CN109371050B - 一种犬干扰素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种犬干扰素的制备方法，该方法通过培养携带犬干扰素基因的重组质粒的大肠杆菌获得种子液，并以一定浓度接种菌液，然后经低温诱导获得发酵菌液，发酵菌液经离心收菌体，菌体经破碎离心收获包涵体，包涵体经洗涤、重悬、低温静水压复性和层析纯化后获得犬干扰素，该方法的优势在于采用低温诱导结合低温静水压复性提高包涵体复性率和蛋白活性。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品领域，具体是涉及一种犬干扰素的制备方法。
背景技术
犬干扰素是一种具有较强抗病毒能力的糖蛋白，临床上己经将其用于防治狂犬病，犬细小病毒病，犬瘟热等病毒病。随着分子生物学的迅速发展，利用基因工程的方法体外合成的干扰素已经获得成功。大肠杆菌表达系统因其具备高效、成本低廉等先天优势，成为现有技术中生产犬干扰素蛋白的首要选择，但是由于其表达效率过高、过速，往往使表达的外源蛋白不能正确折叠形成具有正确空间结构和特定生物学功能的蛋白质，表达产物常聚集成直径为0.5-lμm的不可溶的致密的包涵体颗粒。因此将大肠杆菌表达系统表达的犬干扰素用于临床，须进行蛋白复性。现有复性技术中存在较大问题，主要包括：包涵体颗粒结构过于致密，需要用高浓度的裂解剂(常为8M的尿素或6M的盐酸胍)才能使其复溶，而在后期去除裂解剂的过程中，由于难以控制裂解剂的置换速率，常由于环境变化过于剧烈导致复性产物再次聚集失活；此外，为保证复性产物不发生再次聚集失活，在置换裂解剂的过程中常需要大量含有相对低浓度裂解剂的置换液，而大量置换液的引入又会导致过低的复性收率，且由于置换步骤多导致成本高耗时长不适合规模化生产。因此，建立一套降低犬干扰素包涵体的致密程度并在复性过程中引入低浓度的裂解剂的生产工艺，成为解决犬重组干扰素临床应用亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种犬干扰素的制备的方法。
本发明采用低温诱导的方式可降低转录、翻译速率，并减少高温和/或外源蛋白过速表达对宿主菌的毒性。
本发明采用含有β-巯基乙醇或二硫苏糖醇的低浓度尿素重悬液重悬包涵体，既有助于包涵体溶解又能与静水压结合完成复性。
本发明采用低温静水压的方式进行包涵体复性，压力可挤压水分进入包涵体内部、破坏疏水结构，从而达到包涵体蛋白溶解、并进一步解聚成单体的效果，从而提高复性效率。
为实现以上技术目的，本发明采用如下技术方案：
一种犬干扰素制备方法，其具体步骤为：
一种犬干扰素的制备方法，其特征在于，包括：
1)构建含有犬干扰素基因重组质粒的大肠杆菌，并培养以获取种子液；
2)种子液经扩大培养后在38℃-40℃诱导表达，得到发酵菌液；
3)发酵菌液经破碎、离心后得到包涵体；
4)包涵体经洗涤后，用含β-巯基乙醇或二硫苏糖醇的尿素浓度为2-4mol/L重悬液重悬；
5)将重悬后的包涵体在2-8℃、静水压100-300Mpa的条件下复性，复性产物经层析纯化后得到犬干扰素。
进一步的，步骤4)中所述的重悬液中尿素的浓度为3mol/L。
进一步的，步骤4)中所述的重悬液中β-巯基乙醇或二硫苏糖醇的浓度为0.5-2％。
进一步的，步骤4)中所述的重悬液中β-巯基乙醇或二硫苏糖醇的浓度为1％。
进一步的，步骤5)中将溶解后的包涵体在5℃，静水压200Mpa下复性，得到复性的犬干扰素。
进一步的，步骤5)中所述的复性时长为20小时。
进一步的，步骤2)作为优选可在38℃诱导菌液，得到发酵菌液。
进一步的，步骤2)中所述的诱导菌液的时间为12小时。
进一步的，所述的大肠杆菌重组质粒的培养条件为30℃、200rpm培养18h。
进一步的，所述的接种菌液是指以10％浓度将种子液接种至培养基。
进一步的，步骤3)所述的发酵菌液破碎条件是在超声波功率600W条件下破碎。
进一步的，步骤3)所述的发酵菌液的离心条件是5000r/min，离心30min。
进一步的，所述的包涵体洗涤是指用含1％TritonX-100的缓冲液洗涤3次。
采用上述技术方案，本发明具有的有益效果为：
1.低尿素浓度的重悬液在促进包涵体溶解的同时能保证不影响犬干扰素的复性过程，同时防止复性完成的犬干扰素再次聚集失活。
2.用低温诱导结合低温静水压复性的方式代替稀释和透析复性，从根本上简化复性工艺、降低复性成本、提升蛋白得率。
3.采用低温诱导，能显著降低犬干扰素的表达速率，进而降低表达过程中形成的包涵体的致密程度，使之成为结构相对疏散的蛋白结构，有利于低浓度尿素条件下重悬液的助溶效果。
具体实施方式
以下具体说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。本领域的技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的前提下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。
实施例1：不同诱导温度下的犬干扰素的制备
1.将冻存的重组大肠杆菌在30℃环境下，摇床震荡培养18小时，摇床转速为200rpm，获得种子液；
2.种子液以10％的浓度接种，分别在38℃、40℃、42℃诱导12小时，获得发酵液；
3.发酵液经5000r/min、离心30min，收获菌体；
4.菌体经600W超声破碎后，10000r/min离心30min，收获沉淀，得到包涵体；
5.包涵体用含0.1％TritonX-100的缓冲液洗涤3次，并用含有6mol/L尿素、0.5％的二硫苏糖醇的溶解液，制备获得780～800ug/ml蛋白的包涵体悬液；
6.包涵体悬液，用稀释复性法，2℃复性18h，复性后，用5K的超滤柱洗滤，去除尿素，即得有活性的犬干扰素样品。
7.干扰素活性的测定：参照下述方法测定干扰素的活性
1)细胞的制备
按常规传代细胞培养方法消化的MDCK细胞悬液，用生长液稀释至每毫升含20～40万个细胞，每孔100μl，置37℃、5％CO2培养箱培养5小时。
2)上样
将干扰素样品进行10倍系列稀释，每个稀释度接种2孔，每孔0.1ml，置37℃、5％CO2培养箱培养24小后攻击病毒。设细胞对照及病毒对照孔。
3)攻毒
将攻击病毒VSV用生长液稀释至100TCID50/0.1ml，每孔0.1ml，置37℃、5％CO2培养箱内培养，待病毒对照孔75％以上细胞出现病变时，结束攻毒，判定结果。
4)按Reed-Muench法计算半数保护量，即得到干扰素的活性(单位U)。
5)结果表明，详见表1，38℃-40℃条件下得到的蛋白活性较高。可选择38℃-40℃作为进一步试验的诱导温度。
表1不同诱导温度下的犬干扰素的制备各阶段参数指标
实施例2：不同重悬条件下，犬干扰素的制备
1.将冻存的重组大肠杆菌在30℃环境下，摇床震荡培养18小时，摇床转速为200rpm，最终获得种子液；
2.种子液以10％的浓度接种，38℃诱导12h，获得发酵液；
3.发酵液经5000r/min、离心20min，收获菌体；
4.菌体经600W超声破碎后，10000r/min离心30min，收获沉淀，得到包涵体；
5.包涵体用含0.1％TritonX-100的缓冲液洗涤3次，分别用含有1-5mol/L尿素、内含0.5-2％的二硫苏糖醇的重悬液，制备获得780～800ug/ml蛋白的包涵体悬液；
6.包涵体悬液，用稀释复性法，8℃复性18h，复性后，用5K的超滤柱洗滤，去除尿素，即得有活性的犬干扰素样品。
7.干扰素活性的测定：
参照实施例1的干扰素活性的测定方法进行检测，结果详见表2，数据显示在室温稀释复性的条件下，单纯改变重悬液中尿素和二硫苏糖醇的浓度仍然不能充分溶解包涵体，也不能显著提高复性率。
表2不同重悬条件下犬干扰素的制备各阶段参数指标
实施例3：在改变复性体系时，不同重悬条件对复性率的影响
1.将冻存的重组大肠杆菌在30℃环境下，摇床震荡培养18小时，摇床转速为200rpm，最终获得种子液；
2.种子液以10％的浓度接种，38℃诱导12h，获得发酵液；
3.发酵液经5000r/min、离心20min，收获菌体；
4.菌体经600W超声破碎后，10000r/min离心30min，收获沉淀，得到包涵体；
5.包涵体用含0.1％TritonX-100的缓冲液洗涤3次，并用含有2～5mol/L尿素、2％的二硫苏糖醇的重悬液，制备获得780-800ug/ml蛋白的包涵体悬液；
6.包涵体悬液，置于200Mpa静水压容器中，温度分别为5℃复性18h，复性后，用5K的超滤柱洗滤，即得有活性的犬干扰素样品。
7.干扰素活性的测定：
参照实施例1的干扰素活性的测定方法进行检测，结果详见表3，数据显示，在200Mpa静水压，温度为5℃条件下复性，2～5mol/L尿素、2％的二硫苏糖醇的重悬条件下，获得的干扰素蛋白活性显著提高。
表3不同复性条件下犬干扰素的制备各阶段参数指标
实施例4：不同复性条件下包涵体复性率的变化
1.将冻存的重组大肠杆菌在30℃环境下，摇床震荡培养18小时，摇床转速为200rpm，最终获得种子液；
2.种子液以10％的浓度接种，38℃诱导12h，获得发酵液；
3.发酵液经5000r/min、离心20min，收获菌体；
4.菌体经600W超声破碎后，10000r/min离心30min，收获沉淀，得到包涵体；
5.包涵体用含0.1％TritonX-100的缓冲液洗涤3次，并用3mol/L尿素、0.5％的二硫苏糖醇，获得780～800ug/ml蛋白的包涵体悬液；
6.包涵体悬液，分别置于100Mpa、200Mpa、300Mpa静水压容器中，温度分别为2℃、5℃、8℃复性18h，复性后，用5K的超滤柱洗滤，即得有活性的犬干扰素样品。
7.干扰素活性的测定：
参照实施例1的干扰素活性的测定方法进行检测，结果详见表4，复性条件为100Mpa-300Mpa静水压条件下，在2-8℃温度下复性获得的干扰素蛋白活性显著提高。
表4不同复性条件下犬干扰素的制备各阶段参数指标
实施例5
参照实施例4的试验方法，将诱导温度变为40℃，其他复性条件如表5所述，数据显示，包涵体复性后的蛋白活性和实施例4的结果类似。
表5不同复性条件下犬干扰素的制备各阶段参数指标
Claims (10)
1.一种犬干扰素的制备方法，其特征在于，包括：
1)构建含有犬干扰素基因的重组质粒的大肠杆菌表达体系，并培养以获取种子液；
2)种子液经扩大培养后在38℃-40℃诱导表达，得到发酵菌液；
3)发酵菌液经破碎、离心后得到包涵体；
4)包涵体经洗涤后，用含β-巯基乙醇或二硫苏糖醇的尿素浓度为2-4mol/L重悬液重悬；
5)将重悬后的包涵体在2-8℃、静水压100-300Mpa的条件下复性，复性产物经层析纯化后得到犬干扰素。
2.根据权利要求1所述的一种犬干扰素的制备方法，其特征在于：步骤4)中所述的重悬液中尿素的浓度为3mol/L。
3.根据权利要求1所述的一种犬干扰素的制备方法，其特征在于：步骤4)中所述的重悬液中β-巯基乙醇或二硫苏糖醇的浓度为0.5-2％。
4.根据权利要求1所述的一种犬干扰素的制备方法，其特征在于：步骤4)中所述的重悬液中β-巯基乙醇或二硫苏糖醇的浓度为1％。
5.根据权利要求1所述的一种犬干扰素的制备方法，其特征在于：步骤5)中将重悬后的包涵体在5℃，静水压200Mpa下复性，得到复性的犬干扰素。
6.根据权利要求1所述的一种犬干扰素的制备方法，其特征在于：步骤5)中所述的复性时长为20小时。
7.根据权利要求1所述的一种犬干扰素的制备方法，其特征在于：步骤2)中诱导表达是在38℃诱导12小时。
8.根据权利要求1所述的一种犬干扰素的制备方法，其特征在于：所述种子液的培养条件为30℃、200rpm培养18h，并以10％浓度接种进行扩大培养。
9.根据权利要求1所述的一种犬干扰素的制备方法，其特征在于：步骤3)所述的发酵菌液破碎条件是在超声波功率600W条件下破碎，发酵菌液的离心条件是5000r/min，离心30min。
10.据权利要求1所述的一种犬干扰素的制备方法，其特征在于：所述的包涵体洗涤是指用含1％TritonX-100的缓冲液洗涤3次。
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