PT1797174E - Processso para a preparação de material vírico - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "PROCESSSO PARA A PREPARAÇÃO DE MATERIAL VÍRICO" O domínio técnico A invenção refere-se a um processo para a preparação de suspensões de vírus. A invenção refere-se, em particular, a um processo para a preparação de suspensões de vírus com um título elevado em culturas celulares. Os processos preferidos incluem um aumento do volume da cultura celular antes da infecção com material vírico e subsequentemente passos adicionais de aumento do volume para um volume final, o qual é acentuadamente maior que o volume máximo de cultura antes da infecção.

Estado da técnica São conhecidos, no estado da técnica, vários processos para a preparação de material vírico. São conhecidos, em particular, processos nos quais o material vírico é preparado a partir de culturas celulares animais. 0 especialista distingue entre linhas celulares que crescem de forma aderente, isto é linhas celulares que crescem, de um modo preferido, sobre superfícies sólidas, e linhas celulares que crescem, de um modo preferido, em suspensão. As linhas celulares que crescem de forma aderente são cultivadas directamente sobre a superfície do recipiente de cultivo utilizado ou crescem sobre partículas sólidas (p. ex., 1 microssuportes) que, por sua vez, podem estar presentes suspensos num meio nutritivo. São conhecidos processos para a preparação de material virico que utilizam linhas celulares que crescem em suspensão, bem como processos que utilizam linhas celulares que crescem de forma aderente. A composição dos meios tem uma grande importância na preparação de suspensões de virus com culturas celulares. Em muitos casos tem de ser adicionado soro bovino fetal (SBV) e factores de crescimento de origem animal ou vegetal. A par das flutuações de carga e de componentes proteicos perturbadores no processamento, a utilização de soros constitui um risco biológico para a segurança (BSE/TSE, micoplasmas, priões etc.). São preferíveis, por conseguinte, meios isentos de soro, se possível sintéticos [MERTEN ET. AL. 1994].

Em particular quando de utilizam células aderentes, p. ex. em culturas com microssuportes, resultam, a par das barreiras técnicas típicas do aumento da escala, tal como, p. ex., a manutenção de um abastecimento suficiente de oxigénio, a remoção do CO2, uma homogeneização suficiente da cultura do fermentador

para um esforço mínimo de corte, também e em particular, problemas na inoculação da escala processual maior seguinte [GLACKEN ET. AL. 1990, J.B. GRIFFITHS ET. AL. 1985, AMERSHAM 2001] . A "migração directa", de suporte para suporte, de células que crescem puramente de forma aderente só se pode efectuar, neste caso, por manipulação do processo, de tal modo que, através da manipulação, as células percam, pelo menos 2 parcialmente, a sua aderência. 0 especialista tem conhecimento de estratégias para a supressão da aderência de células que crescem de forma aderente e as enzimas utilizáveis para o efeito [E. LINDNER ET. AL. 1987, AMERSHAM 2001, DÍ)RRSCHMID ET. AL. 2003] e têm de ser tidas em consideração no desenvolvimento do processo relativamente à separação ou inactivação das enzimas utilizadas. Nos anos 70 e 80 realizaram-se experiências bem sucedidas, em escalas menores, para a migração celular directa a partir das superfícies dos recipientes para microssuportes em frascos cilíndricos, caixas de Petri e frascos em T. O especialista tem conhecimento da migração bem sucedida, de suporte para suporte, de células que crescem de forma aderente somente em reactores de leito fixo, sendo necessário observar, com intuito restritivo, que se trata, neste caso, de linhas celulares que crescem tanto em suspensão como também de forma aderente [AMERSHAM 2001, DÚRRSCHMID ET. AL. 2003] . 0 modo como o processo é conduzido desempenha, em particular, um papel importante. Na literatura estão descritos vários métodos, . tais como, por exemplo, culturas em lotes ou de perfusão. As culturas de perfusão são utilizadas, neste caso, para desacoplar o tempo de permanência da taxa de crescimento específica, para evitar inibições ou limitações a partir do meio de cultura, para aumentar a produtividade, em que estas culturas são frequentemente conduzidas ao longo de vários meses em modo de "cultura celular de elevada densidade" (CCED). Estes sistemas exigem contudo, a par de dispositivos periféricos complicados (separadores, filtros giratórios, retenção celular por ultrassons, etc.), períodos de arranque morosos e complexos [M. REITER ET. AL. 1989, GLACKEN ET. AL. 1990, J.B. GRIFFITHS ET. AL. 1985, AMERSHAM 2001, dOrRSCHMID ET. AL. 2003 A]. 3 0 abastecimento da cultura celular com soluções de substrato altamente concentradas constitui uma possibilidade adicional para o abastecimento suficiente com nutrientes. No modo de CCED, em particular, as inibições resultantes de um abastecimento, por exemplo amónio e/ou lactato, podem conduzir a rendimentos e produtividades mais reduzidos. Para evitar concentrações inibidoras recomenda-se, até à data, sistemas de perfusão ou de diálise.

No domínio da preparação de material vírico por meio de cultura celular animal, em que é necessário ter em consideração as cinéticas acopladas complexas das células e do vírus, podem surgir problemas na condução do processo, em particular quando se utiliza culturas celulares com microssuportes.

Por exemplo, a utilidade de propagar, por perfusão complexa, um vírus que cause um CPE (do inglês, efeito citopático) é questionável, dado que os vírus destroem as células, ou provocam a lise das mesmas, na maioria das vezes, em curtos intervalos (parcialmente em menos de 3 até 7 dias após a infecção).

Na literatura estão descritos processos para a propagação de vírus em lotes, à escala piloto e à de produção (50 até 1000 L). A propagação de vírus em todos os processos em microssuportes descritos efectua-se com densidades celulares relativamente reduzidas. Após a infecção com o vírus a propagar, a infecção decorre até à colheita, por exemplo, no volume final posterior da escala de produção [B. MONTAGNON ET. AL. 1984, B. BAIJOT ET. AL. 1987] . Em alguns casos, estão descritas culturas de perfusão, à escala laboratorial, para vírus que provocam a 4 lise lentamente, ou nao a provocam. Num caso, é descrita uma troca de meio até ao volume original [AMERSHAM 2001].

Os documentos US 6455298-B1 e US 6656720-B2 descrevem um processo para a preparação de material virico da gripe com linhas celulares que crescem em suspensão. O processo divulgado inclui uma primeira fase de cultivo, na qual o material celular é propagado em cultura de suspensão, um passo de infecção e, subsequentemente, uma segunda fase de cultivo, na qual o vírus é produzido. Durante esta fase, a cultura pode ser adicionalmente diluída por adição de meio ou ser conduzida no género de uma cultura de perfusão. É vantajoso neste processo o facto da capacidade do processo não ser limitada pela expansão limitada da superfície interna dos recipientes de cultivo. É desvantajoso contudo o facto de, na cultura de suspensão, não ser possível alcançar densidades celulares tão elevadas como as que são possíveis com métodos para a produção de vírus que se baseiam em microssuportes. Além disso, a separação de material celular a partir do meio nutritivo, no caso das culturas de suspensão, é consideravelmente mais trabalhosa do que no caso de processos que se baseiam em microssuportes. Estas desvantagens são contornadas no processo segundo a presente invenção dado que, para a preparação de material virico, são aqui utilizadas linhas celulares que crescem de forma aderente sobre microssuportes.

Os documentos US 6726907 e WO 95/24468 descrevem processos para a preparação de material virico compreendendo uma primeira fase de cultivo para a propagação do material celular, um passo de infecção e uma segunda fase de cultivo subsequente, na qual é produzido o material virico. Durante a segunda fase de cultivo, ao contrário do processo de acordo com a invenção, não tem lugar qualquer adição adicional de meio de modo que o volume de 5 cultura não é adicionalmente aumentado durante a segunda fase de cultivo. Isto resulta num volume de colheita relativamente reduzido, em que, para além disso, a cultura apresenta ainda um titulo virico reduzido em comparação com o processo de acordo com a invenção.

Os documentos US 5994134, US 5719051 e US 6194210 divulgam processos para a preparação de material virico baseados em microssuportes, os quais incluem igualmente uma primeira fase de cultivo, um passo de infecção e uma segunda fase de cultivo. De modo diferente do processo segundo a presente invenção, esta segunda fase de cultivo não é acompanhada de um aumento do volume de cultura, sendo esta segunda fase de cultivo realizada como cultura de perfusão. Efectua-se um afluxo continuo de meio fresco enquanto se remove um igual volume de corrente de meio de cultura, de modo que, neste caso, o volume de cultura se mantém constante. É vantajoso neste processo, face ao processo descrito acima com linhas celulares suspensas, o facto de, por um lado, ser possível alcançar uma densidade celular maior e de, por outro, ser possível recolher grandes quantidades de meio de cultura contendo vírus ao longo de um período de tempo mais longo. Este processo para a preparação de material virico baseado em microssuportes apresenta contudo a desvantagem de os meios de cultura contendo vírus obtidos neste caso apresentarem um título virico (partículas víricas por unidade de volume) mais reduzido, em comparação com o processo de acordo com a invenção. Isto dificulta o isolamento do material virico e aumenta assim os custos do produto. Além disso, a adução de meio fresco e a simultânea remoção de caldo de cultura contendo vírus representam elevadas exigências à técnica de esterilização e aumentam o risco de contaminações. A utilização de processos para a preparação de material virico com uma segunda fase de 6 cultivo em modo de perfusão não é possível quando o vírus a produzir causa a lise da célula a produzir e deste modo um efeito citopático (CPE).

Isto também é válido para o processo complexo da diálise externa ou interna, na transferência de massa através de membranas semipermeáveis com um limite específico de exclusão de moléculas. Neste caso, o meio depletado tem de ser separado das células antes de ser submetido a diálise, em processo de contracorrente ou de concorrente, com meio fresco através de uma membrana aplicada externamente. É sobretudo problemático o dispêndio instrumental e o aumento da escala, a par do bloqueio da membrana no interior do módulo por destroços celulares, etc.

Breve Descrição da invenção

Atendendo ao estado da técnica descrito acima, é então o objectivo técnico subjacente à presente invenção o de disponibilizar um processo de preparação para material vírico que, num período de tempo relativamente curto, permite produzir grandes quantidades de suspensão de vírus que contém o material vírico em elevada concentração.

Este objectivo técnico é solucionado, de acordo com a invenção, através de um processo para a preparação de material vírico numa cultura celular com microssuportes compreendendo (a) uma primeira fase de cultivo, que compreende uma ampliação do volume da cultura celular por adição de meio e material de microssuporte, em que é alcançado um primeiro volume máximo de cultura celular; (b) um passo de infecção que é efectuado após a referida primeira fase de cultivo e que compreende a adição de 7 material vírico infeccioso à referida cultura celular com microssuportes; (c) uma segunda fase de cultivo que é efectuada após o referido passo de infecção e que compreende uma ampliação adicional do volume da cultura celular para um segundo volume máximo de cultura celular, em que é gerado material virico durante a segunda fase de cultivo; e (d) um passo de colheita para obtenção do material virico a partir da cultura celular com microssuportes, caracterizado por o referido segundo volume máximo de cultura ser duas até sete vezes maior que o referido primeiro volume máximo de cultura. 0 referido segundo volume máximo de cultura celular é, pelo menos, duas vezes maior que o referido primeiro volume máximo de cultura. É particularmente vantajoso, no processo de acordo com a invenção, o facto de o titulo virico do caldo de cultura poder ser acrescentado 10 vezes, face ao processo em lotes, por alimentação de meio após o passo de infecção. É particularmente vantajoso o facto de também ser possivel alcançar este aumento do titulo virico quando não se procede à alimentação com meio concentrado após o passo de infecção, de modo que o volume de cultura durante a segunda fase de cultivo é novamente acentuadamente aumentado. A quantidade absoluta de material vírico produzido pode ser assim novamente consideravelmente aumentada face ao processo de acordo com a invenção com uma alimentação com concentrado.

Formas de realização adicionais da invenção são acessíveis ao especialista pelo estudo dos exemplos e explicações expostos mais abaixo. 8

Figuras

Figura 1: Representação exemplificativa do processo de acordo com a invenção com alterações volumétricas de 10 litros, passando por 50 litros e 200 litros para 800 litros. A infecção efectua-se à escala de 200 litros. (abreviaturas: pre, pré-cultura; inf, infecção; H/DP, colheita/ processamento)

Descrição detalhada da invenção A invenção refere-se a um processo para a preparação de suspensões de vírus. Os processos de acordo com a invenção apresentam, pelo menos, 2 fases de cultivo. Durante a primeira fase de cultivo (antes do passo de infecção) o volume de cultura é aumentado várias vezes ou continuamente. No processo de acordo com a invenção, o volume de cultura também é adicionalmente aumentado, gradualmente ou continuamente, após o passo de infecção, de modo que o volume final a recolher é acentuadamente maior do que o volume máximo de cultura antes da infecção. A invenção refere-se a: 1. Um processo para a preparação de material vírico numa cultura celular com microssuportes, compreendendo (a) uma primeira fase de cultivo que compreende uma ampliação do volume da cultura celular por adição de meio e material de microssuporte, em que é alcançado um primeiro volume máximo de cultura celular; 9 (b) um passo de infecção que é efectuado após a referida primeira fase de cultivo e que compreende a adição de material virico infeccioso à referida cultura celular com microssuportes; (c) uma segunda fase de cultivo que é efectuada após o referido passo de infecção e que compreende uma ampliação adicional do volume da cultura celular para um segundo volume máximo de cultura celular, em que é gerado material virico durante a segunda fase de cultivo; e (d) um passo de colheita para obtenção do material virico a partir da cultura celular com microssuportes, caracterizado por o referido segundo volume máximo de cultura celular ser duas até sete vezes maior que o referido primeiro volume máximo de cultura celular. 2. Um processo de acordo com o ponto 1, em que o referido segundo volume máximo de cultura é três até quatro vezes maior que o referido primeiro volume máximo de cultura. 3. Um processo de acordo um dos pontos 1 até 2, no qual a referida ampliação do volume da cultura celular á alcançada por adição de meio de cultura não concentrado. 4. Um processo de acordo com um dos pontos 1 até 3, no qual é utilizado um meio isento de soro. 5. Um processo de acordo um dos pontos 1 até 4, no qual é aplicada uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,001 até 2 no passo de infecção. 10 0 cerne da invenção é um aumento significativo sequencial ou continuo do volume de produção, de um modo preferido, com meio do mesmo tipo, ou com meio de um tipo semelhante. 0 acréscimo da eficiência em comparação com processos clássicos é descrito subsequentemente no exemplo da propagação do Parapoxvirus ovis.

Exemplos

Exemplo 1

Em primeiro lugar cultivou-se uma linha celular aderente conhecida de rim bovino em culturas estacionárias (placas empilhadas, frascos cilíndricos) ou em cultura celular com microssuportes em lotes. Para o efeito empregou-se uma concentração de microssuportes de 1 até 8 g/L, de um modo preferido 3 até 7 g/L. A inoculação do reactor efectuou-se com 1 até 6xl05 células/mL. Depois de os nutrientes terem sido consumidos, realizou-se uma troca de meio por via de sedimentação dos microssuportes durante esta fase de propagação celular. Após ter sido alcançada a contagem celular máxima de 0,2 até 2xl07 células/mL, de um modo preferido 0,3 até 0,7xl07 células/mL, realizaram-se passos de lavagem por via de múltipla sedimentação e permuta do sobrenadante com meio sem suplementação ou com concentração dos suplementos acentuadamente mais reduzida para reduzir a concentração dos suplementos, tal como, por exemplo, FCS, hormonas de crescimento etc., no caso do cultivo com meios suplementados. Em seguida efectuou-se a infecção com uma multiplicidade de infecção (MOI) entre 0,001 e 2, de um modo preferido entre 0,005 e 0,1. 11 A infecção teve lugar, neste caso, num volume de cultura de 10 até 100% do volume do fermentador. A infecção decorreu sem manipulação adicional no modo de lotes, aproximadamente 3 até 15 dias, de um modo preferido 7 até 11 dias. Quando se alcançou um efeito citopático (CPE) das células infectadas entre 40 e 100%, de um modo preferido 40-90%, efectuou-se a colheita da cultura. A absorção de gás efectua-se, por exemplo, por absorção de gás por membrana, isenta de bolhas e de baixo corte. Ajusta-se a pC>2 entre 15 e 65%, de um modo preferido entre 25 e 55%.

Ajusta-se o valor de pH com hidrogenocarbonato de sódio, hidróxido de sódio e/ou gás CO2 a pH 6,6 até pH 7,6, de um modo preferido pH 6,9 até pH 7,5. A temperatura perfaz entre 32 °C e 37 °C. Os parâmetros ajustados na fase de crescimento celular e na fase de propagação dos virus podem ser diferentes.

Uma optimização adicional do rendimento em virus pode ser alcançada por meio de alimentação com concentrados de meio ou concentrados de substratos individuais durante a fase de propagação de virus. Este género da condução de processo está estabelecido e descrito para diversos sistemas. Contudo, em particular quando se utiliza linhas celulares aderentes para a propagação de virus em culturas com microssuportes, configura-se como extremamente difícil a determinação de taxas de consumo específicas essencialmente necessárias o que está, em parte, correlacionado com os problemas na determinação da contagem celular conhecidos do especialista. Mesmo quando são conhecidas as taxas de consumo individuais para substratos, coloca-se adicionalmente a dúvida quanto a inibições da cultura. Na literatura estão descritas sobretudo limitações por amónio ou lactato. Dado que não existe qualquer valor limiar válido de um 12 modo geral, é necessário determiná-lo especificamente para o sistema biológico utilizado.

Quando se reconhece uma limitação/inibição esta tem de ser contornada para que se possa obter títulos de produto mais elevados. Nos últimos anos empregaram-se, por conseguinte, em particular no domínio das CCED, culturas de perfusão ou de diálise cujas desvantagens para a propagação de um vírus que cause CPE já foram discutidas.

Exemplo 2

Em seguida compara-se o processo em lote alimentado com expansão de volume (AEV) de acordo com a invenção com os processos conhecidos do estado da técnica. 0 aumento de volume sequencial, já mencionado, por via da diluição da cultura com meio fresco após a infecção (por exemplo na escala processual seguinte: 1:2 - 1:7, de um modo preferido 1:3 - 1:5) revelou, neste caso, de modo surpreendente, não a diminuição do título vírico espectável, sendo possível, pelo contrário, aumentar o título, apesar da diluição, em média em 8 até 13 vezes. Isto foi conseguido embora o volume tenha sido aumentado significativamente, num factor de 2 até 7, de um modo preferido, num factor 3 até 4, em comparação com o processo em lote descrito. Isto origina uma melhoria dramática no rendimento em vírus.

Com os processos comparativos descritos e realizados várias vezes, tal como, por exemplo, a diálise, alimentações com concentrados, perfusão e/ou por simples diminuição da contagem 13 celular, nao foi possível alcançar ou aumentar estes rendimentos (Tabela 1) .

Tabela 1: Confronto dos processos conhecidos com o processo em lote alimentado com expansão de volume iniciado, a título de exemplo, no reactor de 3,5 litros. A título de exemplo, estão representados ensaios com tempo de corrida comparável e contagem celular comparável para a propagação do PPVO por meio de uma linha celular de RB aderente. As condições de cultivo foram mencionadas anteriormente na descrição do processo em lotes e também são válidas para os outros processos. Para a diálise utilizou-se um módulo com uma exclusão de peso molecular de 20 kD, em que a pré-cultura foi realizada em modo de perfusão. A diálise realizou-se em processo de contracorrente. Estão representados os valores relativos relativamente à cultura em lotes.

Lote Diálise Lote alimentado [com meio conc.] Lote AEV [com meio não concentrado] TCIDso [relativamente ao lote] 1 10 9 10 Volume final [relativamente ao lote] 1 1 1 4 Produtividade [ relativamente ao lote] 1 10 9 40 14

Adicionalmente aos rendimentos em virus acentuadamente aumentados é também possível reconhecer efeitos positivos resultantes sobretudo no processamento a jusante. Estes tornam-se sobretudo evidentes na redução das impurezas celulares, tal como as proteínas de células hospedeiras, proteínas e ADN por unidade de dose (particularmente importante na aplicação de terapêuticos humanos semelhantes a vacinas), bem como na redução das perdas de rendimento após filtração. Em média, por exemplo com uma filtração de 20 pm, alcança-se uma perda de ~0,6-l log TCID50 no modo de lote. Em comparação, assinala-se somente uma perda de 0,1 -0,4 log TCID50 no lote AEV. A ampliação do volume tem igualmente efeitos positivos sobre as barreiras técnicas, já descritas, do aumento da escala. No caso do abastecimento de oxigénio, por exemplo através do processo de absorção de gás por membrana, de baixo corte e que evita a formação de espuma, é possível alcançar um acréscimo significativo da escala através de um aumento sucessivo de volume por via da diluição (em resultado dos parâmetros físicos dos reactores), dado que, devido à redução da contagem celular por diluição e lise pelos vírus, é necessário introduzir menos oxigénio no sistema. A figura 1 ilustra o processo, a título de exemplo, para uma melhor compreensão, numa escala relevante para a produção. Os passos representados, em particular relativamente à frequência e eficiência da migração directa, quando se transfere a célula RB para a escala de fermentação seguinte foram confirmados experimentalmente. Não se verificaram, nesse caso, quaisquer efeitos sobre a produtividade. A representação exemplificativa tem início com a inoculação do reactor de 10 litros. A condução do processo efectua-se, como descrito anteriormente para o modo em lotes. Quando a 15 confluência é alcançada, efectua-se uma diluição directa de 1:5 para a escala de 50 litros com microssuportes frescos na mesma proporção, ou em proporção comparável, relativamente ao meio, que numa escala de 10 litros. Quando a confluência é novamente alcançada, inocula-se com o mesmo processo o reactor de 200 litros. Uma breve sedimentação com ou sem agitação interna poderá ser vantajosa.

Caso se tenha utilizado meio contendo soro/contendo proteína durante a fase de crescimento, realizam-se passos de lavagem com meio isento de soro e de proteínas para diminuir a concentração dos suplementos. A infecção efectua-se tal como no processo em lotes com a MOI descrita. 10-36 horas após a infecção, inicia-se então o lote AEV. Neste caso, trata-se de uma diluição segura e robusta da suspensão com meio fresco de cultura, em que isto se pode efectuar no mesmo reactor ou em reactores maiores. Isto requer apenas um esforço reduzido. Os 200 litros de suspensão de vírus-célula são aumentados gradualmente, em intervalos de tempo adequados, e/ou continuamente, por exemplo para 400 litros, depois para 600 litros e para finalizar para 800 litros. De modo surpreendente, isto não conduziu a uma deterioração da produtividade de vírus, tal como já descrito e representado na Tabela 1. Não foi possível verificar, neste caso, diferenças entre células cultivadas com soro, com proteínas e em meio sintético. No exemplo das linhas celulares de rim bovino adaptadas a condições isentas de soro e sintéticas não se verificaram quaisquer diferenças relativamente à migração de suporte para suporte, contagem celular e produtividade. Isto é, o processo 16 pode ser empregue para meios de cultura contendo soro, contendo proteínas e sintéticos.

Tabela 2: Comparação exemplificativa do TCID50 da linha celular RB adaptada a condições contendo soro, isentas de soro e sintéticas para a propagação do vírus PPVO com diferentes processos relativamente ao título normalizado (aqui contendo soro)

Contendo soro Contendo proteína Sintético Frasco cilíndrico 1 0,9 1 Cultura em lotes i—1 1-1 1 1 Lote AEV 1 0,9 1,1

As vantagens de acordo com a invenção do "lote alimentado com expansão de volume" descrito, face aos processos estabelecidos e conhecidos podem ser resumidas como em seguida: (1) Trata-se de um processo seguro, robusto e eficiente para a propagação de vírus. (2) Alcançam-se rendimentos mais elevados em vírus. (3) Não requer maior dispêndio instrumental. (3) A condução do processo é comparativamente simples. (4) 0 dispêndio em pessoal para monitorizar o processo é reduzido. (5) A qualidade do produto é melhorada, particularmente em relação aos passos de processamento a jusante. (6) Podem ser usados fermentadores maiores. (7) Simplicidade da escalabilidade. (8) 0 17 processo é adaptável a diferentes meios de cultura contendo soro, isentas de soro, contendo proteínas e sintéticos.

Exemplo 3

Propagação do PPVO no tanque de agitação de 10 litros por meio de cultura celular com microssuportes em modo de lotes, com utilização de um meio contendo proteína.

Cultivou-se a linha celular de rim bovino adaptada a condições isentas de soro, mas contendo proteína, partindo do banco de células, em primeiro lugar em frascos em T e depois em frascos cilíndricos. Efectuou-se o cultivo a 37 °C e um valor de pH de 7,2 + /- 0,2 na incubadora com absorção de gás CO2. Efectuou-se a colheita do material celular por tripsinização. A concentração dos microssuportes Cytodex 3, Amersham, Suécia, preparados segundo as instruções do comerciante perfez 3 g/L. Efectuou-se a inoculação em 10 litros com uma contagem celular de 2xl05 células/mL. Durante a fase de cultivo celular realizou-se uma troca de meio, por meio de sedimentação, a uma concentração de glicose c < 0,5 g/L. Agitou-se o reactor com auxílio de um agitador tipo âncora com 30 rpm. Ajustou-se a p02 a 40% +/- 10%. O valor de pH perfez 7,2 +/- 0,2.

Após 10 dias alcançou-se uma contagem celular de 3,1 xlO6 células/mL, em que as células se encontravam na fase estacionária de crescimento. Após três passos de lavagem com meio sem suplementos efectuou-se a infecção com PPVO (MOI = 0,01) no volume final. 18

Durante a subsequente propagação de vírus não se realizaram quaisquer manipulações. Após 8 dias alcançou-se uma CPE de 90%. Interrompeu-se a fermentação, após a sedimentação, por filtração por 20 pm. Na Tabela 3 está representado o TCID50 no momento da colheita e após a colheita.

Tabela 3: TCID50 na fermentação em lotes descrita a título de exemplo.

Antes da Após a Volume colheita colheita log 10(TCID50) 6,7 +/- 0,3 6,0 +/- 0,3 ~10 L [log 10 (L/mL)]

Exemplo 4:

Propagação do PPVO no tanque de agitação de 3,5 litros por meio de cultura celular com microssuportes no lote alimentado com expansão de volume (transferência para o reactor de 15 litros) utilizando-se um meio contendo proteína.

Cultivou-se a linha celular de rim bovino adaptada a condições isentas de soro, mas contendo proteína, partindo do banco de células, em primeiro lugar em frascos em T e depois em fracos cilíndricos. Efectuou-se o cultivo a 37 °C e um valor de pH de 7,2 +/- 0,2 na incubadora com absorção de gás CO2.

Efectuou-se a colheita do material celular por tripsinização. A concentração dos microssuportes Cytodex 3, Amersham, Suécia, preparados segundo as instruções do comerciante perfez 19 5 g/L. Efectuou-se a inoculação em 3,5 litros com uma contagem celular de 3xl05 1/mL. Durante a fase de cultivo celular realizou-se uma troca de meio, por meio de sedimentação, a uma concentração de glicose c < 0,5 g/L. Agitou-se o reactor com auxilio de um agitador tipo âncora com 45 rpm. Ajustou-se a p02 a 40% +/- 10%. O valor de pH perfez 7,2 + /- 0,2.

Após 10 dias alcançou-se uma contagem celular de 7,lxl06 1/mL, em que as células se encontravam na fase estacionária de crescimento. Após três passos de lavagem com meio sem suplementos, efectuou-se a infecção com PPVO (MOI = 0,01) em 1,7 litros durante 2 h a n = 14 rpm, antes de se preencher até aos 3,5 litros e de se aumentar a rotação do agitador para n = 45 rpm. 16 h após a infecção transferiu-se a totalidade da cultura para o reactor de 15 litros e preencheu-se com 7 litros (diluição de 1:2). Ajustou-se os mesmos parâmetros no reactor de 15 litros. 46 h após a infecção diluiu-se para 10,5 litros (diluição de 1:3 relativamente a 3,5 L) . O CPE perfez aproximadamete 30% relativamente à contagem celular no reactor de 3,5 litros e tendo em consideração a diluição. 70 h após a infecção aumentou-se o volume para 12,5 litros, antes de se elevar, por fim, 94 h após a infecção, para 13,8 litros (diluição de 1:3,9). 7 Dias após a infecção (2,5 dias após a última diluição) interrompeu-se a fermentação por sedimentação e subsequente filtração da cultura por 20 pm (CPE = 93%). 20

Na Tabela 4 está representado o TCID50 no momento da colheita e na colheita.

Tabela 4: TCID50 no lote AEV de acordo com a invenção.

Antes da Após a Volume colheita colheita log 10(TCID50) 7,7 +/- 0,3 7,6 +/- 0,3 14 litros [log 10 (1/mL)]

Exemplo 5:

Propagação do PPVO no tanque de agitação de 3,5 litros por meio de cultura celular com microssuportes no lote alimentado com expansão de volume (transferência para o reactor de 15 litros) utilizando-se um meio isento de proteína e isento de soro.

Cultivou-se a linha celular de rim bovino adaptada a condições sintéticas, partindo do banco de células, em primeiro lugar em frascos em T e depois em fracos cilíndricos. Efectuou-se o cultivo a 37 °C e um valor de pH de 7,2 +/- 0,2 na incubadora com absorção de gás CO2. Efectuou-se a colheita do material celular por tripsinização. A concentração dos microssuportes Cytodex 3, Amersham, Suécia, preparados segundo instruções do comerciante perfez 5 g/L. Efectuou-se a inoculação em 3,5 litros com uma contagem celular de 3,8xl05 1/mL. Durante a fase de cultivo celular realizou-se uma troca de meio, por meio de sedimentação, a uma 21 concentração de glicose c < 0,5 g/L. Agitou-se o reactor com auxílio de um agitador tipo âncora com 45 rpm. Ajustou-se a p02 a 40% + /- 10%. O valor de pH perfez 7,2 +/- 0,2.

Após 13 dias alcançou-se uma contagem celular de 5,6xl06 células/mL, em que as células se encontravam na fase estacionária de crescimento. Após três passos de lavagem com o mesmo meio, efectuou-se a infecção com PPVO (MOI=0,01) em 3,5 litros n=40 rpm. 20 h após a infecção transferiu-se a totalidade da cultura para o reactor de 15 litros e preencheu-se com 7 litros (diluição de 1:2) . Ajustaram-se os mesmos parâmetros no reactor de 15 litros. 49 h após a infecção diluiu-se para os 11 litros (diluição de 1:3 relativamente a 3,5 L) . O CPE perfez aproximadamente 30% relativamente à contagem celular no reactor de 3,5 litros e tendo em consideração a diluição. 69 h após a infecção aumentou-se o volume para 12,5 litros, antes de, para finalizar, se aumentar para 13,5 litros (diluição de 1:3,9), 86 h após a infecção. 7 dias após a infecção interrompeu-se a fermentação por sedimentação e subsequente filtração por 20 pm da cultura (CPE = 93%).

Na Tabela 5 está representado o TCID50 no momento da colheita e após a colheita. 22

Tabela 5: Representação do TCID50 alcançado na fermentação em lote AEV com a linha celular sintética descrita a título de exemplo

Antes da Após a Volume colheita colheita log 10(TCID50) 7,8 +/- 0,3 7,4 +/- 0,3 ~14 L [log 10 (L/mL)]

Exemplo 6

Para a obtenção de preparados de vírus altamente purificados empregou-se colheitas de vírus isentas de microssuportes. A propagação de vírus efectuou-se, p. ex., tal como descrito nos exemplos 1 até 5. Em primeiro lugar, submeteu-se a colheita de vírus a uma microf iltração cuidadosa. Para este efeito pode empregar-se, p. ex., um suporte de cartuchos da firma Sartorius (Alemanha) com um cartucho de membrana da firma Sartorius (Alemanha). Alternativamente também se pode utilizar módulos de fibras ocas da firma Minntech (EUA) ou da firma Pall (EUA). Para a microfiltração utiliza-se, de um modo preferido, membranas ou fibras ocas com uma dimensão de poros de 0,1 pm. A etapa de microfiltração serve para reduzir o volume em 5 até 20 vezes, para condicionar o pH (de um modo preferido pH 7,5 até 9,0) e para o empobrecimento em substâncias concomitantes da fermentação, de baixo peso molecular. Inactivou-se quimicamente o concentrado de vírus obtido deste modo com etilenimino a pH 8,6. Para a inactivação dos vírus empregou-se uma concentração de etilenimino de 3 até 20 mM. Realizou-se a inactivação em duas etapas. Incubou-se, em primeiro lugar, a mistura reaccional durante 3 até 6 h a 37 °C sob controlo de pH e terminou-se 23 subsequentemente a inactivação dos vírus num recipiente reaccional adicional a 37 °C durante a noite. Neutralizou-se a suspensão de vírus inactivada por adição de um excesso molar de 1,5 até 3,0 de tiossulfato de sódio. A seguir à neutralização, efectuou-se uma centrifugação a baixas rotações a 4000 até 8000 g durante 2 até 4 h. Este primeiro passo de purificação serviu para separar as partículas víricas da solução de inactivação neutralizada. As partículas víricas inactivadas podem ser armazenadas temporariamente a 2-8 °C ou a -65 °C, após esta primeira etapa de purificação, até ao processamento adicional. A segunda etapa de purificação pode efectuar-se, p. ex., por centrifugação a baixas rotações utilizando-se uma almofada de sacarose a 20%. Alternativamente também podem ser contudo empregues adsorventes de membrana da firma Sartorius (Alemanha) ou da firma Pall (EUA) . A segunda etapa de centrifugação realizou-se a 4000 até 8000 g durante a noite. O balanço do processo de purificação efectuou-se por meio de fraccionamento assimétrico de fluxo-campo-fluxo (análise AF4) e refractometria, bem como por microscopia electrónica quantificadora. Nas Tabelas 6 e 7 estão representados perfis típicos de rendimento. 24

Tabela 6: Balanço do processo de purificação descrito anteriormente por meio de fraccionamento assimétrico de fluxo-campo-fluxo (análise AF4) e refractometria. N2 do Etapa do processo Amostra Total de Rendimento ensaio partículas cumulativo [%] 508623 3,0/0,8 pm Inicial 5,9E13 100 Filtração de partículas Filtrado 2,5E13 42 Etapa de centrifugação Inicial 2,5E13 1 Sedimento 5,5E12 9 Etapa de centrifugação Inicial 5,5E12 2 Sedimento 3,6E12 6 508624 3,0/0,8 pm Inicial 6,6E13 100 Filtração de partículas Filtrado 2,3E13 35 Etapa de centrifugação Alimentação 2,3E13 1 Sedimento 5,9E12 9 Etapa de centrifugação Alimentação 5,9E12 2 Sedimento 3,6E12 5 508627 3,0/0,8 pm Inicial 3,6E13 100 Filtração de partículas Filtrado 1,5E13 43 Etapa de centrifugação Alimentação 1,55E13 1 Sedimento 3,1E12 8 Etapa de centrifugação Alimentação 3,1E12 2 Sedimento 2,0E12 5 Rendimento 5 médio 25

Tabela 7:

Balanço do processo de purificação descrito anteriormente por meio de microscopia electrónica quantificadora.

Nfi do ensaio Etapa do processo Amostra Total de partículas Rendimento cumulativo [%] 508623 3,0/0,8 pm Inicial 1,55E13 100 Filtração de partículas Filtrado n. d. - Etapa de centrifugação Alimentação n. d. - 1 Sedimento 4,4E12 30 Etapa de centrifugação Alimentação 4,5E12 - 2 Sedimento 4,2E12 29 508624 3,0/0,8 pm Inicial 2,4E13 100 Filtração de partículas Filtrado n. d. - Etapa de centrifugação Alimentação n. d. - 1 Etapa de centrifugação Sedimento Alimentação 4,6E12 4,6E12 19 2 Sedimento 3,2E12 13 508627 3,0/0,8 pm Inicial 7,3E12 100 Filtração de partículas Filtrado n.d. - Etapa de centrifugação Alimentação n.d. - 1 Sedimento 2,3E12 31 Etapa de centrifugação Alimentação 2,3E12 - 2 Sedimento 3,5E12 Rendimento médio 48 13 ~ 48 0 teor em proteína de células hospedeiras foi averiguado em etapas específicas do processo com um ensaio específico para proteínas de células hospedeiras e utilizado para determinar os factores de empobrecimento. Na Tabela 8 estão representados resultados típicos do empobrecimento. 26

Tabela 8: Empobrecimento em proteínas de células hospedeiras no decurso da purificação dos vírus. ΝΩ do ensaio Etapa do processo Amostra Teor de PCH [pg/lElO PVs] Empobrecimento cumulativo em PCH 508623 3,0/0,8 pm Pré-filtração 58 - Filtração de partículas Pós-filtração n. d. - Etapa de centrifugação Alimentação n. d. - 1 Sedimento 3,5 17 Etapa de centrifugação Alimentação 3,5 - 2 Sedimento 3 19 508624 3,0/0,8 pm Pré-filtração 80 - Filtração de partículas Pós-filtração n. d. - Etapa de centrifugação Alimentação n. d. - 1 Etapa de centrifugação Sedimento Alimentação CO CO 17 2 Sedimento 5 16 508627 3,0/0,8 pm Pré-filtração 187 - Filtração de partículas Pós-filtração n. d. - Etapa de centrifugação Alimentação n. d. - 1 Sedimento 14 13 Etapa de centrifugação Alimentação 14 - 2 Sedimento 14 13

Empobrecimento 13-19 médio 27 0 teste quanto à pureza microbiana efectuou-se com os processos padrão habituais. Foi possível demonstrar que o processo de purificação anteriormente descrito pode ser realizado sob condições assépticas.

Tabela 9: Avaliação da pureza microbiana

Nfi do ensaio Etapa do processo Amostra Biocarga [Contagem/mL] 508623 3,0/0,8 μιη Inicial 0/0 Filtração de partículas Filtrado 0/0 Etapa de centrifugação Alimentação - 1 Sedimento 0/0 Etapa de centrifugação Alimentação - 2 Sedimento 0/0 508624 3,0/0,8 pm Inicial 0/0 (02KUR02) Filtração de partículas Filtrado 0/0 Etapa de centrifugação Alimentação - 1 Sedimento 0/0 Etapa de centrifugação Alimentação - 2 Sedimento 0/0 508627 3,0/0,8 pm Inicial 0/0 (02KUR05) Filtração de partículas Filtrado 0/0 Etapa de centrifugação Alimentação - 1 Sedimento 1/0 Etapa de centrifugação Alimentação - 2 Sedimento 0/0 A seguir à segunda etapa de purificação procedeu-se à formulação da preparaçao de vírus altamente purificada utilizando -se microfiltração. Para esta etapa de formulação podem ser empregues membranas da firma Sartorius (Alemanha) ou da firma Pall (EUA) , bem como fibras ocas da firma Minntech 28 (EUA) ou Amersham Biosciences (EUA). A dimensão de poros preferida situa-se a 0,1 pm. A finalidade desta etapa de formulação é a de condicionar a suspensão de vírus relativamente ao valor de pH, osmolalidade e teor em partículas. Após a adição de um estabilizador adequado (1-5 % de poligelina), o preparado de vírus assim preparado pode ser liofilizado para permitir o seu armazenamento a longo prazo. Antes da sua utilização como produto farmacêutico o liofilizado tem de ser misturado com água para injecção esterilizada isenta de pirogénios de acordo com o seu volume de partida. A preparação de vírus preparada por meio do processo descrito anteriormente é adequada para aplicações parentéricas.

Na Tabela 10 estão resumidos resultados típicos da caracterização do preparado de vírus formulado antes da liofilização.

Tabela 10: Análise da suspensão de vírus formulada, antes da liofilização. 508623 508624 508627 1,8E10 2,0E10 1,0E10 4,15E10 3,58E10 2,5E10 Corresponde

Parâmetros

Teor em partículas por meio de AP4/RI [PVs/mL]

Teor em partículas por meio de microscopia electrónica quantificadora [PVs/mL]

Actividade biológica (murganho HBV transgénico) 29 (continuação)

Parâmetros 508623 508624 508627 Biocarga [contagem/mL] 0 0 0 Teo\r em endotoxinas [EU/mL]* 6 6 2,4 Teor em proteína de célula hospedeira [pg/mL] 4,7 - 6,4 8,6 - 9,3 9,9 - 13,3 Teor em ácido nucleico [ng/mL] 3,7 2,9 1,6 *: o estabilizador de virus utilizado já tem um teor médio em endotoxinas de 2 até 8 EU/mL.

PATENTES

Documento US 6455298 Documento US 6656720 Documento US 5994134 Documento US 5719051 Documento US 6194210 Documento US 6726907 Documento WO 95/24468 30

BIBLIOGRAFIA AMERSHAM, "Microcarrier Cell Culture-Principals and Methods", Manual Amersham Pharmacia, Sweden, 2001 B. BAIJOT, M. DUCHENE, J. STEPHENNE, "Production of Aujesky Vaccine by the Microcarrier Technology", Devei. Biol. Standard,. 66, 523-530, 1987 M. p. dOrrschmid, k. landauer, g. simic, h. klug, t. keijzer, f. TRAMPLER, A. OUDSHOORN, M. GRÕSCHL, D. MÚLLER, O. DOLBHOFF-DIER, "Comparison of Fluidized Bed and Ultrasonic Cell Retention Systems for High Cell Density Mammalian Cell Culture", Biotechnol. Prog,. 19, 1045-1048, 2003 Μ. P. DuRRSCHMID, K. LANDAUER, G. SIMIC, G. BLÚML, O. DOLBHOFF-DIER, "Scaleable Inoculation Strategies for Microcarrier Based Animal Cell Bioprocesses", Biotechnol. And Bioeng,. 83, N° 6, 2003 M. W. GLACKEN, R.J. FLEISCHAKER, A.J. SINSKEY, "Large Scale Production of Mammalian Cells and Their Products", em Annail New York Academy of Sciences,355-372, 1989 J. B. GRIFFITHS, D.R. CAMERON, D. LOBBY, "A Comparison of Unit Process Systems for Anchorage Dependet Cells", Devei. Biol. Standard,. 66, 331-338, 1994 E. LINDNER, A.-C. ARVIDSSON, I. WERGELAND, D. BILLIG, "Subpassaging Cells on Microcarriers", Devei. Biol. Standard, 66, 299-305, 1987 31 MERTEN, O.W., KIERULFF J.V., CASTINGOLLES, N., PERRIN, P, "Evaluation of the new serum free médium (MSDSS2) for the production of different biologicals: Use of various cell lines", Cytotechnol. 14, 47-59, 1994 B. J. MONTAGNON, B. FANGET, J.C: VINCENT-FALQUET, "Industrial Scale Production of Inactivated Poliovirus Vaccine Prepared by Culture of Vero Cells on Microcarrier" Rev. Of Inf. Diseases,. 6, suplemento 2, 1984 B. J. MONTAGNON, J.C: VINCENT-FALQUET, B. FANGET, "Thousand Litre Scale Microcarrier Culture of Vero Cells for Killed Polio Viruses Vaccine", Devei. Biol. Standard,. 55, 37-42, 1984 M. REITER, F. WEIGANG, W. ERNST, "High Density Microcarrier Culture with a New Device which Allows Oxygenation and Perfusion of Microcarrier Cultures" Cytotechnology,. 3, 39- 42, 1990

Lisboa, 30 de Abril de 2010 32

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a preparação de material vírico numa cultura celular com microssuportes, compreendendo (a) uma primeira fase de cultivo que compreende uma ampliação do volume da cultura celular por adição de meio e material de microssuporte, em que é alcançado um primeiro volume máximo de cultura celular; (b) um passo de infecção que é efectuado após a referida primeira fase de cultivo e que compreende a adição de material virico infeccioso à referida cultura celular com microssuportes; (c) uma segunda fase de cultivo que é efectuada após o referido passo de infecção e que compreende uma ampliação adicional do volume da cultura celular para um segundo volume máximo de cultura celular, em que é gerado material virico durante a segunda fase de cultivo; e (d) um passo de colheita para obtenção do material virico a partir da cultura celular com microssuportes, caracterizado por o referido segundo volume máximo de cultura ser duas até sete vezes maior que o referido primeiro volume máximo de cultura. 1
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o referido segundo volume máximo de cultura é três até quatro vezes maior que o referido primeiro volume máximo de cultura.
3. 3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, no qual a referida ampliação do volume da cultura celular é alcançada por adição de meio de cultura não concentrado.
4. 4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, no qual é utilizado um meio isento de soro.
5. 5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, no qual é aplicada uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,001 até 2 no passo de infecção. Lisboa, 30 de Abril de 2010 2