CN107793469B - 一种去除宿主细胞蛋白含量的亲和纯化工艺 - Google Patents

一种去除宿主细胞蛋白含量的亲和纯化工艺 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种新的有效降低宿主细胞蛋白(HCP)含量的亲和纯化工艺，其具体步骤包括：步骤1、处理亲和填料，上样；步骤2、淋洗，使用pH值较低的缓冲液(3.9～5.6)，以及使用含有氯化钠、氯化钙和/或精氨酸盐酸作为添加剂的淋洗缓冲液2淋洗层析柱；步骤3、洗脱，使用不同pH洗脱缓冲液洗脱产品并收集产品。本发明所使用的材料去除HCP效果显著，适用范围广，可广泛适用于抗体类蛋白质亲和纯化工艺中，从而为有效控制抗体类药物中HCP的含量提供技术支持。

Description

一种去除宿主细胞蛋白含量的亲和纯化工艺
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种有效去除FC融合蛋白及单抗宿主细胞蛋白含量的亲和纯化工艺。
背景技术
宿主细胞蛋白(Host Cell Protein，HCP)是指来源于宿主细胞的蛋白质成分，是制备抗体类药物(包括抗体及FC融合蛋白)过程中需要去除的杂质。由于HCP的主要成分是蛋白质，即使很小的剂量，都有可能引发机体产生过敏反应。此外，部分HCP本身具有蛋白酶活性，残留在抗体类药物中，可能导致蛋白药物降解，最终影响药效。如果残留的HCP与抗体类药物之间存在相互作用，有可能阻断抗体类药物的活性位点，也会导致药效降低。因此，在抗体类药物制备过程中，必须严格控制HCP的含量，一般要求最终药物中HCP的含量<100ppm(pg/mg)。
为了降低抗体类药物制剂中宿主蛋白质的残留量，目前主要是通过采用纯化工艺，并结合一定的检测定量手段(主要是通过酶联免疫检测HCP含量，通过UV280的吸收值来检测抗体及FC融合蛋白浓度)，来控制抗体类药物生产过程中残留的HCP的动态变化过程。目前在抗体类药物制备过程中，去除HCP的纯化工艺主要包括：亲和层析、阴离子交换层析和阳离子交换层析，以及集聚物沉淀和中间品深层过滤等。其中，亲和层析作为在抗体类药物制备过程中的关键工艺步骤，不仅能够对产品实行直接捕获，而且能够特异去除大部分的宿主细胞蛋白及其它杂质。随着上游细胞培养工艺的不断改进，CHO细胞目的蛋白的表达量得到显著提高，但与此同时HCP的表达量也被提高了。而且部分HCP能够与目的蛋白产生相互作用，或者与填料基质非特异吸附，从而导致在亲和纯化工艺中这些HCP非常难以去除，大量的HCP与目的蛋白一起被洗脱和收集，进而对后续纯化工艺造成非常大的困难，甚至可能导致最终产品HCP的含量无法满足质控标准。
为了克服这一技术难题，最大限度的在捕获步骤降低HCP的含量，从而减轻后续纯化步骤的压力，本发明对亲和纯化工艺进行了系统优化，尤其在淋洗步骤改变淋洗的缓冲液的pH或者添加各种试剂，从而在不影响收率的前提下显著提高亲和纯化工艺对HCP的去除效率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种新的有效降低宿主细胞蛋白(HCP)含量的亲和纯化工艺，能够提高抗体类药物制备过程中亲和层析工艺去除HCP的效率，为FC融合蛋白及单抗类药物亲和纯化工艺提供更加可靠的选择。
为解决上述技术问题，本发明提供的一种去除宿主细胞蛋白(HCP)含量的亲和纯化工艺，通过将改变淋洗步骤2的pH,通过加入氯化钠、氯化钙、精氨酸盐酸中的至少一种作为淋洗2过程中的添加剂，降低HCP同目的蛋白及填料基质间的相互作用，从而起到去除HCP的作用。其具体步骤包括：
步骤1、处理亲和填料，上样；
步骤2、淋洗，使用pH 3.9～5.6的醋酸-醋酸钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液的淋洗缓冲液2淋洗柱层析；
步骤3、洗脱，使用不同pH值的洗脱缓冲液洗脱产品并收集产品。
具体的，所述步骤1具体操作方法是：
1a、亲和填料装柱，用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱；
1b、然后用3-5倍柱体积的NaOH溶液消毒层析柱；
1c、用3-5倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱；
1d、上样，让样品在柱上保留2-10分钟。
具体的，所述亲和填料配基为Protein A。所述亲和填料包括但不限于GEhealthcare的MabSelect SuRe和MabSelect SuRe LX，Merck的EshmunoA，JSR的A3。
具体的，所述步骤2的具体操作方法是：
2a、用3-5倍平衡缓冲液淋洗层析柱；
2b、用3-5倍柱体积的淋洗2缓冲液淋洗层析柱。
2c、用3-5倍柱体积的淋洗3缓冲液淋洗层析柱。
具体的，所述步骤3的具体操作方法是：用3-10倍不同pH的洗脱缓冲液洗脱产品。
具体的，所述亲和纯化工艺还包括步骤4：对层析柱进行再生处理。
步骤4中，优选采用2-5倍柱体积的1M醋酸对层析柱进行再生处理。
具体的，所述亲和纯化工艺还包括步骤5：对层析柱进行平衡和保存。
步骤5的具体操作方法是：
5a、用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱；
5b、用3-5倍柱体积的NaOH溶液消毒层析柱；
5c、用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱；
5d、用2-5倍柱体积的保存液保存层析柱。
优选的，所述1a、1c、2a、5a、5c步骤中所用的平衡缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris-醋酸缓冲液，其pH为7.2-7.6，盐浓度为0.15M的。
优选的，所述1b、5b步骤中所用的NaOH溶液的浓度为0.1M。
优选的，所述淋洗2缓冲液为Tris-盐酸缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液，其pH为3.9～5.6、浓度为20-50mM。所述淋洗2缓冲液还可以含有氯化钠、氯化钙和/或精氨酸盐酸作为添加剂，其中，氯化钠的浓度为0-2M，氯化钙的浓度为0-0.5M，精氨酸盐酸的浓度为0-0.5M。所述淋洗2缓冲液的pH优选为4.0～4.5。
优选的，所述淋洗3缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液或柠檬酸缓冲液，其浓度为20-50mM，pH为5.2～5.7。
优选的，所述保存液为20％乙醇。
本发明的亲和纯化工艺所使用的材料去除HCP效果显著，适用范围广，可广泛适用于抗体类蛋白质亲和纯化工艺中，从而为有效控制抗体类药物中HCP的含量提供技术支持。
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明。
本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可市场购得。
附图说明
图1为实施例1中pH4.2、4.3、4.4的淋洗2缓冲液淋洗亲和层析图谱。
图2为图1的局部放大图。
图3为实施例1中pH4.0、4.5、5.5、9.0的淋洗2缓冲液淋洗亲和层析图谱。
图4为图3的局部放大图。
图5为实施例2中Fc融合蛋白在淋洗2中加入盐离子及精氨酸的亲和层析图谱。
图6为图5的局部放大图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了对本发明所公开的新的亲和纯化工艺进行进一步阐述，现结合抗体类药物制备过程中实施的亲和层析案例进行详细说明。
亲和层析在GE的AKTA pureM仪器上完成，涉及的各项检测包括有：
1)蛋白质浓度：通过UV280的吸收值来检测；
2)单体纯度：通过分子排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)检测；
3)HCP含量：通过酶联免疫检测。
本发明所用的亲和介质是Protein A配基交联到包括但不限于琼脂糖、羟基化聚醚树脂、聚丙烯酸树脂、聚苯乙烯二乙烯苯基树脂、聚甲基丙烯酸树脂、聚苯乙烯树脂、羟基磷灰石、玻璃等基质上的层析介质，优选基质为琼脂糖。优选的亲和填料有GE healthcare的MabSelect SuRe和MabSelect SuRe LX，Merck的EshmunoA，JSR的A3。
层析具体步骤如下：
步骤1a，用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱。
步骤1b，然后用3-5倍柱体积的NaOH溶液消毒层析柱。
步骤1c，用3-5倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱。
步骤1d，上样，让样品在柱上保留2-10分钟。
步骤2a，用3-5倍平衡缓冲液淋洗层析柱。
步骤2b，然后用3-5倍柱体积的淋洗2缓冲液淋洗层析柱。
步骤2c，用3-5倍柱体积的淋洗3缓冲液淋洗层析柱。
步骤3，用3-10倍洗脱缓冲液洗脱产品.
步骤4，用2-5倍柱体积的1M醋酸对层析柱进行再生处理。
步骤5a，用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱.
步骤5b，然后用3-5倍柱体积的NaOH溶液消毒层析柱.
步骤5c，用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱.
步骤5d，用2-5倍柱体积保存液保存层析柱。
步骤1a、步骤1c、步骤2a、步骤5a、步骤5c，所用的平衡缓冲液为包括但不限于磷酸盐缓冲液、Tris-醋酸缓冲液，其pH为7.2-7.6，盐浓度为0.15M。
步骤1b、步骤5b，所使用的消毒剂包括但不局限于0.1M的NaOH溶液。
步骤2b的淋洗2缓冲液包括但不限于Tris-盐酸缓冲液，醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液，其浓度为20-50Mm，pH为3.9～5.6。所述淋洗2缓冲液还可以加入包括但不限于NaCl、CaCl2和精氨酸盐酸，其中，NaCl的浓度为0-2M，CaCl2的浓度为0-0.5M，精氨酸盐酸的浓度为0-0.5M。
步骤2c的淋洗3缓冲液包括但不限于醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸缓冲液，其浓度为20-50mM，pH为5.2～5.7。
步骤3的洗脱缓冲液包括但不限于醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为3.4～4.0。
步骤5d的保存液包括但不限于20％的乙醇。
具体实施过程举例说明如下：
实施例1低pH淋洗2缓冲液在Fc融合蛋白亲和层析工艺中的作用
用50mM的Tris-HAc、150mM NaCl、pH 7.4，作为步骤1a、步骤1c、步骤2a、步骤5a、步骤5c的平衡缓冲液；50mM的NaAc-HAc、pH 5.5，作为步骤2c的淋洗3缓冲液；0.1M的NaOH溶液作为步骤1b、步骤5b的消毒剂；20％的乙醇作为步骤5d的保存液；醋酸-醋酸钠体系，不同pH的缓冲液作分别作为步骤2b的淋洗2缓冲液；上样用Protein A层析柱(JSR A3，3ml)，上样载量为24mg/mL和28mg/mL(24mg/mL：pH4.2、4.3、4.4；28.0mg/mL：pH4.0、4.5、5.5、9.0)。
用2倍(3倍：对于载量28mg/mL)柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱(步骤1a)后用3倍柱体积的NaOH消毒层析柱(步骤1b)；用5倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱(步骤1c)；上样，让样品在柱上保留5分钟(步骤1d)；用3倍(5倍：对于载量28mg/mL)平衡缓冲液淋洗层析柱，冲洗出未结合的发酵液(步骤2a)；然后用3倍柱体积的淋洗2缓冲液淋洗层析柱(步骤2b)(对于载量28mg/mL：用3倍柱体积的淋洗3缓冲液淋洗层析柱(步骤2c)；用3倍(2倍：对于载量28mg/mL)柱体积的洗脱缓冲液洗脱产品并基于UV280收集产品(步骤3)；用3倍柱体积的1M醋酸对层析柱进行再生处理(步骤4)(对于载量28mg/mL，到此结束)；用2倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱(步骤5a)；然后用2倍柱体积的NaOH消毒层析柱(步骤5b)；用2倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱(步骤5c)；用3倍柱体积保存液保存层析柱(步骤5d)。
针对于不同的对比实验，步骤2b中的醋酸体系的pH分别为4.2、4.3、4.4。
收集洗脱样品测定浓度计算得率，测量产品质量(SEC-HPLC)，检测HCP残留含量。由图1和2可以明显看到在步骤2b的淋洗2阶段，随着pH的下降，淋洗2过程中出的峰越来越大，这说明越来越多的HCP蛋白质被淋洗下来。通过表1可以看出，随着pH的下降，洗脱产品中HCP的含量得到显著降低(从92920ppm下降到2105ppm，92920ppm的数据来源于50mMTris-HCl，pH9.0作为淋洗2的淋洗缓冲液)，而通过UV280的吸收值和SEC-HPLC检测到的收率及产品纯度并没有受到显著影响。这说明，在淋洗步骤中使用低pH4.0～5.5的低pH淋洗2缓冲液能够有效的降低洗脱产品中HCP的含量，而且不会影响洗脱产品的收率，从而达到有效提高洗脱产品纯度的效果。
表1.Fc融合蛋白亲和层析使用低pH淋洗2缓冲液的检测结果
Figure BDA0001434609350000061
实施例2Fc融合蛋白添加氯化钠、氯化钙及精氨酸在亲和层析工艺中的作用
用50mM的Tris-HAc、150mM NaCl、pH 7.4，作为步骤1a、步骤1c、步骤2a、步骤5a、步骤5c的平衡缓冲液；50mM的NaAc-HAc、pH 5.5，作为步骤2c的淋洗3缓冲液；0.1M的NaOH溶液作为步骤1b、步骤5b的消毒剂；20％的乙醇作为步骤5d的保存液；50mM的NaAc-HAc，pH 5.5的缓冲液作为步骤2b的淋洗2缓冲液；其他对比例中步骤2b的淋洗2缓冲液还含有1M氯化钠、或0.5M氯化钙、或0.25M精氨基、或0.5M精氨酸；上样用Protein A层析柱(MerckEshmonuA，3ml)，上样载量为18mg/mL。
用2倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱(步骤1a)后用3倍柱体积的NaOH消毒层析柱(步骤1b)；用5倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱(步骤1c)；上样，让样品在柱上保留5分钟(步骤1d)；用5倍平衡缓冲液淋洗层析柱，冲洗出未结合的发酵液(步骤2a)；然后用3倍柱体积的淋洗2缓冲液淋洗层析柱(步骤2b)；用3倍柱体积的淋洗3缓冲液淋洗层析柱(步骤2c)；用5倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱产品并基于UV280收集产品(步骤3)；用3倍柱体积的1M醋酸对层析柱进行再生处理(步骤4)；用2倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱(步骤5a)；然后用3倍柱体积的NaOH消毒层析柱(步骤5b)；用5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱(步骤5c)；用5倍柱体积保存液保存层析柱(步骤5d)。
收集洗脱样品测定浓度计算得率，测量产品质量(SEC-HPLC)，检测HCP残留含量。由图1，2，3，4，及表2可以看出，在不显著影响产品收率率以及质量(SEC-HPLC)的前提下，盐离子及精氨酸的加入都可以一定程度上提高HCP的去除效果，特别是精氨酸的添加去除效果相对更好，HCP的含量从75161ppm下降至36111ppm。这说明盐离子及精氨酸作为添加剂也可以一定程度上进一步去除HCP，可以作为亲和层析优化的一个选择。
表2.Fc融合蛋白亲和层析在淋洗2中加盐离子及精氨酸后产品的检测结果
Figure BDA0001434609350000071
综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (11)

1.一种去除FC融合蛋白的宿主细胞蛋白含量的亲和纯化工艺，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、处理亲和填料，上样；步骤2、淋洗，使用淋洗2缓冲液淋洗柱层析；步骤3、洗脱，收集产品；
其中，所述步骤1的具体操作方法是：1a、亲和填料装柱，用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱；1b、然后用3-5倍柱体积的NaOH溶液消毒层析柱；1c、用3-5倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱；1d、上样，让样品在柱上保留2-10分钟；所述亲和填料的配基为ProteinA；
其中，所述步骤2的具体操作方法是：2a、用3-5倍平衡缓冲液淋洗层析柱；2b、用3-5倍柱体积的淋洗2缓冲液淋洗层析柱；2c、用3-5倍柱体积的淋洗3缓冲液淋洗层析柱；
其中，所述淋洗2缓冲液为pH 4.0～4.5的醋酸-醋酸钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、柠檬酸缓冲液或磷酸缓冲液，浓度为20-50mM；
其中，所述淋洗3缓冲液是醋酸-醋酸钠缓冲液或柠檬酸缓冲液，其pH为5.2～5.7、浓度为20-50mM；
其中，所述步骤3的具体操作方法是：用3-10倍洗脱缓冲液洗脱产品，和，收集产品；所述洗脱缓冲液是醋酸-醋酸钠缓冲液，pH为3.4～4.0。
2.如权利要求1所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述亲和填料包括GE healthcare的MabSelect SuRe和MabSelect SuRe LX，Merck的 EshmunoA，JSR的A3。
3.如权利要求1所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述亲和纯化工艺还包括步骤4：对层析柱进行再生处理。
4.如权利要求3所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述步骤4中的具体操作方法是：采用2-5倍柱体积的1M醋酸对层析柱进行再生处理。
5.如权利要求1所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述亲和纯化工艺还包括步骤5：对层析柱进行平衡和保存。
6.如权利要求5所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述步骤5的具体操作方法是：5a、用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱；5b、用3-5倍柱体积的NaOH溶液消毒层析柱；5c、用2-5倍柱体积的平衡缓冲液漂洗层析柱；5d、用2-5倍柱体积的保存液保存层析柱。
7.如权利要求1或6所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述平衡缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tris-醋酸缓冲液，其pH为7.2-7.6，盐浓度为0.15M。
8.如权利要求1或6所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述NaOH溶液的浓度为0.1M。
9.如权利要求1所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述淋洗2缓冲液还含有氯化钠、氯化钙和精氨酸盐酸作为添加剂。
10.如权利要求9所述的亲和纯化工艺，其特征在于，氯化钠的浓度为0-2M，氯化钙的浓度为0-0.5M和精氨酸盐酸的浓度为0-0.5M。
11.如权利要求6所述的亲和纯化工艺，其特征在于，所述保存液为20％乙醇。
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