CN102171237A

CN102171237A - 使用蛋白a亲和色谱法纯化抗体的方法

Info

Publication number: CN102171237A
Application number: CN2009801390242A
Authority: CN
Inventors: R.奇米洛夫斯基; E.格林-特雷克斯勒; D.劳什
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 2008-08-14
Filing date: 2009-08-10
Publication date: 2011-08-31
Also published as: US20110144311A1; WO2010019493A1; AU2009282234A1; AU2009282234A8; JP2011530606A; SG2013061528A; JP5529869B2; CA2733782A1; EP2321338A1; MX2011001696A

Abstract

本发明提供了纯化单体单克隆抗体的方法，所述方法包括：使样品接触蛋白A亲和色谱柱，其中所述样品包含单体单克隆抗体、宿主细胞杂质、二聚体和更高阶聚集体；使用洗脱缓冲液，从蛋白A亲和色谱柱洗脱单体单克隆抗体；和收集单体单克隆抗体的一个或多个级分，形成蛋白A产物库，其中所述产物库包含小于5%的更高阶聚集体，且具有pH约3.2至约4.5，由此从样品纯化单体单克隆抗体。本发明也提供了纯化单体单克隆抗体的方法，所述方法包括：任选地在有氨基酸存在下，用醋酸盐或柠檬酸盐洗脱。本发明也提供了纯化单体单克隆抗体的方法，所述方法包括：在一定温度范围内，进行所述方法。

Description

使用蛋白A亲和色谱法纯化抗体的方法

贯穿本申请，在圆括号中用阿拉伯数字提及不同的参考文献。这些出版物的公开内容于此通过引用全部并入本申请中，以更完整地描述本发明所述领域的状况。在说明书最后（所附权利要求之前）可以找到这些参考文献的全部文献标引。

背景技术

在过去的10年中，关于治疗性单克隆抗体 (mAb)的申请已经显著增加。MAb稳定性代表着这些蛋白的纯化和配制中的当前挑战。MAb不稳定性导致蛋白制剂中高水平的mAb聚集，这可以具有几个缺点，包括改变蛋白活性和潜在地导致在患者中的不希望的免疫应答。

蛋白A亲和色谱法是用于纯化抗体的有力且广泛使用的工具。为了从蛋白A树脂洗脱蛋白或抗体，由于单克隆抗体对树脂的高亲和力，需要酸性条件。暴露于这些酸性条件，可以导致蛋白聚集体的形成。以前已经在文献中描述了一些解决在蛋白A色谱法过程中聚集的策略 (1, 2, 3, 4, 5, 6)。此外，病毒灭活需要在洗脱后的低pH保持步骤，且该步骤也可以导致蛋白聚集体的形成 (7, 8, 9)。

以前，一个减少mAb制剂中的蛋白聚集的方案是使用额外的色谱法步骤。该方案在材料和处理时间方面都是昂贵的；且它也导致每一步的产物损失，这可以降低mAb产物的总产率。

另一个以前的减少mAb制剂中的蛋白聚集的方案是使用先进的色谱法方法，诸如峰切割，以减少在亲和色谱法步骤之后的蛋白聚集的量。这些方案是耗时的，且它们经常是不成功的，需要额外的色谱法步骤来生产适合人用的mAb制剂。

再一个以前的减少mAb制剂中的蛋白聚集的方案是使用稳定剂，这可以具有几个缺点，包括，蛋白活性的变化、其它纯化步骤的困难、和潜在地在患者中的不希望的免疫应答。

本发明的主题方法解决了对为了纯化适合人用的单体单克隆抗体而减少单克隆抗体制剂中的蛋白聚集的更简单且更廉价的方法的需要。

发明内容

本发明提供了从样品中纯化单体单克隆抗体的第一种方法，其中所述样品包含单体单克隆抗体、宿主细胞杂质、二聚体和更高阶聚集体，所述方法包括：(a) 使样品接触蛋白A亲和色谱柱；(b) 使用洗脱缓冲液，从蛋白A亲和色谱柱洗脱单体单克隆抗体；和(c) 收集来自步骤(b)的单体单克隆抗体的一个或多个级分，形成蛋白A产物库，其中所述产物库 (i) 包含小于5%的更高阶聚集体，且(ii) 具有约3.5至约4.5的pH，由此从样品纯化单体单克隆抗体。

本发明提供了从样品中纯化单体单克隆抗体的第二种方法，其中所述样品包含单体单克隆抗体、宿主细胞杂质、二聚体和更高阶聚集体，所述方法包括：(a) 在约15℃至约27℃的温度下，使样品接触蛋白A亲和色谱柱；(b) 使用洗脱缓冲液，从蛋白A亲和色谱柱洗脱单体单克隆抗体，所述洗脱缓冲液包含浓度为约0.030 M至约0.085 M的柠檬酸盐；和(c) 收集来自步骤(b)的单体单克隆抗体的一个或多个级分，形成蛋白A产物库，其中所述产物库(i) 包含小于5%的更高阶聚集体，且(ii) 具有约3.5至约4.0的pH，由此从样品纯化单体单克隆抗体。

本发明提供了从样品中纯化单体单克隆抗体的第三种方法，其中所述样品包含单体单克隆抗体、宿主细胞杂质、二聚体和更高阶聚集体，所述方法包括：(a) 在约15℃至约27℃的温度下，使样品接触蛋白A亲和色谱柱； (b) 使用洗脱缓冲液，从蛋白A亲和色谱柱洗脱单体单克隆抗体，所述洗脱缓冲液包含浓度为约0.050 M至约0.200 M的醋酸盐；和(c) 收集来自步骤(b)的单体单克隆抗体的一个或多个级分，形成蛋白A产物库，其中所述产物库(i) 包含小于5%的更高阶聚集体，且(ii) 具有约3.5至约4.5的pH，由此从样品纯化单体单克隆抗体。

附图说明

图1显示了抗-DKK-1单克隆抗体 (在图22中显示的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)在4℃、17℃和37℃在pH6.1的PAP库中更高阶聚集体的形成速率作为时间的函数。在该图中，□ = pH 6.1在4℃，ο = pH 6.1在17℃，且Δ = pH 6.1在37℃。

图2显示了抗-DKK-1单克隆抗体 (在图22中显示的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)在4℃、17℃和37℃在pH3.5的PAP库中更高阶聚集体的形成速率作为时间的函数。在该图中，□ = pH 3.5在4℃，ο = pH 3.5在17℃，且Δ = pH 3.5在37℃。

图3显示了抗-DKK-1单克隆抗体在4℃、17℃和37℃在pH6.1的PAP库中二聚体的形成速率作为时间的函数。在该图中，□ = pH 6.1在4℃，ο = pH 6.1在17℃，且Δ = pH 6.1在37℃。

图4显示了抗-DKK-1单克隆抗体在4℃、17℃和37℃在pH3.5的PAP库中二聚体的形成速率作为时间的函数。在该图中，□ = pH 3.5在4℃，且ο = pH 3.5在17℃。

图5显示了抗-DKK-1单克隆抗体在25℃和30℃在pH3.5的PAP库中更高阶聚集体的形成速率作为时间的函数。在该图中，□ = pH 3.5在25℃，且ο = pH 3.5在30℃。

图6显示了抗-DKK-1单克隆抗体在25℃和30℃在pH3.5的PAP库中二聚体的形成速率作为时间的函数。在该图中，□ = pH 3.5在25℃，且ο = pH 3.5在30℃。

图7显示了抗-DKK-1单克隆抗体在21℃在pH4.0、4.5和5.0更高阶聚集体的形成速率作为时间的函数。在该图中，□ = pH 4.0在21℃，ο = pH 4.5在21℃，且Δ = pH 5.0在21℃。

图8显示了抗-DKK-1单克隆抗体在30℃在pH4.0、4.5和5.0更高阶聚集体的形成速率作为时间的函数。在该图中，□ = pH 4.0在30℃，ο = pH 4.5在30℃，且Δ = pH 5.0在30℃。

图9显示了抗-DKK-1单克隆抗体在21℃在pH4.0、4.5和5.0二聚体的形成速率作为时间的函数。在该图中，□ = pH 4.0在21℃，ο = pH 4.5在21℃，且Δ = pH 5.0在21℃。

图10显示了抗-DKK-1单克隆抗体在30℃在pH4.0、4.5和5.0二聚体的形成速率作为时间的函数。在该图中，□ = pH 4.0在30℃，ο = pH 4.5在30℃，且Δ = pH 5.0在30℃。

图11显示了抗-DKK-1单克隆抗体PAP在pH 3.5在4℃、17℃、25℃和30℃相对于时间的更高阶聚集体的水平。在该图中，■ = 30℃，♦ = 25 ℃，▲ =17℃，且x = 4℃。

图12显示了抗-DKK-1单克隆抗体在pH 3.91和50mM柠檬酸盐浓度中更高阶聚集体形成作为时间和温度的函数。在该图中，◊ = pH 3.91在4℃，□ = pH 3.91在15℃，Δ = pH 3.91在20℃，且x = pH 3.91在24℃。

图13显示了抗-DKK-1单克隆抗体在室温在50mM和100 mM柠檬酸盐浓度中更高阶聚集体形成作为时间的函数。在该图中，■ = pH 3.5在25℃，且♦ = pH 3.91在24℃。

图14显示了抗-DKK-1单克隆抗体在25℃更高阶聚集体形成作为柠檬酸盐浓度和时间的函数。在该图中， = 60 mM柠檬酸盐在pH 3.8，

= 75 mM柠檬酸盐在pH 3.6，

= 100 mM柠檬酸盐在pH 3.6， = 85 mM柠檬酸盐在pH 3.4，且= 40 mM柠檬酸盐在pH 3.4。

图15A显示了抗-DKK1抗体在30 mM、60 mM和100 mM柠檬酸盐中在pH 3.0的DSC曲线。

图15B显示了抗-DKK1抗体在30 mM、60 mM和100 mM柠檬酸盐中在pH 3.5的DSC曲线。

图15C显示了抗-DKK1抗体在30 mM、60 mM和100 mM柠檬酸盐中在pH 4.0的DSC曲线。

图16A显示了抗-DKK1抗体在30 mM、60 mM和100 mM柠檬酸盐中在pH 4.5的DSC曲线。

图16B显示了抗-DKK1抗体在30 mM、60 mM和100 mM柠檬酸盐中在pH 5.0的DSC曲线。

图16C显示了抗-DKK1抗体在30 mM、60 mM和100 mM柠檬酸盐中在pH 5.5的DSC曲线。

图16D显示了抗-DKK1抗体在30 mM、60 mM和100 mM柠檬酸盐中在pH 6.0的DSC曲线。

图17显示了在25 ℃用含有和不含50 mM 精氨酸的60 mM柠檬酸盐洗脱时抗-DKK-1单克隆抗体的更高阶聚集体的形成速率。在该图中，◊ = 60 mM柠檬酸盐 + 50 mM 精氨酸，在pH 3.5和25℃，且□ = 仅60 mM柠檬酸盐，在pH 3.5和25℃。

图18显示了在25 ℃用含有和不含250 mM 精氨酸的100 mM柠檬酸盐洗脱时抗-DKK-1单克隆抗体的更高阶聚集体的形成速率。在该图中，◊ = 100 mM柠檬酸盐 + 250 mM 精氨酸，在pH 3.5和25℃，且□ = 仅100 mM柠檬酸盐，在pH 3.5和25℃。

图19显示了与磷酸盐缓冲液相比，抗-DKK-1单克隆抗体在不同的柠檬酸盐浓度在25℃更高阶聚集体的形成速率作为时间的函数。在该图中，

= 60 mM柠檬酸盐，

= 75 mM柠檬酸盐， = 40 mM柠檬酸盐，

= H₃PO₄， = 100 mM柠檬酸盐，且

= 85 mM柠檬酸盐。

图20显示了抗-DKK-1单克隆抗体的单克隆抗体浓度对在25℃在15 mM柠檬酸盐中的更高阶聚集速率随时间影响。在该图中，♦ = 8 mg/mL 抗-DKK-1 mAb，■ = 14 mg/mL 抗-DKK-1 mAb，且▲ = 34 mg/mL 抗-DKK-1 mAb。

图21显示了抗-DKK-1单克隆抗体的单克隆抗体浓度对在pH 4.0、在15 mM柠檬酸盐中在21 ℃和在85 mM 醋酸盐中在25℃的更高阶聚集速率随时间影响。在该图中，● = 在醋酸盐中5 mg/mL 抗-DKK-1 mAb，+ = 在醋酸盐中11 mg/mL 抗-DKK-1 mAb，Δ =在醋酸盐中 37 mg/mL 抗-DKK-1 mAb，且♦ = 在柠檬酸盐中7 mg/mL 抗-DKK-1 mAb 。

图22显示了抗-DKK-1单克隆抗体的重链和轻链氨基酸序列 (SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)。

图23显示了抗-ADDL # 1单克隆抗体的重链和轻链氨基酸序列(SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)。

图24显示了抗-ADDL # 2单克隆抗体的重链和轻链氨基酸序列 (SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)。

图25显示了抗-hIL-13rα-1单克隆抗体的重链和轻链氨基酸序列 (SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)。

图26显示了来自单克隆抗体的IgG2m4 Fc区的氨基酸序列与来自IgG1、IgG2和IgG4的Fc区的氨基酸序列的比对。

具体实施方式

定义

本文使用的术语“蛋白”或“多肽”是指由通过肽键共价连接到一起的氨基酸残基组成的多肽。

本文使用的术语“抗体”、“免疫球蛋白”和“免疫球蛋白分子” 可互换地使用。每个抗体具有允许它结合它的特定抗原的独特结构，但是所有抗体具有相同的本文所述的总体结构。已知基础抗体结构单元包含亚基的四聚体。每个四聚体具有2个相同的多肽链对，每个对具有1个“轻”链(约25 kDa)和1个“重”链 (约50-70 kDa)。每个链的氨基端部分包括约100-110个或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。每个链的羧基端部分定义为恒定区，其主要负责效应子功能(10)。

术语“Fc”片段是指含有C_H2和C_H3结构域的抗体的“片段结晶的”C-端区域。术语“Fab”片段是指含有V_H、C_H1、V_L和C_L结构域的抗体的“片段抗原结合”区域。

本文使用的术语“单克隆抗体” (mAb)是指从基本上均一的抗体群体得到的抗体，即，除了可能以微量存在的可能天然存在的突变以外，构成该群体的单个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，不同于通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制品，每个mAb针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性以外，单克隆抗体的优势在于，它们可以通过杂交瘤培养来合成，未被其它免疫球蛋白污染。术语“单克隆”是指从基本上均一的抗体群体得到的抗体的特征，不应解释为要求通过任意特定方法来生产抗体。例如，本文的单克隆抗体可以通过Kohler等人, (1975) Nature, 256:495首先描述的杂交瘤方法来制备，或可以通过重组DNA方法来制备(11)。

本文使用的术语“单体单克隆抗体”是指含有2个重链和2个轻链的抗体分子，即单体。

本文使用的“抗-DKK-1”抗体是指具有在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2（参见图22）中所述的轻链和重链氨基酸序列的单克隆抗体。

本文使用的“抗-ADDL”抗体是指具有在SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6（分别参见图23和图24）中所述的重链和轻链氨基酸序列的单克隆抗体。

本文使用的“抗-hIL-13rα1”抗体是指具有在SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8（参见图25）中所述的重链和轻链氨基酸序列的单克隆抗体。

本文使用的“修饰的IgG2抗体”是指这样的抗体，其具有由图26所示的氨基酸序列表示的单克隆抗体的“IgG2m4”Fc区。

术语“二聚体”本文使用的是指由2个称作单体的亚基组成的生物分子。本发明的“二聚体”是指含有2个单体单克隆抗体的分子。

本文使用的术语“更高阶聚集体”或“HOA”是指单体单克隆抗体的大寡聚体，通常大于300 kDa，即二聚体分子量。

本文使用的术语“聚集体”或“聚集”是指2个或更多个单个分子的团聚(agglomeration)或寡聚，即蛋白聚集体或蛋白聚集。蛋白聚集体可以是可溶的或不溶的。

本文使用的“杂质”是指不同于目标蛋白产物的物质，诸如蛋白聚集体。杂质可以是目标蛋白或另一种蛋白的变体。本文的杂质的具体实例包括来自生产目标蛋白的宿主细胞的蛋白，诸如宿主蛋白、浸出的（leached ）蛋白A、DNA、RNA等 (参见，例如美国专利申请公开号US 2005/0038231)。

本文使用的术语“蛋白降解”是指这样的单体单克隆抗体或蛋白，其在一定条件下降解，形成二聚体或更高阶聚集体。

初步回收产生蛋白A色谱法的进料流。用于描述该进料流的一个术语称作“深度过滤的离心分离液”，且如本文所使用的，是指已经通过离心(去除细胞和碎片)和深度过滤(去除< 10 μm的细碎片)处理过的单克隆抗体或蛋白溶液。在本发明中，深度过滤的产物被用作蛋白A亲和色谱法实验室实验的进料溶液，并用于生产不同的临床批次。

术语“蛋白A亲和色谱法”是指使用蛋白A分离或纯化物质和/或颗粒，其中所述蛋白A通常固定化在固相上。蛋白A是最初在金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureas）中发现的40-60 kD细胞壁蛋白。抗体对蛋白A树脂的结合是高度特异性的。蛋白A以高亲和力结合免疫球蛋白的Fc区。它以高亲和力结合人IgG1和IgG2 以及小鼠IgG2a和IgG2b。蛋白A以中等亲和力结合人IgM、IgA和IgE以及小鼠IgG3和IgG1。包含C_H2/C_H3区的蛋白可以可逆地被蛋白A结合或吸附。用于本文的蛋白A亲和色谱法中的蛋白A亲和色谱柱包括但不限于：固定化在琼脂糖固相上的蛋白A，例如MABSELECT^TM或MABSURE^TM柱(Amersham Biosciences Inc.)；固定化在聚苯乙烯固相上的蛋白A，例如POROS 50A^TM柱 (Applied Biosystems Inc.)。

当与本发明的方法一起使用时，“样品”包括但不限于：任意身体组织、血液、血清、血浆、脑脊髓液、淋巴细胞、渗出物或来自细胞培养物的上清液。

术语“装载”或“负载”是指每单位体积的蛋白的量。

本文使用的术语“接触”是指使单克隆抗体接触在蛋白A亲和色谱柱中的蛋白A树脂。

本文使用的术语“洗脱缓冲液”是指包含诸如柠檬酸钠或醋酸钠等主要物质（a primary species）的缓冲液，其用于从蛋白A亲和柱洗脱抗体。

本文使用的术语“柠檬酸盐”是指从对应的酸或盐衍生出的存在于洗脱缓冲液中的阴离子物质。

本文使用的术语“醋酸盐”是指从对应的酸或盐衍生出的存在于洗脱缓冲液中的阴离子物质。

本文使用的术语“级分”（“fraction”），如在“收集一个或多个级分”中，是指分离过程的结果，在所述分离过程中，将一定量的混合物(固体、液体、溶质或悬浮液)分成许多更小的量(“级分”)，其中组成根据梯度变化。在这里，随着单体单克隆抗体从蛋白A亲和柱洗脱，收集级分。

本文使用的术语“再生缓冲液”是指用于清洁柱以去除结合的杂质的缓冲液。例如，高盐缓冲液、含有NaOH的或含有磷酸的缓冲液(13)。

本文使用的术语“柱体积”或“CV”是指在柱内填充的树脂的体积，包括任意空体积。例如，如果给10 mL柱填充了2 ml树脂，则一个CV是2 mL。

本文使用的术语“停留时间”是指一部分产物与树脂相互作用的时间的量。

本文使用的术语“流速”是指柱体积除以停留时间。例如，在指定的5 min 停留时间，装有10 ml树脂的柱的流速如下：

。

本文使用的术语“蛋白A产物”或“PAP”是指使用诸如柠檬酸钠或醋酸钠等酸从蛋白A亲和色谱柱洗脱的产物。

本文使用的术语“猝灭的蛋白A产物”或“QPAP”是指将碱加入PAP，诸如tris碱或磷酸盐溶液，以使PAP的pH从约pH 3.0-4.0升高至约6.0 - 7.5。

本文使用的术语“产率”是指回收的产物的量除以装载到柱上的产物的量，乘以100。例如，给柱装载含有100 g产物的溶液，但是从该柱在洗脱流中回收了80 g产物，则具有80%产率。

本文使用的术语“示差扫描量热法”或“DSC”是指这样的热分析技术，其测量升高样品和参照物的温度所需的热的量的差异作为温度的函数。对于蛋白，DSC会提供关于蛋白和它的单个结构域的热稳定性和未折叠形式的蛋白的溶解度的信息。

本文使用的术语“高压或高效液相色谱法”或“HPLC”是指，使用高压来分离、鉴别和定量化合物的柱色谱法形式。HPLC使用装有在特定温度的固定相的柱、流动相溶液的泵、和用于定量注射到柱上的每种化合物的检测器。

术语“高压尺寸排阻色谱法”或“HPSEC”是指这样的色谱方法，其使用高压(20 - 150巴) 基于它们的分子量或流体力学体积来分离颗粒。在本发明中，将该技术用于分离和定量单克隆抗体、二聚体和更高阶聚集体。

本文使用的术语“小规模”是指小于300 mL树脂的蛋白A亲和柱尺寸。

本文使用的术语“稳定剂”是指降低蛋白聚集体形成速率的试剂，诸如精氨酸、脯氨酸或组氨酸。

本文使用的术语“时间零点样品”是指实验的起始时间，其表示产物已经刚刚从树脂洗脱。

本发明的实施方案

在上述方法的一个实施方案中，所述洗脱缓冲液是醋酸盐或柠檬酸盐。

在另一个实施方案中，所述洗脱缓冲液中柠檬酸盐的浓度是约0.030 M至约0.085 M。本文使用的“约”是指± 0.015 M。

在另一个实施方案中，醋酸盐的浓度是约0.050 M至约0.200 M。本文使用的“约”是指± 0.015 M。

在上述方法的另一个实施方案中，所述方法在约4℃至约30 ℃的温度进行。本文使用的“约”是指± 4℃。

在另一个实施方案中，所述方法在约15℃至约27 ℃的温度进行。本文使用的“约”是指± 4℃。

在一个实施方案中，所述单体单克隆抗体是IgG抗体。

在另一个实施方案中，所述单体单克隆抗体是IgG1或修饰的IgG2抗体。

在另一个实施方案中，所述IgG1抗体是抗-ADDL抗体。一个实例是抗-ADDL抗体，其重链和轻链表示为图23 中的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4 (参见，例如PCT国际申请号PCT/US2005/038125)。

在另一个实施方案中，所述修饰的IgG2抗体是IgG2m4抗体 (图26) (参见，例如，美国系列号 11/581,931)。

在另一个实施方案中，所述修饰的IgG2m4抗体是抗-DKK-1抗体。一个实例是抗-DKK-1抗体，其重链和轻链表示为图22 中的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2 (参见，例如，美国系列号 12/012,885)。

在另一个实施方案中，所述修饰的IgG2m4抗体是抗-ADDL抗体。一个实例是抗-ADDL抗体，其重链和轻链表示为图24中的SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6 (参见，例如，PCT国际申请号PCT/US2006/040508)。

在另一个实施方案中，所述修饰的IgG2m4抗体是抗-hIL-13rα-1抗体。一个实例是抗- hIL-13rα-1抗体，其重链和轻链表示为图25 中的SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8 (参见，例如，美国系列号 11/875,017)。

在一个实施方案中，以约50 mM至约500 mM的浓度，将氨基酸加入洗脱缓冲液中。本文使用的“约”是指± 0.015 M。

在另一个实施方案中，使用的氨基酸是组氨酸、脯氨酸或精氨酸。

在一个实施方案中，所述单体单克隆抗体是IgG抗体。

在另一个实施方案中，所述IgG1抗体是抗-ADDL抗体。一个实例是抗-ADDL抗体，其重链和轻链表示为图23中的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4 (参见，例如PCT国际申请号PCT/US2005/038125)。

在另一个实施方案中，所述修饰的IgG2m4抗体是抗-DKK-1抗体。一个实例是抗-DKK-1抗体，其重链和轻链表示为图22中的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2 (参见，例如，美国系列号 12/012,885)。

在另一个实施方案中，所述修饰的IgG2m4抗体是抗-hIL-13rα-1抗体。一个实例是抗- hIL-13rα-1抗体，其重链和轻链表示为图25中的SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8 (参见，例如，美国系列号 11/875,017)。

在一个实施方案中，所述单体单克隆抗体是IgG抗体。

在另一个实施方案中，所述IgG1抗体是抗-ADDL抗体。一个实例是抗-ADDL抗体，其重链和轻链表示为在图23中的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4 (参见，例如PCT国际申请号PCT/US2005/038125)。

在每个上述方法的另一个实施方案中，所述蛋白A产物库具有3.2或更大的pH。

从下面的实施例将更好地理解本发明。但是，本领域技术人员会容易地理解：讨论的具体方法和结果仅仅是在此后的权利要求书中更完整地描述的本发明的例证。

实施例

实施例 1

降低温度来降低在蛋白 A 亲和色谱法洗脱和随后的低 pH 保持过程中的蛋白聚集体水平

为了表征蛋白聚集的温度和pH依赖性，针对抗-DKK-1单克隆抗体，评价了温度和pH对含有柠檬酸盐 (100mM, pH 3.5)的PAP洗脱库的影响。相同的操作可以用于其它mAb，诸如抗-ADDL单克隆抗体。

材料和方法

小规模: 使用AKTA EXPLORER 100^TM，进行所有小规模实验。磷酸盐、柠檬酸盐和氢氧化钠缓冲液购自Hyclone (Logan, UT)。用于PAP的pH调节的Tris碱购自Hyclone (Logan, UT)。用于蛋白A亲和色谱法实验的Mabselect^TM树脂购自GE Healthcare。得到深度过滤的离心分离液，并用作蛋白A亲和色谱法实验的原料。热混合器R（Thermomixer R）(Eppendorf)和2个温控室用于控制PAP和QPAP 样品温度。

实验 1A:

以6.8 mL/min (5分钟停留时间)，用5个CV的6 mM磷酸钠、pH 7.2 (PBS)平衡装有Mabselect^TM树脂 (33.35 mL)的柱 (1.7 cm x 14.5 cm)。在17℃，使用6.8 mL/min的流速，以27 g mAb/升树脂，装载深度过滤的离心分离液。装载后，用3个CV的PBS、随后用4个CV的6 mM磷酸钠 pH 7.2洗涤柱。以8.3 mL/min (4 min 停留时间)，用0.1M 柠檬酸钠 pH 3.5洗脱产物0.5-3.0 CV。洗脱后，将PAP (9 g/L)库在17℃在pH 3.5保持30分钟。低pH保持后，将在pH 3.5的蛋白A产物 (PAP)的一部分放置在4、17和37℃。将PAP流的剩余部分猝灭至pH 6.1，并放在4、17和37℃。在不同的时间间隔采取来自pH条件3.5和6.1的样品 (280 µL) ，使用Tris碱(1M, 20 µL)猝灭至pH 6，并使用HPSEC分析蛋白聚集体含量。以8.3 mL/min，用5个CV的50 mM 氢氧化钠、1M 氯化钠再生柱，并保藏在20%的乙醇的PBS溶液中。

实验 1B:

该实验使用与在实验1A中所述进行蛋白A亲和色谱法相同的柱、原料和操作，例外是该步骤在25℃进行。洗脱后，细分PAP (8 g/L, pH 3.5)，并放在25℃和30℃。在不同的时间间隔，获取在2个温度的样品 (280 µL)，使用Tris碱(1M, 20 µL)猝灭至pH 6，并使用HPSEC分析蛋白聚集体含量。在8.3 mL/min，用5个CV的50 mM 氢氧化钠、1M 氯化钠再生柱，并保存在20%的乙醇的PBS溶液中。

分析 :

使用在Agilent 1100^TM HPLC 系统 (Agilent, Palo Alto, CA)上的POROS^TM 蛋白A ID 免疫亲和柱，分析所有PAP或QPAP 样品的mAb单体浓度。使用在Agilent 1100^TM HPLC 系统上的Tosoh 尺寸排阻柱 (0.78 cm内径x 30 cm长度)，定量在每个样品中的蛋白聚集体 (二聚体和更高阶聚集体)。使用pH探头(± 0.1 pH单位精确度)和具有温度补偿的量器 (二者购自Fisher Scientific)测量溶液 pH。

结果和讨论

使用蛋白A亲和色谱法纯化抗-DKK-1抗体，并保持在不同的 pH (3.5, 6.1)和温度 (4℃-37℃)值，以测定pH和温度对蛋白聚集的影响。通过HPSEC 分析测得，当在从蛋白A亲和柱洗脱产物后将PAP流猝灭至pH 6.1并在37℃保持多达3.5天时，蛋白聚集没有发生(图1)。在pH 6.1和37℃，在3.5天时，更高阶聚集体水平从0.8%增加至1.3%，而抗体水平从98%降低至97%。在所有温度、在pH 6.1，二聚体保持在恒定水平(图3)。在4℃和17℃、在pH 6.1，单体保持稳定(参见，图1和3)。

在pH 3.5，更高阶聚集体 (HOA)的水平随着温度升高而显著增加(图2)。另外，随着温度升高至17℃，在pH 3.6的二聚体水平增加了0.8% (图4)。在37℃和pH 3.6，单体的稳定性快速降低(参见，图2和4)，这促进了显著的蛋白聚集体沉淀。该沉淀会影响通过HPSEC定量蛋白聚集体水平的精确度，并代表该方法的限制性。当温度降低至4℃时，HOA水平在30分钟后是仅0.7%，在8小时后是1.5% (图2)。因此，通过使PAP的温度从17℃降低至4℃，使HOA水平显著降低了4%-7%。

另一个实验在25℃和30℃进行，以定量更高的温度 (> 17℃)对蛋白聚集体形成的影响。在25℃每20分钟，使PAP (pH 3.5, 9 mg/mL 抗-DKK-1抗体)的更高阶聚集体 (HOA)的水平增加1.5%-3.0%，并在30℃每20分钟，增加4%-6% (图5)。在25℃经4小时，二聚体的水平增加至7%，并在30℃经1.5小时增加至10% (图6)。另外，25℃实验的时间零点样品(产物洗脱和收集后) 含有0.6% HOA。因此，当产物结合或从该实验的柱洗脱时，HOA没有形成。

实施例 2

升高 PAP 库的 pH 来降低在蛋白 A 亲和色谱法洗脱和随后的低 pH 保持过程中的蛋白聚集体水平

为了表征pH对蛋白聚集的影响，针对抗-DKK1单克隆抗体，评价了pH (3.5-5.0)对QPAP洗脱库的影响。相同的操作可以用于其它mAb，诸如抗-ADDL单克隆抗体。

材料和方法

小规模: 使用AKTA EXPLORER 100^TM(GE Healthcare)，进行所有小规模实验。磷酸盐、柠檬酸盐和氢氧化钠缓冲液购自Hyclone (Logan, UT)。用于PAP的pH调节的Tris碱购自Hyclone (Logan, UT)。用于蛋白A亲和色谱法实验的Mabselect^TM树脂购自GE Healthcare。使用深度过滤的离心分离液作为蛋白A亲和色谱法实验的原料。热混合器R (Eppendorf)和2个温控室用于控制PAP和QPAP 样品温度。

实验 2A

以6.8 mL/min (5分钟停留时间)，用5个CV的6 mM磷酸钠 pH 7.2 (PBS)平衡装有Mabselect^TM树脂 (33.35 mL)的柱 (1.7 cm x 14.5 cm)。在室温(21℃)，使用6.8 mL/min的流速，以25 g mAb/升树脂，装载深度过滤的离心分离液。装载后，用3个CV的PBS、随后用4个CV的6 mM磷酸钠 pH 7.2洗涤柱。以8.3 mL/min (4 min 停留时间)，用0.1M 柠檬酸钠 pH 3.5洗脱产物0.5-3.0 CV。洗脱后，使用1M Tris碱(16 v%)，将PAP (9 g/L)库猝灭至pH 6。

实验 2B

该QPAP流用作pH实验的进料。将柠檬酸盐溶液(4 M, 50 - 100 µL)加入QPAP (20 mL)中，直到溶液pH达到5.0。在pH 5.0，获取该溶液的样品(2 mL)，并放在21℃和30℃。重复该操作，以产生在pH 4.5和4.0的溶液条件。在不同时间点获取样品 (100 µL)，使用Tris碱(0.5-1M, 10-30 µL)猝灭至pH 6，并使用HPSEC分析蛋白聚集体含量。

分析 :

使用在Agilent 1100^TM HPLC 系统 (Agilent, Palo Alto, CA)上的POROS^TM 蛋白A ID 免疫亲和柱，分析所有PAP或QPAP 样品的mAb浓度。使用在Agilent 1100^TM HPLC 系统上的Tosoh 尺寸排阻柱 (0.78 cm内径x 30 cm长度)，定量在每个样品中的蛋白聚集体 (即二聚体和更高阶聚集体)。使用具有+/- 0.1 pH单位精确度的pH探头(Fisher Scientific)和具有温度补偿的量器 (Fisher Scientific)，测量溶液 pH。

结果和讨论

使QPAP的pH降低到pH 4.0至pH 5.0，以测定pH对蛋白聚集的影响。所述单体在21℃和30℃、在pH 4.5或更高稳定至少2.5小时 (参见，图7和9以及8和10)。在pH 4.0在21℃的HOA水平是在0.9%-2.0%范围内，且在30℃经2.5小时，是在3%-13%范围内(图7和图8)。在pH 4.0，HOA水平随着温度升高而升高，这是在实施例 1中在pH 3.5发现的相同趋势。二聚体水平在21℃和pH 4.0-5.0保持恒定，但是当在pH 4.0温度升高至30℃时增加 (图9和图10)。

除了温度以外，pH也影响PAP库中蛋白聚集体形成的动力学速率。随着PAP库的pH升高，更高阶聚集体和二聚体的比例显著减少。使用高浓度酸，可以调节在该实验中离子强度变化的影响。为了防止在蛋白A亲和色谱法洗脱和随后的低pH保持步骤过程中的蛋白聚集，可以在更高的pH进行洗脱。

实施例 3

解耦洗脱缓冲液浓度和 pH 的影响来降低在蛋白 A 亲和色谱法洗脱和随后的低 pH 保持过程中的蛋白聚集体水平

解耦洗脱缓冲液pH和浓度的影响，以表征两个参数对PAP库中蛋白聚集的影响。另外，测定了从蛋白A亲和色谱柱洗脱单体所需的洗脱缓冲液的最小浓度。针对抗-DKK1单克隆抗体，进行了该评价。

材料和方法

小规模: 使用AKTA EXPLORER 100^TM(GE Healthcare) ，进行所有小规模实验。磷酸盐、柠檬酸盐和氢氧化钠缓冲液购自Hyclone (Logan, UT)。用于PAP的pH调节的Tris碱购自Hyclone (Logan, UT)。用于蛋白A亲和色谱法实验的Mabselect^TM树脂购自GE Healthcare。使用深度过滤的离心分离液作为蛋白A亲和色谱法实验的原料。使用热混合器R (Eppendorf)控制PAP和QPAP 样品温度。

实验 A:

以0.2 mL/min (5分钟停留时间)，用5个CV的6 mM磷酸钠 pH 7.2 (PBS)平衡装有Mabselect^TM树脂 (1.06 mL)的柱 (0.5 cm x 5.4 cm)。在室温(17℃-25℃)，使用0.2 mL/min的流速，以25 g mAb/升树脂，装载深度过滤的离心分离液。装载后，用3个CV的PBS、随后用4个CV的6 mM磷酸钠pH 7.2，以0.2 mL/min洗涤柱。使用10% 0.1M 柠檬酸钠 pH 3.5 (10 mM柠檬酸盐)的不连续梯度，以0.5-1.0 mL/min (1-2 min 停留时间)洗脱产物至少2.5 CV。使用20%、30%和100%的0.1M 柠檬酸钠pH 3.5缓冲液（分别是20 mM、30 mM和100 mM柠檬酸盐)，重复该洗脱步骤另外3次。洗脱后，使用1 M tris碱，将所有PAP流猝灭至pH 6。在0.5-1.0 mL/min，用50 mM 氢氧化钠、1 M 氯化钠再生柱，并保存在20v%的乙醇的PBS溶液中。

实验 B:

以2.2 mL/min (5分钟停留时间)，用5个CV的6 mM磷酸钠 pH 7.2 (PBS)平衡装有Mabselect^TM树脂 (10.4 mL)的柱(1.1 cm x 10.9 cm)。在室温(17℃-20℃)，使用2.1 mL/min的流速，以27 g mAb/升树脂，装载深度过滤的离心分离液。装载后，用3个CV的PBS、随后用4个CV的6 mM磷酸钠pH 7.2，以2.1 mL/min洗涤柱。使用60% 0.1M 柠檬酸钠 pH 3.5 (60 mM柠檬酸盐)或40% 0.1M 柠檬酸钠 pH 3.0 (40 mM柠檬酸盐)的不连续梯度，以2.6 mL/min (4 min 停留时间)洗脱产物0.5-3 CV。洗脱后立即将PAP (11 g/L)库的样品放在25℃的热混合器中。洗脱后立即获取时间零点样品，用tris碱猝灭，并放在HPSEC上，进行蛋白聚集体含量分析。在不同的时间间隔获取样品 (200 µL)，立即使用Tris碱(0.5-1M, 5-10 µL)猝灭至pH 6，并使用HPSEC分析蛋白聚集体含量。在2.4 mL/min，用5个CV的50 mM 氢氧化钠、1 M 氯化钠再生蛋白A亲和柱，并保存在20%的乙醇的PBS溶液中。对于60%柠檬酸盐洗脱 (60 mM柠檬酸盐)，将PAP库分成单独的2 mL等分试样。将柠檬酸盐 (4M, 5-10 µL)加入一个等分试样，达到pH 3.4或3.6。将磷酸 (8 v%, 10 µL)加入一个等分试样，达到pH 3.6。

实验 C:

在蛋白A 洗脱缓冲液中，将柠檬酸盐浓度降低至50 mM，以测定酸浓度是否对抗-DKK-1稳定性有影响。该降低的酸浓度影响在洗脱过程中pH渐变的梯度，这导致更高的PAP库pH3.9（相对于3.6）。

使用5分钟的停留时间，在23-25℃，将深度过滤的离心分离液 (1.7 g/L 抗-DKK-1 mAb) 装载上蛋白A柱 (V = 33.35 mL, 板: 2026 N/m²,不对称: 1.33)。装载后，用3个CV的PBS、随后用4个CV的6 mM磷酸钠 pH 7.2，以0.2 mL/min洗涤柱。对于洗脱，使用100 mM柠檬酸盐 pH 3.5的50% 梯度，从树脂洗脱抗-DKK-1单克隆抗体。在洗脱过程中，从0.5至3.0 CV，每0.5 CV收集级分。分析这些级分的单体浓度、pH和电导率，然后合并，达到7.2 g/L的终浓度。将PAP流的样品放在不同的温度(4、15、20和23-25℃)和pH值 (3.9、4.2、4.5、5.0)，并使用HPSEC在不同的时间点分析聚集(图11)。当酸浓度降低至50 mM时，pH梯度轻微变化，导致PAP pH3.9 （相对于100 mM柠檬酸盐的3.6）。但是，洗脱曲线重叠，且产物收集窗保持相同。50%洗脱的蛋白A产率是94%。使用50 mM柠檬酸盐洗脱，在上述不同温度的HOA曲线如图12所示。在23-25℃，50 mM和100 mM柠檬酸盐洗脱之间的对比表示在图13中。

分析 :

使用在Agilent 1100^TM HPLC 系统 (Agilent, Palo Alto, CA)上的POROS^TM 蛋白A ID 免疫亲和柱（cartridge），分析所有PAP样品的mAb浓度。使用在Agilent 1100^TM HPLC 系统上的Tosoh 尺寸排阻柱 (0.78 cm内径x 30 cm长度)，定量在每个样品中的蛋白聚集体 (二聚体和更高阶聚集体)。使用具有± 0.1 pH单位精确度的pH探头(Fisher Scientific)和具有温度补偿的量器 (Fisher Scientific)，测量溶液 pH。

结果和讨论

使用不同的柠檬酸盐浓度，洗脱蛋白A亲和柱，以测定可能从树脂洗脱单体的柠檬酸盐最低浓度。10 v%和20 v%柠檬酸盐浓度洗脱80%的结合在柱上的单体(未显示)。当柠檬酸盐浓度增加至30 v%时，从柱洗脱仅2%的额外单体。因此，从柱洗脱≥ 80%单体的最小浓度是20 mM柠檬酸盐。

测试了不同的柠檬酸盐浓度，以测定在不同的 pH点柠檬酸盐浓度对单体稳定性的影响。当将柠檬酸盐浓度降低至60 mM并将pH升高至3.8时，在25℃ 的HOA水平是0.3%（相对于4%-5%，100 mM柠檬酸盐） (pH 3.5) (图14)。随着柠檬酸盐浓度降低至在pH 3.6的40 mM柠檬酸盐时，HOA水平在0.3%保持至少3小时。因此，单体稳定性是柠檬酸盐浓度以及pH的函数。当加入磷酸（替代柠檬酸盐）来pH调节洗脱库时，每个时间点样品的HOA水平增加了大约0.3%，直到2小时。因此，与在相同溶液pH (3.6)的柠檬酸盐相比，加入磷酸会增加HOA形成速率。

在PAP库 pH 3.6，测试了下述4个不同的酸浓度: 40 mM、75 mM和100 mM柠檬酸盐和含有0.1 v%磷酸的60 mM柠檬酸盐。HOA的水平随着柠檬酸盐浓度增加而增加。另外，在大于75 mM的柠檬酸盐浓度，HOA水平随时间显著增加。例如，在1小时时间范围内，在100 mM柠檬酸盐中的HOA速率是每20分钟2%，相对于在相同pH3.6在75 mM柠檬酸盐中的每20分钟0.2%-0.3%。与在相同溶液pH3.6的柠檬酸盐相比，向PAP库中加入磷酸会增加HOA形成速率。当pH保持恒定时，PAP库中的柠檬酸盐浓度对HOA形成有影响。

从上面的图12可以看出，使用50 mM柠檬酸盐洗脱条件在pH 3.9，PAP是非常稳定的，且在 ≤ 15℃经至少12小时含有≤ 0.4% HOA。在更高的温度，PAP中的抗-DKK-1 mAb 也表现出提高的稳定性。例如，在20-25℃保持12小时后，PAP含有1.0%-1.4% HOA。对于30-60分钟的低pH保持时间，在20-25℃，PAP中的HOA水平是0.2%-0.4%，其低于图13中的对比所示的批次中的3%-6% HOA水平。在50 mM柠檬酸盐 PAP中的蛋白降解的总量(HOA + 二聚体)是1.5%，其满足≤ 5%的目标。因此，经证实，降低柠檬酸盐浓度和增加pH会使PAP的HOA水平在≤ 60分钟的保持时间从3%-6%显著降低至0.5%。

实施例 4

通过示差扫描量热法测得的 pH 和柠檬酸盐浓度对热诱导的单克隆抗体的解折叠的影响

示差扫描量热法是用于测量蛋白稳定性的工具。蛋白稳定性主要依赖于环境，所述环境具有稳定化和去稳定化蛋白的折叠结构的能力。通过测量温度渐变（ramp）过程中蛋白溶液的热容，与溶剂参照物的热容相对比，进行DSC。蛋白溶液和溶剂参照物之间的示差热容会提供代表蛋白的变性的曲线。从该曲线可以确定表观变性温度（melting temperature）I。蛋白向未折叠状态的变性经常导致不希望的事件，诸如聚集或化学降解 (19, 20, 21, 22, 23)。

通过测量温度诱导的蛋白解折叠，示差扫描量热法(DSC)会提供对折叠机理的一些了解。由DSC提供的信息可用于涉及蛋白稳定性的多种用途，诸如克隆选择、制剂开发和蛋白表征(24, 25)。具有相对容易的方法来在开发过程的早期鉴别出最稳定的药物化合物，会通过潜在地缩短面市时间来提供巨大利益。DSC在制剂开发中也是关键性的。蛋白环境（诸如pH、离子强度和其它赋形剂）的变化可以影响蛋白的折叠结构，导致变性温度的漂移。通过在制剂缓冲液中筛选不同的添加剂，DSC会提供优化缓冲液组成的快速方式。

治疗蛋白的聚集具有非常严重的牵连，其范围从纯化过程中的困难到在体内的免疫原性应答。蛋白的变性和随后的聚集对许多因素是敏感的，包括pH和温度。因而，调节这两个因素对于治疗蛋白的稳定性是关键性的。

单克隆抗体具有多个结构域，每个结构域受到pH和离子强度的不同影响。使用DSC来评价离子强度(30 mM、60 mM和100 mM的柠檬酸盐浓度)和pH (3.0 to 6.0)对蛋白的热稳定性的影响。

材料和方法

在30 mM、60 mM和100 mM 柠檬酸(Sigma, St. Louis)的浓度，制备溶液。使用氢氧化钠 (Fisher Chemicals)将柠檬酸盐溶液的pH调至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5和6.0 pH目标值。使用Accumet pH计(Fisher Scientific)得到pH测量结果。

使用在每个pH的柠檬酸盐缓冲液，将在制剂缓冲液中的54.2 mg/mL的抗-DKK-1抗体稀释至1 mg/mL。测量最终的1 mg/mL溶液的浓度和pH。以相同的比例稀释制剂缓冲液，用作参照缓冲液。

在MicroCal^TM VP-DSC上进行示差扫描量热法 (DSC)。以1℃/min的速率，使温度从25℃渐变到95℃。如下分析粗DSC曲线：减去参照缓冲液，标准化浓度，并使用Origin 软件进行基线校正。以两个重复运行样品。

结果和讨论

使用DSC，检查了pH和柠檬酸盐浓度对抗-DKK1抗体的热稳定性的影响。结果表明，变性温度随着pH降低而降低。结果也表明，在低pH值，柠檬酸盐对该单克隆抗体的热稳定性具有更大的影响。

在低于4.5的pH值，用柠檬酸盐缓冲液稀释的抗-DKK-1单克隆抗体在低柠檬酸盐浓度是更热稳定的(图15 A, B, C)。在pH 3.0，100 mM柠檬酸盐似乎已经完全解折叠所述蛋白，且在曲线中不存在跃迁。对于30 mM和60 mM柠檬酸盐，单个跃迁是明显的，表明2个抗体结构域被解折叠。数据表明，该单个跃迁表示抗体的Fab区的解折叠。随着pH升高至4.0，结构域的解折叠温度升高，并发现了3个跃迁。最低稳定性的跃迁最可能是C_H2结构域的解折叠，继之为Fab片段和C_H3结构域。

在4.5和以上的pH值，抗-DKK-1单克隆抗体的表观跃迁温度独立于柠檬酸盐浓度 (图16 A、B、C、D)。抗体的变性温度随pH升高而升高。在更高的pH值，2个结构域同时解折叠，产生具有如下跃迁的曲线：一个跃迁具有大焓，第二个跃迁具有较低的焓。我们从其它单克隆抗体的结果得出结论：C_H2结构域和Fab在高pH值具有类似的变性温度，其与第一个大跃迁相对应。C_H3结构域的解折叠具有更高的变性温度，并与第二个跃迁相对应。

柠檬酸盐浓度和pH会影响热诱导的单克隆抗体的解折叠。随着pH降低，抗-DKK-1单克隆抗体的热稳定性降低。在低pH值，柠檬酸盐浓度仅影响表观跃迁温度。更低的柠檬酸盐浓度导致更高的变性温度。

实施例 5

氨基酸稳定剂对蛋白聚集的影响

为了从蛋白A亲和树脂洗脱蛋白或抗体，需要酸性条件。暴露于这些在低pH (3-4)的酸性条件可以导致蛋白聚集体的形成。已经证实，向蛋白A 洗脱缓冲液中加入稳定剂会增加蛋白在低pH的稳定性。选择精氨酸作为该实验的稳定剂，以测定精氨酸在洗脱缓冲液中的存在是否会降低更高阶聚集体的水平，并由此增加mAb稳定性。所有实验都在25℃进行。

对于使用含有和不含精氨酸 (50 mM)的60 mM柠檬酸盐的洗脱，与对照相比，HOA百分比每小时仅降低0.01% (图17)。但是，对于使用含有和不含精氨酸 (250 mM)的100 mM柠檬酸盐的洗脱，与对照相比，更高阶聚集体百分比每小时降低2.9% (图18)。因此，精氨酸可有效地降低100 mM柠檬酸盐溶液中更高阶聚集体的水平，且可以用作在蛋白A亲和色谱法和随后的低pH保持步骤中降低聚集体水平的另一个选择。

实施例 6

研究蛋白浓度对在蛋白 A 亲和色谱法中使用的柠檬酸盐和醋酸盐洗脱缓冲液中的单体稳定性的影响

研究了柠檬酸盐和醋酸盐缓冲液中的蛋白浓度的影响，以测定在每个缓冲液系统中浓度对聚集速率的影响。另外，为了测定酸类型对聚集的影响，对比了在pH 4.0的柠檬酸盐和醋酸盐缓冲液。

材料和方法

小规模: 使用AKTA EXPLORER 100^TM(GE Healthcare) ，进行所有小规模实验。磷酸钠缓冲液购自Hyclone (Logan, UT)。醋酸盐和柠檬酸盐购自Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)。用于PAP的pH调节的Tris碱购自Hyclone (Logan, UT)。用于蛋白A亲和色谱法实验的Mabselect^TM树脂购自GE Healthcare。使用猝灭的蛋白A产物作为这些实验的原料。使用热混合器R (Eppendorf)来控制PAP和QPAP 样品温度。

使用QPAP流作为该实验的进料。使用30kDa膜，以4500 rpm的离心速度，将进料渗滤进4-5体积的磷酸钠缓冲液中。渗滤后，将每个溶液浓缩至起始浓度的1x、2x和4x之一。将在不同浓度的样品的一半渗滤进至少4体积的醋酸钠 (50 mM, pH 5.0)溶液。

对于取自实施例 2的3个不同浓缩溶液的第一组，将柠檬酸盐 (15 mM)加入每个溶液，以达到pH 4.0。获取每个溶液的样品(2 mL)，并放在21℃ (图7)。对于浓缩溶液的第二组，加入冰醋酸，以达到pH 4.0 (总85 mM 醋酸盐)。获取每个溶液的样品(2 mL)，并放在25℃。对于每组实验，在不同时间点获取样品 (140 µL)，使用Tris碱(0.25 M-1.0 M, 10-20 µL)猝灭至pH 6，并使用HPSEC分析蛋白聚集体含量。

分析 :

使用在Agilent 1100^TM HPLC 系统 (Agilent, Palo Alto, CA)上的POROS^TM 蛋白A ID 免疫亲和柱，分析样品的单体mAb浓度。使用在Agilent 1100^TM HPLC 系统上的Tosoh 尺寸排阻柱 (0.78 cm内径x 30 cm长度)，定量在每个样品中的蛋白聚集体 (即二聚体和更高阶聚集体)。使用具有+/- 0.1 pH单位精确度的pH探头(Fisher Scientific)和具有温度补偿的量器 (Fisher Scientific)，测量溶液 pH。

结果和讨论

研究了柠檬酸盐和醋酸盐缓冲液中的mAb浓度的影响，以测定浓度对每个缓冲液系统中的聚集速率的影响。随着柠檬酸盐 (15 mM, pH 3.5)溶液中mAb浓度的增加，更高阶聚集体的形成速率也增加(图20)。例如，在1小时保持时间后，更高阶聚集体的水平从在8 mg/mL mAb浓度的0.3%增加至在34 mg/mL mAb浓度的2.6%。因此，溶液中的蛋白浓度会影响在低pH的柠檬酸盐缓冲系统中的更高阶聚集体的形成速率。但是，对于醋酸盐 (85 mM, pH 4.0)溶液，更高阶聚集体的水平保持恒定在小于1%（对于5 mg/mL、11 mg/mL和37 mg/mL mAb浓度） (图21)。

为了测定酸类型对更高阶聚集体形成的影响，绘制了来自在pH 4.0在25℃的该醋酸盐实验的结果，以及来自在pH 4.0在21℃的柠檬酸盐实验的结果(图21)。在pH 4.0，在柠檬酸盐缓冲系统中，更高阶聚集体的速率开始每30分钟增加0.2%，而在醋酸盐缓冲系统中更高阶聚集体的水平保持恒定。因此，在pH 4.0，在醋酸盐中的mAb稳定性大于柠檬酸盐缓冲液。

结论

除了温度和pH以外，蛋白浓度也影响PAP库中蛋白聚集体的形成速率。随着在pH 3.5的柠檬酸盐缓冲溶液中mAb浓度增加，更高阶聚集体的速率显著降低。但是，对于从5 mg/mL至37 mg/mL的不同蛋白浓度，在pH 4.0的醋酸盐缓冲溶液中，更高阶聚集体的水平保持小于1%。当以5 mg/mL至11 mg/mL的蛋白浓度在pH 4.0比较醋酸盐和柠檬酸盐缓冲液系统时，在醋酸盐缓冲液中的mAb具有更大的稳定性。因此，洗脱缓冲液的类型在mAb稳定性中起作用，在pH 4.0时醋酸盐比柠檬酸盐缓冲液更稳定。醋酸盐可以用作从蛋白A亲和柱洗脱mAb的替代缓冲液。

实施例 7

研究 pH 、温度、缓冲液浓度和蛋白装载对在蛋白 A 亲和色谱法洗脱和随后的低 pH 保持过程中的蛋白聚集体水平的影响

材料和方法:

小规模: 使用AKTA EXPLORER 100^TM，进行所有小规模实验。磷酸盐、柠檬酸盐和氢氧化钠缓冲液购自Hyclone (Logan, UT)。用于PAP的pH调节的Tris碱购自Hyclone (Logan, UT)。用于蛋白A亲和色谱法实验的Mabselect^TM树脂购自GE Healthcare。得到深度过滤的离心分离液，并用作蛋白A亲和色谱法实验的原料。热混合器R (Eppendorf)和2个温控室用于控制PAP和QPAP 样品温度。

实验 :

以2.0 mL/min (5分钟停留时间)，用5个CV的6 mM磷酸钠、100 mM NaCL、pH 7.2缓冲液平衡装有Mabselect^TM树脂 (10 mL)的柱 (1.7 cm x 14.5 cm)。使用在表1中列出的温度，以在表1中列出的浓度(g mAb/升树脂)，以2.0 mL/min的流速，装载深度过滤的离心分离液。装载后，在2 ml/min，用3个CV的6 mM磷酸钠、100 mM NaCl、pH 7.2缓冲液洗涤柱，然后以2 ml/min，用4个CV的6 mM磷酸钠、pH 7.2缓冲液洗涤。以2 ml/min，以100%不连续梯度，用3个CV的洗脱缓冲液 (无水柠檬酸和柠檬酸三钠盐的混合物至目标pH值) (从0.5开始，在3.5结束) (4 min 停留时间)，洗脱产物。

在该实验中使用的洗脱缓冲液如下：

• 60mM 柠檬酸钠，pH 3.5

• 40mM 柠檬酸钠，pH 3.2

• 40mM 柠檬酸钠，pH 3.8

• 80mM 柠檬酸钠，pH 3.2

• 80mM 柠檬酸钠，pH 3.8

洗脱后，在下述时间点，使用HPSEC分析产物洗脱液样品的蛋白聚集体含量：0、15、30、60、120 min。样品是200微升，并加入40微升0.25M Tris碱来猝灭样品。以2.0 mL/min，用5个CV的50 mM 氢氧化钠、1M 氯化钠缓冲液再生柱，并保存在20v%的乙醇的PBS溶液中。

分析 :

使用在Agilent 1100^TM HPLC 系统 (Agilent, Palo Alto, CA)上的POROS^TM 蛋白A ID 免疫亲和柱，分析所有样品的mAb单体浓度。使用在Agilent 1100^TM HPLC 系统上的Tosoh 尺寸排阻柱 (0.78 cm内径x 30 cm长度)，定量在每个样品中的蛋白聚集体 (即二聚体和更高阶聚集体)。使用pH探头(± 0.1 pH单位精确度)和具有温度补偿的量器 (二者购自Fisher Scientific)，测量溶液 pH。

结果:

研究了pH、温度、缓冲液浓度和蛋白装载的作用，以测定它们对产率和蛋白聚集的影响。上述实验的结果可以参见下面的表1。

在10℃和pH 3.2，装载或柠檬酸盐浓度不会显著影响产率或聚集水平。在10℃和pH 3.8，装载和/或柠檬酸盐浓度会降低产率，但是聚集体保持在低水平 (< 5%)。在30℃和pH 3.2，装载不会显著影响聚集，但是对于80mM柠檬酸盐浓度，温度对降低产率和增加聚集水平具有巨大影响，但是在40mM柠檬酸盐中几乎没有观察到作用。随着在30℃ pH从3.2变化至3.8，聚集体水平显著降低，且在40至80mM柠檬酸盐中产率增加。

表1: 抗-DKK-1 mAb在不同的浓度、pH、蛋白装载和温度的聚集数据

参考文献

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序列表

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Erin Green-Trexler

David Roush

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<150> 61/188,903

<151> 2008-08-14

<160> 12

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗-DKK-1抗体轻链氨基酸序列

<400> 1

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗-DKK-1抗体重链氨基酸序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗-ADDL #1抗体重链氨基酸序列

<400> 3

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<210> 4

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗-ADDL #1抗体轻链氨基酸序列

<400> 4

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Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

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<220>

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Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 6

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗-ADDL #2抗体轻链氨基酸序列

<400> 6

Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

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Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Leu His Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗-hIL-13rα-1抗体重链氨基酸序列

<400> 7

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<211> 211

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗-hIL-13rα-1抗体轻链氨基酸序列

<400> 8

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Ser

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210

<210> 9

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人

<400> 9

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145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

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210 215 220

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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 10

<211> 326

<212> PRT

<213> 智人

<400> 10

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 11

<211> 327

<212> PRT

<213> 智人

<400> 11

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

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260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 12

<211> 327

<212> PRT

<213> 智人

<400> 12

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

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Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

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210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

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Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

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275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

Claims

1. 一种从样品中纯化单体单克隆抗体的方法，其中所述样品包含所述单体单克隆抗体、宿主细胞杂质、二聚体和更高阶聚集体，所述方法包括：

a) 使所述样品接触蛋白A亲和色谱柱；

b) 使用洗脱缓冲液，从所述蛋白A亲和色谱柱洗脱所述单体单克隆抗体；和

c) 收集来自步骤(b)的所述单体单克隆抗体的一个或多个级分，形成蛋白A产物库，其中所述产物库

i) 包含小于5%的更高阶聚集体，且

ii) 具有pH 约3.5至约4.5，

由此从所述样品纯化所述单体单克隆抗体。

2. 根据权利要求1的方法，其中所述洗脱缓冲液是柠檬酸盐或醋酸盐。

3. 根据权利要求2的方法，其中所述洗脱缓冲液是柠檬酸盐。

4. 根据权利要求3的方法，其中所述洗脱缓冲液中柠檬酸盐的浓度是约0.030 M至约0.085 M。

5. 根据权利要求2的方法，其中所述洗脱缓冲液是醋酸盐。

6. 根据权利要求5的方法，其中所述洗脱缓冲液中醋酸盐的浓度是约0.050 M至约0.200 M。

7. 根据权利要求1的方法，其中所述方法在约4℃至约30℃的温度进行。

8. 根据权利要求7的方法，其中所述方法在约15℃至约27℃的温度进行。

9. 根据权利要求1的方法，其中所述单体单克隆抗体是IgG抗体。

10. 根据权利要求9的方法，其中所述单体单克隆抗体是IgG1或修饰的IgG2抗体。

11. 根据权利要求10的方法，其中所述单体单克隆抗体是IgG2m4抗体。

12. 根据权利要求11的方法，其中所述IgG2m4抗体是抗-DKK1抗体。

13. 根据权利要求1的方法，其中将氨基酸加入步骤(b)中的所述洗脱缓冲液中至约50 mM至约500 mM的浓度。

14. 根据权利要求13的方法，其中所述氨基酸是精氨酸、脯氨酸或组氨酸。

15. 一种从样品中纯化单体单克隆抗体的方法，其中所述样品包含所述单体单克隆抗体、宿主细胞杂质、二聚体和更高阶聚集体，所述方法包括：

a) 在约15℃至约27℃的温度下，使样品接触蛋白A亲和色谱柱；

b) 使用洗脱缓冲液，从所述蛋白A亲和色谱柱洗脱所述单体单克隆抗体，所述洗脱缓冲液包含浓度为约0.030 M至约0.085 M的柠檬酸盐；和

i) 包含小于5%的更高阶聚集体，且

ii) 具有pH 约3.5至约4.0，

由此从所述样品纯化所述单体单克隆抗体。

16. 一种从样品中纯化单体单克隆抗体的方法，其中所述样品包含所述单体单克隆抗体、宿主细胞杂质、二聚体和更高阶聚集体，所述方法包括：

b) 使用洗脱缓冲液，从所述蛋白A亲和色谱柱洗脱所述单体单克隆抗体，所述洗脱缓冲液包含浓度为约0.050 M至约0.200 M的醋酸盐；和

i) 包含小于5%的更高阶聚集体，且

ii) 具有pH 约3.5至约4.5，

由此从所述样品纯化所述单体单克隆抗体。

17. 一种从样品中纯化单体单克隆抗体的方法，其中所述样品包含所述单体单克隆抗体、宿主细胞杂质、二聚体和更高阶聚集体，所述方法包括：

a) 使所述样品接触蛋白A亲和色谱柱；

i) 包含小于5%的更高阶聚集体，且

ii) 具有pH 约3.2至约4.5，

由此从所述样品纯化所述单体单克隆抗体。

18. 一种从样品中纯化单体单克隆抗体的方法，其中所述样品包含单体单克隆抗体、宿主细胞杂质、二聚体和更高阶聚集体，所述方法包括：

i) 包含小于5%的更高阶聚集体，且

ii) 具有pH 约3.2至约4.0，

由此从所述样品纯化所述单体单克隆抗体。

19. 一种从样品中纯化单体单克隆抗体的方法，其中所述样品包含所述单体单克隆抗体、宿主细胞杂质、二聚体和更高阶聚集体，所述方法包括：

b) 使用洗脱缓冲液，从所述蛋白A亲和色谱柱洗脱单体单克隆抗体，所述洗脱缓冲液包含浓度为约0.050 M至约0.200 M的醋酸盐；和

i) 包含小于5%的更高阶聚集体，且

ii) 具有pH 约3.2至约4.5，

由此从所述样品纯化所述单体单克隆抗体。