CN102876645A

CN102876645A - 双功能色谱介质辅助溶菌酶体外复性的方法

Info

Publication number: CN102876645A
Application number: CN2012104174889A
Authority: CN
Inventors: 高栋; 王骊丽; 谭福春; 王文鹏
Original assignee: Northwest University
Current assignee: Northwest University
Priority date: 2012-10-26
Filing date: 2012-10-26
Publication date: 2013-01-16

Abstract

本发明公开了一种双功能色谱介质辅助溶菌酶体外复性的方法。具体步骤如下：1)制备双功能色谱介质；2)用平衡缓冲液平衡装有双功能色谱介质的色谱柱；3)用变性缓冲液溶解溶菌酶，吸附上样；4)用复性缓冲液进行洗脱复性。本发明的优点在于：(1)同时利用疏水作用力和静电排斥作用力来抑制变性蛋白的聚集，既可提高蛋白的活性收率，又可提高蛋白回收率；(2)双功能色谱介质具有高的分辨率，复性和纯化可同时完成；(3)制备工艺简单成熟，易于控制和放大。

Description

双功能色谱介质辅助溶菌酶体外复性的方法

发明领域

本发明属于生物技术中的蛋白质复性技术领域，涉及一种双功能色谱介质辅助溶菌酶体外复性技术。

背景技术

目前通过基因工程技术表达的4000余种蛋白质中，90％多都是通过大肠杆菌(E.coli)表达为无活性的包涵体(inclusion body)后，再进行复性获得。包涵体蛋白的分离纯化与复性是重组蛋白药物开发的技术“瓶颈”，要占生产总成本的70-90％。因此，研究包涵体蛋白分离纯化与复性的方法对于重组蛋白药物的发展具有重大的实际意义。

蛋白质复性的经典方法一般采用稀释法和透析法，前者将变性蛋白质直接加入复性缓冲液，高蛋白浓度下往往形成大量沉淀，因而复性时要求蛋白浓度很低，后者操作繁琐，都不利于工业化复性生产。色谱法用于蛋白复性具有一些显著优势，比如，(1)减少蛋白质相互聚集的几率，提高蛋白质复性浓度；(2)复性蛋白易于与错误折叠蛋白质分离；(3)蛋白复性和纯化可同步进行；(4)耗时较少，容易自动化。目前，能够用于蛋白复性的色谱方法包括疏水相互作用色谱(CN 1077715A，CN 1508150A，CN 1219793C)、离子交换色谱(CN1410435A，CN 101948504A)、体积排阻色谱(CN 101386639)与亲合色谱(CN 1556206A)等。这些方法中，疏水相互作用色谱具有较高的分辨率，适用范围较广，以盐-水溶液为流动相，是一种最为常用的色谱复性方法。但是疏水相互作用色谱复性法也存在着其局限性，比如，采用疏水相互作用色谱复性时，往往因蛋白质和介质配基彼此间的疏水性吸附过强，阻碍蛋白质的正确折叠，同时蛋白质不易洗脱下来，使得活性回收率降低，所以必须在洗脱缓冲液中添加一些变性剂来帮助蛋白质洗脱，但这样洗脱下来的蛋白绝大部分的结构为部分折叠构型，并不能使蛋白在介质上完全折叠回原本的构型。

疏水相互作用色谱的配基通常包括乙醚基(Ether)、异丙基(Isopropyl)，丁基(Butyl)、辛基(Octyl)和苯基(Phenyl)等，配基的极性及其配基密度对疏水相互作用色谱的疏水强度有重要影响。鉴于上述问题的存在，在用疏水相互作用色谱复性时，有学者便利用一些疏水性较弱的官能基团来作为疏水配基，比如乙醚基或聚乙二醇(PEG)等，但如此以来，会造成吸附载量下降、变性蛋白易于直接穿透的缺点。

发明内容

本发明的目的在于克服已有技术的不足，提出一种双功能色谱介质辅助溶菌酶体外复性的新方法，该介质同时提供疏水相互作用力和静电排斥作用力，更有利于抑制变性蛋白质的聚集，从而辅助变性蛋白质高效复性。

为了实现上述任务，本发明采取如下技术解决方案：

双功能色谱介质辅助溶菌酶体外复性的方法，其特征在于选用同时带有疏水基团与可以解离的带正电基团的分子作为色谱配基，通过控制色谱介质的配基密度，调整流动相的pH和离子强度，使变性蛋白质与介质表面同时存在疏水相互作用力和静电排斥作用力，控制变性蛋白的上样量及上样流速，之后逐渐去除流动相中的变性剂，在两种作用力的协同作用下抑制变性蛋白的错误聚集，并促进蛋白分子在介质表面进行再折叠，逐渐形成正确构象。最后通过调整流动相的盐浓度，洗脱蛋白，从而实现变性蛋白的复性。

实施步骤如下：

1)以空白基质为原材料，以β-苯乙胺为配基，制备双功能色谱介质；

2)用平衡缓冲液平衡装有双功能色谱介质的色谱柱；

3)用变性缓冲液溶解溶菌酶，吸附上样；

4)用复性缓冲液进行洗脱复性。

所述的双功能色谱介质的制备方法为：以空白基质为原材料，空白基质可以是交联琼脂糖微球，纤维素微球或高纯硅胶微球，经过活化反应，活化方法为环氧氯丙烷法，烯丙基溴法或γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷法，然后以β-苯乙胺做为配基，经过偶联反应即得双功能色谱介质；

所述平衡缓冲液为盐浓度为1-4M、pH值为6-8、变性剂0-4M，并含有氧化还原对的缓冲液；变性缓冲液为含0-0.2M还原剂、5-10M脲、0.5-1.5mMEDTA的缓冲液；复性缓冲液为不含盐、H值为6-8、变性剂0-4M，并含有氧化还原对的缓冲液；

所述变性蛋白溶液制备方法为：称取5mg溶菌酶溶解于1ml变性缓冲液，将溶液置于37度、100rpm摇床中处理60-90分钟，得到无活性的去折叠态溶菌酶溶液；

所述步骤3)方法是：柱子平衡好后，控制上样量为20-40微克/毫升，控制流速为0.5-1.5ml/min，使变性蛋白与色谱介质结合，使变性蛋白之间避免聚集，之后再用平衡缓冲液冲洗1-5个柱体积；

所述步骤4)方法是：用平衡缓冲液冲洗完后，用复性缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰进行分析，流速为0.5-1.5ml/min；

所述溶菌酶的比活测定采用标准的F.I.P.法，溶菌酶的浓度采用考玛斯亮蓝法测定，溶菌酶的活力回收率为复性后溶液中溶菌酶的活力与变性前溶菌酶活力之比。

本发明的优点在于：(1)同时利用疏水作用力和静电排斥作用力来抑制变性蛋白的聚集，既可提高蛋白的活性收率，又可提高蛋白回收率；(2)双功能色谱介质具有高的分辨率，复性和纯化可同时完成；(3)制备工艺简单成熟，易于控制和放大。

附图说明

图1是本发明双功能色谱介质分离模型蛋白的色谱图，图中：横坐标为蛋白质出峰时间，纵坐标为mAU表示A280紫外吸收值，色谱峰顺序为1，Cyt-C；2，Myo；3，Lys；4，Car；5，BSA；6，α-Amy；色谱条件为：A液：3.0mol/L(NH₄)₂SO₄，20.0mmol/L KH₂PO₄，pH7.0；B液：20.0mmol/L KH₂PO₄，pH7.0；流速1.0ml/min。线性梯度洗脱30-100％B液，30min，延长100％B 10min；检测波长280nm。

图2是本发明双功能色谱介质复性变性溶菌酶的色谱图，图中：横坐标为蛋白质出峰时间，纵坐标为mAU表示A280紫外吸收值，标记“1”为天然溶菌酶的出峰色谱图，标记“2”为经变性复性的溶菌酶的出峰色谱图，“*”为正确构象的溶菌酶的出峰位置；色谱条件为：平衡缓冲液：3.0mol/L(NH₄)₂SO₄，50mmol/L KH₂PO₄，pH7.0；复性缓冲液：50mmol/LKH₂PO₄，pH7.0；流速1.0ml/min。线性梯度洗脱30-100％复性缓冲液，30min，延长100％复性缓冲液10min；检测波长280nm。

图3是本发明双功能色谱介质复性变性溶菌酶的色谱图，图中：横坐标为蛋白质出峰时间，纵坐标为mAU表示A280紫外吸收值，标记“1”为天然溶菌酶的出峰色谱图，标记“2”为经变性复性的溶菌酶的出峰色谱图，“*”为正确构象的溶菌酶的出峰位置；色谱条件为：平衡缓冲液：3.0mol/L(NH₄)₂SO₄，50mmol/L KH₂PO₄，3.0mol/L Urea，pH7.0；复性缓冲液：50mmol/L KH₂PO₄，3.0mol/L Urea，pH7.0；流速1.0ml/min。线性梯度洗脱30-100％复性缓冲液，30min，延长100％复性缓冲液10min；检测波长280nm。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的描述：

实施例1

1)双功能色谱介质制备：以高纯硅胶作为空白基质，首先进行酸处理，将硅胶用1∶1盐酸120度回流3-4小时，冷却，然后用蒸馏水反复洗涤，直到溶液显中性，真空干燥过夜，使硅胶表面的硅羟基维持在一个合适的水平。然后将酸处理好的硅胶用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(TM-560)进行活化，即在50mmol/L的醋酸钠溶液中，90度条件下缓慢滴加TM-560适量，与硅胶反应2h，然后依次用水、甲醇、水洗涤干净，真空干燥。β-苯乙胺与环氧化硅胶的反应在用钠丝干燥的1，4-二氧六环溶液中进行，加入反应物后超声10分钟，在70℃搅拌下反应10h，然后用丙酮、水反复洗涤，真空干燥，过夜即可。

2)双功能色谱介质分辨率考察实验：以细胞色素-C(Cyt-C)、肌红蛋白(Myo)、溶菌酶(Lys)、碳酸酐酶(Car)、牛血清白蛋白(BSA)和淀粉酶(α-Amy)六种蛋白作为模型蛋白，考察双功能色谱介质的分辨率。将双功能色谱柱(100×4.6mm I.D.)用流动相A(3.0mol/L(NH₄)₂SO₄，20.0mmol/L KH₂PO₄，pH7.0)平衡，流速为1ml/min，进样上述六种蛋白混合液50微升，继续用流动相A冲洗，然后用流动相B(20.0mmol/L KH₂PO₄，pH7.0)按照线性梯度30-100％B进行洗脱，30min，流速1.0ml/min，并延长100％B 10min，整个过程检测波长为280nm。

实施例2

2)双功能色谱介质复性实验：将双功能色谱柱(100×4.6mm I.D.)用平衡缓冲液(3.0mol/L(NH₄)₂SO₄，50mmol/L KH₂PO₄，pH7.0)平衡，流速为1ml/min，用变性缓冲液(0.1mol/LTris-HCl，8.0mol/L urea，1.0mmol/L EDTA，0.15mol/L DTT，pH8.5)制备变性溶菌酶溶液，然后进样10微升使变性蛋白吸附，继续用平衡缓冲液冲洗3个柱体积，然后换复性缓冲液(50mmol/L KH₂PO₄，pH7.0)进行复性洗脱，洗脱方式为线性梯度30-100％B液，30min，并延长100％B 10min，流速为1ml/min，收集洗脱峰并测活性。与此同时，取天然溶菌酶5mg溶解于缓冲液(0.1mol/LTris-HCl，pH8.5)中，按照上述相同方法完成吸附洗脱过程，作为复性溶菌酶出峰时间的参照。

实施例3

2)双功能色谱介质复性实验：将双功能色谱柱(100×4.6mm I.D.)用平衡缓冲液(3.0mol/L(NH₄)₂SO₄，50mmol/LKH₂PO₄，3.0mol/LUrea，pH7.0)平衡，流速为1ml/min，用变性缓冲液(0.1mol/L Tris-HCl，8.0mol/L urea，1.0mmol/L EDTA，0.15mol/L DTT，pH8.5)制备变性溶菌酶溶液，然后进样10微升使变性蛋白吸附，继续用平衡缓冲液冲洗3个柱体积，然后换复性缓冲液(50mmol/L KH₂PO₄，3.0mol/L Urea，pH7.0)进行复性洗脱，洗脱方式为线性梯度30-100％B液，30min，并延长100％B 10min，流速为1ml/min，收集洗脱峰并测活性。与此同时，取天然溶菌酶5mg溶解于缓冲液(0.1mol/L Tris-HCl，pH8.5)中，按照上述相同方法完成吸附洗脱过程，作为复性溶菌酶出峰时间的参照。

实施例4

2)双功能色谱介质复性实验：将双功能色谱柱(100×4.6mm I.D.)用平衡缓冲液(3.0mol/L(NH₄)₂SO₄，50mmol/L KH₂PO₄，1.8mmol/L GSH，0.3mmol/L GSSG，pH7.0)平衡，流速为1ml/min，用变性缓冲液(0.1mol/LTris-HCl，8.0mol/Lurea，1.0mmol/L EDTA，0.15mol/LDTT，pH8.5)制备变性溶菌酶溶液，然后进样10微升使变性蛋白吸附，继续用平衡缓冲液冲洗3个柱体积，然后换复性缓冲液(50mmol/L KH₂PO₄，1.8mmol/L GSH，0.3mmol/L GSSG，pH7.0)进行复性洗脱，洗脱方式为线性梯度30-100％B液，30min，并延长100％B 10min，流速为1ml/min，收集洗脱峰并测活性。与此同时，取天然溶菌酶5mg溶解于缓冲液(0.1mol/LTris-HCl，pH8.5)中，按照上述相同方法完成吸附洗脱过程，作为复性溶菌酶出峰时间的参照。

实施例5

2)双功能色谱介质复性实验：将双功能色谱柱(100×4.6mm I.D.)用平衡缓冲液(3.0mol/L(NH₄)₂SO₄，50mmol/L KH₂PO₄，1.8mmol/L GSH，0.3mmol/L GSSG，3.0mol/L Urea，pH7.0)平衡，流速为1ml/min，用变性缓冲液(0.1mol/LTris-HCl，8.0mol/Lurea，1.0mmol/LEDTA，0.15mol/L DTT，pH8.5)制备变性溶菌酶溶液，然后进样10微升使变性蛋白吸附，继续用平衡缓冲液冲洗3个柱体积，然后换复性缓冲液(50mmol/L KH₂PO₄，1.8mmol/L GSH，0.3mmol/L GSSG，3.0mol/L Urea，pH7.0)进行复性洗脱，洗脱方式为线性梯度30-100％B液，30min，并延长100％B 10min，流速为1ml/min，收集洗脱峰并测活性。与此同时，取天然溶菌酶5mg溶解于缓冲液(0.1mol/L Tris-HCl，pH8.5)中，按照上述相同方法完成吸附洗脱过程，作为复性溶菌酶出峰时间的参照。

Claims

1.双功能色谱介质辅助溶菌酶体外复性方法，其特征在于同时利用疏水相互作用力与静电排斥相互作用力的协同作用来抑制变性蛋白的错误聚集，从而辅助蛋白高效复性，该过程步骤如下：

2)用平衡缓冲液平衡装有双功能色谱介质的色谱柱；

3)用变性缓冲液溶解溶菌酶，吸附上样；

4)用复性缓冲液进行洗脱复性。

2.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于所述的双功能色谱介质为同时能提供疏水相互作用力和静电排斥作用力的色谱介质。

3.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于所述的双功能色谱介质的空白基质可以是交联琼脂糖微球，纤维素微球或高纯硅胶微球。

4.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于所述的双功能色谱介质的配基是β-苯乙胺。

5.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于所述平衡缓冲液为盐浓度为1-4M、pH值为6-8、变性剂0-4M，并含有氧化还原对的缓冲液。

6.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于所述的变性缓冲液为含0-0.2M还原剂、5-10M脲、0.5-1.5mMEDTA的缓冲液。

7.如权利要求1所述的复性方法，其特征在于所述的复性缓冲液为不含盐、H值为6-8、变性剂0-4M，并含有氧化还原对的缓冲液。