mM。在任何此類實施例中的一些實施例中，在平衡緩衝液或洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 120 mM 至約 600 mM。在任何此類實施例中的一些實施例中，在平衡緩衝液或洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 120 mM、約 240 mM、約 360 mM、約 480 mM 或約 600 mM。在任何此類實施例中的一些實施例中，在平衡緩衝液及/或洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 100 mM 至約 800 mM、約 100 mM 至約 700 mM、約 100 mM 至約 600 mM、約 100 mM 至約 500 mM、約 200 mM 至約 800 mM、約 200 mM 至約 700 mM、約 200 mM 至約 600 mM、約 200 mM 至約 500 mM、約 300 mM 至約 800 mM、約 300 mM 至約 700 mM、約 300 mM 至約 600 mM、或約 300 mM 至約 500 mM。在任何此類實施例中的一些實施例中，在平衡緩衝液及/或洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 100 mM、125 mM、150 mM、175 mM、200 mM、225 mM、250 mM、275 mM、300 mM、325 mM、350 mM、375 mM、400 mM、425 mM、450 mM、475 mM、500 mM、525 mM、550 mM、575 mM、600 mM、625 mM、650 mM、675 mM、700 mM、725 mM、750 mM、775 mM 或 800 mM。

在任何此類實施例中的一些實施例中，親液劑為硫酸鈉。在任何此類實施例中的一些實施例中，親液劑為磷酸鉀。在任何此類實施例中的一些實施例中，親液劑為硫酸銨。

在任何此類實施例中的一些實施例中，溶析緩衝液相比平衡緩衝液具有較低的 pH。在任何此類實施例中的一些實施例中，溶析緩衝液具有約 2.0 至約 4.0、或約 2.5 至約 3.0 之 pH。在任何此類實施例中的一些實施例中，溶析緩衝液具有約 2.5、約 2.55、約 2.6、約 2.65、約 2.7、約 2.75、約 2.8、約 2.85、約 2.9、約 2.95、約 3.0、約 3.05、約 3.1、約 3.15、約 3.2、約 3.25 或約 3.3 之 pH。在任何此類實施例中的一些實施例中，溶析緩衝液具有約 2.7、約 2.75、約 2.8、約 2.85、約 2.9 或約 2.95 之 pH。在任何此類實施例中的一些實施例中，溶析緩衝液相比平衡緩衝液具有較高的 pH。在任何此類實施例中的一些實施例中，溶析緩衝液具有約 10.0 至約 12.0 之 pH。

在任何此類實施例中的一些實施例中，溶析緩衝液包含乙酸。在任何此類實施例中的一些實施例中，溶析緩衝液包含約 50 mM 乙酸至約 250 mM 乙酸。

在任何此類實施例中的一些實施例中，溶析緩衝液包含處於約 2.8 之 pH 的約 150 mM 乙酸。

在任何此類實施例中的一些實施例中，溶析緩衝液包含乙酸鈉、檸檬酸鹽或甘胺酸。

在任何此類實施例中的一些實施例中，抗原結合蛋白與蛋白 L 結合不佳 (poorly)。在任何此類實施例中的一些實施例中，與為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白相比，抗原結合蛋白與蛋白 L 結合不佳。在任何此類實施例中的一些實施例中，相比為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白，抗原結合蛋白與蛋白 L 結合較弱。

在任何此類實施例中的一些實施例中，抗原結合蛋白為抗體或免疫黏附素 (immunoadhesin) 或其片段。在任何此類實施例中的一些實施例中，抗原結合蛋白為單株抗體。在任何此類實施例中的一些實施例中，抗原結合蛋白為人抗體、嵌合抗體或人源化抗體。在任何此類實施例中的一些實施例中，抗體為選自 Fab、Fab'-SH、Fv、scFv 及 (Fab')2 片段的抗體片段。在任何此類實施例中的一些實施例中，抗體片段為 Fab。在任何此類實施例中的一些實施例中，Fab 包含缺乏疏水性區塊 (patch) 或具有弱疏水性區塊之用於與蛋白 L 結合的結合位點。在任何此類實施例中的一些實施例中，用於與蛋白 L 結合的結合位點缺乏疏水性區塊。在任何此類實施例中的一些實施例中，用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。在任何此類實施例中的一些實施例中，與用於與為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白之蛋白 L 結合的結合位點相比，用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。在任何此類實施例中的一些實施例中，用於與蛋白 L 結合的結合位點包含親水性區塊。

在任何此類實施例中的一些實施例中，抗原結合蛋白對蛋白 L 之結合親和力 (EC50) 及/或解離常數具有的值比為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白對蛋白 L 之結合親和力 (EC50) 及/或解離常數的值高。在任何此類實施例中的一些實施例中，抗原結合蛋白對蛋白 L 之結合親和力 (EC50) 及/或解離常數具有的值比為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白對蛋白 L 之結合親和力 (EC50) 及/或解離常數的值高至少 15%、至少 25%、至少 50%、至少 75%、至少 100%、至少 150%、至少 200%、至少 300%、至少 400% 或至少 500%。

在任何此類實施例中的一些實施例中，抗體不含有 Fc 域。

在任何此類實施例中的一些實施例中，抗體為多特異性抗體。在任何此類實施例中的一些實施例中，多特異性抗體包含 VL 域及第二 VL 域，且其中 VL 域為卡帕 (κ) VL。在任何此類實施例中的一些實施例中，VL 域為 κ2 VL。在任何此類實施例中的一些實施例中，VL 域與蛋白 L 結合不佳。在任何此類實施例中的一些實施例中，VL 域與蛋白 L 結合不佳且第二 VL 域不與蛋白 L 結合。在任何此類實施例中的一些實施例中，第二 VL 域為拉目達 (λ) VL。在任何此類實施例中的一些實施例中，VL 域為 λ 亞型 VL 或 κ VL。在任何此類實施例中的一些實施例中，VL 域與蛋白 L 結合不佳。在任何此類實施例中的一些實施例中，與為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白之 VL 域與蛋白 L 的結合相比，該 VL 域與蛋白 L 的結合不佳。在任何此類實施例中的一些實施例中，VL 域為 κ VL 且包含削弱 VL 域與蛋白 L 的結合之修飾。在任何此類實施例中的一些實施例中，該修飾包含在 VL 域中的一個或多個胺基酸取代。在任何此類實施例中的一些實施例中，VL 域為 κ2 VL。

在任何此類實施例中的一些實施例中，抗原結合蛋白包含缺乏疏水性區塊或具有弱疏水性區塊之用於與蛋白 L 結合的結合位點。在一些實施例中，用於與蛋白 L 結合的結合位點缺乏疏水性區塊。在一些實施例中，用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。在任何此類實施例中的一些實施例中，與用於與為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白之蛋白 L 結合的結合位點相比，用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。在任何此類實施例中的一些實施例中，用於與蛋白 L 結合的結合位點包含親水性區塊。

在任何此類實施例中的一些實施例中，蛋白 L 層析材料為 Pierce™ 蛋白 L 層析匣、Capto™ L 層析、HiTrap® 蛋白 L 層析、KanCap™ L 層析、TOYOPEARL® AF-rProtein L-650F 層析或 MabSelect ^TMVL 層析。

本文還提供了一種組成物，其包含藉由包含本文所述之任何方法的方法所純化的抗原結合蛋白。在一些實施例中，組成物包含一種或多種醫藥賦形劑。

本文還提供了一種純化包含 VL 域的抗原結合蛋白之套組，其中套組包含蛋白 L 層析材料及親液劑。

在一些實施例中，套組進一步包含平衡緩衝液。在一些實施例中，平衡緩衝液包含 Tris、MES、MOPS 或 EDTA。在任何此類實施例中的一些實施例中，平衡緩衝液包含 Tris 及 NaCl。在任何此類實施例中的一些實施例中，Tris 以約 10 mM 至約 50 mM、或約 25 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中。在任何此類實施例中的一些實施例中，NaCl 以約 10 mM 至約 50 mM、或約 25 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中。

在任何此類實施例中的一些實施例中，平衡緩衝液具有約 4 至約 10 之 pH。在任何此類實施例中的一些實施例中，平衡緩衝液具有約 6.5 至約 8.5、或約 7.7 之 pH。在任何此類實施例中的一些實施例中，平衡緩衝液具有約 7 至約 8 之 pH。

在任何此類實施例中的一些實施例中，套組進一步包含洗滌緩衝液。在一些實施例中，洗滌緩衝液具有約 4 至約 10 之 pH。在任何此類實施例中的一些實施例中，洗滌緩衝液具有約 4 至約 10、約 4 至約 9.5、約 4 至約 9、約 4 至約 8.5、約 4 至約 8、約 4 至約 7.5、約 5 至約 10、約 5 至約 9.5、約 5 至約 9、約 5 至約 8.5、約 5 至約 8、約 5 至約 7.5、約 6 至約 10、約 6 至約 9.5、約 6 至約 9、約 6 至約 8.5、約 6 至約 8、或約 6 至約 7.5 之 pH。在任何此類實施例中的一些實施例中，洗滌緩衝液具有約 4、約 4.5、約 5、約 5.5、約 6、約 6.5、約 7、約 7.5、約 8、約 8.5、約 9、約 9.5 或約 10 之 pH。在任何此類實施例中的一些實施例中，洗滌緩衝液具有約 7.0、約 7.1、約 7.2、約 7.3、約 7.4、約 7.5、約 7.6、約 7.7、約 7.8、約 7.9 或約 8.0 之 pH。

在任何此類實施例中的一些實施例中，洗滌緩衝液包含平衡緩衝液及親液劑。在任何此類實施例中的一些實施例中，平衡緩衝液進一步包含親液劑。

在任何此類實施例中的一些實施例中，親液劑為磷酸鹽或硫酸鹽。在任何此類實施例中的一些實施例中，親液劑為磷酸鉀、硫酸鈉或硫酸銨。在任何此類實施例中的一些實施例中，在平衡緩衝液或洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 100 mM 至約 800 mM。在任何此類實施例中的一些實施例中，在平衡緩衝液及洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 100 mM 至約 800 mM。在任何此類實施例中的一些實施例中，在平衡緩衝液或洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 120 mM 至約 600 mM。在任何此類實施例中的一些實施例中，在平衡緩衝液或洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 120 mM、約 240 mM、約 360 mM、約 480 mM 或約 600 mM。在任何此類實施例中的一些實施例中，在平衡緩衝液及/或洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 100 mM 至約 800 mM、約 100 mM 至約 700 mM、約 100 mM 至約 600 mM、約 100 mM 至約 500 mM、約 200 mM 至約 800 mM、約 200 mM 至約 700 mM、約 200 mM 至約 600 mM、約 200 mM 至約 500 mM、約 300 mM 至約 800 mM、約 300 mM 至約 700 mM、約 300 mM 至約 600 mM、或約 300 mM 至約 500 mM。在任何此類實施例中的一些實施例中，在平衡緩衝液及/或洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 100 mM、125 mM、150 mM、175 mM、200 mM、225 mM、250 mM、275 mM、300 mM、325 mM、350 mM、375 mM、400 mM、425 mM、450 mM、475 mM、500 mM、525 mM、550 mM、575 mM、600 mM、625 mM、650 mM、675 mM、700 mM、725 mM、750 mM、775 mM 或 800 mM。

在任何此類實施例中的一些實施例中，套組進一步包含溶析緩衝液。在一些實施例中，溶析緩衝液相比平衡緩衝液具有較低的 pH。在任何此類實施例中的一些實施例中，溶析緩衝液具有約 2.0 至約 4.0、或約 2.5 至約 3.0 之 pH。在任何此類實施例中的一些實施例中，溶析緩衝液具有約 2.5、約 2.55、約 2.6、約 2.65、約 2.7、約 2.75、約 2.8、約 2.85、約 2.9、約 2.95、約 3.0、約 3.05、約 3.1、約 3.15、約 3.2、約 3.25 或約 3.3 之 pH。在任何此類實施例中的一些實施例中，溶析緩衝液具有約 2.7、約 2.75、約 2.8、約 2.85、約 2.9 或約 2.95 之 pH。

在一些實施例中，溶析緩衝液相比平衡緩衝液具有較高的 pH。在任何此類實施例中的一些實施例中，溶析緩衝液具有約 10.0 至約 12.0 之 pH。

在任何此類實施例中的一些實施例中，溶析緩衝液包含乙酸。在一些實施例中，溶析緩衝液包含約 50 mM 乙酸至約 250 mM 乙酸。在任何此類實施例中的一些實施例中，溶析緩衝液包含處於約 2.8 之 pH 的約 150 mM 乙酸。在任何此類實施例中的一些實施例中，溶析緩衝液包含乙酸鈉、檸檬酸鹽或甘胺酸。

在任何此類實施例中的一些實施例中，套組用於純化抗體或免疫黏附素或其片段。在任何此類實施例中的一些實施例中，抗原結合蛋白為單株抗體。在任何此類實施例中的一些實施例中，抗原結合蛋白為人抗體、嵌合抗體或人源化抗體。在任何此類實施例中的一些實施例中，抗體為選自 Fab、Fab'-SH、Fv、scFv 及 (Fab')2 片段的抗體片段。在任何此類實施例中的一些實施例中，抗體片段為 Fab。

在一些實施例中，Fab 包含缺乏疏水性區塊或具有弱疏水性區塊之用於與蛋白 L 結合的結合位點。在一些實施例中，用於與蛋白 L 結合的結合位點缺乏疏水性區塊。在一些實施例中，用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。在任何此類實施例中的一些實施例中，與用於與為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白之蛋白 L 結合的結合位點相比，用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。在任何此類實施例中的一些實施例中，用於與蛋白 L 結合的結合位點包含親水性區塊。

在任何此類實施例中的一些實施例中，抗體不含有 Fc 域。

在任何此類實施例中的一些實施例中，抗體為多特異性抗體。在一些實施例中，多特異性抗體包含 VL 域及第二 VL 域，且其中 VL 域為卡帕 (κ) VL。在任何此類實施例中的一些實施例中，VL 域為 κ2 VL。在任何此類實施例中的一些實施例中，VL 域與蛋白 L 結合不佳。在任何此類實施例中的一些實施例中，VL 域與蛋白 L 結合不佳且第二 VL 域不與蛋白 L 結合。在任何此類實施例中的一些實施例中，第二 VL 域為拉目達 (λ) VL。在任何此類實施例中的一些實施例中，抗體包含為 λ 亞型 VL 或 κ VL 的 VL 域。在任何此類實施例中的一些實施例中，VL 域與蛋白 L 結合不佳。在任何此類實施例中的一些實施例中，與為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白相比，抗原結合蛋白之 VL 域與蛋白 L 結合不佳。在任何此類實施例中的一些實施例中，相比為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白，抗原結合蛋白之 VL 域與蛋白 L 結合較弱。

在任何此類實施例中的一些實施例中，VL 域為 κ VL 且包含削弱 VL 域與蛋白 L 的結合之修飾。在一些實施例中，該修飾包含 VL 域中的一個或多個胺基酸取代。在任何此類實施例中的一些實施例中，VL 域為 κ2 VL。在任何此類實施例中的一些實施例中，抗原結合蛋白包含缺乏疏水性區塊或具有弱疏水性區塊之用於與蛋白 L 結合的結合位點。在一些實施例中，用於與蛋白 L 結合的結合位點缺乏疏水性區塊。在一些實施例中，用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。在任何此類實施例中的一些實施例中，與用於與為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白之蛋白 L 結合的結合位點相比，用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。在任何此類實施例中的一些實施例中，用於與蛋白 L 結合的結合位點包含親水性區塊。

相關申請的交叉引用

本申請要求 2022 年 6 月 17 日提交的美國臨時申請第 63/353,512 號的優先權，題為「親液劑用於提高親和層析純化步驟的產率之用途」，其內容藉由引用整體併入。

在一些態樣中，本發明提供了純化包含 VL 域的抗原結合蛋白之方法，該方法包含：a) 將抗原結合蛋白與蛋白 L 層析材料結合，b) 用洗滌緩衝液洗滌蛋白 L 層析材料，其中洗滌緩衝液包含平衡緩衝液及親液劑 (例如，硫酸鹽或磷酸鹽)，c) 用溶析緩衝液自蛋白 L 層析材料溶析抗原結合蛋白。在一些態樣中，本發明提供了改進包含 VL 域的抗原結合蛋白之蛋白 L 純化之方法，該方法包含：a) 將抗原結合蛋白與蛋白 L 層析材料結合，b) 用洗滌緩衝液洗滌蛋白 L 層析材料，其中洗滌緩衝液包含平衡緩衝液及親液劑 (例如，硫酸鹽或磷酸鹽)，c) 用溶析緩衝液自蛋白 L 層析材料溶析抗原結合蛋白。在一些實施例中，與其中洗滌緩衝液不包含親液劑的蛋白 L 層析相比，抗原結合蛋白之產率及/或純度增加。

本領域技術人員還將理解，在不脫離本揭示的範圍的情況下，可以對本文描述的實施方案的形式和細節進行改變。此外，雖然已經參考各種實施方案描述了各種優點、方面和目的，但是本揭示的範圍不應受此類優點、方面和目的的限制。定義

出於解釋本說明書之目的，將適用以下定義，且在任何適當的情況下，以單數使用的術語還將包括複數，反之亦然。如果下文示出之任何定義與通過引用併入本文之任何文件相衝突，則所示之定義為準。

如本文所用，「親液劑 (kosmotrope)」，較少拼寫為「cosmotrope」，為一種鹽，該鹽由於它們在溶液中構造水分子之方式而促進疏水性結合。層析中使用的親液性陰離子的兩個實例為磷酸鹽及硫酸鹽。另一種親液劑，即硫酸銨，具有很強的親液性，它經常用於從溶液中切割 (沉澱) 蛋白質的鹽。與親液劑不同的是離液鹽，該離液鹽會破壞疏水性結合；霍夫邁斯特序為根據不同鹽的特性，在親液劑與離液劑光譜中對該等不同鹽進行的排序。

術語「多肽」或「蛋白質」在本文可互換使用，係指任何長度之胺基酸殘基之聚合物。聚合物可以是線性或支化的，它可以包含經修飾的胺基酸，並且它可以被非胺基酸中斷。該術語亦涵蓋經天然方式或藉由干預修飾之胺基酸聚合物；干預例如為二硫鍵形成、醣基化、脂化、乙醯化、磷酸化或諸如與標記組分之結合的任何其他操作或修飾。定義內還包括例如含有一種或多種胺基酸類似物（包括例如非天然胺基酸等）的多肽，以及本領域已知的其他修飾。如本文所用，術語「多肽」和「蛋白質」具體涵蓋抗體。

「純化的」多肽 (例如，抗體或免疫黏附素) 意指純度已增加的多肽，使得它以比其天然環境中及/或最初合成時更純的形式存在，且/或在實驗室條件下擴增。純度是一個相對術語，並不一定意味著絕對純度。

術語「抗體」包括全長抗體及其抗原結合片段。在一些實施例中，全長抗體包含兩條重鏈和兩條輕鏈。輕鏈和重鏈的可變區負責抗原結合。兩條鏈中的可變區通常含有三個高度可變的環，稱為互補決定區 (CDR)（輕鏈 (LC) CDR，包括 LC-CDR1、LC-CDR2 和 LC-CDR3；重鏈 (HC) CDR，包括 HC-CDR1、HC-CDR2 和 HC-CDR3）。本文揭示的抗體和抗原結合片段的 CDR 邊界可以藉由 Kabat、Chothia 或 Al-Lazikani 的約定來定義或鑑定（Al-Lazikani 1997；Chothia 1985；Chothia 1987；Chothia 1989；Kabat 1987；Kabat 1991）。重鏈或輕鏈的三個 CDR 介於稱為骨架區 (FR) 的側翼段之間，其比 CDR 更加高度保守並形成支架以支持高變環。重鏈和輕鏈的恆定區不參與抗原結合，但表現出多種效應子功能。抗體基於其重鏈的恆定區的胺基酸序列進行分類。抗體的五個主要類別或同型是 IgA、IgD、IgE、IgG 和 IgM，其特徵分別是存在 α、δ、ε、γ 和 μ 重鏈。幾個主要的抗體類別被分為亞類，諸如 lgG1 (γ1 重鏈)、lgG2 (γ2 重鏈)、lgG3 (γ3 重鏈)、lgG4 (γ4 重鏈)、lgA1 (α1 重鏈) 或 lgA2 (α2 重鏈)。在一些實施例中，抗體為嵌合抗體。在一些實施例中，抗體為半合成抗體。在一些實施例中，抗體為雙抗體。在一些實施例中，抗體為人源化抗體。在一些實施例中，抗體為多特異性抗體，諸如雙特異性抗體。在一些實施例中，抗體連接至融合蛋白。在一些實施例中，抗體連接至免疫刺激蛋白，諸如介白素。在一些實施例中，抗體與促進穿過血腦屏障進入的蛋白質連接。

如本文所用，術語「抗原結合片段」是指抗體片段，包括例如雙抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv 片段、二硫鍵穩定的 Fv 片段 (dsFv)、(dsFv)2、雙特異性 dsFv (dsFv-dsFv')、二硫化物穩定的雙抗體 (ds diabody)、單鏈抗體分子 (scFv)、scFv 二聚體 (二價雙抗體)、由包含一個或多個 CDR 的抗體的一部分形成的多特異性抗體、駱駝化單域抗體、奈米抗體、域抗體、二價域抗體或結合抗原但不包含完整抗體結構的任何其他抗體片段。抗原結合片段能夠結合親本抗體或親本抗體片段 (例如親本 scFv) 所結合的相同抗原。在一些實施例中，抗原結合片段可包含移植到來自一種或多種不同人抗體的骨架區的來自特定人抗體的一個或多個 CDR。

術語「嵌合抗體」是指以下抗體：其中重鏈及/或輕鏈之一部分與源自特定物種或屬於特定抗體種類或亞類之抗體之相應序列相同或同源，而鏈之其餘部分與源自另一物種或屬於另一抗體種類或亞類之抗體以及該等抗體之片段之相應序列相同或同源，只要其展現本發明的生物活性即可 (參見美國專利第 4,816,567 號；及 Morrison 等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:6851-6855 (1984))。

本文所用之術語「多特異性抗體」是指針對至少兩個不同位點 (即不同抗原上之不同抗原決定基或同一抗原上之不同抗原決定基) 具有結合特異性的單株抗體。在某些方面，多特異性抗體具有兩種結合特異性（雙特異性抗體）。在某些態樣中，多特異性抗體具有三種或更多種結合特異性。多特異性抗體可製成全長抗體或抗體片段。

關於抗體或抗體的術語「半合成」意指抗體或抗體具有一種或多種天然存在的序列以及一種或多種非天然存在的 (即合成的) 序列。

「Fv」為包含完整抗原識別與結合位點之最小抗體片段。該片段由一個重鏈和一個輕鏈可變區域的二聚體緊密、非共價結合而成。由這兩個結構域的折疊產生六個高變環 (重鏈和輕鏈各 3 個環)，這些環形成用於抗原結合之胺基酸殘基，並賦予抗體以抗原結合特異性。然而，即使單個可變域 (或僅包含對抗原具有特異性之三個 CDR 的 Fv 的一半) 亦具有識別及結合抗原之能力，儘管其親和力低於整個結合位點。

「單鏈 Fv」也簡稱為「sFv」或「scFv」，是包含連接到單一多肽鏈中的 VH 和 VL 抗體域的抗體片段。在一些實施例中，scFv 多肽在 VH 與 VL 結構域之間進一步包含多肽連接子，其使得 scFv 能夠形成用於抗原結合之所需結構。有關 scFv 的綜述，參見 Pluckthun 的 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)。

術語「雙抗體 (diabody)」是指藉由構建在 VH 和 VL 結構域之間通常具有短連接子 (諸如約 5 至約 10 個殘基) 的 scFv 片段 (參見前段) 而製備的小抗體片段，使得 V 域的鏈間而非鏈內配對達成，從而產生二價片段，即，具有兩個抗原結合位點的片段。雙特異性雙抗體是兩個「互換型」scFv 片段的異二聚體，其中兩個抗體的 VH 和 VL 結構域存在於不同的多肽鏈上。雙抗體更完整說明於例如下列者：EP 404,097；WO 93/11161；及 Hollinger 等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:6444-6448 (1993)。

非人類 (例如，囓齒類動物) 抗體的「人源化」形式是含有衍生自非人抗體的最小序列的嵌合抗體。針對大多數部分，人源化抗體是人類免疫球蛋白 (接受者抗體)，其中來自接受者的高變區 (HVR) 的殘基被非人類物種 (提供者抗體) (諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物) 的具有所需抗體特異性、親和力、及能力的高變區之殘基替換。在一些情況下，人類免疫球蛋白的骨架區 (FR) 殘基被相應的非人類殘基取代。此外，人源化抗體可包含未見於接受者抗體或提供者抗體的殘基。這些修飾是進行以進一步改善抗體效能。通常，人源化抗體將包括實質上所有至少一個 (且通常兩個) 可變域，其中，所有或實質上所有高度變異環對應於非人類免疫球蛋白之高度變異環，並且所有或實質上所有 FR 是人免疫球蛋白序列之 FR。人源化抗體亦視情況將包含免疫球蛋白恆定區 (Fc) 的至少一部分，通常是人類免疫球蛋白的恆定區。關於其他細節，參見 Jones 等人， Nature321:522-525 (1986)；Riechmann 等人， Nature332:323-329 (1988)；及 Presta, Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596 (1992)。

如本文所用，術語「分離的」係指已經從通常在自然界中發現或產生的組分中的至少一些組分中分離出來的分子。例如，當多肽與產生它的細胞的組分中的至少一些組分分離時，該多肽被稱為「分離的」。在多肽在表現後藉由細胞分泌的情況下，將含有多肽的上清液與產生它的細胞物理分離被認為是「分離」多肽。相近地，當多核苷酸不為通常在自然界中發現的較大多核苷酸 (諸如，例如，在 DNA 多核苷酸的情況下，基因組 DNA 或粒線體 DNA) 的一部分時，或者與產生它的細胞的組分中的至少一些組分分離時，例如，在 RNA 多核苷酸的情況下，該多核苷酸被稱為「分離的」。因此，包含在宿主細胞內之載體中的 DNA 多核苷酸可被稱為「分離的」。

「污染物」是指不同於所需的多肽產物的材料。污染物包括但不限於：宿主細胞材料，諸如 CHO 宿主細胞蛋白 (CHOP)；淋溶蛋白 A；核酸；所需多肽 (例如，所需多肽之高分子量種類 (HMWS) 或極高分子量種類 (vHMWS) 多肽) 之變體 (例如，所需多肽之鹼性變異體或酸性變異體)、片段、聚集體或衍生物；另一種多肽；內毒素；病毒污染物；細胞培養基組分等。在一些實例中，污染物可以為來自例如但不限於細菌細胞 (諸如大腸桿菌細胞)、昆蟲細胞、原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、鳥類細胞、真菌細胞之宿主細胞蛋白 (HCP)。

術語「疏水性區塊」係指抗原結合蛋白 (例如，抗體或免疫黏附素或其片段，諸如 Fab) 之一部分，其含有一個或多個疏水性胺基酸殘基，這使其具有總體疏水性。術語「親水性區塊」係指抗原結合蛋白 (例如，抗體或免疫黏附素或其片段，諸如 Fab) 之一部分，其含有一個或多個親水性胺基酸殘基，這使其具有總體親水性。

術語「包含」、「具有」、「含有」和「包括」以及其他類似形式及其語法等效詞，如本文所用，旨在在含義上是等效的並且是開放式的，即在這些詞中的任何一個之後的一個或多個項目並不意味著是此類一個或多個項目的詳盡列表，或意味著僅限於列出的一個或多個項目。例如，「包含」組分 A、B 和 C 的物品可以由（即，僅含有）組分 A、B 和 C 組成，或者不僅可以含有組分 A、B 和 C，還可以含有一種或多種其他組分。因此，旨在並理解「包含」及其類似形式以及其語法等效詞包括「基本上由……組成」或「由……組成」的實施例的揭示。

在提供數值範圍的情況下，應瞭解，除非上下文另有明確規定，否則在該範圍的上限與下限之間的每個中間值至下限單位之十分之一或該所述範圍中之中間值涵蓋於本揭示內，在規定的範圍中受任何特別排除的限制。在所述範圍包括一個或兩個限值時，排除那些包括的一者或兩者的範圍亦包括在本揭示中。

本文提及「約」值或參數包括 (和描述) 針對該值或參數本身的變化。例如，涉及「約 X」的描述包括對「X」的描述。

如本文所用，包括在所附申請專利範圍中，單數形式「一個」、「或」和「該」包括複數指示物，除非上下文另外明確指出。 親液劑在蛋白 L 層析中之用途

在一些實施例中，平衡緩衝液可以為任何合適的平衡緩衝液。

在本發明的一些實施例中，平衡緩衝液包含 Tris (即，三(羥甲基)胺基甲烷或三甲烷 (tromethane))。在本發明的一些實施例中，平衡緩衝液包含 NaCl。在本發明的一些實施例中，平衡緩衝液包含 Tris 及 NaCl。

在一些實施例中，Tris 以約 10 mM 至約 100 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中。在一些實施例中，存在於平衡緩衝液中的 Tris 之濃度在約 10 mM 與 100 mM、15 mM 與 100 mM、20 mM 與 100 mM、25 mM 與 100 mM、30 mM 與 100 mM、40 mM 與 100 mM、50 mM 與 100 mM、75 mM 與 100 mM、10 mM 與 75 mM、15 mM 與 75 mM、20 mM 與 75 mM、25 mM 與 75 mM、30 mM 與 75 mM、40 mM 與 75 mM、50 mM 與 75 mM、75 mM 與 75 mM、10 mM 與 50 mM、15 mM 與 50 mM、20 mM 與 50 mM、25 mM 與 50 mM、30 mM 與 50 mM、40 mM 與 50 mM、10 mM 與 40 mM、15 mM 與 40 mM、20 mM 與 40 mM、25 mM 與 40 mM、30 mM 與 40 mM、10 mM 與 30 mM、15 mM 與 30 mM、20 mM 與 30 mM、25 mM 與 30 mM、10 mM 與 25 mM、15 mM 與 25 mM、20 mM 與 25 mM、10 mM 與 20 mM、15 mM 與 20 mM、或 10 mM 與 15 mM 中任一者之間。在一些實施例中，Tris 以超過約 10 mM、15 mM、20 mM、25 mM、30 mM、40 mM、50 mM、75 mM 或 100 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中。

在本發明的一些實施例中，平衡緩衝液包含 MES (2-(N-嗎啉基)乙磺酸)。在一些實施例中，平衡緩衝液包含 MES 及 NaCl。在一些實施例中，平衡緩衝液包含 MOPS (3-(N-嗎啉基)丙磺酸)。在一些實施例中，平衡緩衝液包含 MOPS 及 NaCl。在一些實施例中，平衡緩衝液包含 EDTA (乙二胺四乙酸)。在一些實施例中，平衡緩衝液進一步包含碳酸鹽緩衝液。

在一些實施例中，NaCl 以約 10 mM 至約 100 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中。在一些實施例中，存在於平衡緩衝液中的 NaCl 之濃度在約 10 mM 與 100 mM、15 mM 與 100 mM、20 mM 與 100 mM、25 mM 與 100 mM、30 mM 與 100 mM、40 mM 與 100 mM、50 mM 與 100 mM、75 mM 與 100 mM、10 mM 與 75 mM、15 mM 與 75 mM、20 mM 與 75 mM、25 mM 與 75 mM、30 mM 與 75 mM、40 mM 與 75 mM、50 mM 與 75 mM、75 mM 與 75 mM、10 mM 與 50 mM、15 mM 與 50 mM、20 mM 與 50 mM、25 mM 與 50 mM、30 mM 與 50 mM、40 mM 與 50 mM、10 mM 與 40 mM、15 mM 與 40 mM、20 mM 與 40 mM、25 mM 與 40 mM、30 mM 與 40 mM、10 mM 與 30 mM、15 mM 與 30 mM、20 mM 與 30 mM、25 mM 與 30 mM、10 mM 與 25 mM、15 mM 與 25 mM、20 mM 與 25 mM、10 mM 與 20 mM、15 mM 與 20 mM、或 10 mM 與 15 mM 中任一者之間。在一些實施例中，NaCl 以超過約 10 mM、15 mM、20 mM、25 mM、30 mM、40 mM、50 mM、75 mM 或 100 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中。

在一些實施例中，Tris 以約 10 mM 至約 100 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中並且 NaCl 以約 10 mM 至約 100 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中。在一些實施例中，Tris 以約 10 mM 至約 50 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中並且 NaCl 以約 10 mM 至約 50 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中。在一些實施例中，Tris 以約 20 mM 至約 30 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中並且 NaCl 以約 20 mM 至約 30 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中。在一些實施例中，Tris 以約 25 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中並且 NaCl 以約 25 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中。

在一些實施例中，平衡緩衝液具有約 4.0 至約 10.0 之 pH。在一些實施例中，平衡緩衝液具有約 6.0 至約 9.0 之 pH。在一些實施例中，平衡緩衝液具有約 7.0 至約 8.0 之 pH。在一些實施例中，平衡緩衝液具有在約 6.0 與 9.0、6.5 與 8.5、或 7.0 與 8.0 中任一者之間之 pH。在一些實施例中，平衡緩衝液具有約 6.0、6.5、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.5 或 9.0 中任一者之 pH。在一些實施例中，平衡緩衝液具有約 7.7 或約 7.7 之 pH。在一些實施例中，Tris 以約 10 mM 至約 100 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中，NaCl 以約 10 mM 至約 100 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中，並且平衡緩衝液之 pH 為約 6.0 至約 9.0。在一些實施例中，Tris 以約 10 mM 至約 50 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中，NaCl 以約 10 mM 至約 50 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中，並且平衡緩衝液之 pH 為約 6.5 至約 8.5。在一些實施例中，Tris 以約 20 mM 至約 30 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中，NaCl 以約 20 mM 至約 30 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中，並且平衡緩衝液之 pH 為約 7.5 至約 8.0。在一些實施例中，Tris 以約 25 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中，NaCl 以約 25 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中，並且平衡緩衝液之 pH 為約 7.7。

在一些實施例中，洗滌緩衝液具有約 4 至約 10 之 pH。在一些實施例中，洗滌緩衝液具有約 4 至約 10、約 4 至約 9.5、約 4 至約 9、約 4 至約 8.5、約 4 至約 8、約 4 至約 7.5、約 5 至約 10、約 5 至約 9.5、約 5 至約 9、約 5 至約 8.5、約 5 至約 8、約 5 至約 7.5、約 6 至約 10、約 6 至約 9.5、約 6 至約 9、約 6 至約 8.5、約 6 至約 8、或約 6 至約 7.5 之 pH。在一些實施例中，洗滌緩衝液具有約 4、約 4.5、約 5、約 5.5、約 6、約 6.5、約 7、約 7.5、約 8、約 8.5、約 9、約 9.5 或約 10 之 pH。在一些實施例中，洗滌緩衝液具有約 7.0、約 7.1、約 7.2、約 7.3、約 7.4、約 7.5、約 7.6、約 7.7、約 7.8、約 7.9 或約 8.0 之 pH。

在一些實施例中，抗原結合蛋白以宿主細胞培養上清液 (HCCS) 在步驟 a) 中經負載到蛋白 L 層析材料上。在一些實施例中，抗原結合蛋白以純化的多肽溶液在步驟 a) 中經負載到蛋白 L 層析材料上。在一些實施例中，抗原結合蛋白以來自先前純化步驟的混合物在步驟 a) 中經負載到蛋白 L 層析材料上。先前純化步驟可以為純化程序或工作流程中發生在在步驟 a) 中負載到蛋白 L 層析材料上之前的任何步驟。在一些實施例中，抗原結合蛋白在步驟 a) 中負載到蛋白 L 層析材料上之前係配製在平衡緩衝液中。在一些實施例中，在步驟 a) 中負載到蛋白 L 層析材料上之前，將先前之親液劑添加至包含抗原結合蛋白的 HCCS 中。在一些實施例中，抗原結合蛋白在步驟 a) 中負載到蛋白 L 層析材料上之前係配製在平衡緩衝液及親液劑中。在一些實施例中，親液劑為磷酸鹽或硫酸鹽。在一些實施例中，親液劑為磷酸鉀、硫酸鈉或硫酸銨。在一些實施例中，在步驟 a) 中負載到蛋白 L 層析材料上之前，平衡緩衝液或 HCCS 中的親液劑 (例如磷酸鉀、硫酸鈉或硫酸銨) 之濃度為至少約 100 mM 之任何濃度，該濃度不會導致抗原結合蛋白從溶液中沉澱出來。在一些實施例中，在步驟 a) 中負載到蛋白 L 層析材料上之前，平衡緩衝液或 HCCS 中的親液劑 (例如磷酸鉀、硫酸鈉或硫酸銨) 之濃度為約 100 mM 至約 1000 mM。在一些實施例中，在步驟 a) 中負載到蛋白 L 層析材料上之前，平衡緩衝液或 HCCS 中的親液劑 (例如磷酸鉀、硫酸鈉或硫酸銨) 之濃度在約 100 mM 與 1000 mM、120 mM 與 1000 mM、240 mM 與 1000 mM、360 mM 與 1000 mM、480 mM 與 1000 mM、600 mM 與 1000 mM、800 mM 與 1000 mM、100 mM 與 800 mM、120 mM 與 800 mM、240 mM 與 800 mM、360 mM 與 800 mM、480 mM 與 800 mM、600 mM 與 800 mM、100 mM 與 600 mM、120 mM 與 600 mM、240 mM 與 600 mM、360 mM 與 600 mM、480 mM 與 600 mM、100 mM 與 480 mM、120 mM 與 480 mM、240 mM 與 480 mM、360 mM 與 480 mM、100 mM 與 360 mM、120 mM 與 360 mM、240 mM 與 360 mM、100 mM 與 240 mM、120 mM 與 240 mM、或 100 mM 與 120 mM 中任一者之間。在一些實施例中，在步驟 a) 中負載到蛋白 L 層析材料上之前，平衡緩衝液或 HCCS 中的親液劑 (例如磷酸鉀、硫酸鈉或硫酸銨) 之濃度超過約 100 mM、120 mM、240 mM、360 mM、480 mM、600 mM、800 mM 或 1000 mM 中任一者。在一些實施例中，在平衡緩衝液中的親液劑之濃度為約 100 mM 至約 800 mM。在一些實施例中，在平衡緩衝液中的親液劑之濃度為約 120 mM 至約 600 mM。

在一些實施例中，在平衡緩衝液及/或洗滌緩衝液中的親液劑 (例如磷酸鉀、硫酸鈉或硫酸銨) 之濃度為約 100 mM 至約 800 mM、約 100 mM 至約 700 mM、約 100 mM 至約 600 mM、約 100 mM 至約 500 mM、約 200 mM 至約 800 mM、約 200 mM 至約 700 mM、約 200 mM 至約 600 mM、約 200 mM 至約 500 mM、約 300 mM 至約 800 mM、約 300 mM 至約 700 mM、約 300 mM 至約 600 mM、或約 300 mM 至約 500 mM。在一些實施例中，在平衡緩衝液及/或洗滌緩衝液中的親液劑 (例如磷酸鉀、硫酸鈉或硫酸銨) 之濃度為約 100 mM、125 mM、150 mM、175 mM、200 mM、225 mM、250 mM、275 mM、300 mM、325 mM、350 mM、375 mM、400 mM、425 mM、450 mM、475 mM、500 mM、525 mM、550 mM、575 mM、600 mM、625 mM、650 mM、675 mM、700 mM、725 mM、750 mM、775 mM 或 800 mM。在一些實施例中，親液劑為硫酸鈉。在一些實施例中，親液劑為磷酸鉀。在一些實施例中，親液劑為硫酸銨。

在一些實施例中，步驟 b) 之洗滌緩衝液包含親液劑。在一些實施例中，洗滌緩衝液中之親液劑為磷酸鹽或硫酸鹽。在一些實施例中，洗滌緩衝液中之親液劑為磷酸鉀、硫酸鈉或硫酸銨。在一些實施例中，步驟 b) 之洗滌緩衝液包含平衡緩衝液及親液劑。在一些實施例中，步驟 b) 之洗滌緩衝液中的親液劑 (例如磷酸鉀、硫酸鈉或硫酸銨) 之濃度為至少約 100 mM 之任何濃度，該濃度不會導致抗原結合蛋白從溶液中沉澱出來。在一些實施例中，步驟 b) 之洗滌緩衝液中的親液劑 (例如磷酸鉀、硫酸鈉或硫酸銨) 之濃度為約 100 mM 至約 1000 mM。在一些實施例中，步驟 b) 之洗滌緩衝液中的親液劑 (例如磷酸鉀、硫酸鈉或硫酸銨) 之濃度在約 100 mM 與 1000 mM、120 mM 與 1000 mM、240 mM 與 1000 mM、360 mM 與 1000 mM、480 mM 與 1000 mM、600 mM 與 1000 mM、800 mM 與 1000 mM、100 mM 與 800 mM、120 mM 與 800 mM、240 mM 與 800 mM、360 mM 與 800 mM、480 mM 與 800 mM、600 mM 與 800 mM、100 mM 與 600 mM、120 mM 與 600 mM、240 mM 與 600 mM、360 mM 與 600 mM、480 mM 與 600 mM、100 mM 與 480 mM、120 mM 與 480 mM、240 mM 與 480 mM、360 mM 與 480 mM、100 mM 與 360 mM、120 mM 與 360 mM、240 mM 與 360 mM、100 mM 與 240 mM、120 mM 與 240 mM、或 100 mM 與 120 mM 中任一者之間。在一些實施例中，步驟 b) 之洗滌緩衝液中的親液劑 (例如磷酸鉀、硫酸鈉或硫酸銨) 之濃度超過約 100 mM、120 mM、240 mM、360 mM、480 mM、600 mM、800 mM 或 1000 mM 中任一者。在一些實施例中，在洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 100 mM 至約 800 mM。在一些實施例中，在洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 120 mM 至約 600 mM。

在一些實施例中，在平衡緩衝液及洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 100 mM 至約 800 mM。在一些實施例中，在平衡緩衝液及洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 120 mM 至約 600 mM。

在一些實施例中，步驟 c) 之溶析緩衝液相比平衡緩衝液具有較低的 pH 在一些實施例中，溶析緩衝液具有約 2.0 至約 5.0 之 pH。在一些實施例中，溶析緩衝液具有在約 2.0 與 5.0、2.5 與 5.0、3.0 與 5.0、3.5 與 5.0、4.0 與 5.0、2.0 與 4.0、2.5 與 4.0、3.0 與 4.0、3.5 與 4.0、2.0 與 3.5、2.5 與 3.5、3.0 與 3.5、2.0 與 3.0、2.5 與 3.0、或 2.0 與 2.5 中任一者之間之 pH。在一些實施例中，溶析緩衝液具有約 2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.75、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、4.0 或 5.0 中任一者之 pH。在一些實施例中，溶析緩衝液具有約 2.5、約 2.55、約 2.6、約 2.65、約 2.7、約 2.75、約 2.8、約 2.85、約 2.9、約 2.95、約 3.0、約 3.05、約 3.1、約 3.15、約 3.2、約 3.25 或約 3.3 之 pH。在一些實施例中，溶析緩衝液具有約 2.7、約 2.75、約 2.8、約 2.85、約 2.9 或約 2.95 之 pH。

在一些實施例中，步驟 c) 之溶析緩衝液相比平衡緩衝液具有較高的 pH。例如，一些抗原結合蛋白可能不耐受具有在例如約 2.0 與約 5.0 之間的 pH 之溶析緩衝液的低 pH。在一些實施例中，溶析緩衝液具有約 10.0 或更高之 pH。據此，在一些實施例中，溶析緩衝液具有在約 10.0 與 12.0、10.5 與 12.0、11.0 與 12.0、10.0 與 11.5、或 10.0 與 11.0 中任一者之間之 pH。在一些實施例中，溶析緩衝液具有約 10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9 或 12.0 中任一者之 pH。在一些實施例中，溶析緩衝液具有在約 10.0 與 12.0 之間之 pH。

在一些實施例中，溶析緩衝液包含乙酸。在一些實施例中，溶析緩衝液包含乙酸鈉、檸檬酸鹽或甘胺酸。在一些實施例中，溶析緩衝液包含乙酸、乙酸鈉、檸檬酸鹽或甘胺酸，該乙酸、乙酸鈉、檸檬酸鹽或甘胺酸之濃度在約 50 mM 與 250 mM、75 mM 與 250 mM、100 mM 與 250 mM、125 mM 與 250 mM、150 mM 與 250 mM、175 mM 與 250 mM、200 mM 與 250 mM、50 mM 與 200 mM、75 mM 與 200 mM、100 mM 與 200 mM、125 mM 與 200 mM、150 mM 與 200 mM、175 mM 與 200 mM、50 mM 與 175 mM、75 mM 與 175 mM、100 mM 與 175 mM、125 mM 與 175 mM、150 mM 與 175 mM、50 mM 與 150 mM、75 mM 與 150 mM、100 mM 與 150 mM、125 mM 與 150 mM、50 mM 與 125 mM、75 mM 與 125 mM、100 mM 與 125 mM、50 mM 與 100 mM、75 mM 與 100 mM、或 50 mM 與 75 mM 中任一者之間。在一些實施例中，溶析緩衝液包含乙酸、乙酸鈉、檸檬酸鹽或甘胺酸，該乙酸、乙酸鈉、檸檬酸鹽或甘胺酸之濃度為約 50 mM、75 mM、100 mM、125 mM、150 mM、160 mM、170 mM、175 mM、180 mM、190 mM、200 mM、225 mM 或 250 mM 中任一者。

在一些實施例中，溶析緩衝液包含約 50 mM 乙酸至約 250 mM 乙酸。在一些實施例中，溶析緩衝液包含乙酸，該乙酸之濃度在約 50 mM 與 250 mM、75 mM 與 250 mM、100 mM 與 250 mM、125 mM 與 250 mM、150 mM 與 250 mM、175 mM 與 250 mM、200 mM 與 250 mM、50 mM 與 200 mM、75 mM 與 200 mM、100 mM 與 200 mM、125 mM 與 200 mM、150 mM 與 200 mM、175 mM 與 200 mM、50 mM 與 175 mM、75 mM 與 175 mM、100 mM 與 175 mM、125 mM 與 175 mM、150 mM 與 175 mM、50 mM 與 150 mM、75 mM 與 150 mM、100 mM 與 150 mM、125 mM 與 150 mM、50 mM 與 125 mM、75 mM 與 125 mM、100 mM 與 125 mM、50 mM 與 100 mM、75 mM 與 100 mM、或 50 mM 與 75 mM 中任一者之間。在一些實施例中，溶析緩衝液包含乙酸，該乙酸之濃度為約 50 mM、75 mM、100 mM、125 mM、150 mM、160 mM、170 mM、175 mM、180 mM、190 mM、200 mM、225 mM 或 250 mM 中任一者。在一些實施例中，溶析緩衝液包含約 150 mM 乙酸。在一些實施例中，溶析緩衝液包含處於約 2.8 之 pH 的約 150 mM 乙酸。

在一些實施例中，藉由蛋白 L 層析所純化的抗原結合蛋白為抗體或免疫黏附素或其片段。在一些實施例中，抗體或免疫黏附素或其片段之 VL 域為 λ 亞型 VL 或 κ2 VL。在一些實施例中，VL 域與蛋白 L 結合不佳。在一些實施例中，VL 域為 κ VL 且包含削弱 VL 域與蛋白 L 的結合之修飾。在一些實施例中，該修飾包含 VL 域中的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，VL 域為 κ2 VL。

在一些實施例中，抗原結合蛋白與蛋白 L 結合不佳。例如，在一些實施例中，並且不受理論之束縛，本文所述之方法中所用之抗原結合蛋白與蛋白 L 結合不佳，並且親液劑強化結合抗原結合蛋白與蛋白 L 之結合，而雜質諸如 HMWF 及 LC-二聚體與蛋白 L 之結合可能比抗原結合蛋白更緊密，這可能導致在不存在親液劑的情況下抗原結合蛋白之產率及質量更差。在一些實施例中，與蛋白 L 結合不佳之抗原結合蛋白包含 κ2 亞型之 VL 域。

在一些實施例中，與參考抗原結合蛋白相比，抗原結合蛋白 (例如抗體或免疫黏附素) 與蛋白 L 結合不佳。在一些實施例中，參考抗原結合蛋白為與抗原結合蛋白相同或相近類型之抗原結合蛋白，例如，為抗體。在一些實施例中，與為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白相比，抗原結合蛋白 (例如抗體或免疫黏附素) 與蛋白 L 結合不佳。在一些實施例中，相比參考抗原結合蛋白，抗原結合蛋白 (例如抗體或免疫黏附素) 與蛋白 L 結合較弱。在一些實施例中，相比為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白，抗原結合蛋白 (例如抗體或免疫黏附素) 與蛋白 L 結合較弱。G6-31 (也稱為「G6.31」) 單株抗體為一種抗體片段，其為抗 VEGF Fab，已被廣泛發表。參見例如 Korsisaari 等人，PNAS, 2007, 104(25): 10625-10630。在一些實施例中，G6-31 Fab 可充當參考抗原結合蛋白，以用於判定另一種抗原結合蛋白是否，例如，與被認為對蛋白 L 表現出正常結合的 G6-31 Fab 相比對蛋白 L 表現出更弱或更差之結合。在一些實施例中，對蛋白 L 表現出較弱或較差之結合的抗原結合蛋白可能特別適用於本文所述之方法，其涉及使用親液劑以改進所關注之抗原結合蛋白的產率及純度，這可能受益於強化抗原結合蛋白與蛋白 L 之結合。

在一些實施例中，抗原結合蛋白為單株抗體。在一些實施例中，抗原結合蛋白為人抗體、嵌合抗體或人源化抗體。在一些實施例中，抗體為選自 Fab、Fab'-SH、Fv、scFv 及 (Fab')2 片段的抗體片段。在一些實施例中，抗體不含有 Fc 域。

在一些實施例中，抗體片段為 Fab。在一些實施例中，Fab 包含缺乏疏水性區塊或具有弱疏水性區塊之用於與蛋白 L 結合的結合位點。在一些實施例中，用於與蛋白 L 結合的結合位點缺乏疏水性區塊。在一些實施例中，用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。在一些實施例中，用於與蛋白 L 結合的結合位點包含親水性區塊。

在一些實施例中，與蛋白 L 結合不佳之抗原結合蛋白包含缺乏疏水性區塊或具有弱疏水性區塊之用於與蛋白 L 結合的結合位點。在一些實施例中，與用於與為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白之蛋白 L 結合的結合位點相比，用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。

在一些實施例中，與蛋白 L 結合不佳之抗原結合蛋白包含親水性區塊。

在一些實施例中，抗原結合蛋白 (例如抗體或免疫黏附素) 對蛋白 L 之結合親和力 (EC50) 及/或解離常數具有的值比為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白對蛋白 L 之結合親和力 (EC50) 及/或解離常數的值高。在一些實施例中，抗原結合蛋白 (例如抗體或免疫黏附素) 對蛋白 L 之結合親和力 (EC50) 及/或解離常數具有的值比為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白對蛋白 L 之結合親和力 (EC50) 及/或解離常數的值高至少 15%、至少 25%、至少 50%、至少 75%、至少 100%、至少 150%、至少 200%、至少 300%、至少 400% 或至少 500%。

在一些實施例中，抗原結合蛋白，例如 Fab，包含 VL 域，並且結合位點包含在 VL 域內。

在一些實施例中，抗體為多特異性抗體。在一些實施例中，多特異性抗體為雙特異性抗體。在一些實施例中，多特異性抗體包含 VL 域及第二 VL 域，且其中 VL 域為卡帕 (κ) VL。在一些實施例中，VL 域為 κ2 VL。在一些實施例中，VL 域與蛋白 L 結合不佳。在一些實施例中，VL 域與蛋白 L 結合不佳且第二 VL 域不與蛋白 L 結合。在一些實施例中，抗原結合蛋白 (例如抗體或免疫黏附素) 包含 VL 域，並且與包含 VL 域的參考抗原結合蛋白相比，與蛋白 L 結合不佳。在一些實施例中，參考抗原結合蛋白為與抗原結合蛋白相同或相近類型之抗原結合蛋白，例如，為抗體。在一些實施例中，抗原結合蛋白 (例如抗體或免疫黏附素) 包含 VL 域，並且與為單株抗體 G6-31 的包含 VL 域的參考抗原結合蛋白相比，與蛋白 L 結合不佳。在一些實施例中，抗原結合蛋白 (例如抗體或免疫黏附素) 包含 VL 域，並且相比包含 VL 域的參考抗原結合蛋白，與蛋白 L 結合較弱。在一些實施例中，抗原結合蛋白 (例如抗體或免疫黏附素) 包含 VL 域，並且相比為單株抗體 G6-31 的包含 VL 域的參考抗原結合蛋白，與蛋白 L 結合較弱。在一些實施例中，與為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白之 VL 域與蛋白 L 的結合相比，該 VL 域與蛋白 L 的結合不佳。

在一些實施例中，第二 VL 域為拉目達 (λ) VL。在一些實施例中，VL 域為 κ VL 且包含削弱 VL 域與蛋白 L 的結合之修飾。在一些實施例中，該修飾包含 VL 域中的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，VL 域為 κ2 VL。

在一些實施例中，VL 域為 λ 亞型 VL 或 κ2 VL。蛋白 L 層析

蛋白 L 為細菌大消化鏈球菌之細胞壁蛋白 (Björck 等人 (1988) J. Immunol.140: 1194-1197)，該細胞壁蛋白結合至 κ 輕鏈之可變區而不干擾抗體或抗體片段之抗原結合位點 (Nilson 等人 (1992) J Biol Chem.267: 2234-2239)。蛋白 L 在 κ 輕鏈之 V 區與 FW1 交互作用，並且其結合僅限於 κ1、κ3 及 κ4 亞型之 VL，但不結合或弱結合 κ2 亞型之 VL。市售蛋白 L 層析材料包括但不限於 Pierce™ 蛋白 L 層析匣、Capto™ L 層析、HiTrap® 蛋白 L 層析、KanCap™ L 層析、TOYOPEARL® AF-rProtein L-650F 層析或 MabSelect ^TMVL 層析。 額外步驟

在一些態樣中，本發明提供了涉及或與如本文所述之抗原結合蛋白的純化相關的額外步驟。涉及或與純化相關的額外步驟，以及進行這些步驟的方法是已知的。參見，例如，Liu 等人 mAbs, 2, 2010，其在此藉由引用整體併入。

在一些實施例中，抗原結合蛋白的純化進一步包含樣品處理步驟，諸如樣品製備步驟。在一些實施例中，抗原結合蛋白的純化進一步包含澄清步驟，諸如澄清 HCCF。在一些實施例中，抗原結合蛋白的純化進一步包含宿主細胞及宿主細胞碎片去除步驟，諸如從獲自純化平台的樣品及/或組成物中去除宿主細胞及宿主細胞碎片。在一些實施例中，抗原結合蛋白的純化進一步包含離心步驟。在一些實施例中，抗原結合蛋白的純化進一步包含無菌過濾步驟。在一些實施例中，抗原結合蛋白的純化進一步包含切向流微過濾步驟。在一些實施例中，抗原結合蛋白的純化進一步包含絮凝/沉澱步驟。 抗原結合蛋白

在一些態樣中，使用包含親液劑的洗滌緩衝液的蛋白 L 層析方法可用於從抗原結合蛋白製劑中純化並濃縮包含 VL 域的抗原結合蛋白。在一些實施例中，抗原結合蛋白製劑源自宿主細胞製劑。在一些實施例中，宿主細胞製劑是宿主細胞培養液 (HCCF)。在一些實施例中，抗原結合蛋白製劑包含宿主細胞培養液的一部分。在一些實施例中，抗原結合蛋白製劑源自宿主細胞培養液。在一些實施例中，抗原結合蛋白製劑包含宿主細胞。在一些實施例中，抗原結合蛋白製劑包含宿主細胞的組分，諸如宿主細胞碎片。在一些實施例中，宿主細胞是細菌細胞。在一些實施例中，宿主細胞是昆蟲細胞。在一些實施例中，宿主細胞是哺乳動物細胞。在一些實施例中，宿主細胞是中華倉鼠卵巢 (CHO) 細胞。在一些實施例中，宿主細胞是大腸桿菌 ( E. coli) 細胞。 抗原結合蛋白

待藉由蛋白 L 層析 (包括使用本文所述之方法在洗滌緩衝液中使用親液劑) 所純化的抗原結合蛋白通常使用重組技術來產生。用於產生重組蛋白的方法描述於例如美國專利第 5,534,615 及 4,816,567 號中，其藉由引用具體併入本文。在一些實施例中，所關注之蛋白質在 CHO 細胞中產生 (參見例如 WO 94/11026)。在一些實施例中，所關注之多肽在大腸桿菌細胞中產生。參見例如美國專利第 5,648,237 號；美國專利第 5,789,199 號及美國專利第 5,840,523 號，其描述了用於優化表現及分泌之翻譯起始區 (TIR) 及訊息序列。亦參見 Charlton, Methods in Molecular Biology，第 248 卷 (B. K. C. Lo 編輯，Humana Press, Totowa, N.J., 2003)，第 245-254 頁，其描述多肽片段在大腸桿菌中之表現。當使用重組技術時，多肽可以在細胞內、周質間隙中產生或直接分泌到培養基。

可自培養基或自宿主細胞裂解物回收抗原結合蛋白。可藉由各種物理或化學手段 (諸如冷凍-解凍循環、音波處理、機械破壞或細胞裂解劑) 來破碎用於表現抗原結合蛋白之細胞。如果抗原結合蛋白在細胞內產生，作為第一步，例如藉由離心或超濾去除顆粒碎片 (宿主細胞或裂解的片段)。Carter 等人， Bio/Technology10: 163-167 (1992) 描述了分離分泌到大腸桿菌的周質間隙的多肽的程序。簡而言之，將細胞糊在乙酸鈉 (pH 3.5)、EDTA 及苯甲基磺醯氟 (PMSF) 存在下解凍約 30 分鐘。細胞碎片可以藉由離心去除。當抗原結合蛋白分泌到培養基中時，來自此類表現系統的上清液通常首先使用市售多肽濃度過濾器 (例如 Amicon ^®或 Millipore Pellicon ^®超濾裝置) 進行濃縮。可以在上述步驟中之任一者中包括蛋白酶抑制劑 (如 PMSF) 以抑制蛋白水解，並且可以包括抗生素以防止外源污染物的生長。

在一些實施例中，抗原結合蛋白在藉由本發明之方法進行分析之前已經被純化或部分純化。例如，該方法之抗原結合蛋白在來自親和層析、陽離子交換層析、陰離子交換層析、混合模式層析及疏水性交互作用層析的溶析液中。

待藉由蛋白 L 層析 (包括但不限於使用本文所述之方法在洗滌緩衝液中使用親液劑) 所純化的抗原結合蛋白的實例包括但不限於免疫球蛋白、免疫黏附素、抗體及免疫結合物。 (A) 抗體

在本文所述之任何方法的一些實施例中，抗原結合蛋白為抗體或免疫黏附素。 (i) 單株抗體

在一些實施例中，抗體為單株抗體。單株抗體係獲自實質上同源抗體之群體，亦即，該群體中所包含之個別抗體為相同的及/或結合同一抗原決定基，但不包括在單株抗體之產生期間出現的可能變異體，此類變異體一般以少量存在。因此，修飾語「單株」指示抗體不為不同或多株抗體之混合物之特徵。

例如，單株抗體可使用首先由 Kohler 等人, Nature256:495 (1975) 中描述的融合瘤方法進行製備，或藉由重組 DNA 方法 (美國專利第 4,816,567 號) 進行製備。

在融合瘤方法中，如本文所述對小鼠或其他適當的宿主動物 (諸如倉鼠) 進行免疫接種，以誘導產生或能夠產生與用於免疫接種的多肽特異性結合之抗體的淋巴球。可替代地，可以在活體外免疫淋巴球。然後使用合適的融合劑 (諸如聚乙二醇) 將淋巴球與骨髓瘤細胞系融合，以形成融合瘤細胞 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 第 59-103 頁 (Academic Press, 1986))。

將如此製備的融合瘤細胞接種並生長於適當培養基中，該培養基較佳含有一種或多種抑制未融合的親代骨髓瘤細胞生長或存活的物質。例如，如果親代骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶 (HGPRT 或 HPRT)，則用於融合瘤之培養基通常包括次黃嘌呤、胺蝶呤及胸苷 (HAT 培養基)，該等物質阻止 HGPRT 缺陷細胞之生長。

在一些實施例中，骨髓瘤細胞是高效融合的細胞，其支持被選抗體產生細胞穩定地高水平產生抗體，並對培養基諸如 HAT 培養基敏感。其中，在一些實施例中，骨髓瘤細胞株為鼠骨髓瘤細胞株，諸如源自可得自美國加利福尼亞州聖地牙哥的 Salk Institute Cell Distribution Center 的 MOPC-21 及 MPC-11 小鼠腫瘤的鼠骨髓瘤細胞株，及可得自美國馬里蘭州洛克維市的 American Type Culture Collection 的 SP-2 或 X63-Ag8-653 細胞。亦描述了用於人類單株抗體之生產的人骨髓瘤及小鼠-人異源骨髓瘤細胞系 (Kozbor, J. Immunol. 133:3001 (1984)；Brodeur 等人, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 第 51-63 頁 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。

測定融合瘤細胞在其中生長的培養基針對抗原的單株抗體的產生。在一些實施例中，融合瘤細胞產生的單株抗體的結合特異性藉由免疫沉澱或活體外結合測定法 (諸如放射免疫檢定 (RIA) 或酶聯免疫吸附測定 (ELISA)) 來確定。

單株抗體之結合親和力可例如藉由 Munson 等人, Anal. Biochem.107:220 (1980) 的 Scatchard 分析方法進行確定。

鑑定出產生具有所需之特異性、親和力及/或活性之抗體的融合瘤細胞後，即可藉由有限稀釋方法將殖株亞選殖，並藉由標準方法使其生長 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice第 59-103 頁 (Academic Press, 1986))。用於此目的的合適培養基包括例如 D-MEM 或 RPMI-1640 培養基。此外，融合瘤細胞可以在動物活體內作為腹水性腫瘤生長。

由次選殖株分泌的單株抗體藉由習知免疫球蛋白純化程序，諸如多肽 A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親及層析適當地從培養基、腹水或血清中分離。

編碼單株抗體是之 DNA 可使用常規方法 (例如，藉由使用能夠與編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針) 輕易地分離並測序。在一些實施例中，利用融合瘤細胞作為此類 DNA 的來源。分離後，可將 DNA 放入表現載體中，然後將其轉染到宿主細胞 (諸如大腸桿菌細胞、猴 COS 細胞，中華倉鼠卵巢 (CHO) 細胞或不另外產生免疫球蛋白多肽的骨髓瘤細胞)，以獲得重組宿主細胞中單株抗體之合成。有關編碼抗體之 DNA 的細菌中之重組表現的綜述文章包括：Skerra 等人, Curr. Opinion in Immunol. 5:256-262 (1993) 及 Plückthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)。

在一進一步實施例中，可從使用在 McCafferty 等人, Nature348:552-554 (1990) 中描述的技術生成的抗體噬菌體庫中分離抗體或抗體片段。Clackson 等人, Nature352:624-628 (1991) 及 Marks 等人, J. Mol. Biol.222:581-597 (1991) 分別描述了使用噬菌體庫分離鼠及人抗體。後續出版物描述了藉由鏈改組 (Marks 等人, Bio/Technology10:779-783 (1992)) 產生高親和力 (處於 nM 範圍內) 人抗體以及組合感染及活體內重組作為構建非常大之噬菌體庫的策略 (Waterhouse 等人, Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993))。因此，這些技術是用於分離單株抗體之傳統單株抗體融合瘤技術的可行之替代方法。

亦可例如藉由用人重鏈及輕鏈恆定域的編碼序列替代同源鼠序列 (美國專利第 4,816,567 號；Morrison 等人, P roc. Natl Acad. Sci. USA81:6851 (1984)) 或藉由將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列共價連接至免疫球蛋白編碼序列，對 DNA 進行修飾。

通常，此類非免疫球蛋白多肽取代抗體的恆定域，或它們取代抗體的一個抗原結合位點的可變域，以產生包含一個對抗原具有特異性的抗原結合位點及另一對不同抗原具有特異性的抗原結合位點的嵌合二價抗體。

在本文所述之任何方法的一些實施例中，抗體為 IgA、IgD、IgE、IgG 或 IgM。在一些實施例中，抗體為 IgG 單株抗體。 (ii) 人源化抗體

在一些實施例中，抗體為人源化抗體。用於使非人抗體人源化的方法已描述於本領域中。在一些實施例中，人源化抗體具有一個或多個從非人源引入的胺基酸殘基。這些非人胺基酸殘基通常被稱為「導入」殘基，它們通常取自「導入」可變域。人源化基本上可以按照 Winter 及同事們的方法 (Jones 等人, Nature321:522-525 (1986)；Riechmann 等人, Nature332:323-327 (1988)；Verhoeyen 等人, Science239:1534-1536 (1988))，藉由用高度可變區代替人抗體的相應序列來進行。因此，此類「人源化」抗體為嵌合抗體 (美國專利第 4,816,567 號)，其中基本上少於完整的人可變域被來自非人物種的相應序列取代。在實踐中，人源化抗體通常為人抗體，其中一些高度可變區殘基及可能的一些 FR 殘基被囓齒動物抗體中類似位點的殘基取代。

選擇用於製備人源化抗體的輕鏈及重鏈人類可變域均對於降低抗原性非常重要。根據所謂的「最佳擬合」方法，根據已知的人可變域序列的整個基因庫對囓齒動物抗體的可變域序列進行篩選。然後接受最接近囓齒動物之人類序列為人源化抗體之人類骨架區 (FR) (Sims 等人, J. Immunol.151:2296 (1993)；Chothia 等人, J. Mol. Biol.196:901 (1987))。另一種方法使用源自輕鏈或重鏈可變區的特定亞組的所有人抗體的共通序列的特定骨架區。相同的骨架可用於幾種不同的人源化抗體 (Carter 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:4285 (1992)；Presta 等人, J. Immunol. 151:2623 (1993))。

更重要的是，抗體經人源化，保留對抗原的高親和力及其他有利的生物學特性。為了實現這一目標，在該等方法的一些實施例中，藉由使用親本及人源化序列的三維模型分析親本序列及多種概念性人源化產物的方法來製備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常可獲得並且為本領域技術人員所熟悉。電腦程式可用於說明及顯示選定候選免疫球蛋白序列的可能的三維構型結構。檢查這些顯示允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能的作用，亦即分析影響候選免疫球蛋白結合其抗原的能力的殘基。以這種方式，可以從受體及導入序列中選擇和組合 FR 殘基，從而實現所需的抗體特性，諸如提高對靶抗原的親和力。一般而言，高變區殘基直接且最實質地參與影響抗原結合。 (iii) 人抗體

在一些實施例中，抗體為人抗體。作為人源化的替代物，可生成人抗體。例如，現在可以生產轉基因動物 (例如，小鼠)，它們在免疫接種後能夠在沒有內源性免疫球蛋白產生的情況下產生完整人抗體庫。例如，已經描述了嵌合及種系突變小鼠中抗體重鏈連接區 (J _H) 基因之同型合子缺失導致內源性抗體產生的完全抑制。在此類種系突變小鼠中轉移人類種系免疫球蛋白基因陣列將導致在抗原攻擊後產生人抗體。參見例如，Jakobovits 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:2551 (1993)；Jakobovits 等人, Nature362:255-258 (1993)；Bruggermann 等人 , Year in Immuno.7:33 (1993)；及美國專利第 5,591,669 號；第 5,589,369 號；及第 5,545,807 號。

替代性地，可使用噬菌體展示技術 (McCafferty 等人, Nature348:552-553 (1990)) 從來自未免疫接種供體的免疫球蛋白可變 (V) 域基因庫活體外產生人抗體及抗體片段。根據該技術，抗體 V 域基因被框內選殖到絲狀噬菌體 (諸如 M13 或 fd) 的主要或次要外殼多肽基因中，並作為功能性抗體片段展示於噬菌體粒子的表面上。由於絲狀粒子含有噬菌體基因體的單鏈 DNA 拷貝，基於抗體的功能特性的選擇亦導致對編碼表現出那些特性的抗體之基因的選擇。因此，噬菌體模擬 B 細胞的一些特性。噬菌體展示可以多種形式進行；其綜述參見例如，Johnson, Kevin S. 及 Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology3:564-571 (1993)。若干 V 基因片段來源可用於噬菌體展示。Clackson 等人 ( Nature352 :624-628 (1991)) 從源自免疫接種之小鼠脾臟的小型 V 基因隨機組合文庫中分離出多種抗噁唑啉酮抗體。可構建來自未免疫接種之人類供體的 V 基因庫，並可基本上按照 Marks 等人, J. Mol. Biol.222:581-597 (1991) 或 Griffith 等人, EMBO J.12:725-734 (1993) 所述之技術分離針對多種抗原 (包括自體抗原) 的抗體。亦參見美國專利第 5,565,332 號及第 5,573,905 號。

人抗體亦可由活體外活化之 B 細胞產生 (參見美國專利第 5,567,610 號及第 5,229,275 號)。 (iv) 抗體片段

在一些實施例中，抗體為抗體片段。在一些實施例中，抗體片段為 Fab，Fab'-SH、Fv、scFv 或 (Fab')2 片段。在一些實施例中，抗體片段為 Fab。在一些實施例中，抗體為包含 Fc 受體結合域的抗體片段。已開發出用於產生抗體片段的各種技術。傳統上，此等片段係經由完整抗體之蛋白水解消化而獲得 (參見例如, Morimoto 等人, Journal of Biochemical and Biophysical Methods24:107-117 (1992)；及 Brennan 等人, Science229:81 (1985))。然而，此等片段現可藉由重組型宿主細胞直接產生。例如，可將抗體片段與如上文所述之抗體噬菌體文庫分離。

在一些實施例中，提供本文所述的抗體片段。在一些實施例中，抗體片段為抗原結合片段。在一些實施例中，抗體片段為包含 Fc 受體結合域的抗原結合片段。在一些實施例中，抗體片段為包含 Fcγ 受體結合域的抗原結合片段。 (v) 雙特異性抗體

在一些實施例中，抗體為雙特異性抗體。雙特異性抗體為對至少兩個不同抗原決定基具有結合特異性的抗體。示例性雙特異性抗體可結合至兩個不同抗原決定基。替代性地，雙特異性抗體結合臂可以與結合至白血球上的觸發分子諸如 T 細胞受體分子 (例如，CD2 或 CD3)、或 IgG 的 Fc 受體 (FcγR) 諸如 FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32) 及 FcγRIII (CD16) 的臂合併，以便將細胞防禦機制集中於細胞上。雙特異性抗體可以製備為全長抗體或抗體片段 (例如 F(ab') ₂雙特異性抗體)。

用於製備雙特異性抗體的方法為本領域中所知。全長雙特異性抗體的傳統生產基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之共表現，其中兩條鏈具有不同特異性 (Millstein 等人, Nature305:537-539 (1983))。由於免疫球蛋白重鏈及輕鏈之隨機分配律，這些融合瘤 (quadromas) 產生 10 種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結構。正確的分子通常藉由親及層析步驟來純化，該過程相當繁瑣，且產品產率低。WO 93/08829 及 Traunecker 等人 , EMBO J., 10:3655-3659 (1991) 中揭示了類似的程序。

根據不同的方法，將具有所需結合特異性 (抗體-抗原結合位點) 的抗體可變域與免疫球蛋白恆定域序列融合。在一些實施例中，融合係與免疫球蛋白重鏈恆定域 (包含鉸鏈、CH2 及 CH3 區的至少一部分) 融合。在一些實施例中，含有輕鏈結合所必需之位點的第一重鏈恆定區 (CH1) 存在於融合物中的至少一者中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物及 (如果需要) 免疫球蛋白輕鏈的 DNA 插入單獨的表現載體中，並共轉染至適當的宿主生物體中。當用於該構建的三條多肽鏈的不等比率提供最佳產率時，這在實施例中調節三個多肽片段的相互比例方面提供了巨大靈活性。然而，當至少兩條多肽鏈以相等比率表現導致高產率或當比率無特定意義時，可以將兩條或所有三條多肽鏈的編碼序列插入一種表現載體中。

在該方法的一些實施例中，雙特異性抗體由在一個臂中具有第一結合特異性的雜交免疫球蛋白重鏈及在另一個臂中的雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對 (提供第二結合特異性) 構成。發現該不對稱結構有利於將所需之雙特異性化合物與不需要的免疫球蛋白鏈組合分離，因為僅在雙特異性分子的一半中存在免疫球蛋白輕鏈，提供了一種簡便的分離方式。該方法揭示於 WO 94/04690 中。關於生成雙特異性抗體之其他細節，參見例如 Suresh 等人, Methods in Enzymology121:210 (1986)。

根據美國專利第 5,731,168 號中描述的另一種方法，可對一對抗體分子之間的界面進行工程改造，以最大限度提高從重組細胞培養物中回收的異二聚體之百分比。在一些實施例中，界面包含抗體恆定域之 C _H3 域的至少一部分。在該方法中，用較大側鏈 (例如酪胺酸或色胺酸) 取代第一抗體分子界面上之一條或多條較小的胺基酸側鏈。藉由將較大胺基酸側鏈取代為較小的胺基酸側鏈 (例如丙胺酸或蘇胺酸)，在第二抗體分子之界面上形成與一條或多條較大側鏈具有相同或相近大小的互補「空腔」。這提供了一種用於提高異二聚體而非其他不需要的最終產物 (諸如同二聚體) 之產率的機制。

雙特異性抗體包括交聯或「異結合物 (heteroconjugate)」抗體。例如，異結合物中的一種抗體可連接至抗生物素蛋白，另一種抗體連接至生物素。例如，已提出此類抗體將免疫系統細胞靶向不需要的細胞 (美國專利第 4,676,980 號)，並用於治療 HIV 感染 (WO 91/00360、WO 92/200373 及 EP 0308936)。可以使用任何方便的交聯方法來製備異結合物抗體。適當的交聯劑為本領域所熟知，並與許多交聯技術一起揭示於美國專利第 4,676,980 號中。

該文獻中亦描述了用於由抗體片段生成雙特異性抗體之技術。例如，可使用化學鍵結來製備雙特異性抗體。Brennan 等人, Science229: 81 (1985) 描述了一種程序，其中完整抗體經蛋白水解切割以生成 F(ab') ₂片段。這些片段在二硫醇錯合劑亞砷酸鈉存在下被還原，以穩定鄰位二硫醇並防止分子間二硫化物形成。然後將生成的 Fab' 片段轉化為硫代硝基苯甲酸酯 (TNB) 衍生物。然後將 Fab'-TNB 衍生物中的一種藉由用巰基乙胺還原而重新轉化為 Fab'-硫醇，並與等莫耳量的另一種 Fab'-TNB 衍生物混合，以形成雙特異性抗體。所產生的雙特異性抗體可用為酶之選擇性固定化劑。

亦描述了直接由重組細胞培養物製備並分離雙特異性抗體片段的各種技術。例如，已經使用白胺酸拉鏈生產了雙特異性抗體。Kostelny 等人, J. Immunol.148(5):1547-1553 (1992)。將來自 Fos 及 Jun 蛋白的白胺酸拉鏈肽藉由基因融合連接到兩種不同抗體的 Fab' 部分。抗體同二聚體在鉸鏈區被還原以形成單體，然後重新氧化，以形成抗體異二聚體。該方法亦可用於生產抗體同二聚體。由 Hollinger 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:6444-6448 (1993) 所描述之「雙抗體」技術提供了用於製備雙特異性抗體片段的替代機制。這些片段包含藉由連接子連接至輕鏈可變域 (V _L) 的重鏈可變域 (V _H)，該連接子過短，以致不能在同一條鏈上的兩個域之間配對。因此，迫使一個片段的 V _H及 V _L域與另一個片段的互補 V _L及 V _H域配對，從而形成兩個抗原結合位點。亦有報道用於藉由使用單鏈 Fv (sFv) 二聚體製備雙特異性抗體片段的另一策略。參見 Gruber 等人, J. Immunol.152:5368 (1994)。

設想到具有多於兩個價態的抗體。例如，可製備三特異性抗體。Tutt 等人, J. Immunol.147: 60 (1991)。 (v) 多價抗體

在一些實施例中，抗體為多價抗體。多價抗體可以比二價抗體更快速被表現抗體結合之抗原的細胞內化 (及/或分解代謝)。本文提供的抗體可為具有三個或更多個抗原結合位點的多價抗體 (不是 IgM 類) (例如，四價抗體)，其可藉由編碼抗體之多肽鏈的核酸的重組表現容易地產生。多價抗體可包含二聚化域及三個或更多個抗原結合位點。較佳之二聚化域包含 Fc 區或鉸鏈區 (或由其組成)。在這種情形下，抗體將包含 Fc 區及 Fc 區胺基末端的三個或更多個抗原結合位點。本文較佳之多價抗體包含三個至約八個、但較佳的是四個抗原結合位點 (或由其組成)。多價抗體包含至少一條多肽鏈 (且較佳的是兩條多肽鏈)，其中一條或多條多肽鏈包含兩個或更多個可變域。例如，一條或多條多肽鏈可以包含 VD1-(X1)n-VD2-(X2) n-Fc，其中 VD1 為第一可變域，VD2 為第二可變域，Fc 為 Fc 區的一條多肽鏈，X1 及 X2 代表胺基酸或多肽，且 n 為 0 或 1。例如，一種或多種多肽鏈可包含：VH-CH1-撓性連接子-VH-CH1-Fc 區鏈；或 VH-CH1-VH-CH1-Fc 區鏈。本文之多價抗體較佳地進一步包含至少兩個 (較佳的是四個) 輕鏈可變域多肽。本文之多價抗體可例如包含約兩個至約八個輕鏈可變域多肽。本文所設想之輕鏈可變域多肽包含輕鏈可變域，並且視情況進一步包含 CL 域。

在一些實施例中，抗體為多特異性抗體。多特異性抗體包括但不限於包含重鏈可變域 (V _H) 及輕鏈可變域 (V _L) 的抗體，其中 V _HV _L單元具有多抗原決定基特異性、具有兩個或更多個 V _L及 V _H域的抗體，各 V _HV _L單元結合不同抗原決定基、具有兩個或多個單一可變域的抗體，各單一可變域結合不同抗原決定基、全長抗體、抗體片段，諸如 Fab、Fv、dsFv、scFv、雙抗體、雙特異性雙抗體、三抗體、三功能抗體、已經共價或非共價連接的抗體片段。在一些實施例中，多特異性抗體包含 VH 域及第二 VH 域，它們各自結合至不同抗原決定基。在一些實施例中，抗體具有多抗原決定基特異性，例如，與相同或不同靶標上的兩個或更多個不同抗原決定基特異性結合的能力。在一些實施例中，抗體是單特異性的；例如，僅結合一個抗原決定基的抗體。根據一個實施例，多特異性抗體為 IgG 抗體，其以 5 μM 至 0.001 pM、3 μM 至 0.001 pM、1 μM 至 0.001 pM、0.5 μM 至 0.001 pM 或 0.1 μM 至 0.001 pM 的親和力與各抗原決定基結合。 (vi) 其他抗體修飾

可能希望在效應功能方面修飾本文所提供之抗體，例如，以便提高抗體的抗原依賴性細胞媒介的細胞毒性 (ADCC) 及/或補體依賴性細胞毒性 (CDC)。這可以藉由在抗體的 Fc 區中引入一個或多個胺基酸取代來實現。替代性地或另外地，可以將一個或多個半胱胺酸殘基引入 Fc 區，從而允許在該區形成鏈間二硫鍵。由此生成的同二聚體抗體可能具有改善的內化能力及/或增加的補體媒介的細胞殺傷及抗體依賴性細胞毒性 (ADCC)。參見 Caron 等人, J. Exp Med.176:1191-1195 (1992) 及 Shopes, B. J., Immunol.148:2918-2922 (1992)。如 Wolff 等人, Cancer Research53:2560-2565 (1993) 中所述，亦可使用異雙功能交聯劑製備具有增強的抗腫瘤活性的同二聚體抗體。替代性地，抗體可經工程改造，其具有雙 Fc 區，從而可以具有增強的補體媒介的裂解及 ADCC 能力。參見 Stevenson 等人, Anti-Cancer Drug Design3:219-230 (1989).

為增加抗體的血清半衰期，可如 US 2006/0067930 中所述在抗體中進行胺基酸改變，其在此藉由引用整體併入。 (B) 多肽變異體及修飾

本文所述之多肽 (例如，抗原結合蛋白)，包括抗體，的胺基酸序列修飾可用於純化本文所述之多肽 (例如，抗原結合蛋白) 的方法。 (i) 變異體多肽

「多肽變異體」意指多肽 (例如，抗原結合蛋白)，較佳的是活性多肽，如本文所定義，其與多肽之全長天然序列、缺乏訊息肽的多肽序列、多肽的細胞外域 (具有或不具有訊息肽) 具有至少約 80% 的胺基酸序列同一性。此類多肽變異體包括例如其中一個或多個胺基酸殘基在全長天然胺基酸序列的 N 端或 C 端被添加或缺失的多肽。通常，TAT 多肽變異體將與全長天然序列多肽序列、缺乏訊息肽的多肽序列、多肽的細胞外域 (具有或不具有訊息肽) 具有至少約 80% 的胺基酸序列同一性，替代性地至少約 85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的胺基酸序列同一性。視情況，與天然多肽序列相比，變異體多肽將具有不超過一個保守胺基酸取代，或者與天然多肽序列相比，不超過約 2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個中任一者之保守胺基酸取代。

例如，當與全長天然多肽比較時，變異體多肽可以在 N 端或 C 端被截短，或者可以缺乏內部殘基。某些變異體多肽可能缺乏對所需生物活性而言并非至關重要的胺基酸殘基。這些具有截短、缺失及插入的變異體多肽可以藉由許多習用技術中的任何一種來製備。可以化學合成所需之變異體多肽。另一種適當的技術涉及藉由聚合酶鏈反應 (PCR) 分離並擴增編碼所需變異體多肽的核酸片段。在 PCR 的 5' 及 3' 引物處使用定義核酸片段之所需末端的寡核苷酸。較佳的是，變異體多肽與本文所揭示之天然多肽共享至少一種生物及/或免疫活性。

胺基酸序列插入包括胺基及/或羧基末端融合體之長度，從一個殘基到包含一百個或更多殘基之多肽，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入的實例包括具有 N 末端甲硫胺醯基殘基的抗體或與細胞毒性多肽融合的抗體。抗體分子之其他插入變異體包括與抗體的 N 端或 C 端融合的酶或提高抗體血清半衰期之多肽。

例如，可能需要改進多肽 (例如，抗原結合蛋白) 之結合親和力及/或其他生物特性。多肽的胺基酸序列變異體係藉由將適當的核苷酸變化引入抗體核酸或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如多肽之胺基酸序列中的殘基的缺失及/或插入及/或取代。進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構建體，其限制條件為最終構建體具有所需特徵。胺基酸變化亦可改變多肽 (例如，抗體) 的轉譯後過程，諸如改變醣基化位點的數量或位置。

藉由將多肽之序列與已知的同源多肽分子的序列進行比較，並最大程度地減少高同源性區中胺基酸序列變化數，可以找到確定可以插入、取代或刪除哪些胺基酸殘基而不會對所需活性產生不利影響的指導。

如 Cunningham 及 Wells, Science244:1081-1085 (1989) 所述，用於鑑定多肽 (例如，抗原結合蛋白) 的作為較佳之誘變位置的某些殘基或區域的一種有用的方法稱為「丙胺酸掃描誘變」。在該方法中，殘基或標靶殘基組 (例如，帶電殘基，諸如 Arg、Asp、His、Lys 及 Glu) 經鑑定且經中性或帶負電胺基酸 (最佳的是丙胺酸或聚丙胺酸) 取代以影響胺基酸與抗原之交互作用。然後，藉由在取代位點處或針對取代位點引入進一步或其他變異體，對顯示對取代具有功能敏感性的那些胺基酸位置進行細化。因此，雖然引入胺基酸序列變體的位點經預先確定，但突變本身的性質無需預先確定。例如，為分析給定位點突變的性能，在標靶密碼子或區域進行 ala 掃描或隨機誘變，並篩選具有所需活性的所表現之抗體變異體。

另一種類型的變異體為胺基酸取代變異體。這些變異體在抗體分子中具有至少一個胺基酸殘基被不同殘基取代。針對取代誘變最關注的位點包括高度可變區，但亦設想到 FR 改變。保留取代列於下表 1 之「例示性取代」標題下。如果此類取代導致生物活性改變，則可以引入更實質性的改變，在表 1 中命名為「取代」，或者如以下參考胺基酸類別進一步描述的，並篩選產物。

表 1 .

原始殘基	取代	例示性取代
Ala (A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg (R)	Lys；Gln；Asn	Lys
Asn (N)	Gln；His；Asp；Lys；Arg	Gln
Asp (D)	Glu；Asn	Glu
Cys (C)	Ser；Ala	Ser
Gln (Q)	Asn；Glu	Asn
Glu (E)	Asp；Gln	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile (I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸	Leu
Leu (L)	正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys (K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met (M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe (F)	Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Val；Ser	Ser
Trp (W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val (V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸	Leu

多肽的生物學特性的實質性修飾係藉由選擇取代來達成，該取代在維持 (a) 該取代區域中的多肽主鏈結構，例如片狀或螺旋狀構造、(b) 分子在靶位點處的電荷或疏水性、或 (c) 側鏈的大部分的作用方面顯著不同。可以根據胺基酸的側鏈特性的相似性將其分組 (A. L. Lehninger， Biochemistry，第二版，第 73-75 頁，Worth Publishers, New York (1975))： (1) 非極性：Ala (A)、Val (V)、Leu (L)、Ile (I)、Pro (P)、Phe (F)、Trp (W)、Met (M) (2) 不帶電極性：Gly (G)、Ser (S)、Thr (T)、Cys (C)、Tyr (Y)、Asn (N)、Gln (Q) (3) 酸性：Asp (D)、Glu (E) (4) 鹼性：Lys (K)、Arg (R)、His(H)

另外，自然產生的殘基可基於常見的側鏈特性分組： (1) 疏水性：正白胺酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile； (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3) 酸性：Asp，Glu； (4) 鹼性：His，Lys，Arg; (5) 影響鏈取向之殘基：Gly，Pro； (6) 芳香族：Trp，Tyr，Phe。非保留取代需要將這些類別中之一類的成員交換為另一類的成員。

任何不參與維持抗體正確構型的半胱胺酸殘基亦可被取代，通常被絲胺酸取代，以改善分子的氧化穩定性並防止異常交聯。相反，可將一個或多個半胱胺酸鍵添加至多肽以改善其穩定性 (特別是在其中抗體為抗體片段諸如 Fv 片段的情況下)。

一種特別較佳之取代變異體涉及取代一個或多個親代抗體 (例如，人源化抗體) 之高度可變區殘基。通常，選擇用於進一步開發的一種或多種所得變異體相對於生成它們的親本抗體具有改善的生物學特性。一種用於生成此類取代變異體的合宜方法涉及使用噬菌體展示的親和力成熟。簡而言之，使若干高度可變區位點 (例如，6 至 7 個位點) 突變，以在每個位點處產生所有可能的胺基取代。由此生成的抗體變異體以單價方式從絲狀噬菌體粒子展示為與包裝在每個粒子內的 M13 之基因 III 產物的融合物。然後篩選噬菌體展示的變異體的生物活性 (例如，結合親和力)，如本文所揭示。為了鑑定用於修飾的候選高度可變區位點，可進行丙胺酸掃描誘變以鑑定對抗原結合有顯著貢獻的高度可變區殘基。替代性地或另外地，分析抗原-抗體複合物之晶體結構以鑑定抗體與抗原之間的接觸點可能是有益的。根據本文詳述的技術，此類接觸殘基及相鄰殘基為取代的候選者。一旦生成此類變異體，變異體組即如本文所述經受篩選，並且可以選擇在一種或多種相關測定中具有優異特性的抗體用於進一步開發。

另一種類型的多肽 (例如，抗原結合蛋白) 之胺基酸變異體改變抗體的原始醣基化模式。多肽可包含非胺基酸部分。例如，多肽可以經醣基化。此類醣基化可以在宿主細胞或宿主生物體中多肽表現期間自然發生，或者可以為人為乾預引起的故意修飾。改變意指缺失多肽中發現的一個或多個碳水化合物部分，及/或添加多肽中不存在的一個或多個醣基化位點。

多肽的醣基化通常為 N 連接或 O 連接的。N-連接係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基的側鏈相聯。三肽序列，天冬醯胺酸-X-絲胺酸和天冬醯胺酸-X-蘇胺酸，其中 X 是除脯胺酸外的任何胺基酸，是將碳水化合物部分與天冬醯胺酸側鏈酶促相聯的識別序列。因此，多肽中這些三肽序列中任一個的存在產生潛在的醣基化位點。O連接型醣基化係指糖N-乙醯半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者與羥胺基酸，最通常是絲胺酸或蘇胺酸的連接，但亦可使用5-羥脯胺酸或5-羥離胺酸。

將醣基化位點添加至多肽宜藉由改變胺基酸序列以使其含有上文所描述之三肽序列中之一者或多者 (對於 N 連接的醣基化位點) 來實現。亦可藉由向原始抗體的序列添加或取代一個或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基 (對於 O 連接的醣基化位點) 來進行改變。

多肽上存在的碳水化合物部分的去除可藉由化學或酶促方法或藉由突變取代編碼充當醣基化目標的胺基酸殘基的密碼子來完成。多肽上碳水化合物部分的酶促切割可藉由使用多種內切糖苷酶及外切糖苷酶來實現。

其他修飾包括將麩胺醯胺及天冬醯胺殘基分別脫醯胺成相應的麩胺醯基及天冬胺醯殘基，脯胺酸及離胺酸的羥基化，絲胺醯或蘇胺酸殘基的羥基磷酸化，離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈的 α-胺基的甲基化，N 末端胺的乙醯化，及任何 C 末端羧基基團的醯胺化。 (ii) 嵌合多肽

本文所述之多肽 (例如，抗原結合蛋白) 可以以形成嵌合分子的方式被修飾，該等嵌合分子包含與另一異源多肽或胺基酸序列融合的多肽。在一些實施例中，嵌合分子包含多肽與標籤多肽的融合物，該標籤多肽提供了抗標籤抗體可以選擇性結合的抗原決定基。抗原決定基標籤通常位於多肽的胺基或羧基末端。可以使用針對標籤多肽的抗體來檢測多肽的此等抗原決定基標籤形式的存在。同樣，提供抗原決定基標籤使得能夠使用抗標籤抗體或結合抗原決定基標籤的另一種類型的親及基質藉由親及純化容易地純化多肽。

在一個替代實施例中，嵌合分子可包含多肽與免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定區的融合物。嵌合分子的二價形式稱為「免疫黏附素」。

如本文所用，術語「免疫黏附素」表示結合異源多肽的結合特異性與免疫球蛋白恆定域的效用功能的抗體樣分子。在結構上，免疫黏附素包含具有所需結合特異性的胺基酸序列 (除抗體的抗原識別及結合位點之外) (亦即，「異源」) 與免疫球蛋白恆定域序列的融合物。免疫黏附素分子的黏附素部分通常是至少包含受體或配體結合位點的連續胺基酸序列。免疫黏附素中的免疫球蛋白恆定域序列可以獲自任何免疫球蛋白，諸如 IgG1、IgG2、IgG3 或 IgG4 亞型、IgA (包括 IgA1 及 IgA2)、IgE、IgD 或 IgM。

Ig 融合物較佳地包括用可溶 (跨膜域缺失或失活) 形式的多肽替代 Ig 分子內的至少一個可變區的取代。在一特佳實施例中，免疫球蛋白融合物包括 IgG1 分子的鉸鏈、CH ₂及 CH ₃，或鉸鏈、CH ₁、CH ₂及 CH ₃區。 (iii) 多肽結合物

用於本文所述之方法的抗原結合蛋白可以結合至細胞毒性劑諸如化學治療劑、生長抑制劑、毒素 (例如，細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，或其片段) 或放射性同位素 (亦即放射性結合物)。

可使用可用於產生此類結合物的化學治療劑。此外，可使用的酶活性毒素及其片段包括但不限於白喉 A 鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素 A 鏈 (來源於綠膿桿菌)、蓖麻毒蛋白 A 鏈、相思子毒素 A 鏈 (abrin A chain) 、莫迪素 A 鏈 (modeccin A chain) 、α-八疊球菌 (alpha-sarcin) 、油桐蛋白 (Aleurites fordii protein) 、香石竹毒蛋白 (dianthin protein) 、美洲商陸蛋白 (PAPI、PAPII 及 PAP-S)、苦瓜抑制因子 (momordica charantia inhibitor)、痲瘋樹毒蛋白 (curcin)、巴豆毒素 (crotin)、肥皂草抑制劑 (sapaonaria officinalis inhibitor)、白樹毒素 (gelonin)、米托菌素 (mitogellin)、局限曲菌素 (restrictocin)、酚黴素 (phenomycin)、伊諾黴素 (enomycin) 及新月毒素 (tricothecene)。多種放射性核種可用於產生放射性結合多肽。實例包括 ²¹²Bi、 ¹³¹I、 ¹³¹In、 ⁹⁰Y 及 ¹⁸⁶Re。多肽與細胞毒性劑之結合物可使用多種雙功能蛋白偶合劑進行製備，該等雙功能蛋白偶合劑為諸如 N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯 (SPDP)、亞胺基硫烷 (IT)、亞胺基酸酯的雙功能衍生物 (諸如己二酸二甲酯鹽酸鹽 (HCL))、活性酯 (諸如雙琥珀醯亞胺辛二酸)、醛 (例如戊二醛)、雙疊氮化合物 (諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物 (諸如雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯 (諸如甲苯 2,6-二異氰酸酯) 及雙活性氟化合物 (諸如 1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如 Vitetta 等人, Science238: 1098 (1987) 中所闡述進行製備。用於將放射性核苷酸結合至多肽的一種示例性螯合劑為碳-14 標記的 1-異硫氰酸芐基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸 (MX-DTPA)。

本文亦設想到抗原結合蛋白與一種或多種小分子毒素的結合物，諸如加利車黴素 (calicheamicin)、美登素類生物鹼 (maytansinoid)、新月毒素及 CC1065，以及具有毒素活性的這些毒素的衍生物。

美登素類生物鹼為藉由抑制微管蛋白聚合起作用的有絲分裂抑制劑。美登素最初是從東非灌木鋸齒美登木 ( Maytenus serrata) 中分離得到的。接著，發現某些微生物亦產生美登素類生物鹼，諸如美登醇 (maytansinol) 及 C-3 美登醇酯。亦設想到合成美登醇及其衍生物及類似物。本領域已知許多用於製備多肽-美登素類生物鹼結合物的連接基團，包括例如美國專利第 5,208,020 號中所揭示的那些。連接基團包括二硫化物基團、硫醚基團、酸不穩定基團、光不穩定基團、肽酶不穩定基團或酯酶不穩定基團，如上述專利中所揭示，較佳的是二硫化物及硫醚基團。

連接子可在不同位置處接附至美登素類生物鹼分子，其取決於連接的類型。例如，可以使用常規偶合技術藉由與羥基反應形成酯鍵。反應可發生在具有羥基之 C-3 位置、經羥甲基修飾之 C-14 位置、經羥基修飾之 C-15 位置以及具有羥基之 C-20 位置。在一較佳實施例中，在美登醇或美登醇類似物的 C-3 位置形成連接。

另一種所關注之結合物包括與一個或多個加利車黴素分子結合的抗原結合蛋白。加利車黴素抗生素家族能夠在亞皮莫耳濃度下產生雙鏈 DNA 斷裂。對於加利車黴素家族之結合物的製備，參見例如美國專利第 5,712,374 號。可以使用的加利車黴素的結構類似物包括但不限於 γ ₁ ^I、α ₂ ^I、α ₃ ^I、N-乙醯基-γ ₁ ^I、PSAG 及 θ ₁ ^I。抗體可結合的另一種抗腫瘤藥物為 QFA，其為抗葉酸劑。加利車黴素及 QFA 兩者皆具有細胞內作用位點，且不易穿過質膜。因此，細胞透過多肽 (例如，抗體) 媒介的內化作用攝取這些藥物，大大增強其細胞毒性作用。

可與本文所述之多肽結合的其他抗腫瘤劑包括 BCNU、鏈脲佐菌素、長春新鹼及 5-氟尿嘧啶、統稱為 LL-E33288 複合體的藥劑家族、以及埃斯培拉黴素。

在一些實施例中，抗原結合蛋白可以為多肽與具有核裂解活性的化合物 (例如，核糖核酸酶或 DNA 內切核酸酶，諸如脫氧核糖核酸酶；DNA 酶) 之間的結合物。

在又一實施例中，可以將抗原結合蛋白結合至「受體」 (諸如鏈黴親和素) 以便在腫瘤預靶向中使用，其中向患者投予多肽受體結合物，接著使用清除劑從循環中去除未結合之結合物，然後投予結合至細胞毒性劑 (例如，放射性核苷酸) 的「配位子」 (例如，抗生物素蛋白)。

在一些實施例中，抗原結合蛋白可以結合至前驅藥活化酶，該前驅藥活化酶將前驅藥 (例如，肽基化學治療劑) 轉化為活性抗癌藥。免疫結合物的酶組分包括任何能夠以將其轉化為更具活性的細胞毒性形式的方式作用於前驅藥的酶。

可用的酶包括但不限於：鹼性磷酸酶，其可用於將含磷酸酯之前驅藥轉化為遊離藥物；芳基磺酸酯酶，其可用於將含磺酸酯之前驅藥轉化為遊離藥物；胞嘧啶去胺基酶，其可用於將無毒之 5-氟胞嘧啶轉化為抗癌藥物 5-氟尿嘧啶；蛋白酶諸如沙雷氏菌屬 (serratia) 蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶及組織蛋白酶 (諸如組織蛋白酶 B 及 L)，其可用於將含肽之前驅藥轉化為遊離藥物；D-丙胺醯基羧肽酶，其可用於將含有 D-胺基酸取代基之前驅藥轉化為遊離藥物；碳水化合物切割酶諸如 β-半乳糖苷酶及神經胺糖酸苷酶，其可用於將經醣基化之前驅藥轉化為遊離藥物；β-內醯胺酶，其可用於將以 β-內醯胺衍生化之藥物轉化為遊離藥物；以及青黴素醯胺酶諸如青黴素 V 醯胺酶或青黴素 G 醯胺酶，其可用於將在其胺氮處以苯氧基乙醯基或苯基乙醯基衍生化之藥物分別轉化為遊離藥物。替代性地，具有酶活性的抗體，在本領域中亦稱為「抗體酶」，可用於將前驅藥轉化為遊離活性藥物。 (iv) 其他

抗原結合蛋白之另一種類型的共價修飾包含將抗原結合蛋白連接至多種非蛋白質聚合物 (例如，聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇及聚丙二醇的共聚物) 中之一者。抗原結合蛋白亦可包埋在例如透過凝聚技術或透過介面聚合製備的微囊 (例如，分別為羥甲基纖維素微囊或明膠微囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊) 中、膠體藥物遞送系統 (例如，脂質體、白蛋白微球、微乳、奈米粒子及奈米微囊 (nanocapsule)) 中或粗滴乳狀液中。此類技術揭示於 Remington's Pharmaceutical Sc iences第 18 版, Gennaro, A.R. 主編 (1990)。

用於本文所述之方法的抗原結合蛋白可以包含削弱 VL 域與蛋白 L 的結合之修飾。在一些實施例中，該修飾包含 VL 域中的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，VL 域為 κ2 VL。在一些實施例中，修飾包含 VL 域中的 S12P 取代。 獲得用於該等方法中的多肽

可使用本領域熟知的方法，包括重組方法，獲得用於本文所述之純化的方法之抗原結合蛋白。以下部分提供關於這些方法的指導。 (A) 多核苷酸

本文可互換使用的「多核苷酸」或「核酸」係指任意長度核苷酸之聚合物，並且包括 DNA 及 RNA。

編碼多肽的多核苷酸可獲自任何來源，包括但不限於由據信具有多肽 mRNA 並以可檢測位準表現其的組織所製備的 cDNA 文庫。因此，編碼多肽的多核苷酸可合宜地獲自由人體組織製備的 cDNA 文庫。多肽編碼基因亦可也可獲自基因組文庫或藉由已知的合成程序 (例如，自動化核酸合成)。

例如，多核苷酸可以編碼整個免疫球蛋白分子鏈，諸如輕鏈或重鏈。完整重鏈不僅包括重鏈可變區 (V _H)，而且包括重鏈恆定區 (C _H)，其通常將包含三個恆定域：C _H1、C _H2 及 C _H3；及「鉸鏈」區。在一些情況下，恆定區的存在為可取的。

可以由多核苷酸編碼的其他抗原結合蛋白包括抗原結合抗體片段，諸如單域抗體 (「dAb」)、Fv、scFv、Fab' 及 F(ab') ₂以及「微抗體」。微抗體 (通常) 為二價抗體片段，其中已切除 C _H1 及 C _K或 C _L域。由於微抗體小於習用抗體，它們應在臨床/診斷用途中實現較佳的組織滲透，但作為二價抗體，它們應保持比單價抗體片段 (諸如 dAb) 更高的結合親和力。因此，除非上下文另外明確指出，否則如本文所用之術語「抗體」不僅包括完整抗體分子，而且包括上述類型的抗原結合抗體片段。較佳的是，編碼多肽中存在的各骨架區相對於相應的人類受體骨架將包含至少一個胺基酸取代。因此，例如，骨架區相對於受體骨架區可包含總共三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個或十五個胺基酸取代。 醫藥組成物

在一些態樣中，本揭露提供了醫藥組成物，其包含獲自本文所述之純化程序 (例如，使用如本文所述之親液劑的蛋白 L 層析) 的抗原結合蛋白。在一些實施例中，醫藥組成物是純化的組成物。在一些實施例中，醫藥組成物是無菌的醫藥組成物。

醫藥組成物可藉由將具有所需純度之抗原結合蛋白與視情況之醫藥上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合來製備以用於儲存 ( Remington's Pharmaceutical Sciences第 16 版，Osol, A. 編輯 (1980))，以凍乾調配物或水溶液的形式。

如本文所用，「載劑」包括在所用之劑量及濃度下對暴露於其中之細胞或哺乳動物無毒之醫藥上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。生理上可接受之載劑通常為 pH 緩衝水溶液。

可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所採用的劑量及濃度下對接受者無毒，並且包括：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑 (諸如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六羥季銨；氯化苯二甲烴銨；氯化本索寧；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量 (小於約 10 個殘基) 多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如 EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬複合物 ( 例如Zn-蛋白複合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如 TWEEN™、PLURONICS™ 或聚乙二醇 (PEG)。套組

在本發明的一些態樣中，一種用於在如本文所述之純化抗原結合蛋白的方法中的套組。在一些實施例中，該套組包括蛋白 L 層析材料、平衡緩衝液、洗滌緩衝液、溶析緩衝液及親液劑中之一者或多者。在一些實施例中，套組進一步提供其使用說明。容器容納調配物，且在容器上或容器隨附之標籤可指示使用說明。製品可進一步包括自商業及使用者角度來看需要之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、培養皿、用於檢測報導分子之試劑、及具有使用說明之藥品仿單。套組可進一步包括自商業及使用者角度來看需要之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、培養皿、用於檢測報導分子之試劑、及具有使用說明之藥品仿單。 例示性實施例

本文提供了以下例示性實施例： 1. 一種純化包含 VL 域的抗原結合蛋白之方法，該方法包含： a) 將抗原結合蛋白與蛋白 L 層析材料結合， b) 用洗滌緩衝液洗滌蛋白 L 層析材料，其中洗滌緩衝液包含平衡緩衝液及親液劑，以及 c) 用溶析緩衝液自蛋白 L 層析材料溶析抗原結合蛋白。 2. 一種改進包含 VL 域的抗原結合蛋白之蛋白 L 純化之方法，該方法包含： 1. 將抗原結合蛋白與蛋白 L 層析材料結合， 2. 用洗滌緩衝液洗滌蛋白 L 層析材料，其中洗滌緩衝液包含平衡緩衝液及親液劑，以及 3. 用溶析緩衝液自蛋白 L 層析材料溶析抗原結合蛋白。 3. 如實施例 2 之方法，其中與其中洗滌緩衝液不包含親液劑的蛋白 L 層析相比，抗原結合蛋白之產率及/或純度增加。 4. 如實施例 1 至 3 中任一項之方法，其中平衡緩衝液包含 Tris、MES、MOPS 或 EDTA。 5. 如實施例 1 至 4 中任一項之方法，其中平衡緩衝液包含 Tris 及 NaCl。 6. 如實施例 4 或請求項 5 之方法，其中 Tris 以約 10 mM 至約 50 mM、或約 25 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中。 7. 如實施例 5 或實施例 6 之方法，其中 NaCl 以約 10 mM 至約 50 mM、或約 25 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中。 8. 如實施例 1 至 7 中任一項之方法，其中平衡緩衝液具有約 4 至約 10 之 pH。 9. 如實施例 1 至 8 中任一項之方法，其中平衡緩衝液具有約 6.5 至約 8.5、或約 7.7 之 pH。 10. 如實施例 1 至 9 中任一項之方法，其中平衡緩衝液具有約 7 至約 8 之 pH。 11. 如實施例 1 至 10 中任一項之方法，其中洗滌緩衝液具有約 4 至約 10 之 pH。 12. 如實施例 1 至 11 中任一項之方法，其中洗滌緩衝液具有約 4 至約 10、約 4 至約 9.5、約 4 至約 9、約 4 至約 8.5、約 4 至約 8、約 4 至約 7.5、約 5 至約 10、約 5 至約 9.5、約 5 至約 9、約 5 至約 8.5、約 5 至約 8、約 5 至約 7.5、約 6 至約 10、約 6 至約 9.5、約 6 至約 9、約 6 至約 8.5、約 6 至約 8、或約 6 至約 7.5 之 pH。 13. 如實施例 1 至 12 中任一項之方法，其中洗滌緩衝液具有約 4、約 4.5、約 5、約 5.5、約 6、約 6.5、約 7、約 7.5、約 8、約 8.5、約 9、約 9.5 或約 10 之 pH。 14. 如實施例 1 至 12 中任一項之方法，其中洗滌緩衝液具有約 7.0、約 7.1、約 7.2、約 7.3、約 7.4、約 7.5、約 7.6、約 7.7、約 7.8、約 7.9 或約 8.0 之 pH。 15. 如實施例 1 至 14 中任一項之方法，其中抗原結合蛋白以宿主細胞培養上清液在步驟 a) 中經負載到蛋白 L 層析材料上。 16. 如實施例 1 至 14 中任一項之方法，其中抗原結合蛋白以純化的多肽溶液在步驟 a) 中經負載到蛋白 L 層析材料上。 17. 如實施例 1 至 14 中任一項之方法，其中抗原結合蛋白以來自先前純化步驟的混合物在步驟 a) 中經負載到蛋白 L 層析材料上。 18. 如實施例 1 至 14 中任一項之方法，其中抗原結合蛋白在步驟 a) 中負載到蛋白 L 層析材料上之前係配製在平衡緩衝液中。 19. 如實施例 1 至 14 及 18 中任一項之方法，其中抗原結合蛋白在步驟 a) 中負載到蛋白 L 層析材料上之前係配製在平衡緩衝液及親液劑中。 20. 如實施例 1 至 19 中任一項之方法，其中親液劑為磷酸鹽或硫酸鹽。 21. 如實施例 1 至 20 中任一項之方法，其中親液劑為磷酸鉀、硫酸鈉或硫酸銨。 22. 如實施例 1 至 21 中任一項之方法，其中在平衡緩衝液或洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 100 mM 至約 800 mM。 23. 如實施例 1 至 21 中任一項之方法，其中在平衡緩衝液及洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 100 mM 至約 800 mM。 24. 如實施例 1 至 23 中任一項之方法，其中在平衡緩衝液或洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 120 mM 至約 600 mM。 25. 如實施例 1 至 24 中任一項之方法，其中在平衡緩衝液或洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 120 mM、約 240 mM、約 360 mM、約 480 mM 或約 600 mM。 26. 如實施例 1 至 21 中任一項之方法，其中在平衡緩衝液及/或洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 100 mM 至約 800 mM、約 100 mM 至約 700 mM、約 100 mM 至約 600 mM、約 100 mM 至約 500 mM、約 200 mM 至約 800 mM、約 200 mM 至約 700 mM、約 200 mM 至約 600 mM、約 200 mM 至約 500 mM、約 300 mM 至約 800 mM、約 300 mM 至約 700 mM、約 300 mM 至約 600 mM、或約 300 mM 至約 500 mM。 27. 如實施例 1 至 21 中任一項之方法，其中在平衡緩衝液及/或洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 100 mM、125 mM、150 mM、175 mM、200 mM、225 mM、250 mM、275 mM、300 mM、325 mM、350 mM、375 mM、400 mM、425 mM、450 mM、475 mM、500 mM、525 mM、550 mM、575 mM、600 mM、625 mM、650 mM、675 mM、700 mM、725 mM、750 mM、775 mM 或 800 mM。 28. 如實施例 1 至 27 中任一項之方法，其中親液劑為硫酸鈉。 29. 如實施例 1 至 27 中任一項之方法，其中親液劑為磷酸鉀。 30. 如實施例 1 至 27 中任一項之方法，其中親液劑為硫酸銨。 31. 如實施例 1 至 30 中任一項之方法，其中溶析緩衝液相比平衡緩衝液具有較低的 pH。 32. 如實施例 1 至 31 中任一項之方法，其中溶析緩衝液具有約 2.0 至約 4.0、或約 2.5 至約 3.0 之 pH。 33. 如實施例 1 至 32 中任一項之方法，其中溶析緩衝液具有約 2.5、約 2.55、約 2.6、約 2.65、約 2.7、約 2.75、約 2.8、約 2.85、約 2.9、約 2.95、約 3.0、約 3.05、約 3.1、約 3.15、約 3.2、約 3.25 或約 3.3 之 pH。 34. 如實施例 1 至 32 中任一項之方法，其中溶析緩衝液具有約 2.7、約 2.75、約 2.8、約 2.85、約 2.9 或約 2.95 之 pH。 35. 如實施例 1 至 30 中任一項之方法，其中溶析緩衝液相比平衡緩衝液具有較高的 pH。 36. 如實施例 35 之方法，其中溶析緩衝液具有約 10.0 至約 12.0 之 pH。 37. 如實施例 1 至 36 中任一項之方法，其中溶析緩衝液包含乙酸。 38. 如實施例 37 之方法，其中溶析緩衝液包含約 50 mM 乙酸至約 250 mM 乙酸。 39. 如實施例 37 或實施例 38 之方法，其中溶析緩衝液包含處於約 2.8 之 pH 的約 150 mM 乙酸。 40. 如實施例 1 至 36 中任一項之方法，其中溶析緩衝液包含乙酸鈉、檸檬酸鹽或甘胺酸。 41. 如實施例 1 至 40 中任一項之方法，其中抗原結合蛋白與蛋白 L 結合不佳。 42. 如實施例 1 至 41 中任一項之方法，其中與為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白相比，抗原結合蛋白與蛋白 L 結合不佳。 43. 如實施例 1 至 41 中任一項之方法，其中相比為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白，抗原結合蛋白與蛋白 L 結合較弱。 44. 如實施例 1 至 43 中任一項之方法，其中抗原結合蛋白為抗體或免疫黏附素或其片段。 45. 如實施例 1 至 44 中任一項之方法，其中抗原結合蛋白為單株抗體。 46. 如實施例 1 至 45 中任一項之方法，其中抗原結合蛋白為人抗體、嵌合抗體或人源化抗體。 47. 如實施例 44 至 46 中任一項之方法，其中抗體為選自 Fab、Fab'-SH、Fv、scFv 及 (Fab')2 片段的抗體片段。 48. 如實施例 47 之方法，其中抗體片段為 Fab。 49. 如實施例 48 之方法，其中 Fab 包含缺乏疏水性區塊或具有弱疏水性區塊之用於與蛋白 L 結合的結合位點。 50. 如實施例 49 之方法，其中用於與蛋白 L 結合的結合位點缺乏疏水性區塊。 51. 如實施例 49 之方法，其中用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。 52. 如實施例 49 至 51 中任一項之方法，其中與用於與為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白之蛋白 L 結合的結合位點相比，用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。 53. 如實施例 48 至 52 中任一項之方法，其中用於與蛋白 L 結合的結合位點包含親水性區塊。 54. 如實施例 1 至 53 中任一項之方法，其中抗原結合蛋白對蛋白 L 之結合親和力 (EC50) 及/或解離常數具有的值比為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白對蛋白 L 之結合親和力 (EC50) 及/或解離常數的值高。 55. 如實施例 54 之方法，其中抗原結合蛋白對蛋白 L 之結合親和力 (EC50) 及/或解離常數具有的值比為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白對蛋白 L 之結合親和力 (EC50) 及/或解離常數的值高至少 15%、至少 25%、至少 50%、至少 75%、至少 100%、至少 150%、至少 200%、至少 300%、至少 400% 或至少 500%。 56. 如實施例 44 至 55 中任一項之方法，其中抗體不含有 Fc 域。 57. 如實施例 44 至 46 中任一項之方法，其中抗體為多特異性抗體。 58. 如實施例 57 之方法，其中多特異性抗體包含 VL 域及第二 VL 域，且其中 VL 域為卡帕 (κ) VL。 59. 如實施例 58 之方法，其中 VL 域為 κ2 VL。 60. 如實施例 57 至 59 中任一項之方法，其中 VL 域與蛋白 L 結合不佳。 61. 如實施例 58 至 60 中任一項之方法，其中 VL 域與蛋白 L 結合不佳且第二 VL 域不與蛋白 L 結合。 62. 如實施例 58 至 61 中任一項之方法，其中第二 VL 域為拉目達 (λ) VL。 63. 如實施例 1 至 56 中任一項之方法，其中 VL 域為 λ 亞型 VL 或 κ VL。 64. 如實施例 63 之方法，其中 VL 域與蛋白 L 結合不佳。 65. 如實施例 60 至 64 中任一項之方法，其中與為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白之 VL 域與蛋白 L 的結合相比，該 VL 域與蛋白 L 的結合不佳。 66. 如實施例 63 至 65 中任一項之方法，其中 VL 域為 κ VL 且包含削弱 VL 域與蛋白 L 的結合之修飾。 67. 如實施例 66 之方法，其中該修飾包含在 VL 域中的一個或多個胺基酸取代。 68. 如實施例 63 至 67 中任一項之方法，其中 VL 域為 κ2 VL。 69. 如實施例 1 至 48 及 56 至 68 中任一項之方法，其中抗原結合蛋白包含缺乏疏水性區塊或具有弱疏水性區塊之用於與蛋白 L 結合的結合位點。 70. 如實施例 69 之方法，其中用於與蛋白 L 結合的結合位點缺乏疏水性區塊。 71. 如實施例 69 之方法，其中用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。 72. 如實施例 69 至 71 中任一項之方法，其中與用於與為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白之蛋白 L 結合的結合位點相比，用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。 73. 如實施例 69 至 71 中任一項之方法，其中用於與蛋白 L 結合的結合位點包含親水性區塊。 74. 如實施例 1 至 73 中任一項之方法，其中蛋白 L 層析材料為 Pierce™ 蛋白 L 層析匣、Capto™ L 層析、HiTrap® 蛋白 L 層析、KanCap™ L 層析、TOYOPEARL® AF-rProtein L-650F 層析或 MabSelect ^TMVL 層析。 75. 一種組成物，其包含藉由包含如實施例 1 至 74 中任一項之方法的方法所純化的抗原結合蛋白。 76. 如實施例 75 之組成物，其中組成物包含一種或多種醫藥賦形劑。 77. 一種純化包含 VL 域的抗原結合蛋白之套組，其中套組包含蛋白 L 層析材料及親液劑。 78. 如實施例 77 之套組，其中套組進一步包含平衡緩衝液。 79. 如實施例 78 之套組，其中平衡緩衝液包含 Tris、MES、MOPS 或 EDTA。 80. 如實施例 78 或實施例 79 之套組，其中平衡緩衝液包含 Tris 及 NaCl。 81. 如實施例 79 或實施例 80 之套組，其中 Tris 以約 10 mM 至約 50 mM、或約 25 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中。 82. 如實施例 80 或實施例 81 之套組，其中 NaCl 以約 10 mM 至約 50 mM、或約 25 mM 之濃度存在於平衡緩衝液中。 83. 如實施例 78 至 82 中任一項之套組，其中平衡緩衝液具有約 4 至約 10 之 pH。 84. 如實施例 78 至 83 中任一項之套組，其中平衡緩衝液具有約 6.5 至約 8.5、或約 7.7 之 pH。 85. 如實施例 78 至 84 中任一項之套組，其中平衡緩衝液具有約 7 至約 8 之 pH。 86. 如實施例 77 至 85 中任一項之套組，其中套組進一步包含洗滌緩衝液。 87. 如實施例 86 之套組，其中洗滌緩衝液具有約 4 至約 10 之 pH。 88. 如實施例 86 或實施例 87 之套組，其中洗滌緩衝液具有約 4 至約 10、約 4 至約 9.5、約 4 至約 9、約 4 至約 8.5、約 4 至約 8、約 4 至約 7.5、約 5 至約 10、約 5 至約 9.5、約 5 至約 9、約 5 至約 8.5、約 5 至約 8、約 5 至約 7.5、約 6 至約 10、約 6 至約 9.5、約 6 至約 9、約 6 至約 8.5、約 6 至約 8、或約 6 至約 7.5 之 pH。 89. 如實施例 86 至 88 中任一項之套組，其中洗滌緩衝液具有約 4、約 4.5、約 5、約 5.5、約 6、約 6.5、約 7、約 7.5、約 8、約 8.5、約 9、約 9.5 或約 10 之 pH。 90. 如實施例 86 至 88 中任一項之套組，其中洗滌緩衝液具有約 7.0、約 7.1、約 7.2、約 7.3、約 7.4、約 7.5、約 7.6、約 7.7、約 7.8、約 7.9 或約 8.0 之 pH。 91. 如實施例 86 至 90 中任一項之套組，其中洗滌緩衝液包含平衡緩衝液及親液劑。 92. 如實施例 78 至 91 中任一項之套組，其中平衡緩衝液進一步包含親液劑。 93. 如實施例 77 至 92 中任一項之套組，其中親液劑為磷酸鹽或硫酸鹽。 94. 如實施例 77 至 93 中任一項之套組，其中親液劑為磷酸鉀、硫酸鈉或硫酸銨。 95. 如實施例 78 至 94 中任一項之套組，其中在平衡緩衝液或洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 100 mM 至約 800 mM。 96. 如實施例 78 至 94 中任一項之套組，其中在平衡緩衝液及洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 100 mM 至約 800 mM。 97. 如實施例 78 至 96 中任一項之套組，其中在平衡緩衝液或洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 120 mM 至約 600 mM。 98. 如實施例 78 至 97 中任一項之套組，其中在平衡緩衝液或洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 120 mM、約 240 mM、約 360 mM、約 480 mM 或約 600 mM。 99. 如實施例 77 至 94 中任一項之套組，其中在平衡緩衝液及/或洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 100 mM 至約 800 mM、約 100 mM 至約 700 mM、約 100 mM 至約 600 mM、約 100 mM 至約 500 mM、約 200 mM 至約 800 mM、約 200 mM 至約 700 mM、約 200 mM 至約 600 mM、約 200 mM 至約 500 mM、約 300 mM 至約 800 mM、約 300 mM 至約 700 mM、約 300 mM 至約 600 mM、或約 300 mM 至約 500 mM。 100. 如實施例 77 至 94 中任一項之套組，其中在平衡緩衝液及/或洗滌緩衝液中的親液劑之濃度為約 100 mM、125 mM、150 mM、175 mM、200 mM、225 mM、250 mM、275 mM、300 mM、325 mM、350 mM、375 mM、400 mM、425 mM、450 mM、475 mM、500 mM、525 mM、550 mM、575 mM、600 mM、625 mM、650 mM、675 mM、700 mM、725 mM、750 mM、775 mM 或 800 mM。 101. 如實施例 77 至 100 中任一項之套組，其中親液劑為硫酸鈉。 102. 如實施例 77 至 100 中任一項之套組，其中親液劑為磷酸鉀。 103. 如實施例 77 至 100 中任一項之套組，其中親液劑為硫酸銨。 104. 如實施例 77 至 103 中任一項之套組，其中套組進一步包含溶析緩衝液。 105. 如實施例 104 之套組，其中溶析緩衝液相比平衡緩衝液具有較低的 pH。 106. 如實施例 104 或實施例 105 之套組，其中溶析緩衝液具有約 2.0 至約 4.0、或約 2.5 至約 3.0 之 pH。 107. 如實施例 104 至 106 中任一項之套組，其中溶析緩衝液具有約 2.5、約 2.55、約 2.6、約 2.65、約 2.7、約 2.75、約 2.8、約 2.85、約 2.9、約 2.95、約 3.0、約 3.05、約 3.1、約 3.15、約 3.2、約 3.25 或約 3.3 之 pH。 108. 如實施例 104 至 106 中任一項之套組，其中溶析緩衝液具有約 2.7、約 2.75、約 2.8、約 2.85、約 2.9 或約 2.95 之 pH。 109. 如實施例 104 之套組，其中溶析緩衝液相比平衡緩衝液具有較高的 pH。 110. 如實施例 104 或實施例 109 之套組，其中溶析緩衝液具有約 10.0 至約 12.0 之 pH。 111. 如實施例 104 至 110 中任一項之套組，其中溶析緩衝液包含乙酸。 112. 如實施例 111 之套組，其中溶析緩衝液包含約 50 mM 乙酸至約 250 mM 乙酸。 113. 如實施例 111 或實施例 112 之套組，其中溶析緩衝液包含處於約 2.8 之 pH 的約 150 mM 乙酸。 114. 如實施例 104 至 110 中任一項之套組，其中溶析緩衝液包含乙酸鈉、檸檬酸鹽或甘胺酸。 115. 如實施例 77 至 114 中任一項之套組，其用於純化抗體或免疫黏附素或其片段。 116. 如實施例 77 至 115 中任一項之套組，其中抗原結合蛋白為單株抗體。 117. 如實施例 77 至 116 中任一項之套組，其中抗原結合蛋白為人抗體、嵌合抗體或人源化抗體。 118. 如實施例 115 至 117 中任一項之套組，其中抗體為選自 Fab、Fab'-SH、Fv、scFv 及 (Fab')2 片段的抗體片段。 119. 如實施例 118 之套組，其中抗體片段為 Fab。 120. 如實施例 119 之套組，其中 Fab 包含缺乏疏水性區塊或具有弱疏水性區塊之用於與蛋白 L 結合的結合位點。 121. 如實施例 120 之套組，其中用於與蛋白 L 結合的結合位點缺乏疏水性區塊。 122. 如實施例 120 之套組，其中用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。 123. 如實施例 120 或實施例 122 之套組，其中與用於與為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白之蛋白 L 結合的結合位點相比，用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。 124. 如實施例 120 至 123 中任一項之套組，其中用於與蛋白 L 結合的結合位點包含親水性區塊。 125. 如實施例 77 至 124 中任一項之套組，其中抗原結合蛋白對蛋白 L 之結合親和力 (EC50) 及/或解離常數具有的值比為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白對蛋白 L 之結合親和力 (EC50) 及/或解離常數的值高。 126. 如實施例 125 之套組，其中抗原結合蛋白對蛋白 L 之結合親和力 (EC50) 及/或解離常數具有的值比為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白對蛋白 L 之結合親和力 (EC50) 及/或解離常數的值高至少 15%、至少 25%、至少 50%、至少 75%、至少 100%、至少 150%、至少 200%、至少 300%、至少 400% 或至少 500%。 127. 如實施例 115 至 126 中任一項之套組，其中抗體不含有 Fc 域。 128. 如實施例 115 至 127 中任一項之套組，其中抗體為多特異性抗體。 129. 如實施例 128 之套組，其中多特異性抗體包含 VL 域及第二 VL 域，且其中 VL 域為卡帕 (κ) VL。 130. 如實施例 129 之套組，其中 VL 域為 κ2 VL。 131. 如實施例 129 或實施例 130 之套組，其中 VL 域與蛋白 L 結合不佳。 132. 如實施例 129 至 131 中任一項之套組，其中 VL 域與蛋白 L 結合不佳且第二 VL 域不與蛋白 L 結合。 133. 如實施例 129 至 132 中任一項之套組，其中第二 VL 域為拉目達 (λ) VL。 134. 如實施例 115 至 127 中任一項之套組，其中抗體包含為 λ 亞型 VL 或 κ VL 的 VL 域。 135. 如實施例 134 之套組，其中 VL 域與蛋白 L 結合不佳。 136. 如實施例 129 至 135 中任一項之套組，其中與為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白相比，抗原結合蛋白之 VL 域與蛋白 L 結合不佳。 137. 如實施例 129 至 136 中任一項之套組，其中相比為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白，抗原結合蛋白之 VL 域與蛋白 L 結合較弱。 138. 如實施例 134 至 137 中任一項之套組，其中 VL 域為 κ VL 且包含削弱 VL 域與蛋白 L 的結合之修飾。 139. 如實施例 138 之套組，其中該修飾包含在 VL 域中的一個或多個胺基酸取代。 140. 如實施例 134 至 139 中任一項之套組，其中 VL 域為 κ2 VL。 141. 如實施例 77 至 140 中任一項之套組，其中抗原結合蛋白包含缺乏疏水性區塊或具有弱疏水性區塊之用於與蛋白 L 結合的結合位點。 142. 如實施例 141 之套組，其中用於與蛋白 L 結合的結合位點缺乏疏水性區塊。 143. 如實施例 141 之套組，其中用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。 144. 如實施例 141 或實施例 143 之套組，其中與用於與為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白之蛋白 L 結合的結合位點相比，用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。 145. 如實施例 141 至 144 中任一項之套組，其中用於與蛋白 L 結合的結合位點包含親水性區塊。

本領域習知此項技術者將認識到，在本申請揭示之範圍和精神內，若干實施例是可能的。藉由以下實例進一步說明本揭示，其不應將其解釋為將本揭示在範圍或精神上限制於其中描述的具體程序。實例實例 1. 使用親液劑對抗體片段進行蛋白 L 層析

在為本文稱為 Fab 1 (Fab 抗體片段) 之管道分子開發純化程序的同時，使用了蛋白 L，因為該 Fab 分子缺乏 Fc 區，即使用蛋白 A 所需之結合位點。

在開發蛋白 L 層析運行 ( 圖 1)時，觀察到在負載後及溶析前之洗滌階段測量到的 UV 吸光度升高。此外，在含有磷酸鉀 (一種用於去除離子雜質 (諸如宿主細胞 DNA) 的非腐蝕性緩衝鹽) 之階段，UV 讀數下降，但在該洗滌階段結束後，UV 基線再次增加。該結果表明蛋白質在負載階段後從管柱脫落，但發明人發現該蛋白質外流藉由磷酸鹽，即一種親液劑，的存在暫時而中斷並抑制。

為了研究親液劑用於提高蛋白 L 層析之用途，進行了多項研究以藉由蛋白 L 層析來純化 Fab 1，該層析使用補充有不同濃度之磷酸鉀 (一種親液劑)、硫酸鈉 (一種更強的親液劑) 及氯化鈉 (一種很少或沒有親液性特性的中性鹽) 的洗滌緩衝液。將含有 Fab 1 抗體片段之宿主細胞培養液 (HCCF) 以 3.74 g/L 之密度及 2.23 ml/min 之流速負載到 7 ml Capto L 管柱上。用含有親液劑 (硫酸鈉或磷酸鉀) 之平衡緩衝液 (25 mM Tris、25 mM NaCl、pH 7.7) 或用濃度為 600 mM、480 mM、360 mM、240 mM 或 120 mM 之 NaCl 洗滌管柱。不含親液劑或額外 NaCl 之平衡緩衝液用為陰性對照。然後使用 100 mM 乙酸 (pH 2.9) 從管柱中溶析抗體。在整個層析運行過程中監測藉由 A280 測量到的蛋白質濃度、電導率及 pH。使用 SEC-HPLC (TSKGel 2000SW 管柱) 分析層析運行之產率及質量。如下所示，使用親液鹽之方法增加了產率及純度。研究 1 ：硫酸鈉 ( 強親液劑 )

運行了六次純化，其中平衡緩衝液使用了五種不同濃度之硫酸鈉以評估抗體從管柱中的損失。將含有 Fab 1 抗體片段之宿主細胞培養液 (HCCF) 以 3.74 g/L 之密度及 2.23 ml/min 之流速負載到 7 ml Capto L 管柱上。用含有硫酸鈉 (600 mM、480 mM、360 mM、240 mM、120 mM) 或不含硫酸鹽 (0 mM；作為陰性對照) 之平衡緩衝液 (25 mM Tris、25 mM NaCl、pH 7.7) 洗滌管柱。然後使用 100 mM 乙酸 (pH 2.9) 從管柱中溶析抗體。在整個層析運行過程中監測藉由 A280 測量到的蛋白質濃度、電導率及 pH。

檢查層析圖 ( 圖 2)揭示，較高的硫酸鹽濃度與洗滌階段離開管柱的蛋白質較少以及溶析階段回收的蛋白質較多相關。

收集從溶析階段回收的合併物，並藉由濃縮及粒徑篩析 HPLC 進行分析 ( 圖 3)。如表 2所顯示，當親液劑包含在洗滌緩衝液中時，產率以及純度均有所改進。不受理論之束縛，該結果表明親液劑正在強化主要物種與蛋白 L 之結合。很可能雜質諸如 HMWF 及 LC-二聚體與蛋白 L 之結合可能比主要物種更緊密，因為具有 2 或更多的結合位點，這可能導致主要物種之產率及質量更差。表 2. 從溶析合併物的分析中計算出的產率及純度。

洗滌緩衝液添加劑	計算出的產率 (%)	主峰 ( 藉由 SEC-HPLC) (%)
0 mM 硫酸鈉	22.71	80.28
120 mM 硫酸鈉	32.48	85.47
240 mM 硫酸鈉	39.20	87.27
360 mM 硫酸鈉	46.37	88.89
480 mM 硫酸鈉	52.73	90.21
600 mM 硫酸鈉	58.60	91.02

研究 2 ：磷酸鉀 ( 親液劑 )

在該研究中，評估了具有共同親液性質之不同鹽。運行了六次純化，其中平衡緩衝液使用了五種不同濃度之硫酸鉀 (600 mM、480 mM、360 mM、240 mM、120 mM) 或未進行硫酸鹽之使用 (0 mM；作為陰性對照)。其他層析參數與硫酸鈉運行相同。如圖 4及表 3所顯示，儘管效應在之前的研究中並不明顯，但結果相近。在層析圖 ( 圖 4)中，負載後洗滌中的 UV 吸光度訊息隨著磷酸鉀濃度之增加而逐漸受到抑制。產率及純度同樣也隨著磷酸鉀濃度之增加而有所改進 ( 圖 5 ，表 3)，儘管沒有等效濃度之硫酸鈉改進得那麼多。表 3. 從溶析合併物的分析中計算出的產率及純度。

洗滌緩衝液添加劑	計算出的產率 (%)	主峰 ( 藉由 SEC-HPLC) (%)
0 mM 磷酸鉀	21.96	79.38
120 mM 磷酸鉀	33.05	83.55
240 mM 磷酸鉀	36.87	85.29
360 mM 磷酸鉀	41.09	86.36
480 mM 磷酸鉀	45.45	87.50
600 mM 磷酸鉀	50.38	88.51

研究 3 ：氯化鈉 ( 中性鹽，對照 )

向洗滌緩衝液添加氯化鈉對拯救該步驟之性能的影響最小。在比較層析圖 ( 圖 6)時，即使在高濃度氯化鈉下，洗滌後之 UV 吸光度仍然很高，並且在研究過程中伴隨著與等效濃度之親液鹽相比，產率及純度之小幅提高 ( 圖 7 ，表 4)。表 4. 從溶析合併物的分析中計算出的產率及純度。

洗滌緩衝液添加劑	計算出的產率 (%)	主峰 ( 藉由 SEC-HPLC) (%)
0 mM 氯化鈉	21.91	78.86
120 mM 氯化鈉	26.41	81.09
240 mM 氯化鈉	28.60	83.70
360 mM 氯化鈉	30.79	84.48
480 mM 氯化鈉	32.15	84.19
600 mM 氯化鈉	33.43	84.88

實例 2. 使用親液劑對雙特異性抗體進行蛋白 L 層析

觀察到抗體與另一個分子中之蛋白 L 的結合不佳，即帶有一條針對標靶抗原 A 之輕鏈 (「抗 A 輕鏈」) 及一條針對標靶抗原 B 之輕鏈 (「抗 B 輕鏈」) 之雙特異性抗體，該雙特異性抗體在本文被稱為雙特異性抗體 1。藉由對 VL 區中之 S12P 進行工程改造，抗 B 輕鏈被設計為不與蛋白 L 結合，僅留下抗 A 輕鏈充當蛋白 L 之「錨定物」。抗 A LC 具有 VK2 κ 骨架，其為蛋白 L 之不佳結合劑。

為了研究親液劑用於提高雙特異性抗體 1 的蛋白 L 層析之用途，在不存在或存在親液劑的情況下進行層析運行。使用 0.22 µ 來過濾含有雙特異性抗體 1 片段之宿主細胞培養液 (HCCF) 並在平衡緩衝液 (25 mM Tris、25 mM NaCl、pH 7.7) 中稀釋至 0.345 g/L，並以 0.4 ml/min 之流速負載到 1 ml HiTrap 蛋白 L 管柱上。用不含親液劑之平衡緩衝液或用 600 mM 硫酸鈉洗滌管柱。然後使用 170 mM 乙酸 (pH 2.75) 從管柱中溶析抗體。在整個層析運行過程中監測藉由 A280 測量到的蛋白質濃度、電導率及 pH。

層析運行之結果 (其中洗滌緩衝液不含親液劑) 在圖 8中顯示，並且層析運行之結果 (其中洗滌緩衝液含有親液劑 (600 mM 硫酸鈉)) 在圖 9中顯示。在含硫酸鹽之實驗中，蛋白質突破及洗去下降，這導致蛋白質保留，並且與不含硫酸鹽相比，含硫酸鹽恢復了更大的溶析峰。比較圖 9與圖 8。

非硫酸鹽運行之步驟產率計算為 10.11%，但在使用硫酸鹽之實驗中計算為 31.49%，為產率的三倍。

圖 1顯示了來自在蛋白 L 樹脂上純化 Fab 1 (Fab 抗體片段) 的層析圖。在具有高電導率的含磷酸酯洗滌階段，UV 吸光度受到抑制，但在該階段結束後恢復。圖 2顯示了使用包含不同量之硫酸鈉 (0 mM、120 mM、240 mM、360 mM、480 mM 及 600 mM) 的洗滌緩衝液跨越六次層析運行的 UV 吸光度訊息疊合。離開管柱的蛋白質藉由 UV 痕量來檢測 (Y 軸上以毫吸光度單位「mAU」表示的強度)。在每次運行中，管柱在注射前以體積 = 0 mL (在 X 軸上) 進行平衡。由於原料 (收穫的細胞培養液) 中宿主雜質的高負荷，因此負載階段會產生高 UV 訊息。在標記「1.A.1」處負載階段結束，並且洗滌階段開始，通過標記 1.A.2 繼續進行。溶析階段在 X 軸上大約 120 mL 體積處的標記 1.A.3 處回收純化的蛋白質。圖 3中顯示了在圖 2中顯示的層析運行之後的 Fab 1 的 SEC-HPLC 分析。除了 Fab，還檢測到高分子量片段 (HMWF) 及輕鏈 (LC) 二聚體。圖 4顯示了使用包含不同量之磷酸鉀 (0 mM、120 mM、240 mM、360 mM、480 mM 及 600 mM) 的洗滌緩衝液跨越六次層析運行的 UV 吸光度訊息疊合。圖 5中顯示了在圖 4中顯示的層析運行之後的 Fab 1 的 SEC-HPLC 分析。除了 Fab，還檢測到高分子量片段 (HMWF) 及輕鏈 (LC) 二聚體。圖 6顯示了使用包含不同量之氯化鈉 (0 mM、120 mM、240 mM、360 mM、480 mM 及 600 mM) 的洗滌緩衝液跨越六次層析運行的 UV 吸光度訊息疊合。圖 7中顯示了在圖 6中顯示的層析運行之後的 Fab 1 的 SEC-HPLC 分析。除了 Fab，還檢測到高分子量片段 (HMWF) 及輕鏈 (LC) 二聚體。圖 8顯示了來自使用雙特異性抗體的蛋白 L 層析的層析圖，其中洗滌緩衝液中不包含硫酸鹽 (即，對照實驗)。層析圖顯示了 UV 吸光度訊息以及針對 pH 及電導率的訊息。UV 的升高早期說明蛋白質在負載階段突破，並在洗滌階段洗去。在 34 分鐘標記附近恢復了一個適度的溶析峰。圖 9顯示了來自使用雙特異性抗體的蛋白 L 層析的層析圖，其中 600 mM 硫酸鹽存在於負載原料及洗滌緩衝液兩者中。運行層析圖含有 UV 吸光度訊息以及針對 pH 及電導率的訊息。UV 的升高早期說明蛋白質在負載階段突破，並在洗滌階段洗去。在 34 分鐘標記附近恢復了一個適度的溶析峰。

Claims

一種純化包含 VL 域的抗原結合蛋白之方法，該方法包含： a) 將該抗原結合蛋白與蛋白 L 層析材料結合， b) 用洗滌緩衝液洗滌該蛋白 L 層析材料，其中該洗滌緩衝液包含平衡緩衝液及親液劑 (kosmotrope)，以及 c) 用溶析緩衝液自該蛋白 L 層析材料溶析該抗原結合蛋白。
一種改進包含 VL 域的抗原結合蛋白之蛋白 L 純化之方法，該方法包含： a) 將該抗原結合蛋白與蛋白 L 層析材料結合， b) 用洗滌緩衝液洗滌該蛋白 L 層析材料，其中該洗滌緩衝液包含平衡緩衝液及親液劑，以及 c) 用溶析緩衝液自該蛋白 L 層析材料溶析該抗原結合蛋白。
如請求項 2 之方法，其中與其中該洗滌緩衝液不包含親液劑的蛋白 L 層析相比，該抗原結合蛋白之產率及/或純度增加。
如請求項 1 至 3 中任一項之方法，其中該平衡緩衝液包含 Tris、MES、MOPS 或 EDTA。
如請求項 1 至 4 中任一項之方法，其中該平衡緩衝液包含 Tris 及 NaCl。
如請求項 4 或請求項 5 之方法，其中該 Tris 以約 10 mM 至約 50 mM、或約 25 mM 之濃度存在於該平衡緩衝液中。
如請求項 5 或請求項 6 之方法，其中該 NaCl 以約 10 mM 至約 50 mM、或約 25 mM 之濃度存在於該平衡緩衝液中。
如請求項 1 至 7 中任一項之方法，其中該平衡緩衝液具有約 4 至約 10 之 pH。
如請求項 1 至 8 中任一項之方法，其中該平衡緩衝液具有約 6.5 至約 8.5、或約 7.7 之 pH。
如請求項 1 至 9 中任一項之方法，其中該平衡緩衝液具有約 7 至約 8 之 pH。
如請求項 1 至 10 中任一項之方法，其中該洗滌緩衝液具有約 4 至約 10 之 pH。
如請求項 1 至 11 中任一項之方法，其中該洗滌緩衝液具有約 4 至約 10、約 4 至約 9.5、約 4 至約 9、約 4 至約 8.5、約 4 至約 8、約 4 至約 7.5、約 5 至約 10、約 5 至約 9.5、約 5 至約 9、約 5 至約 8.5、約 5 至約 8、約 5 至約 7.5、約 6 至約 10、約 6 至約 9.5、約 6 至約 9、約 6 至約 8.5、約 6 至約 8、或約 6 至約 7.5 之 pH。
如請求項 1 至 12 中任一項之方法，其中該洗滌緩衝液具有約 4、約 4.5、約 5、約 5.5、約 6、約 6.5、約 7、約 7.5、約 8、約 8.5、約 9、約 9.5 或約 10 之 pH。
如請求項 1 至 12 中任一項之方法，其中該洗滌緩衝液具有約 7.0、約 7.1、約 7.2、約 7.3、約 7.4、約 7.5、約 7.6、約 7.7、約 7.8、約 7.9 或約 8.0 之 pH。
如請求項 1 至 14 中任一項之方法，其中該抗原結合蛋白以宿主細胞培養上清液在步驟 a) 中經負載到該蛋白 L 層析材料上。
如請求項 1 至 14 中任一項之方法，其中該抗原結合蛋白以純化的多肽溶液在步驟 a) 中經負載到該蛋白 L 層析材料上。
如請求項 1 至 14 中任一項之方法，其中該抗原結合蛋白以來自先前純化步驟的混合物在步驟 a) 中經負載到該蛋白 L 層析材料上。
如請求項 1 至 14 中任一項之方法，其中該抗原結合蛋白在步驟 a) 中負載到該蛋白 L 層析材料上之前係配製在平衡緩衝液中。
如請求項 1 至 14 及 18 中任一項之方法，其中該抗原結合蛋白在步驟 a) 中負載到該蛋白 L 層析材料上之前係配製在平衡緩衝液及該親液劑中。
如請求項 1 至 19 中任一項之方法，其中該親液劑為磷酸鹽或硫酸鹽。
如請求項 1 至 20 中任一項之方法，其中該親液劑為磷酸鉀、硫酸鈉或硫酸銨。
如請求項 1 至 21 中任一項之方法，其中在該平衡緩衝液或該洗滌緩衝液中的該親液劑之濃度為約 100 mM 至約 800 mM。
如請求項 1 至 21 中任一項之方法，其中在該平衡緩衝液及該洗滌緩衝液中的該親液劑之濃度為約 100 mM 至約 800 mM。
如請求項 1 至 23 中任一項之方法，其中在該平衡緩衝液或該洗滌緩衝液中的該親液劑之濃度為約 120 mM 至約 600 mM。
如請求項 1 至 24 中任一項之方法，其中在該平衡緩衝液或該洗滌緩衝液中的該親液劑之濃度為約 120 mM、約 240 mM、約 360 mM、約 480 mM 或約 600 mM。
如請求項 1 至 21 中任一項之方法，其中在該平衡緩衝液及/或該洗滌緩衝液中的該親液劑之濃度為約 100 mM 至約 800 mM、約 100 mM 至約 700 mM、約 100 mM 至約 600 mM、約 100 mM 至約 500 mM、約 200 mM 至約 800 mM、約 200 mM 至約 700 mM、約 200 mM 至約 600 mM、約 200 mM 至約 500 mM、約 300 mM 至約 800 mM、約 300 mM 至約 700 mM、約 300 mM 至約 600 mM、或約 300 mM 至約 500 mM。
如請求項 1 至 21 中任一項之方法，其中在該平衡緩衝液及/或該洗滌緩衝液中的該親液劑之濃度為約 100 mM、125 mM、150 mM、175 mM、200 mM、225 mM、250 mM、275 mM、300 mM、325 mM、350 mM、375 mM、400 mM、425 mM、450 mM、475 mM、500 mM、525 mM、550 mM、575 mM、600 mM、625 mM、650 mM、675 mM、700 mM、725 mM、750 mM、775 mM 或 800 mM。
如請求項 1 至 27 中任一項之方法，其中該親液劑為硫酸鈉。
如請求項 1 至 27 中任一項之方法，其中該親液劑為磷酸鉀。
如請求項 1 至 27 中任一項之方法，其中該親液劑為硫酸銨。
如請求項 1 至 30 中任一項之方法，其中該溶析緩衝液相比該平衡緩衝液具有較低的 pH。
如請求項 1 至 31 中任一項之方法，其中該溶析緩衝液具有約 2.0 至約 4.0、或約 2.5 至約 3.0 之 pH。
如請求項 1 至 32 中任一項之方法，其中該溶析緩衝液具有約 2.5、約 2.55、約 2.6、約 2.65、約 2.7、約 2.75、約 2.8、約 2.85、約 2.9、約 2.95、約 3.0、約 3.05、約 3.1、約 3.15、約 3.2、約 3.25 或約 3.3 之 pH。
如請求項 1 至 32 中任一項之方法，其中該溶析緩衝液具有約 2.7、約 2.75、約 2.8、約 2.85、約 2.9 或約 2.95 之 pH。
如請求項 1 至 30 中任一項之方法，其中該溶析緩衝液相比該平衡緩衝液具有較高的 pH。
如請求項 35 之方法，其中該溶析緩衝液具有約 10.0 至約 12.0 之 pH。
如請求項 1 至 36 中任一項之方法，其中該溶析緩衝液包含乙酸。
如請求項 37 之方法，其中該溶析緩衝液包含約 50 mM 乙酸至約 250 mM 乙酸。
如請求項 37 或請求項 38 之方法，其中該溶析緩衝液包含處於約 2.8 之 pH 的約 150 mM 乙酸。
如請求項 1 至 36 中任一項之方法，其中該溶析緩衝液包含乙酸鈉、檸檬酸鹽或甘胺酸。
如請求項 1 至 40 中任一項之方法，其中該抗原結合蛋白與蛋白 L 結合不佳 (poorly)。
如請求項 1 至 41 中任一項之方法，其中與為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白相比，該抗原結合蛋白與蛋白 L 結合不佳。
如請求項 1 至 41 中任一項之方法，其中相比為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白與蛋白 L 結合較弱。
如請求項 1 至 43 中任一項之方法，其中該抗原結合蛋白為抗體或免疫黏附素 (immunoadhesin) 或其片段。
如請求項 1 至 44 中任一項之方法，其中該抗原結合蛋白為單株抗體。
如請求項 1 至 45 中任一項之方法，其中該抗原結合蛋白為人抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
如請求項 44 至 46 中任一項之方法，其中該抗體為選自 Fab、Fab'-SH、Fv、scFv 及 (Fab')2 片段的抗體片段。
如請求項 47 之方法，其中該抗體片段為 Fab。
如請求項 48 之方法，其中該 Fab 包含缺乏疏水性區塊 (patch) 或具有弱疏水性區塊之用於與蛋白 L 結合的結合位點。
如請求項 49 之方法，其中該用於與蛋白 L 結合的結合位點缺乏疏水性區塊。
如請求項 49 之方法，其中該用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。
如請求項 49 至 51 中任一項之方法，其中與用於與為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白之蛋白 L 結合的結合位點相比，該用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。
如請求項 48 至 52 中任一項之方法，其中該用於與蛋白 L 結合的結合位點包含親水性區塊。
如請求項 1 至 53 中任一項之方法，其中該抗原結合蛋白對蛋白 L 之結合親和力 (EC50) 及/或解離常數具有的值比為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白對蛋白 L 之結合親和力 (EC50) 及/或解離常數的值高。
如請求項 54 之方法，其中該抗原結合蛋白對蛋白 L 之結合親和力 (EC50) 及/或解離常數具有的值比為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白對蛋白 L 之結合親和力 (EC50) 及/或解離常數的值高至少 15%、至少 25%、至少 50%、至少 75%、至少 100%、至少 150%、至少 200%、至少 300%、至少 400% 或至少 500%。
如請求項 44 至 55 中任一項之方法，其中該抗體不含有 Fc 域。
如請求項 44 至 46 中任一項之方法，其中該抗體為多特異性抗體。
如請求項 57 之方法，其中該多特異性抗體包含該 VL 域及第二 VL 域，且其中該 VL 域為卡帕 (κ) VL。
如請求項 58 之方法，其中該 VL 域為 κ2 VL。
如請求項 57 至 59 中任一項之方法，其中該 VL 域與蛋白 L 結合不佳。
如請求項 58 至 60 中任一項之方法，其中該 VL 域與蛋白 L 結合不佳且該第二 VL 域不與蛋白 L 結合。
如請求項 58 至 61 中任一項之方法，其中該第二 VL 域為拉目達 (λ) VL。
如請求項 1 至 56 中任一項之方法，其中該 VL 域為 λ 亞型 VL 或 κ VL。
如請求項 63 之方法，其中該 VL 域與蛋白 L 結合不佳。
如請求項 60 至 64 中任一項之方法，其中與為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白之 VL 域與蛋白 L 的結合相比，該 VL 域與蛋白 L 的結合不佳。
如請求項 63 至 65 中任一項之方法，其中該 VL 域為 κ VL 且包含削弱該 VL 域與蛋白 L 的結合之修飾。
如請求項 66 之方法，其中該修飾包含在該 VL 域中的一個或多個胺基酸取代。
如請求項 63 至 67 中任一項之方法，其中該 VL 域為 κ2 VL。
如請求項 1 至 48 及 56 至 68 中任一項之方法，其中該抗原結合蛋白包含缺乏疏水性區塊或具有弱疏水性區塊之用於與蛋白 L 結合的結合位點。
如請求項 69 之方法，其中該用於與蛋白 L 結合的結合位點缺乏疏水性區塊。
如請求項 69 之方法，其中該用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。
如請求項 69 至 71 中任一項之方法，其中與用於與為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白之蛋白 L 結合的結合位點相比，該用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。
如請求項 69 至 71 中任一項之方法，其中該用於與蛋白 L 結合的結合位點包含親水性區塊。
如請求項 1 至 73 中任一項之方法，其中該蛋白 L 層析材料為 Pierce™ 蛋白 L 層析匣 (cartridge)、Capto™ L 層析、HiTrap® 蛋白 L 層析、KanCap™ L 層析、TOYOPEARL® AF-rProtein L-650F 層析或 MabSelect ^TMVL 層析。
一種組成物，其包含藉由包含如請求項 1 至 74 中任一項之方法的方法所純化的抗原結合蛋白。
如請求項 75 之組成物，其中該組成物包含一種或多種醫藥賦形劑。
一種純化包含 VL 域的抗原結合蛋白之套組，其中該套組包含蛋白 L 層析材料及親液劑。
如請求項 77 之套組，其中該套組進一步包含平衡緩衝液。
如請求項 78 之套組，其中該平衡緩衝液包含 Tris、MES、MOPS 或 EDTA。
如請求項 78 或請求項 79 之套組，其中該平衡緩衝液包含 Tris 及 NaCl。
如請求項 79 或請求項 80 之套組，其中該 Tris 以約 10 mM 至約 50 mM、或約 25 mM 之濃度存在於該平衡緩衝液中。
如請求項 80 或請求項 81 之套組，其中該 NaCl 以約 10 mM 至約 50 mM、或約 25 mM 之濃度存在於該平衡緩衝液中。
如請求項 78 至 82 中任一項之套組，其中該平衡緩衝液具有約 4 至約 10 之 pH。
如請求項 78 至 83 中任一項之套組，其中該平衡緩衝液具有約 6.5 至約 8.5、或約 7.7 之 pH。
如請求項 78 至 84 中任一項之套組，其中該平衡緩衝液具有約 7 至約 8 之 pH。
如請求項 77 至 85 中任一項之套組，其中該套組進一步包含洗滌緩衝液。
如請求項 86 之套組，其中該洗滌緩衝液具有約 4 至約 10 之 pH。
如請求項 86 或請求項 87 之套組，其中該洗滌緩衝液具有約 4 至約 10、約 4 至約 9.5、約 4 至約 9、約 4 至約 8.5、約 4 至約 8、約 4 至約 7.5、約 5 至約 10、約 5 至約 9.5、約 5 至約 9、約 5 至約 8.5、約 5 至約 8、約 5 至約 7.5、約 6 至約 10、約 6 至約 9.5、約 6 至約 9、約 6 至約 8.5、約 6 至約 8、或約 6 至約 7.5 之 pH。
如請求項 86 至 88 中任一項之套組，其中該洗滌緩衝液具有約 4、約 4.5、約 5、約 5.5、約 6、約 6.5、約 7、約 7.5、約 8、約 8.5、約 9、約 9.5 或約 10 之 pH。
如請求項 86 至 88 中任一項之套組，其中該洗滌緩衝液具有約 7.0、約 7.1、約 7.2、約 7.3、約 7.4、約 7.5、約 7.6、約 7.7、約 7.8、約 7.9 或約 8.0 之 pH。
如請求項 86 至 90 中任一項之套組，其中該洗滌緩衝液包含該平衡緩衝液及該親液劑。
如請求項 78 至 91 中任一項之套組，其中該平衡緩衝液進一步包含該親液劑。
如請求項 77 至 92 中任一項之套組，其中該親液劑為磷酸鹽或硫酸鹽。
如請求項 77 至 93 中任一項之套組，其中該親液劑為磷酸鉀、硫酸鈉或硫酸銨。
如請求項 78 至 94 中任一項之套組，其中在該平衡緩衝液或該洗滌緩衝液中的該親液劑之濃度為約 100 mM 至約 800 mM。
如請求項 78 至 94 中任一項之套組，其中在該平衡緩衝液及該洗滌緩衝液中的該親液劑之濃度為約 100 mM 至約 800 mM。
如請求項 78 至 96 中任一項之套組，其中在該平衡緩衝液或該洗滌緩衝液中的該親液劑之濃度為約 120 mM 至約 600 mM。
如請求項 78 至 97 中任一項之套組，其中在該平衡緩衝液或該洗滌緩衝液中的該親液劑之濃度為約 120 mM、約 240 mM、約 360 mM、約 480 mM 或約 600 mM。
如請求項 77 至 94 中任一項之套組，其中在該平衡緩衝液及/或該洗滌緩衝液中的該親液劑之濃度為約 100 mM 至約 800 mM、約 100 mM 至約 700 mM、約 100 mM 至約 600 mM、約 100 mM 至約 500 mM、約 200 mM 至約 800 mM、約 200 mM 至約 700 mM、約 200 mM 至約 600 mM、約 200 mM 至約 500 mM、約 300 mM 至約 800 mM、約 300 mM 至約 700 mM、約 300 mM 至約 600 mM、或約 300 mM 至約 500 mM。
如請求項 77 至 94 中任一項之套組，其中在該平衡緩衝液及/或該洗滌緩衝液中的該親液劑之濃度為約 100 mM、125 mM、150 mM、175 mM、200 mM、225 mM、250 mM、275 mM、300 mM、325 mM、350 mM、375 mM、400 mM、425 mM、450 mM、475 mM、500 mM、525 mM、550 mM、575 mM、600 mM、625 mM、650 mM、675 mM、700 mM、725 mM、750 mM、775 mM 或 800 mM。
如請求項 77 至 100 中任一項之套組，其中該親液劑為硫酸鈉。
如請求項 77 至 100 中任一項之套組，其中該親液劑為磷酸鉀。
如請求項 77 至 100 中任一項之套組，其中該親液劑為硫酸銨。
如請求項 77 至 103 中任一項之套組，其中該套組進一步包含溶析緩衝液。
如請求項 104 之套組，其中該溶析緩衝液相比該平衡緩衝液具有較低的 pH。
如請求項 104 或請求項 105 之套組，其中該溶析緩衝液具有約 2.0 至約 4.0、或約 2.5 至約 3.0 之 pH。
如請求項 104 至 106 中任一項之套組，其中該溶析緩衝液具有約 2.5、約 2.55、約 2.6、約 2.65、約 2.7、約 2.75、約 2.8、約 2.85、約 2.9、約 2.95、約 3.0、約 3.05、約 3.1、約 3.15、約 3.2、約 3.25 或約 3.3 之 pH。
如請求項 104 至 106 中任一項之套組，其中該溶析緩衝液具有約 2.7、約 2.75、約 2.8、約 2.85、約 2.9 或約 2.95 之 pH。
如請求項 104 之套組，其中該溶析緩衝液相比該平衡緩衝液具有較高的 pH。
如請求項 104 或請求項 109 之套組，其中該溶析緩衝液具有約 10.0 至約 12.0 之 pH。
如請求項 104 至 110 中任一項之套組，其中該溶析緩衝液包含乙酸。
如請求項 111 之套組，其中該溶析緩衝液包含約 50 mM 乙酸至約 250 mM 乙酸。
如請求項 111 或請求項 112 之套組，其中該溶析緩衝液包含處於約 2.8 之 pH 的約 150 mM 乙酸。
如請求項 104 至 110 中任一項之套組，其中該溶析緩衝液包含乙酸鈉、檸檬酸鹽或甘胺酸。
如請求項 77 至 114 中任一項之套組，其用於純化抗體或免疫黏附素或其片段。
如請求項 77 至 115 中任一項之套組，其中該抗原結合蛋白為單株抗體。
如請求項 77 至 116 中任一項之套組，其中該抗原結合蛋白為人抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
如請求項 115 至 117 中任一項之套組，其中該抗體為選自 Fab、Fab'-SH、Fv、scFv 及 (Fab')2 片段的抗體片段。
如請求項 118 之套組，其中該抗體片段為 Fab。
如請求項 119 之套組，其中該 Fab 包含缺乏疏水性區塊或具有弱疏水性區塊之用於與蛋白 L 結合的結合位點。
如請求項 120 之套組，其中該用於與蛋白 L 結合的結合位點缺乏疏水性區塊。
如請求項 120 之套組，其中該用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。
如請求項 120 或請求項 122 之套組，其中與用於與為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白之蛋白 L 結合的結合位點相比，該用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。
如請求項 120 至 123 中任一項之套組，其中該用於與蛋白 L 結合的結合位點包含親水性區塊。
如請求項 77 至 124 中任一項之套組，其中該抗原結合蛋白對蛋白 L 之結合親和力 (EC50) 及/或解離常數具有的值比為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白對蛋白 L 之結合親和力 (EC50) 及/或解離常數的值高。
如請求項 125 之套組，其中該抗原結合蛋白對蛋白 L 之結合親和力 (EC50) 及/或解離常數具有的值比為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白對蛋白 L 之結合親和力 (EC50) 及/或解離常數的值高至少 15%、至少 25%、至少 50%、至少 75%、至少 100%、至少 150%、至少 200%、至少 300%、至少 400% 或至少 500%。
如請求項 115 至 126 中任一項之套組，其中該抗體不含有 Fc 域。
如請求項 115 至 127 中任一項之套組，其中該抗體為多特異性抗體。
如請求項 128 之套組，其中該多特異性抗體包含 VL 域及第二 VL 域，且其中該 VL 域為卡帕 (κ) VL。
如請求項 129 之套組，其中該 VL 域為 κ2 VL。
如請求項 129 或請求項 130 之套組，其中該 VL 域與蛋白 L 結合不佳。
如請求項 129 至 131 中任一項之套組，其中該 VL 域與蛋白 L 結合不佳且該第二 VL 域不與蛋白 L 結合。
如請求項 129 至 132 中任一項之套組，其中該第二 VL 域為拉目達 (λ) VL。
如請求項 115 至 127 中任一項之套組，其中該抗體包含為 λ 亞型 VL 或 κ VL 的 VL 域。
如請求項 134 之套組，其中該 VL 域與蛋白 L 結合不佳。
如請求項 129 至 135 中任一項之套組，其中與為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白相比，該抗原結合蛋白之該 VL 域與蛋白 L 結合不佳。
如請求項 129 至 136 中任一項之套組，其中相比為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白之該 VL 域與蛋白 L 結合較弱。
如請求項 134 至 137 中任一項之套組，其中該 VL 域為 κ VL 且包含削弱該 VL 域與蛋白 L 的結合之修飾。
如請求項 138 之套組，其中該修飾包含在該 VL 域中的一個或多個胺基酸取代。
如請求項 134 至 139 中任一項之套組，其中該 VL 域為 κ2 VL。
如請求項 77 至 140 中任一項之套組，其中該抗原結合蛋白包含缺乏疏水性區塊或具有弱疏水性區塊之用於與蛋白 L 結合的結合位點。
如請求項 141 之套組，其中該用於與蛋白 L 結合的結合位點缺乏疏水性區塊。
如請求項 141 之套組，其中該用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。
如請求項 141 或請求項 143 之套組，其中與用於與為單株抗體 G6-31 的參考抗原結合蛋白之蛋白 L 結合的結合位點相比，該用於與蛋白 L 結合的結合位點具有弱疏水性區塊。
如請求項 141 至 144 中任一項之套組，其中該用於與蛋白 L 結合的結合位點包含親水性區塊。