CN110204612A - 采用Protein A亲和层析纯化纳米抗体药物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种采用Protein A亲和层析纯化纳米抗体药物的方法，包括步骤：(1)调节纳米抗体样品的pH；(2)用平衡缓冲液平衡层析柱；(3)将步骤(1)调节后的样品上样至层析柱；(4)用清洗缓冲液进行清洗；(5)用洗脱缓冲液进行洗脱。本发明提供的方法具有操作简便，不用另外加上亲和标签就能进行亲和纯化，纯度更高，易于工艺放大等优点。

Description

采用Protein A亲和层析纯化纳米抗体药物的方法
技术领域
本发明涉及抗体药物的分离与提纯，尤其是涉及一种Protein A亲和层析纯化在纳米抗体药物生产中的应用。
背景技术
VHH(纳米抗体)具有体积小、溶解度高、特异性强以及可在细菌中大量表达等优点。较之传统单克隆抗体，VHH在疾病的诊断治疗及药物开发等医学领域具有更广阔的应用前景。
纳米抗体VHH的结构仅由重链可变区构成，缺乏FC片段。可以利用不同标签来表达纳米抗体，包括MBP、SUMO、VHH-Fc、His等，一般在生产过程中会带入His标签，通过镍亲和层析，将蛋白富集。但是镍亲和层析存在着特异性差，一步很难达到高纯度的要求，并且带着His标签对进入临床不理想。现有技术未见报道将亲和层析用于纳米抗体的分离与提纯的方法。
本发明寻求一种合适的Protein A亲和层析应用于纳米抗体的分离与提纯，以达到更优的分离纯化效果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种采用Protein A亲和层析纯化纳米抗体药物的方法，具有操作简便，不用另外加上亲和标签就能进行亲和纯化，纯度更高，易于工艺放大的特点。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
一种采用Protein A亲和层析纯化纳米抗体药物的方法，包括步骤：
(1)将纳米抗体样品的pH调节至5.0～5.8；
(2)用平衡缓冲液平衡层析柱，所述平衡缓冲液为pH 5.0～5.8的0.05～0.2M醋酸钠溶液；
(3)将步骤(1)调节后的样品上样至层析柱，所述层析柱的填料为：JSR Amsphere或GE MabSelect PrismA；
(4)用清洗缓冲液进行清洗，所述清洗缓冲液为pH 5.0～5.8的0.05～0.2M醋酸钠溶液；
(5)用洗脱缓冲液进行洗脱，所述洗脱缓冲液为pH 3.5的0.05～0.2M甘氨酸溶液；
优选的，所述层析柱的填料为JSR Amsphere时，
(1)将纳米抗体样品的pH调节至5.8；
(2)用平衡缓冲液平衡层析柱，所述平衡缓冲液为pH 5.8的0.05～0.2M醋酸钠溶液；
(3)将步骤(1)调节后的样品上样至层析柱；
(4)用清洗缓冲液进行清洗，所述清洗缓冲液为pH 5.8的0.05～0.2M醋酸钠溶液；
(5)用洗脱缓冲液进行洗脱，所述洗脱缓冲液为pH 3.5的0.05～0.2M甘氨酸溶液。
优选的，所述层析柱的填料为GE MabSelect PrismA时，
(1)将纳米抗体样品的pH调节至5.0；
(2)用平衡缓冲液平衡层析柱，所述平衡缓冲液为pH 5.0的0.05～0.2M醋酸钠溶液；
(3)将步骤(1)调节后的样品上样至层析柱；
(4)用清洗缓冲液进行清洗，所述清洗缓冲液为pH 5.0的0.05～0.2M醋酸钠溶液；
(5)用洗脱缓冲液进行洗脱，所述洗脱缓冲液为pH 3.5的0.05～0.2M甘氨酸溶液。
优选的，所述平衡缓冲液为pH 5.0～5.8的0.1M醋酸钠溶液。
具体的，所述步骤(2)中，平衡缓冲液的用量为5～20倍柱体积；优选的，平衡缓冲液的用量为5～15倍柱体积；更优选的，平衡缓冲液的用量为10倍柱体积。
优选的，所述清洗缓冲液为pH 5.0～5.8的0.1M醋酸钠溶液。
具体的，所述步骤(4)中，清洗缓冲液的用量为5～20倍柱体积；优选的，清洗缓冲液的用量为5～15倍柱体积；更优选的，清洗缓冲液的用量为10倍柱体积。
优选的，所述洗脱缓冲液为pH 3.5的0.1M甘氨酸溶液。
具体的，所述步骤(5)中，洗脱缓冲液的用量为5～30倍柱体积；优选的，洗脱缓冲液的用量为10～20倍柱体积；更优选的，洗脱缓冲液的用量为15倍柱体积。
进一步的，所述方法还包括：步骤(6)完全洗脱后，用再生液进行再生清洗残留蛋白；
具体的，所述再生液为0.05～0.2M NaOH溶液。优选的，所述再生液为0.1M NaOH溶液。
具体的，所述再生液的用量为3～10倍柱体积。优选的，所述再生液的用量为5倍柱体积。
进一步的，所述方法还包括：步骤(7)用平衡缓冲液平衡层析柱后，再用储存液储存层析柱。
具体的，所述步骤(7)中，平衡缓冲液的用量为3～10倍柱体积。优选的，所述平衡缓冲液的用量为5倍柱体积。
具体的，所述储存液为体积分数10％～50％乙醇水溶液。优选的，所述储存液为体积分数15％～30％乙醇水溶液；更优选的，所述储存液为体积分数20％乙醇水溶液。
具体的，所述储存液的用量为1～5倍柱体积。优选的，所述储存液的用量为2倍柱体积。
本发明是将亲和层析用于第一步抗体的富集与纯化是最优的分离纯化选择。在这些亲和层析方法中，Protein A亲和纯化是最快速、最简单的一种方法。
针对不同品牌系列的Protein A对抗体不同结构域亲和力不同，本发明筛选并选择了JSR Life Sciences AmsphereTM A3和GE MabSelect PrismA的Protein A填料应用于纳米抗体的亲和层析纯化，纯化效果好。同时，本发明对纳米抗体样品进行调节，实现了纳米抗体与Protein A的高度亲和。
本发明提供了一种新的纳米抗体纯化方法，抗体不携带着His标签，更加符合抗体进入临床的要求。
本发明的方法采用Protein A亲和纯化对蛋白承载量高，操作简单，能有效缩短纯化时间。
本发明的方法相对于Ni等亲和标签，Protein A亲和纯化更能达到高纯度的要求。
附图说明
图1为Protein A亲和纯化纳米抗体时在UV280的色谱流出图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实例1.Protein A层析柱的选择
目前市面上Protein A的品牌和种类有很多，常见的包括GE的MabSelect系列、Bio-rad、Thermo Fisher、Toyopearl及Sigma等品牌。其中MabSelect系列使用最为广泛，其包括SuRe、PrismA和Xtra等子系列。这些Protein A填料都是在金黄色葡萄球菌蛋白A的基础上改造并重组表达而来的，在纯化的动态载量、亲和力、特异性或纯度、可重复性、耐碱等稳定性、内毒素及宿主蛋白控制上得到不同程度的改善。Protein A填料重组改造的过程中，不同品牌系列的Protein A也会展现出构象的差异，从而对纳米抗体骨架区中几个较为恒定的极性或带电氨基酸残基产生特异性亲和力。本申请筛选并选择了JSR LifeSciences AmsphereTM A3，GE MabSelect PrismA以及GE MabSelect SuRe的Protein A填料应用于纳米抗体的亲和层析纯化。
筛选试验及试验结果如下所示：
筛选试验的方法基本步骤为:
(1)将纳米抗体样品的pH调节至5.0-5.8；
(2)用平衡缓冲液平衡层析柱，所述平衡缓冲液为pH 5.0-5.8的0.05～0.2M醋酸钠溶液；
(3)将步骤(1)调节后的样品上样至不同种类的Protein A层析柱；
(4)用清洗缓冲液进行清洗，所述清洗缓冲液为pH 5.0-5.8的0.05～0.2M醋酸钠溶液；
(5)用洗脱缓冲液进行洗脱，所述洗脱缓冲液为pH 3.5的0.05～0.2M甘氨酸溶液。
上述筛选试验共筛选了三种Protein A填料，筛选试验结果如下表所示：
筛选序号 Protein A填料 筛选试验结果
1 Amsphere<sup>TM</sup> A3 填料与纳米抗体结合很强，样品pH调至5.8，即可完全结合
2 MabSelect PrismA 填料与纳米抗体结合较强，样品PH需调至5.0，方可完全结合
3 MabSelect SuRe 填料与纳米抗体结合较弱，流穿液残余大量目的蛋白
实例2.调节样品，实现纳米抗体与Protein A的亲和
纳米抗体骨架区几个恒定的残基根据电荷相互作用与Protein A实现亲和，但抗体表达细胞的培养条件通常为中性pH，而这些极性或带电残基的pI值多位于6.5附近，有些更低，中性pH下带负电。实验结果显示，当不调节样品pH，在中性条件下上样，此时蛋白大量存在于流穿液中，无法与填料有效结合。当将样品pH调至5.0-5.8，使骨架区恒定残基的带电性质或带电量发生变化，会增强纳米抗体与Protein A的亲和力，蛋白将与填料完全结合。通过验证，当将样品PH调至相同pH 5.8时，JSR Amsphere A3Protein A与纳米抗体的亲和力较GE MabSelect PrismA Protein A更强，回收率更高。
实例3.JSR Amsphere Protein A纯化纳米抗体实例
平衡缓冲液(Equilibrate buffer):0.1M Sodium Acetate,pH 5.0-6.0；
清洗缓冲液(Wash buffer):0.1M Sodium Acetate,pH 5.0-6.0；
洗脱缓冲液(Elution buffer):0.1M Glycine,pH 3.5；
再生液(Regeneration buffer):0.1M NaOH；
储存液(Storage buffer):20％Ethanol；
(1)首先将纳米抗体上清液pH调节至5.0-6.0；
(2)用10倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱；
(3)上樣调节好的样品；
(4)用10倍柱体积的清洗缓冲液进行清洗；
(5)用15倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱；
(6)完全洗脱后，用5倍柱体积的再生液进行再生清洗残留蛋白；
(7)用5倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱后，再用2倍柱体积的储存液储存层析柱。
根据结果显示，同一个样品，当将样品调至5.0-5.8，就能够完全结合样品中的目的蛋白，且纯度明显也高于His标签的金属亲和层析。
实例4.GE MabSelect PrismA Protein A纯化纳米抗体实例
平衡缓冲液(Equilibrate buffer):0.05M Sodium Acetate,pH 5.0；
清洗缓冲液(Wash buffer):0.05M Sodium Acetate,pH 5.0；
洗脱缓冲液(Elution buffer):0.1M Sodium Acetate,pH 3.5；
再生液(Regeneration buffer):0.5M NaOH；
储存液(Storage buffer):20％Ethanol；
(1)首先将纳米抗体上清液pH调节至5.0-5.8；
(2)用10倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱；
(3)上樣调节好的样品；
(4)用10倍柱体积的清洗缓冲液进行清洗；
(5)用15倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱；
(6)完全洗脱后，用5倍柱体积再生液进行再生清洗残留蛋白；
(7)用5倍柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱后，再用2倍柱体积的储存液储存层析柱。
根据结果显示，同一个样品，当将样品调至5.0，能够完全结合样品中的目的蛋白，且纯度明显也高于His标签的金属亲和层析
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (16)

1.一种采用Protein A亲和层析纯化纳米抗体药物的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)将纳米抗体样品的pH调节至5.0～5.8；
(2)用平衡缓冲液平衡层析柱，所述平衡缓冲液为pH5.0～5.8的0.05～0.2M醋酸钠溶液；
(3)将步骤(1)调节后的样品上样至层析柱，所述层析柱的填料为：JSR Amsphere或GEMabSelect PrismA；
(4)用清洗缓冲液进行清洗，所述清洗缓冲液为pH5.0～5.8的0.05～0.2M醋酸钠溶液；
(5)用洗脱缓冲液进行洗脱，所述洗脱缓冲液为pH3.5的0.05～0.2M甘氨酸溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤为：
(1)将纳米抗体样品的pH调节至5.8；
(2)用平衡缓冲液平衡层析柱，所述平衡缓冲液为pH5.8的0.05～0.2M醋酸钠溶液；
(3)将步骤(1)调节后的样品上样至层析柱，所述层析柱的填料为JSR Amsphere；
(4)用清洗缓冲液进行清洗，所述清洗缓冲液为pH5.8的0.05～0.2M醋酸钠溶液；
(5)用洗脱缓冲液进行洗脱，所述洗脱缓冲液为pH3.5的0.05～0.2M甘氨酸溶液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤为：
(1)将纳米抗体样品的pH调节至5.0；
(2)用平衡缓冲液平衡层析柱，所述平衡缓冲液为pH5.0的0.05～0.2M醋酸钠溶液；
(3)将步骤(1)调节后的样品上样至层析柱，所述层析柱的填料为GE MabSelectPrismA；
(4)用清洗缓冲液进行清洗，所述清洗缓冲液为pH5.0的0.05～0.2M醋酸钠溶液；
(5)用洗脱缓冲液进行洗脱，所述洗脱缓冲液为pH3.5的0.05～0.2M甘氨酸溶液。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述平衡缓冲液为pH5.0～5.8的0.1M醋酸钠溶液。
5.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，平衡缓冲液的用量为5～20倍柱体积；优选的，平衡缓冲液的用量为5～15倍柱体积；更优选的，平衡缓冲液的用量为10倍柱体积。
6.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述清洗缓冲液为pH5.0～5.8的0.1M醋酸钠溶液。
7.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，清洗缓冲液的用量为5～20倍柱体积；优选的，清洗缓冲液的用量为5～15倍柱体积；更优选的，清洗缓冲液的用量为10倍柱体积。
8.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液为pH3.5的0.1M甘氨酸溶液。
9.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，洗脱缓冲液的用量为5～30倍柱体积；优选的，洗脱缓冲液的用量为10～20倍柱体积；更优选的，洗脱缓冲液的用量为15倍柱体积。
10.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：步骤(6)完全洗脱后，用再生液进行再生清洗残留蛋白。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述再生液为0.05～0.2 M NaOH溶液；优选的，所述再生液为0.1 M NaOH溶液。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述再生液的用量为3～10倍柱体积；优选的，所述再生液的用量为5倍柱体积。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：步骤(7)用平衡缓冲液平衡层析柱后，再用储存液储存层析柱。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述步骤(7)中，平衡缓冲液的用量为3～10倍柱体积；优选的，所述平衡缓冲液的用量为5倍柱体积。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述储存液为体积分数10％～50％乙醇水溶液；优选的，所述储存液为体积分数15％～30％乙醇水溶液；更优选的，所述储存液为体积分数20％乙醇水溶液。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述储存液的用量为1～5倍柱体积；优选的，所述储存液的用量为2倍柱体积。
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