ES2341352T3 - Procedimiento para la preparacion de material virico. - Google Patents
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- C12N2710/00051—Methods of production or purification of viral material
Abstract
Procedimiento para la preparación de material vírico en un cultivo celular con microsoportes, que comprende (a) una primera fase de cultivo que comprende un aumento del volumen del cultivo celular mediante la adición de medio de cultivo y material de microsoporte, alcanzándose un primer volumen de cultivo celular máximo; (b) una etapa de infección que tiene lugar después de la mencionada primera fase de cultivo y que comprende la adición de material vírico infeccioso al mencionado cultivo celular con microsoportes; (c) una segunda fase de cultivo que tiene lugar después de la mencionada etapa de infección y que comprende un aumento adicional del volumen del cultivo celular hasta un segundo volumen de cultivo celular máximo, generándose material vírico durante la segunda fase de cultivo; y (d) una etapa de recolección para obtener el material vírico a partir del cultivo celular con microsoportes, caracterizado porque el mencionado segundo volumen de cultivo máximo es de dos a siete veces mayor que el mencionado primer volumen de cultivo máximo.
Description
Procedimiento para la preparación de material
vírico.
La invención se refiere a un procedimiento para
la preparación de suspensiones de virus. La invención se refiere en
particular a un procedimiento para la preparación de suspensiones de
virus de titulación elevada en cultivos celulares. Los
procedimientos preferidos comprenden un aumento de volumen del
cultivo celular antes de la infección con material vírico y otras
etapas o aumentos de volumen sucesivos, hasta llegar a un volumen
final que es claramente superior al volumen máximo del cultivo
antes de la infección.
\vskip1.000000\baselineskip
En el estado actual de la técnica se conocen
varios procedimientos para la preparación de material vírico. En
particular, se conocen procedimientos en los que el material vírico
se prepara a partir de cultivos celulares animales.
El experto diferencia entre las líneas celulares
de crecimiento adherente, es decir, las líneas celulares que crecen
con preferencia sobre superficies sólidas, de las líneas celulares
que crecen preferentemente en suspensión. Las líneas celulares de
crecimiento adherente se cultivan o bien directamente sobre la
superficie del recipiente de cultivo usado o crecen sobre
partículas sólidas (por ej. sobre microsoportes (microcarriers)),
que por su parte pueden estar presentes en suspensión en un medio de
cultivo.
Se conocen procedimientos para la preparación de
material vírico que usan líneas celulares que crecen en suspensión,
así como también aquellos procedimientos que usan líneas celulares
de crecimiento adherente.
En la preparación de suspensiones de virus con
cultivos celulares tiene una gran importancia la composición del
medio. En muchos casos es necesario añadir suero fetal de ternera
(FCS) y factores de crecimiento de origen animal o vegetal. Además
de las oscilaciones de las cargas y de los componentes proteínicos
perturbadores en el procesamiento, el uso de suero significa un
riesgo de seguridad biológico (BSE/TSE, micoplasmas, priones,
etc.). Por lo tanto, ha de darse preferencia a los medios libres de
suero y a ser posible sintéticos [MERTEN ET AL. 1994].
En particular al usar células adherentes, como
por ej. en el caso de los cultivos sobre microsoportes, además de
las típicas barreras técnicas del aumento de escala, como por ej, el
mantenimiento de un suministro suficiente de oxígeno, la
eliminación del CO_{2} o una homogeneización suficiente del
cultivo de fermentos con un esfuerzo de cizallamiento mínimo,
surgen también y de manera especial problemas en la inoculación de
la siguiente escala del proceso de mayor dimensión [GLACKEN ET
AL. 1990, J.B. GRIFFITHS ET AL. 1985, AMERSHAM 2001].
La "migración directa" de un soporte a otro
de células de crecimiento adherente puro sólo puede producirse
mediante una manipulación del proceso, de suerte que debido a la
manipulación las células pierden su adherencia al menos en parte.
El experto conoce estrategias para eliminar la adherencia de células
de crecimiento adherente y las enzimas que se usan para ello [E.
LINDNER ET AL. 1987, AMERSHAM 2001, DÜRRSCHMID ET AL.
2003] y deben tenerse en cuenta en el desarrollo del proceso en lo
que respecta a la separación o la inactivación de las enzimas
usadas. A una escala menor, en las décadas de 1970 y 1980 se
llevaron a cabo con éxito experimentos para la migración celular
directa desde la superficie de recipientes a microsoportes en
botellas de cultivo rotatorias, placas Petri y frascos T. El
experto conoce la migración con éxito de células de crecimiento
adherente de un soporte a otro únicamente en reactores de lecho
fijo siendo necesario reseñar, limitándolo, que en este caso se
trata de líneas celulares que crecen tanto en suspensión como
también de modo adherente [AMERSHAM 2001, DÜRRSCHMID ET AL.
2003].
El modo en que se lleva a cabo el proceso, en
especial, desempeña un gran papel. En la literatura se describen
diferentes procedimientos tales como, por ejemplo, los cultivos por
lotes o por perfusión. Los cultivos por perfusión se usan para
desacoplar el tiempo de permanencia de la tasa de crecimiento
específica y para evitar los inhibidores o limitadores del medio de
cultivo y aumentar de este modo la productividad, manteniéndose
estos cultivos a menudo a lo largo de varios meses en el modo de
"cultivo celular de alta densidad" ("High Density Cell
Culture" (HDCC)). Sin embargo, estos sistemas requieren períodos
de arranque complejos y lentos además de complicados dispositivos
periféricos (separadores, filtros spin, retención celular con
ultrasonidos, etc.) [M. REITER ET AL. 1989, GLACKEN ET
AL. 1990, GRIFFITHS ET AL. 1985, AMERSHAM 2001,
DÜRRSCHMID ET. AL. 2003A].
Una posibilidad adicional para conseguir un
suministro suficiente de nutrientes lo constituye el aporte al
cultivo celular de soluciones de sustrato muy concentradas. En
particular con la modalidad HDCC, las inhibiciones resultantes del
aporte, como por ejemplo amonio y/o lactato, pueden dar lugar a
productividades y rendimientos más bajos. Hasta la fecha, para
evitar las concentraciones inhibidoras se recomiendan los sistemas
de perfusión o de diálisis.
En el campo de la preparación de material vírico
por medio de cultivos celulares animales, en la que deben tenerse
en cuenta las complejas cinéticas acopladas de las células y del
virus, pueden surgir problemas en la realización del proceso en
especial cuando se usan cultivos celulares sobre microsoportes.
Así por ejemplo, resulta cuestionable el
aprovechamiento mediante perfusión compleja de la propagación de un
virus causante de un CPE (efecto citopático) ya que los virus
destruyen o lisan las células por lo general en un plazo breve (en
parte inferior a los 3 a 7 días siguientes a la infección).
En la literatura se describen procesos por lotes
para la multiplicación de virus a escala piloto y de producción (50
a 1.000:1). En todos los procesos de microsoporte descritos, la
multiplicación de los virus se lleva a cabo con densidades
celulares relativamente pequeñas. Después de la infección con el
virus que hay que propagar, hasta la recolección la infección
transcurre aproximadamente al volumen final tardío de la escala de
producción [B. MONTAGNON ET AL. 1984, BAIJOT ET AL.
1987]. En algunos casos se han descrito cultivos por perfusión para
virus lentos o no lisantes a escala de laboratorio. En un caso se
describe un cambio del medio hasta el volumen original. [AMEMHAM
2001].
Los documentos US 6,455,298-B1 y
US 6,656,720-B2 describen un procedimiento para la
preparación de material vírico de la influenza con líneas celulares
creciendo en suspensión. El procedimiento dado a conocer comprende
una primera fase de cultivo en la que el material celular se
multiplica en un cultivo en suspensión, una etapa de infección y a
continuación una segunda fase de cultivo en la que se produce el
virus. Durante esta fase se puede diluir más el cultivo añadiendo
medio o bien llevándolo a cabo del mismo modo que un cultivo por
perfusión. Lo ventajoso de este procedimiento es el hecho de que la
capacidad del procedimiento no se ve circunscrita por la extensión
limitada de la superficie interior de los recipientes de
cultivo.
Sin embargo, resulta desventajoso que en el
cultivo en suspensión no pueden alcanzarse densidades celulares tan
altas como las que son posibles con los procedimientos basados en
microsoportes para la producción de virus. Además, la separación
del material celular del medio de cultivo en los cultivos en
suspensión es mucho más laboriosa que en el caso de los
procedimientos basados en microsoportes. En el procedimiento
conforme a la presente invención se soslayan estas desventajas,
puesto que aquí se usan líneas celulares de crecimiento adherente
sobre microsoportes para la preparación del material vírico.
Los documentos US 6,726,907 y WO 95/24468
describen procedimientos para la preparación de material vírico que
comprenden una primera fase de cultivo para la multiplicación del
material celular, una etapa de infección y a continuación una
segunda fase de cultivo en la que se produce el material vírico. A
diferencia del procedimiento conforme a la invención, en la segunda
etapa de cultivo no se lleva a cabo ningún aporte de medio de
cultivo, de tal manera que el volumen del cultivo no aumenta más
durante la segunda etapa de cultivo. El resultado es un volumen de
recolección relativamente bajo, presentando además el cultivo una
titulación de virus más pequeña en comparación con el procedimiento
conforme a la invención.
Los documentos US 5,994,134, US 5,719,051 y US
6,194,210 dan a conocer procedimientos basados en microsoportes
para la preparación de material vírico que igualmente comprenden una
primera fase de cultivo, una etapa de infección y una segunda fase
de cultivo. A diferencia del procedimiento conforme a la presente
invención, esta segunda fase de cultivo no va acompañada de un
aumento del volumen del cultivo, sino que esta segunda fase de
cultivo se lleva a cabo como un cultivo por perfusión. Se produce un
aporte continuo de medio de cultivo fresco mientras que al mismo
tiempo se extrae una corriente de igual volumen de medio de cultivo,
de tal manera que el volumen de cultivo se mantiene constante.
Frente a los procedimientos con líneas celulares en suspensión que
se han descrito anteriormente, en este procedimiento resulta
ventajoso que, por un lado, pueda conseguirse una mayor densidad
celular y que, por otro lado, se puedan recolectar a lo largo de un
período prolongado grandes cantidades de medio de cultivo que
contiene virus. Sin embargo, este procedimiento para la preparación
de material vírico basado en microsoportes tiene la desventaja de
que los medios de cultivo que contienen virus que se obtienen
presentan una titulación de virus (partículas víricas por unidad de
volumen) menor en comparación con el procedimiento conforme a la
invención. Esto dificulta el aislamiento del material vírico y con
ello eleva los costes del producto. Además, el aporte de medio de
cultivo fresco y la extracción simultánea de caldo de cultivo que
contiene virus supone una gran exigencia en cuanto a la técnica
estéril y aumenta el riesgo de contaminaciones. El uso de
procedimientos para la preparación de material vírico con una
segunda fase de cultivo en el modo de perfusión no es posible si el
virus que hay que producir provoca la lisis de las células
productoras y causa con ello un efecto citopático (CPE).
Esto tiene igualmente validez para el complejo
procedimiento de la diálisis externa o interna, en el intercambio
de sustancias a través de membranas semipermeables con un límite
específico de exclusión molecular. Para ello, el medio usado debe
separarse de las células antes de que a través de una membrana
dispuesta externamente se dialice frente a medio de cultivo fresco,
en un procedimiento de contracorriente o de corriente continua.
Además del bloqueo de la membrana dentro del módulo a causa de los
residuos celulares, etc., resultan problemáticos sobre todo el
empleo de aparatos y el aumento de la escala.
Teniendo en cuenta el estado actual de la
técnica que se ha descrito anteriormente, el objetivo técnico que
constituye la base de la presente invención es facilitar un
procedimiento de preparación para material vírico con el que, en un
tiempo relativamente corto, puedan producirse grandes cantidades de
suspensión vírica que contengan una alta concentración de material
vírico.
Este problema técnico se resuelve conforme a la
invención por medio de un procedimiento para la preparación de
material vírico en un cultivo celular sobre microsoportes, que
comprende (a) una primera fase de cultivo que comprende un aumento
del volumen del cultivo celular mediante la adición de medio de
cultivo y material de microsoporte, alcanzándose un primer volumen
máximo de cultivo celular; (b) una etapa de infección que tiene
lugar después de la mencionada primera fase de cultivo y que
comprende la adición de material vírico infeccioso al mencionado
cultivo celular con microsoportes; (c) una segunda fase de cultivo
que tiene lugar después de la mencionada etapa de infección y que
comprende un aumento adicional del volumen del cultivo celular
hasta un segundo volumen de cultivo celular máximo, generándose
material vírico durante la segunda fase de cultivo; y (d) una etapa
de recolección para obtener el material vírico a partir del cultivo
celular con microsoportes, estando caracterizado el procedimiento
porque el mencionado segundo volumen de cultivo máximo es de dos a
siete veces mayor que el mencionado primer volumen de cultivo
máximo.
Con el procedimiento conforme a la invención
resulta ventajoso en especial el hecho de que la titulación de
virus del caldo de cultivo se puede aumentar 10 veces en relación al
proceso por lotes mediante el aporte de medio de cultivo después de
la etapa de infección. Resulta especialmente ventajoso el hecho de
que este aumento de la titulación de virus también puede
conseguirse si no se aporta medio de cultivo concentrado después de
la etapa de infección, de tal modo que durante la segunda fase de
cultivo se vuelve a aumentar de manera considerable el volumen de
cultivo. De esta manera, frente al procedimiento conforme a la
invención con aporte de concentrado se puede volver a aumentar de
manera considerable la cantidad absoluta de material vírico
producido.
Otras formas adicionales de realización de la
invención las puede deducir el experto estudiando los ejemplos y
explicaciones que se indican más adelante.
Figura 1: Representación a modo de ejemplo del
procedimiento conforme a la invención con variaciones de volumen de
10 litros a 800 litros pasado por 50 litros y 200 litros. La
infección se lleva a cabo a la escala de 200 litros. (Abreviaturas:
pre, cultivo previo; inf, infección; H/DP,
recolección/preparación).
La invención se refiere a un procedimiento para
la preparación de suspensiones de virus. Los procedimientos
conforme a la invención presentan como mínimo 2 fases de cultivo.
Durante la primera fase de cultivo (antes de la etapa de infección)
se aumenta el volumen de cultivo varias veces o de manera continua.
En el procedimiento conforme a la invención después de la etapa de
infección se aumenta el volumen del cultivo de manera continua o
por etapas, de tal manera que el volumen final que hay que
recolectar es notablemente mayor que el volumen de cultivo máximo
antes de la infección.
La invención se refiere a:
- 1.
- Un procedimiento para la preparación de material vírico en un cultivo celular con microsoportes, que comprende
- (a)
- una primera fase de cultivo que comprende un aumento del volumen del cultivo celular mediante la adición de medio de cultivo y material de microsoporte, alcanzándose un primer volumen de cultivo celular máximo;
- (b)
- una etapa de infección que tiene lugar después de la mencionada primera fase de cultivo y que comprende la adición de material vírico infeccioso al mencionado cultivo celular con microsoportes;
- (c)
- una segunda fase de cultivo que tiene lugar después de la mencionada etapa de infección y que comprende un aumento adicional del volumen del cultivo celular hasta un segundo volumen de cultivo celular máximo, generándose material vírico durante la segunda fase de cultivo; y
- (d)
- una etapa de recolección para obtener el material vírico a partir del cultivo celular con microsoportes,
- caracterizado porque
- el mencionado segundo volumen de cultivo máximo es de dos a siete veces mayor que el mencionado primer volumen de cultivo máximo.
- 2.
- Un procedimiento conforme al punto 1, siendo el mencionado segundo volumen de cultivo máximo de tres a cuatro veces mayor que el mencionado primer volumen de cultivo máximo.
- 3.
- Un procedimiento conforme a uno de los puntos 1 a 2 en el que el mencionado aumento del volumen del cultivo celular se consigue mediante la adición de medio de cultivo no concentrado.
- 4.
- Un procedimiento conforme a uno de los puntos 1 a 3 en el que se usa un medio de cultivo libre de suero.
- 5.
- Un procedimiento conforme a uno de los puntos 1 a 4 en el que en la etapa de infección se usa una multiplicidad de infección (MI) de 0,001 a 2.
El núcleo de la invención es un aumento
secuencial o continuo significativo del volumen de producción de
manera preferente con medio de cultivo del mismo tipo, o con medio
de cultivo de tipo similar. El aumento de la eficiencia en
comparación con el procedimiento clásico se describe a continuación
con el ejemplo de la propagación de Parapoxvirus ovis.
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Se cultivó primero una línea celular Bovine
Kidney adherente conocida en cultivos estacionarios (cubetas de
cultivo apilables, botellas rotatorias) o en cultivo celular con
microsoportes por lotes. Se usó para ello una concentración de
microsoportes de 1 a 8 g/l, con preferencia de 3 a 7 g/l. La
inoculación del reactor se realizó con 1 a 6*10^{5} células/ml.
Después de que se hubieran consumido los nutrientes, durante esta
fase de multiplicación celular se llevó a cabo un cambio de medio de
cultivo a través de la sedimentación de los microsoportes. Después
de alcanzarse el número máximo de células de 0,2 a 2*10^{7}
células/ml, con preferencia de 0,3 a 0,7*10^{7} células/ml, en el
caso del cultivo con medios que contienen suplementos nutrientes
para reducir la concentración de suplementos tales como por ejemplo
FCS, hormonas del crecimiento, etc., se llevaron a cabo etapas de
lavado a través de una sedimentación múltiple y sustitución del
sobrenadante con medio de cultivo sin suplementos o con una
concentración de suplementos notablemente inferior. A continuación
se realizó la infección con una multiplicidad de infección (MI) de
entre 0,001 y 2, con preferencia de entre 0,005 y 0,1.
La infección se realizó en un volumen de cultivo
del 10 al 100% del volumen de fermentador. La infección trascurrió
sin ninguna manipulación adicional en el modo de lotes durante
aproximadamente de 3 a 15 días, con preferencia de 7 a 11 días. Al
alcanzarse un efecto citopático (CPE) de las células infectadas de
entre el 40 y el 100%, con preferencia del 40-90%,
se procedió a recolectar el cultivo.
La aplicación de gas se lleva a cabo por ejemplo
aplicándolo a través de una membrana sin producir burbujas y con
poca desviación. El pO_{2} se ajusta entre el 15 y el 65%, con
preferencia entre el 25 y el 55%.
El pH se ajusta con bicarbonato sódico,
hidróxido sódico y/o gas CO_{2} a pH 6,6 a pH 7,6, con preferencia
pH 6,9 a pH 7,5. La temperatura asciende a entre 32ºC y 37ºC. Los
parámetros ajustados en la fase de crecimiento celular y en la fase
de propagación del virus pueden ser diferentes.
Se puede conseguir una optimización adicional
del rendimiento de virus mediante el aporte de concentrados de
medio de cultivo o concentrados de sustratos individuales durante la
fase de propagación del virus. Este tipo de realización del proceso
se ha descrito y ha adquirido carta de naturaleza para distintos
sistemas. No obstante, en caso de usarse líneas celulares
adherentes para la propagación de virus en cultivos con
microsoportes, la determinación de las tasas de consumo específico
esencialmente necesarias resulta ser extraordinariamente difícil,
lo cual está en parte en correlación con los problemas del recuento
de células que conocen los expertos. Incluso si se conocen las
tasas de consumo individuales para los sustratos, se plantea la
cuestión adicional de las inhibiciones del cultivo. En la
literatura se han descrito sobre todo limitaciones por amonio o
lactato. Puesto que no existe ningún valor umbral de validez
general, hay que determinarlo de manera específica para el sistema
biológico usado.
Si se detecta una limitación/inhibición, hay que
soslayarla para conseguir una titulación alta del producto. Por lo
tanto, en los últimos años se han usado cultivos por perfusión o
diálisis, en especial en el campo del HDCC, cuyas desventajas
acerca de la propagación de un virus causante de CPE ya se han
discutido.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se va a comparar el procedimiento
en lotes alimentados de volumen ampliado
("volume-expanded-fed-batch")
(VEF) conforme a la invención con el procedimiento conocido del
estado actual de la técnica.
El ya mencionado aumento de volumen secuencial
por medio de la dilución del cultivo con medio de cultivo fresco
después de la infección (por ejemplo en la siguiente escala del
proceso: 1:2-1:7, con preferencia
1:3-1:5), de manera asombrosa no mostró la esperada
disminución de la titulación de virus sino que de manera
sorprendente se pudo aumentar la titulación en promedio de 8 a 13
veces, a pesar de la dilución. Esto se consiguió a pesar de que el
volumen se había aumentado en el factor 2 a 7, con preferencia en el
factor 3 a 4, en comparación con el procedimiento por lotes
descrito. El resultado de todo ello es un rendimiento de virus
mejorado de forma considerable.
Con los procedimientos de comparación descritos
y llevados a cabo varias veces tales como por ejemplo diálisis,
aporte de concentrados, perfusión y/o mediante simple disminución
del número de células, no se pudieron alcanzar o aumentar estos
rendimientos (Tabla 1).
Además del considerable aumento en el
rendimiento de virus, pueden observarse también efectos positivos
resultantes sobre todo en los procesos downstream. Estos últimos se
traducen sobre todo en menores impurezas celulares tales como
proteínas de la célula huésped, proteínas y ADN por unidad de dosis
(de especial importancia en el uso de agentes terapéuticos humanos
similares a vacunas), así como en menores pérdidas de rendimiento
después del filtrado. Por término medio, por ejemplo con una
filtración con 20 \mum se consigue una pérdida de \sim
0,6-1 log TCID_{50} en el modo por lotes. Como
comparación, en lotes alimentados de volumen ampliado sólo cabe
reseñar una pérdida de \sim 0,1-0,4 log
TCID_{50}.
El aumento del volumen ejerce igualmente una
influencia positiva sobre las barreras técnicas ya descrita del
aumento de la escala. En el caso del suministro de oxígeno, por
ejemplo mediante el procedimiento de aplicarlo a través de una
membrana que evita producir burbujas y produce poca desviación, con
sucesivos aumentos de volumen a través de una dilución puede
conseguirse un aumento significativo de la escala (resultante de los
parámetros físicos de los reactores), puesto que con la disminución
del número de células a causa de la dilución y de la lisis
provocada por el virus hay que aportar menos oxígeno al sistema.
Para que se entienda mejor, en la Figura 1 se muestra a modo de
ejemplo el procedimiento en una escala relevante para la producción.
En los experimentos se confirmaron las etapas representadas, en
particular con respecto a la frecuencia y la eficiencia de la
migración directa con la transferencia directa de las células BK en
la siguiente escala de fermentación. No se observó ningún efecto
sobre la productividad.
La representación a modo de ejemplo comienza con
la inoculación del reactor de 10 litros. El proceso se lleva a cabo
de la misma manera que ya se ha descrito con anterioridad para el
modo de lotes. Después de alcanzarse la confluencia, se produce una
dilución directa 1:5 en la escala de 50 litros con microsoportes
frescos en la misma o equiparable proporción al medio de cultivo
que en la escala de 10 litros. Después de alcanzarse otra vez la
confluencia, se inocula con el mismo procedimiento el reactor de 200
litros. Puede ser ventajosa una breve sedimentación con o sin
agitación interna.
Si durante la fase de crecimiento se hubiera
usado un medio de cultivo que tuviera suero/proteínas, se realizan
etapas de lavado con medio de cultivo libre de suero y proteínas
para reducir la concentración de suplementos. La infección se lleva
a cabo con la MI descrita lo mismo que en el procedimiento por
lotes.
10-36 horas después de la
infección se realiza entonces el procedimiento en lotes alimentados
de volumen ampliado. Se trata de una dilución segura y robusta de
la suspensión con medio de cultivo fresco, pudiendo realizarse esto
en el mismo reactor o en reactores más grandes. Para ello sólo hace
falta un pequeño esfuerzo. La suspensión de
células-virus de 200 litros se aumenta por etapas a
intervalos apropiados y/o de manera continua por ejemplo a 400
litros, después a 600 litros y por último a 800 litros. De manera
sorprendente esto no condujo, tal como ya se ha descrito y se ha
representado en la Tabla 1, a un empeoramiento de la productividad
de virus.
No pudieron detectarse diferencias entre células
cultivadas en medios que contenían suero, medios que contenían
proteínas y medios sintéticos. En el ejemplo de las líneas celulares
Bovine Kidney adaptadas a condiciones sintéticas y libres de
suero, no se constató ninguna diferencia en lo que respecta a la
migración de un soporte a otro, el número de células y la
productividad. Esto significa que el procedimiento puede usarse para
medios de cultivo que contiene suero, que contienen proteínas y
sintéticos.
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Las ventajas conforme a la invención del
procedimiento de "lotes alimentados de volumen aumentado"
descrito frente a los procedimientos conocidos y ya establecidos
pueden resumirse de la siguiente manera: (1) Se trata de un
procedimiento seguro, robusto y eficiente para la propagación de
virus. (2) Se consiguen rendimientos de virus más elevados. (3) No
hay ninguna necesidad de un mayor equipamiento. (3) El procedimiento
se lleva a cabo de una manera relativamente sencilla. (4) La
necesidad de personal para vigilar los procesos es reducida. (5) Se
mejora la calidad del producto con respecto a las etapas de
procesamiento posteriores. (6) Se pueden usar fermentadores más
grandes. (7) Se puede escalar de manera sencilla. (8) El
procedimiento puede adaptarse a distintos medios de cultivo que
contengan suero, que estén libres de suero, que contengan proteína y
que sea sintéticos.
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La línea celular Bovine Kidney adaptada a
condiciones libres de suero pero con contenido de proteína se
cultivó, partiendo del banco de células, primero en frascos T y
después en botellas rotatorias. El cultivo se llevó a cabo a 37ºC y
un valor de pH de 7,2 +/- 0,2 en estufa de incubación a la que se
aplicó gas CO_{2}. La recolección del material celular se realizó
mediante tripsinización.
La concentración de los microsoportes Cytodex 3
de la empresa Amersham, Suecia, preparados conforme a las
instrucciones del comerciante ascendía a 3 g/l. La inoculación se
llevó a cabo en 10 litros con un número de células de 2 E05
cel./ml. Durante la fase de cultivo celular y mediante sedimentación
se llevó a cabo un cambio de medio de cultivo a una concentración
de glucosa c < 0,5 g/l. El reactor se agitó con ayuda de un
agitador inducido con 30 rpm. El pO_{2} se ajustó al 40% +/- 10%.
El valor del pH ascendía a 7,2 +/- 0,2.
Después de 10 días se alcanzó un número de
células de 3,1 E06 Z/ml, encontrándose las células en la fase de
crecimiento estacionario. Después de tres etapas de lavado con medio
de cultivo sin suplementos se llevó a cabo la infección con PPVO
(MI = 0,01) en el volumen final.
Durante la posterior propagación del virus no se
realizó ninguna manipulación. Al cabo de 8 días se alcanzó una MI
del 90%. La fermentación se interrumpió después de la sedimentación
mediante filtrado con 20 \mum. En la Tabla 3 se representa el
TCID_{50} en el momento de la recolección y después de la
recolección.
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La línea celular Bovine Kidney adaptada a
condiciones libres de suero pero con contenido de proteína se
cultivó, partiendo del banco de células, primero en frascos T y
después en botellas rotatorias. El cultivo se llevó a cabo a 37ºC y
un valor de pH de 7,2 +/- 0,2 en estufa de incubación a la que se
aplicó gas CO_{2}. La recolección del material celular se realizó
mediante tripsinización.
La concentración de los microsoportes Cytodex 3
de la empresa Amersham, Suecia, preparados conforme a las
instrucciones del comerciante ascendía a 5 g/l. La inoculación se
llevó a cabo en 3,5 litros con un número de células de 3 x 10^{5}
1/ml. Durante la fase de cultivo celular y mediante sedimentación se
llevó a cabo un cambio de medio de cultivo a una concentración de
glucosa c < 0,5 g/l. El reactor se agitó con ayuda de un
agitador inducido con 45 rpm. El pO_{2} se ajustó al 40% +/- 10%.
El valor del pH ascendía a 7,2 +/- 0,2.
Después de 10 días se alcanzó un número de
células de 7,1 x 10^{6} 1/ml, encontrándose las células en la fase
de crecimiento estacionario. Después de tres etapas de lavado con
medio de cultivo sin suplementos se llevó a cabo la infección con
PPVO (MI = 0,01) en 1,7 litros durante 2 h a n = 14 rpm antes que se
llenara a 3,5 litros y las revoluciones del agitador se aumentaran
a n = 45 rpm.
16 h después de la infección se transfirió todo
el cultivo al reactor de 15 litros y se llenó con 7 litros
(dilución 1:2). En el reactor de 15 litros se ajustaron los mismos
parámetros.
46 h después de la infección se diluyó a 10,5
litros (dilución 1:3 referido a 3,5 l). El CPE ascendía
aproximadamente al 30% referido al número de células en el reactor
de 3,5 litros y teniendo en cuenta la dilución.
70 h después de la infección se aumentó el
volumen a 12,5 litros antes de que finalmente 94 h después de la
infección se aumentara a 13,8 litros (dilución 1:3,9).
7 días después de la infección (2,5 días después
de la última dilución) se interrumpió la fermentación mediante
sedimentación y posterior filtración con 20 \mum del cultivo (CPE
= 93%).
En la Tabla 4 se representa el TCID_{50} en el
momento de la recolección y en la recolección.
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La línea celular Bovine Kidney adaptada a
condiciones sintéticas se cultivó, partiendo del banco de células,
primero en frascos T y después en botellas rotatorias. El cultivo se
llevó a cabo a 37ºC y un valor de pH de 7,2 +/- 0,2 en estufa de
incubación a la que se aplicó gas CO_{2}. La recolección del
material celular se realizó mediante tripsinización.
La concentración de los microsoportes Cytodex 3
de la empresa Amersham, Suecia, preparados conforme a las
instrucciones del comerciante ascendía a 5 g/l. La inoculación se
llevó a cabo en 3,5 litros con un número de células de 3,8 x
10^{5} 1/ml. Durante la fase de cultivo celular y mediante
sedimentación se llevó a cabo un cambio de medio de cultivo a una
concentración de glucosa c < 0,5 g/l. El reactor se agitó con
ayuda de un agitador inducido con 45 rpm. El pO_{2} se ajustó al
40% +/- 10%. El valor del pH ascendía a 7,2 +/- 0,2.
Después de 13 días se alcanzó un número de
células de 5,6 E06 cel./ml, encontrándose las células en la fase de
crecimiento estacionario. Después de tres etapas de lavado con el
mismo medio de cultivo se llevó a cabo la infección con PPVO (MI =
0,01) en 3,5 litros, n = 40 rpm.
20 h después de la infección se transfirió todo
el cultivo al reactor de 15 litros y se llenó con 7 litros
(dilución 1:2). En el reactor de 15 litros se ajustaron los mismos
parámetros.
49 h después de la infección se diluyó a 11
litros (dilución 1:3 referido a 3,5 l). El CPE ascendía
aproximadamente al 30% referido al número de células en el reactor
de 3,5 litros y teniendo en cuenta la dilución.
69 h después de la infección se aumentó el
volumen a 12,5 litros antes de que finalmente 86 h después de la
infección se aumentara a 13 litros (dilución 1:3,9).
7 días después de la infección se interrumpió la
fermentación mediante sedimentación y posterior filtración con 20
\mum del cultivo (CPE = 93%).
En la Tabla 5 se representa el TCID_{50} en el
momento de la recolección y después de la recolección.
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Para obtener preparados víricos de alta pureza
se usaron cosechas de virus libres de microsoportes. La propagación
de los virus se llevó a cabo por ej. tal como se describe en los
ejemplos 1 a 5. Primero se realizó una microfiltración cuidadosa
con la cosecha de virus. Para este fin puede usarse por ej. un
soporte para cassettes de la empresa Sartorius (Alemania) con un
cassette de membrana de la empresa Sartorius (Alemania). De forma
alternativa pueden usarse también módulos de fibra hueca de la
empresa Minntech (EE.UU.) o de la empresa Pall (EE.UU.). Para la
microfiltración se usan de manera preferente membranas o fibras
huecas con un tamaño de poro de 0,1 \mum. La etapa de
microfiltración sirve para una reducción del volumen de 5 a 20
veces, el acondicionamiento del pH (de manera preferente pH 7,5 a
9,0) y el empobrecimiento de sustancias acompañantes de la
fermentación de bajo peso molecular. El concentrado de virus
obtenido de esta manera se inactivó químicamente con etilenimina a
un pH 8,6. Para la activación de los virus se usó una concentración
de etilenimina de 3 a 20 mM. La inactivación se llevó a cabo en dos
etapas. La mezcla de reacción se incubó primero durante 3 a 6 h a
37ºC con control del pH y a continuación se finalizó la
inactivación de los virus en otro recipiente de reacción a 37ºC
durante la noche. Añadiendo un exceso 1,5 a 3,0 molar de tiosulfato
sódico se neutralizó la suspensión de virus inactivada. A
continuación de la neutralización se llevó a cabo una centrifugación
a bajas revoluciones a 4.000 a 8.000 g durante 2 a 4 h. Este primer
paso de purificación sirvió para separar las partículas víricas de
la solución de inactivación neutralizada. Las partículas víricas
inactivadas se pueden almacenar interinamente después de esta
primera etapa de purificación a 2-8ºC o a <-65ºC
hasta el posterior procesamiento. La segunda etapa de purificación
puede llevarse a cabo por ej. mediante una centrifugación a bajas
revoluciones usando un colchón de sacarosa del 20%. De forma
alternativa se pueden usar también adsorbedores de membrana de la
empresa Sartorius (Alemania) o de la empresa Pall (EE.UU.). La
segunda etapa de centrifugación se realizaría a 4.000 a 8.000 g
durante la noche. El balance del procedimiento de purificación se
llevó a cabo por medio de fraccionamiento
flujo-campo-flujo asimétrico
(análisis AF4) y refractometría, así como microscopía electrónica
cuantificante. En las tablas 6 y 7 se representan los desarrollos
del rendimiento típicos.
Mediante un ensayo de proteína de las células
huésped específico se determinó el contenido de proteína en las
células huésped en etapas del proceso seleccionadas y se usó para la
determinación de los factores de empobrecimiento. En la tabla 8 se
representan los resultados de empobrecimiento típicos.
La prueba de la pureza microbiana se llevó a
cabo con los procedimientos estándar habituales. Pudo demostrarse
que el procedimiento de purificación antes descrito puede llevarse a
cabo en condiciones asépticas.
A continuación de la segunda etapa de
purificación se formuló la preparación vírica de alta pureza usando
microfiltración. Para esta etapa de formulación se pueden usar
membranas de la empresa Sartorius (Alemania) o de la empresa Pall
(EE.UU.), así como fibras huecas de las empresas Minntech (EE.UU.) o
Amersham Biosciences (EE.UU.). El tamaño de poro preferido se
encuentra en 0,1 \mum. El objetivo de esta etapa de formulación
es acondicionar la suspensión de virus en lo que respecta al valor
del pH, la osmolaridad y el contenido de partículas. Tras la
adición de un estabilizador apropiado (1-5% de
poligelina) se puede liofilizar el preparado vírico preparado de
esta manera con fines de almacenamiento a largo plazo. Antes de su
uso como medicamento hay que mezclar el liofilizado según el
volumen de partida con WO (agua para solución inyectable) estéril y
libre de pirógenos. La preparación de virus preparada por medio del
procedimiento descrito anteriormente es adecuada para la aplicación
por vía parenteral.
En la tabla 10 se recopilan resultados típicos
de la caracterización de los preparados víricos formulados antes
de la liofilización.
US 6,455,298
US 6,656,720
US 5,994,134
US 5,719,051
US 6,194,210
US 6,726,907
WO 95/24468
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (5)
1. Procedimiento para la preparación de material
vírico en un cultivo celular con microsoportes, que comprende
- (a)
- una primera fase de cultivo que comprende un aumento del volumen del cultivo celular mediante la adición de medio de cultivo y material de microsoporte, alcanzándose un primer volumen de cultivo celular máximo;
- (b)
- una etapa de infección que tiene lugar después de la mencionada primera fase de cultivo y que comprende la adición de material vírico infeccioso al mencionado cultivo celular con microsoportes;
- (c)
- una segunda fase de cultivo que tiene lugar después de la mencionada etapa de infección y que comprende un aumento adicional del volumen del cultivo celular hasta un segundo volumen de cultivo celular máximo, generándose material vírico durante la segunda fase de cultivo; y
- (d)
- una etapa de recolección para obtener el material vírico a partir del cultivo celular con microsoportes,
caracterizado porque
el mencionado segundo volumen de cultivo máximo
es de dos a siete veces mayor que el mencionado primer volumen de
cultivo máximo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento conforme a la reivindicación 1,
siendo el mencionado segundo volumen de cultivo máximo de tres a
cuatro veces mayor que el mencionado primer volumen de cultivo
máximo.
3. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 o 2 en el que el mencionado aumento del volumen
del cultivo celular se consigue mediante la adición de medio de
cultivo no concentrado.
4. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 3 en el que se usa un medio de cultivo libre
de suero.
5. Procedimiento conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 4 en el que en la etapa de infección se usa una
multiplicidad de infección (MI) de 0,001 a 2.
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