CN109678951A

CN109678951A - 在亲和层析纯化中减少抗体多聚的方法

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Publication number: CN109678951A
Application number: CN201811606430.2A
Authority: CN
Inventors: 王芳; 陈俏梅; 王卓智; 李竞; 陈智胜
Original assignee: Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Current assignee: Wuxi Yaoming Biotechnology Co ltd; Wuxi Yaoming Coupling Biotechnology Co ltd; Wuxi Biologics Shanghai Co Ltd
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2019-04-26

Abstract

本发明公开一种在亲和层析纯化中减少抗体多聚的方法，是以含0.1～1.0M精氨酸的洗脱缓冲液进行洗脱。本发明通过在洗脱液中加入精氨酸可以抑制亲和层析时抗体多聚的产生，且不会干扰抗体结构并维持单体状态，减少样品的多聚峰，增加样品的主峰，增加回收率。精氨酸会抑制多聚来稳定蛋白质，但不会使蛋白变性。

Description

在亲和层析纯化中减少抗体多聚的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及亲和层析纯化中减少抗体多聚的方法。

背景技术

近年来，肿瘤治疗领域迅速发展，抗体已成为生物制药行业的关键治疗手段之一。至今，有超过100个双特异性抗体药物正在处于研究阶段，其中大多数都处于临床前和临床Ⅰ期阶段。Protein A/G在抗体的亲和纯化中得到了广泛应用，Protein A在中性pH下与抗体结合，这种特异性的结合不能通过简单的离子强度去洗脱，需要用较低的pH(2.5-3.5)去洗脱。而在较低的pH洗脱条件就会造成抗体的构象发生变化，从而导致抗体发生聚集或降解，降低纯化效率。

精氨酸是一种两性氨基酸，化学式C₆H₁₄N₄O₂，pKa值分别为2.17、9.04和12.48。通常用于蛋白质的生物合成。与主链最接近的侧链部分较长、有机且疏水，另一端的侧链是一个胍基，在中性或酸性或碱性的环境下都带正电，具有高度极性。精氨酸是蛋白质再折叠常用的添加剂之一，具有稳定蛋白、增加变性蛋白的溶解性、阻止蛋白再折叠等特点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种在亲和层析纯化中减少抗体多聚的方法，能提高纯化后样品的纯度。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种在亲和层析纯化中减少抗体多聚的方法，以含0.1～1.0M精氨酸(Arginine)的洗脱缓冲液进行洗脱。

具体的，所述精氨酸的浓度可以为0.1M，0.2M，0.3M，0.4M，0.5M，0.6M，0.7M，0.8M，0.9M，或1.0M。

优选的，所述精氨酸浓度为0.1～0.5M；更优选的，所述精氨酸浓度为0.2～0.4M；最优选的，所述精氨酸浓度为0.2M。

具体的，所述洗脱缓冲液含0.05～1.0M甘氨酸(Glycine)、0.1～1.0M精氨酸且pH≥3.5且pH为酸性。其中，甘氨酸浓度可以为0.05M，0.1M，0.15M，0.2M，0.25M，0.3M，0.35M，0.4M，0.45M，0.5M，0.55M，0.6M，0.65M，0.7M，0.75M，0.8M，0.85M，0.9M，0.95M，或1.0M。所述精氨酸的浓度可以为0.1M，0.2M，0.3M，0.4M，0.5M，0.6M，0.7M，0.8M，0.9M，或1.0M。

优选的，所述洗脱缓冲液含0.05～0.5M甘氨酸、0.1～0.5M精氨酸且pH≥3.5且pH为酸性；更优选的，所述洗脱缓冲液含0.1～0.3M甘氨酸、0.2～0.3M精氨酸且pH≥3.5且pH≤4.0；最优选的，所述洗脱缓冲液含0.1M甘氨酸、0.2M精氨酸且pH＝3.5；

具体的，在洗脱之前，先用平衡2缓冲液进行层析柱平衡，所述平衡2缓冲液为0.1MTris-HCl溶液，pH 7.0。

具体的，在平衡2之前，先用冲洗缓冲液进行层析柱冲洗，所述冲洗缓冲液为600mM精氨酸溶液，pH 8.0。

具体的，在冲洗之前，先用平衡1缓冲液进行层析柱平衡，所述平衡1缓冲液为0.1MTris-HCl溶液，pH 7.0。

具体的，在洗脱之后，用清洁缓冲液进行层析柱清洁，所述清洁缓冲液为100mM磷酸溶液。

具体的，在清洁之后，用平衡3缓冲液进行层析柱平衡，所述平衡3缓冲液为0.1MTris-HCl溶液，pH 7.0。

具体的，在平衡3之后，用再生缓冲液进行层析柱再生，所述再生缓冲液为0.5MNaOH溶液。

具体的，在再生之后，用平衡4缓冲液进行层析柱平衡，所述平衡4缓冲液为0.1MTris-HCl溶液，pH 7.0。

具体的，在平衡4之后，将层析柱保存于20％(v/v)乙醇中。

具体的，所述亲和层析纯化为Protein A纯化或Protein G纯化。

本发明的方法提供了温和的洗脱液，通过在现有的洗脱液中加入精氨酸可以抑制亲和层析时抗体多聚的产生，且不会干扰抗体结构并维持单体状态。精氨酸会抑制多聚来稳定蛋白质，但不会使蛋白变性。本发明适当的增高洗脱液pH并加精氨酸，能将目的蛋白洗脱，抑制蛋白在酸性条件下多聚。

本发明的方法，在抗体的亲和层析纯化中，洗脱缓冲液中加入精氨酸，有以下优点：

(1)减少蛋白多聚；

(2)减少样品的多聚峰，增加样品的主峰，增加回收率；

(3)减少纯化步骤。对于有些样品，只需要一步纯化，纯度就能达到90％以上。

附图说明

图1为实施例1中用0.1M甘氨酸，pH 3.5洗脱样品的SEC-HPLC检测结果图。

图2为实施例1中用0.1M甘氨酸，0.2M精氨酸，pH 3.5洗脱样品的SEC-HPLC检测结果图。

图3为实施例2中用0.1M甘氨酸，pH 3.5洗脱样品的SEC-HPLC检测结果图。

图4为实施例2中用0.1M甘氨酸，0.2M精氨酸，pH 3.5洗脱样品的SEC-HPLC检测结果图。

图5为实施例3中用0.1M甘氨酸，pH 3.5洗脱样品的SEC-HPLC检测结果图。

图6为实施例3中用0.1M甘氨酸，0.2M精氨酸，pH 3.5洗脱样品的SEC-HPLC检测结果图。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中，在抗体结合在亲和层析柱后的亲和层析纯化的具体工艺步骤为：平衡1——冲洗——平衡2——洗脱——清洁——平衡3——再生——平衡4——保存。以下实施例中实验组各步骤所使用的缓冲溶液如下：

平衡1	0.1M Tris-HCl,pH 7.0
		冲洗缓冲液	600mM Arginine pH 8.0
平衡2	0.1M Tris-HCl,pH 7.0
		洗脱缓冲液	0.1M Glycine,pH 3.5,0.2M Arginine
清洁缓冲液	100mM Phosphoric acid
		平衡3	0.1M Tris-HCl,pH 7.0
再生缓冲液	0.5M NaOH
		平衡4	0.1M Tris-HCl,pH 7.0
保存液	20％(v/v)ethanol

实施例1

实验组：按前述工艺步骤，Ab1-hIgG4抗体经过亲和层析(Protein A)纯化，用0.1MGlycine，0.2M Arginine，pH 3.5作为洗脱缓冲液来洗脱样品，洗脱后样品经SEC-HPLC检测。

对照组：与实验组的区别在于，将实验组的洗脱缓冲液替换为0.1M Glycine，pH3.5，用于洗脱样品，洗脱后样品经SEC-HPLC检测。

实验结果显示，对照组和实验组的纯度分别为31.80％(图1)，72.12％(图2)。用含有精氨酸的洗脱液洗液的多聚峰比例降低，样品纯度升高。

实施例2

实验组：按前述工艺步骤，Ab2-hIgG4抗体经过Protein A纯化，用0.1M Glycine，0.2M Arginine，pH 3.5作为洗脱缓冲液来洗脱样品，洗脱后样品经SEC-HPLC检测。

实验结果显示，对照组和实验组的纯度分别为57.66％(图3)，74.4％(图4)。用含有精氨酸的洗脱液洗液的多聚峰比例降低，样品纯度升高。

实施例3

实验组：按前述工艺步骤，VHH-hIgG4(Fc fusion)抗体经过Protein A纯化，用0.1M Glycine，0.2M Arginine，pH 3.5作为洗脱缓冲液来洗脱样品，洗脱后样品经SEC-HPLC检测。

实验结果显示，对照组和实验组的纯度分别为81.80％(图5)，95.46％(图6)。在洗脱液中加入精氨酸，一步纯化，纯度就能达到90％以上，无需两步纯化，节省时间和资源。

采用本发明提供的方法，能够减少蛋白多聚，增加样品的主峰，增加回收率；纯化后的样品纯度能提高14％以上，对某些抗体样品能提高纯度40％以上。本发明的方法能减少纯化步骤，对于有些样品，本发明只需要一步纯化，纯度就能达到90％以上；而现有技术需两次或更多次纯化才能达到。

综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种在亲和层析纯化中减少抗体多聚的方法，其特征在于，以含0.1～1.0M精氨酸的洗脱缓冲液进行洗脱。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述精氨酸浓度为0.1～0.5M。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述精氨酸浓度为0.2～0.4M。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述精氨酸浓度为0.2M。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液含0.05～1.0M甘氨酸、0.1～1.0M精氨酸，pH≥3.5且pH为酸性。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液含0.05～0.5M甘氨酸、0.1～0.5M精氨酸，pH≥3.5且pH为酸性。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液含0.1～0.3M甘氨酸、0.2～0.3M精氨酸，pH≥3.5且pH≤4.0。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液含0.1M甘氨酸、0.2M精氨酸且pH＝3.5。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在洗脱之前，先用平衡2缓冲液进行层析柱平衡，所述平衡2缓冲液为0.1M Tris-HCl溶液，pH 7.0。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在平衡2之前，先用冲洗缓冲液进行层析柱冲洗，所述冲洗缓冲液为600mM精氨酸溶液，pH 8.0。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，在冲洗之前，先用平衡1缓冲液进行层析柱平衡，所述平衡1缓冲液为0.1M Tris-HCl溶液，pH 7.0。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在洗脱之后，用清洁缓冲液进行层析柱清洁，所述清洁缓冲液为100mM磷酸溶液。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，在清洁之后，用平衡3缓冲液进行层析柱平衡，所述平衡3缓冲液为0.1M Tris-HCl溶液，pH 7.0。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，在平衡3之后，用再生缓冲液进行层析柱再生，所述再生缓冲液为0.5M NaOH溶液。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，在再生之后，用平衡4缓冲液进行层析柱平衡，所述平衡4缓冲液为0.1M Tris-HCl溶液，pH 7.0。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，在平衡4之后，将层析柱保存于体积分数20％乙醇中。

17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述亲和层析纯化为Protein A纯化或Protein G纯化。