CN104193818B - 重组人干扰素β‑1b的高压复性和组合层析制备方法 - Google Patents

重组人干扰素β‑1b的高压复性和组合层析制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及重组人干扰素β‑1b(IFNβ‑1b)的高压复性和组合层析制备方法，该方法包括破菌；包涵体的洗涤；高压复性和纯化；其中，高压复性采用将洗涤后的包涵体直接重悬到复性缓冲溶液中，在180‑320MPa压力下作用10‑16h完成复性；纯化采用一步SP FF阳离子交换层析和一步Butyl‑S疏水层析组合的方法。本发明的制备方法无需变性过程，直接完成包涵体复性，同时全过程无需添加SDS，并可以使用层析的方法进行纯化，适用于大规模生产。

Description

重组人干扰素β-1b的高压复性和组合层析制备方法
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种重组人干扰素β-1b的制备方法，尤其涉及一种先采用高压复性重组人干扰素β-1b包涵体然后使用SP FF阳离子交换和Butyl-S疏水层析组合的方法进行纯化的制备方法。
背景技术
人β干扰素是由成纤维细胞和上皮细胞产生的一类具有广谱生物活性(包括抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用)的细胞因子，属于I型干扰素。目前人β干扰素有两种，分别为干扰素β-1a与干扰素β-1b，其中干扰素β-1b是将17位的Cys突变为Ser而成，含有165aa，分子量为18500Da。
国外采用重组人干扰素β-1b治疗某些疾病，例如性疣、丙型肝炎及相关肝癌，美国FDA已于1993年批准重组人干扰素β-1b用于治疗多发性硬化症，目前市场上的重组人干扰素β-1b药品主要为Bayer公司的Betaferon和诺华公司的Extavia。
重组人干扰素β-1b通过目前最常用的表达系统—大肠杆菌进行表达(US 4,518,584A1)，并且以包涵体的形式存在。由于干扰素β-1b具有强烈的疏水性，其包涵体采用传统变复性手段不能够恢复蛋白的天然结构。
Leo S Lin等人(Methods in Enzymology，986，119:183-192)通过SDS溶解包涵体并结合有机相抽提和凝胶过滤的方法进行变复性和纯化。该方法需要全过程添加SDS，致使后期层析纯化只能采用凝胶过滤的方法，操作繁琐，工作量大，在工业应用中存在困难，需要寻找一种新的变复性方法。
高压复性蛋白质是一种新的包涵体复性技术。St.John等人(University ofColorado-Boulder.Dept.of Chemical and Biological Engineering Thesis.1995:28)认为不同于传统变性剂将蛋白结构完全变性伸展开来，高压处理是一种温和的变性过程，它通过压力作用挤压水分子进入包涵体疏水界面并破坏其疏水结构从而使包涵体溶解，形成的是一种部分展开的过渡态，称之为折叠中间体结构，这种结构高度有序，非常接近蛋白天然态，然后在特定压力下作用一定时间后逐渐折叠恢复至蛋白天然状态，完成复性。
高压复性相较于常规复性方法(稀释复性、透析复性、柱上复性)不仅可以用于许多特殊蛋白的复性，而且还可以在更高初始浓度条件下完成复性，可以很大程度上降低生产成本，减少工作量，易于工业放大。Theodore W.Randolph等人(Proc.Natl.Acad.Sci，1999，96:13029-13033)通过一系列研究表明：使用一定的压力(150-350Mpa)可以复性蛋白质包涵体，获得活性蛋白。
Leo.S.Lin等人(Methods enzymology,1986.119:183-192),Rao.D.V等人(Biochemistry and Biotechnology,2009.158(1):140-154)在制备重组人干扰素β-1b的时候都使用了SDS溶解包涵体，对后期层析过程造成很大困难，只能采用凝胶过滤的方法进一步纯化。Dean Russell.Harde等人(Journal of Interferon and Cytokine Research,1995.15:31-37)虽然没有用到SDS溶解包涵体，但是使用了极端pH，这容易诱发脱酰胺反应使蛋白结构发生变化。Cleland.Jeffrery.L等人(US 8,273,561B2)尝试使用了高压处理的手段，但是仍然使用了SDS溶解包涵体然后有机相抽提的方法，并且有三步组合层析纯化，步骤繁琐而且收率低。因此寻找一种无需变性，直接完成包涵体复性并全程无添加SDS的重组人干扰β-1b制备工艺是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组人干扰素β-1b的制备方法，特别是一种先采用高压复性重组人干扰素β1b包涵体然后使用SP FF阳离子交换和Butyl-S疏水层析组合的方法进行纯化的制备方法。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种重组人干扰素β-1b的高压复性和组合层析制备方法，包括破菌；包涵体的洗涤；高压复性和纯化。
优选地，所述破菌采用高压匀浆的方法进行。
优选地，所述包涵体的洗涤包括以下步骤：
(1)将所述包涵体用缓冲液进行清洗，离心弃上清获得粗制包涵体；
(2)在所述粗制包涵体中按1:10(m/v)加入8M Urea变性剂，0.5％β-巯基乙醇，洗涤过夜，离心弃上清；
(3)将步骤(2)得到的沉淀用去离子水洗涤后，按1:10(m/v)加入2％十四烷基二甲基(3-磺丙基)氢氧化铵内盐(Zwittergent)溶液洗涤，离心弃上清，然后将所得沉淀用去离子水洗涤后获得精制包涵体。
本发明在进行包涵体的洗涤时，步骤(1)所用到的缓冲液可以是现有技术中常用的缓冲液，例如可以是：20mM Tris-HCl，1mM EDTA，1％Triton-100，pH 8.0或20mM Tris-HCl，1mM EDTA，1M NaCl，pH 8.0或20mM Tris-HCl，1mM EDTA，2M Urea，pH 8.0，本发明优选采用上述3种缓冲液分别进行包涵体的洗涤，通过该步骤(1)的洗涤可以去除大部分杂蛋白，获得粗制包涵体。
本发明在步骤(1)的基础上，通过将8M Urea变性剂，0.5％β-巯基乙醇以及2％Zwittergent溶液分别对粗制包涵体作进一步洗涤，可以显著去除特殊杂蛋白，从而获得精制包涵体。
优选地，所述高压复性采用将所述包涵体超声重悬后直接进行复性。
优选地，将所述包涵体的重悬液加到复性缓冲溶液中，混匀后在180-320MPa压力下作用10-16h。
本发明中高压复性的压力还可以选自180MPa、190MPa、200MPa、210MPa、220MPa、230MPa、250MPa、280MPa、300MPa或320MPa，优选为320MPa。
本发明中高压复性的时间还可以选自10h、11h、12h、13h、14h、15h或16h，优选为16h。
优选地，所述复性缓冲溶液包括20mM Tris-HCl，0.5M精氨酸，pH 8.0和0.5％Zwittergent，GSH:GSSG＝1.0mM：0.2mM。
本发明采用高压复性技术，不仅省略了有机相抽提和凝胶过滤步骤，而且全过程无需添加SDS，从而克服了现有技术中后期层析纯化只能用凝胶过滤方法的缺陷，具有操作简便、工作量小等优点。
优选地，所述纯化方法包括SP FF阳离子交换和Butyl-S疏水层析。
优选地，所述SP FF阳离子交换层析方法包括将高压复性获得的样品稀释10倍后上样，上样结束后先用5％洗脱缓冲液淋洗，然后用5-40％洗脱2-3柱体积。
优选地，所述SP FF阳离子交换层析方法用到的平衡缓冲溶液为20mM PB，pH 7.0，所述洗脱缓冲液为20mM PB，1M NaCl，pH 7.0。
优选地，所述Butyl-S疏水层析方法包括将SP FF阳离子交换层析获得的样品中添加AS至终浓度为0.4M，然后用Butyl-S柱进行纯化；
优选地，所述Butyl-S疏水层析方法中用到的平衡缓冲液为20mM PB，0.4M AS，pH7.0，洗脱缓冲液为20mM PB，pH 7.0，直接以100％洗脱缓冲溶液进行洗脱。
本发明采用一步SP FF阳离子交换层析和Butyl-S疏水层析的方法进行纯化，纯化后的重组人干扰素β-1b纯度能够达到95％以上。
作为优选技术方案，本发明的重组人干扰素β-1b的高压复性和组合层析制备方法包括以下步骤：
(1)破菌：采用高压匀浆的方法进行破菌；
(2)包涵体的洗涤：先将所述包涵体用缓冲液进行清洗，离心弃上清后获得粗制包涵体；然后在所述粗制包涵体中按1:10(m/v)的比例加入8M Urea变性剂，添加0.5％β-巯基乙醇，洗涤过夜，离心弃上清；再将得到的沉淀用去离子水洗涤后，按1:10(m/v)的比例加入2％Zwittergent溶液洗涤，离心弃上清，然后将所得沉淀用去离子水洗涤后获得精制包涵体；
(3)高压复性：将步骤(2)得到的精制包涵体用去离子水超声重悬，并将包涵体重悬液加入到复性缓冲溶液中，混匀后在180-320MPa压力下作用10-16h，其中复性缓冲溶液为20mM Tris-HCl，0.5M精氨酸，pH 8.0，0.5％Zwittergent，GSH:GSSG＝1.0mM：0.2mM；
(4)纯化：先采用SP FF阳离子交换层析再利用Butyl-S疏水层析方法进行纯化；
其中，所述SP FF阳离子交换层析方法包括将高压复性获得的样品稀释10倍后上样，上样结束后先用5％洗脱缓冲液淋洗，然后用5-40％洗脱2-3柱体积，所述SP FF阳离子交换层析方法用到的平衡缓冲溶液为20mM PB，pH 7.0，所述洗脱缓冲液为20mM PB，1MNaCl，pH 7.0；
其中，所述Butyl-S疏水层析方法包括将SP FF阳离子交换层析获得的样品中添加AS至终浓度为0.4M，然后用Butyl-S柱进行纯化；所述Butyl-S疏水层析方法中用到的平衡缓冲液为20mM PB，0.4M AS，pH 7.0，洗脱缓冲液为20mM PB，pH 7.0，直接以100％洗脱缓冲溶液进行洗脱。
(5)对纯化后的蛋白进行纯度及结构检测。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
本发明的制备方法无需变性过程，直接完成包涵体复性，省略了有机相抽提和凝胶过滤步骤，同时全过程无需添加SDS，并可以使用层析的方法进行纯化，最终获得的重组人干扰素β-1b样品纯度高于95％；本发明的制备方法适用于大规模生产，降低了成本，提高了生产效率。
附图说明
图1是本发明包涵体洗涤效果的SDS-PAGE电泳图；
其中M为分子量marker，其从小到大依次为14.3kD，20.1kD，29kD，44.3kD，66.4kD，97.2kD，1为8M Urea洗涤后上清，2为8M Urea洗涤后沉淀水洗上清，3为2％Zwittergent洗涤后上清，4为2％Zwittergent洗涤后沉淀水洗上清，5为精制包涵体。
图2是本发明不同复性缓冲体系下的质量收率比较图；
其中，Z G 3.7表示20mM NaAc-HAc，pH 3.7，0.5％Zw3-14，GSH：GSSG＝10：1；Z G3.7表示20mM NaAc-HAc，pH 3.7，0.5％Zw3-14，2mM DTT；U Z D表示50mM Tris-HCl，4MUrea，pH 8.0，0.5％Zw3-14，2mM DTT；U Z G表示50mM Tris-HCl，4M Urea，pH 8.0，0.5％Zw3-14，GSH：GSSG＝10：1；A Z D表示50mM Tris-HCl，0.5M Arg，pH 8.0，0.5％Zw3-14，2mMDTT；A Z G表示50mM Tris-HCl，0.5M Arg，pH 8.0，0.5％Zw 3-14，GSH：GSSG＝10：2。
图3是本发明的SP FF纯化层析图。
图4是本发明的Butyl-S纯化层析图。
图5是本发明纯化获得的重组人干扰素β-1b样品的SDS-PAGE电泳图；
其中，M为分子量marker(从小到大依次为14.3kD，20.1kD，29kD，44.3kD，66.4kD，97.2kD)；
其中，图5-A中1为SP FF纯化上样前样品，2为SP FF纯化穿透峰，3-4为SP FF纯化洗脱峰，5为Butyl-S纯化穿透峰，6-7为Butyl-S纯化洗脱峰，8-9为非还原型Butyl-S纯化洗脱峰；图5-B中1-3分别对应还原型不同上样量条件的本发明的纯化人干扰素β-1b样品，1为10μL，2为20μL，3为30μL，4为空白道，5为非还原型电泳条件下人干扰素β-1b纯化样品。
图6是本发明圆二色光谱检测分析纯化样品结构图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
菌体发酵：将带有目标基因的基因工程菌在常规LB培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母膏，1％NaCl)中发酵培养，添加一定浓度抗生素，待OD600值达到一定程度之后使用IPTG进行诱导，诱导3-5h，发酵结束。
破菌：将菌体用TE(50mmol/LTris-Cl、5mmol/LEDTA)按1:10(g/mL)的比例悬浮菌体，置于高压匀浆机中破碎，压力1000bar，循环3次，破菌后于4℃、8500rpm离心15min，弃上清，沉淀重悬于TE缓冲液中，重复上述操作2次。
通过洗涤包涵体获得一定纯度的包涵体，具体步骤为：(1)将包涵体分别用包涵体洗涤液1(20mM Tris-HCl,1mM EDTA,1％Triton-100,pH 8.0)、洗涤液2(20mM Tris-HCl,1mM EDTA,1M NaCl,pH 8.0)和洗涤液3(20mM Tris-HCl,1mM EDTA,2M Urea,pH 8.0)进行清洗，离心去除上清获得粗制包涵体；(2)然后在粗制包涵体中按1：10(m/v)比例加入8MUrea变性剂，添加0.5％β-ME，洗涤过夜，离心去除上清；(3)将沉淀用去离子水洗涤后按1:10(m/v)比例加入2％Zwittergent3-14洗涤8h，离心去除上清，然后将沉淀用去离子水洗涤后获得精制包涵体。
从图1可以看出，箭头指向本发明的重组人干扰β-1b，图1表明，通过对包涵体进行3步洗涤可以去除大部分杂蛋白以及部分特殊杂蛋白，获得精制包涵体。
实施例2
高压复性人干扰素β-1b包涵体：将已获得的人干扰素β-1b精制包涵体用去离子水超声(功率225-300W，超声3S，间歇6S，工作时间30S)重悬，取少量重悬液变性溶解测浓度，并以此作为复性初始浓度的参考值。
将包涵体重悬液按一定初始浓度(1mg/mL)分别加到不同复性缓冲溶液中，混匀后使用320MPa压力作用16h，比较复性结果。
从图2可以看出，在复性缓冲体系为(20mM Tris-HCl,0.5M Arg，pH 8.0，0.5％Zwittergent3-14，GSH:GSSG＝1.0mM：0.2mM)时获得最高收率，接近100％。
实施例3
SP FF纯化：高压复性获得样品稀释10倍后使用SP FF柱进行纯化，平衡缓冲溶液为20mM PB，pH 7.0，洗脱缓冲溶液为20mM PB，1M NaCl，pH 7.0。上样结束后先用5％洗脱缓冲液淋洗，然后按5％-40％洗脱2-3柱体积，收集洗脱峰；
Butyl-S纯化：在SP FF柱纯化获得样品中添加AS至终浓度为0.4M，然后用Butyl-S柱进行纯化，平衡缓冲溶液为20mM PB，0.4M AS，pH 7.0，洗脱缓冲溶液为20mM PB，pH 7.0。上样结束后直接以100％洗脱缓冲溶液进行洗脱，收集洗脱峰；
图3和图4分别是SP FF纯化层析图和Butyl-S纯化层析图。
通过图3可以看出，在SP FF层析纯化图中大部分杂蛋白穿透过柱子，干扰素β-1b结合在柱上并在洗脱时主要存在于5％-40％B洗脱峰中。进一步使用Butyl-S层析进行纯化时，如图4所示，剩余杂蛋白都穿透过柱子，目标蛋白直接通过100％B洗脱下来。
实施例4
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯化样品纯度：
采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析纯化样品，图5-A显示通过一步SP FF纯化获得接近80％纯度的样品，进一步通过Butyl-S纯化获得样品纯度高于95％，并且通过非还原型电泳结果可知纯化样品中不存在二硫键聚集。图5-B中比较了不同上样量条件下的纯化样品电泳结果，进一步证明本制备工艺获得的纯品已达到电泳纯。
实施例5
圆二色光谱分析检测纯化样品的结构：比较人干扰素标准品以及本制备工艺纯化获得样品的二级结构。
图6表明本发明制备工艺获得的人干扰素β-1b中二级结构主要为α-螺旋结构，与标准品一致，符合理论值，说明本发明得到的纯化样品结构正确。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (9)

1.一种重组人干扰素β-1b的高压复性和组合层析制备方法，其特征在于：所述方法包括破菌；包涵体的洗涤；高压复性和层析纯化；
所述制备方法无需包涵体变性过程，将所述包涵体重悬后直接完成包涵体复性，省略有机相抽提和凝胶过滤步骤，同时全过程无需添加SDS；
所述包涵体的洗涤包括以下步骤：
(1)将所述包涵体用缓冲液进行清洗，离心弃上清后获得粗制包涵体；
(2)在所述粗制包涵体中按1:10(m/v)的比例加入8M Urea变性剂，添加0.5％β-巯基乙醇，洗涤过夜，离心弃上清；
(3)将步骤(2)得到的沉淀用去离子水洗涤后，按1:10(m/v)的比例加入2％Zwittergent溶液洗涤，离心弃上清，然后将所得沉淀用去离子水洗涤后获得精制包涵体；
所述高压复性采用将所述包涵体的重悬液加到复性缓冲溶液中，混匀后在180-320MPa压力下作用10-16h；
所述纯化方法包括SP FF阳离子交换和Butyl-S疏水层析。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述破菌采用高压匀浆的方法进行。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高压复性采用将所述包涵体的重悬液加到复性缓冲溶液中，混匀后在320MPa压力下作用16h。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复性缓冲溶液为20mMTris-HCl，0.5M精氨酸，pH 8.0，0.5％Zwittergent，GSH:GSSG＝1.0mM:0.2mM。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述SP FF阳离子交换层析方法包括将高压复性获得的样品稀释10倍后上样，上样结束后先用5％洗脱缓冲液淋洗，然后用5-40％洗脱2-3柱体积。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述SP FF阳离子交换层析方法用到的平衡缓冲溶液为20mM PB，pH 7.0，所述洗脱缓冲液为20mM PB，1M NaCl，pH 7.0。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述Butyl-S疏水层析方法包括将SP FF阳离子交换层析获得的样品中添加硫酸铵至终浓度为0.4M，然后用Butyl-S FF柱进行纯化。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述Butyl-S疏水层析方法中用到的平衡缓冲液为20mM PB，0.4M硫酸铵，pH 7.0，洗脱缓冲液为20mM PB，pH 7.0，直接以100％洗脱缓冲溶液进行洗脱。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)破菌：采用高压匀浆的方法进行破菌；
(2)包涵体的洗涤：先将所述包涵体用缓冲液进行清洗，离心弃上清后获得粗制包涵体；然后在所述粗制包涵体中按1:10(m/v)的比例加入8M Urea变性剂，添加0.5％β-巯基乙醇，洗涤过夜，离心弃上清；再将得到的沉淀用去离子水洗涤后，按1:10(m/v)的比例加入2％Zwittergent溶液洗涤，离心弃上清，然后将所得沉淀用去离子水洗涤后获得精制包涵体；
(3)高压复性：将步骤(2)得到的精制包涵体用去离子水超声重悬，并将包涵体重悬液加入到复性缓冲溶液中，混匀后在180-320MPa压力下作用10-16h，其中复性缓冲溶液为20mM Tris-HCl，0.5M精氨酸，pH 8.0，0.5％Zwittergent，GSH:GSSG＝1.0mM：0.2mM；
(4)纯化：先采用SP FF阳离子交换层析再利用Butyl-S疏水层析方法进行纯化；
其中，所述SP FF阳离子交换层析方法包括将高压复性获得的样品稀释10倍后上样，上样结束后先用5％洗脱缓冲液淋洗，然后用5-40％洗脱2-3柱体积，所述SP FF阳离子交换层析方法用到的平衡缓冲溶液为20mM PB，pH 7.0，所述洗脱缓冲液为20mM PB，1M NaCl，pH7.0；
其中，所述Butyl-S疏水层析方法包括将SP FF阳离子交换层析获得的样品中添加硫酸铵至终浓度为0.4M，然后用Butyl-S柱进行纯化；所述Butyl-S疏水层析方法中用到的平衡缓冲液为20mM PB，0.4M硫酸铵，pH 7.0，洗脱缓冲液为20mM PB，pH 7.0，直接以100％洗脱缓冲溶液进行洗脱；
(5)对纯化后的蛋白进行纯度及结构检测。
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CN109371050B (zh) * 2018-12-20 2022-02-11 天津瑞普生物技术股份有限公司 一种犬干扰素的制备方法
KR20210009982A (ko) * 2019-07-18 2021-01-27 에이비온 주식회사 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1207304C (zh) * 2001-09-27 2005-06-22 中国科学院过程工程研究所 分离变性蛋白/包涵体蛋白复性混合液中蛋白聚集体的方法
EP2207890A4 (en) * 2007-10-05 2010-12-15 Barofold Inc HIGH PRESSURE PROCESSING OF AGGREGATED INTERFERONS
CN103059123B (zh) * 2013-01-09 2014-02-19 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 一种重组猪干扰素β1及其编码基因和表达方法

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