CN102000326B - 一种生产人用狂犬疫苗的方法 - Google Patents

一种生产人用狂犬疫苗的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN102000326B
CN102000326B CN 201010559283 CN201010559283A CN102000326B CN 102000326 B CN102000326 B CN 102000326B CN 201010559283 CN201010559283 CN 201010559283 CN 201010559283 A CN201010559283 A CN 201010559283A CN 102000326 B CN102000326 B CN 102000326B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bioreactor
strain
human
cell
microcarrier
Prior art date
Application number
CN 201010559283
Other languages
English (en)
Other versions
CN102000326A (zh
Inventor
蔡勇
杨刚强
Original Assignee
成都康华生物制品有限公司
蔡勇
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 成都康华生物制品有限公司, 蔡勇 filed Critical 成都康华生物制品有限公司
Priority to CN 201010559283 priority Critical patent/CN102000326B/zh
Publication of CN102000326A publication Critical patent/CN102000326A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102000326B publication Critical patent/CN102000326B/zh

Links

Abstract

一种生产人用狂犬疫苗的方法,采用三级或三级以上生物反应器线性放大技术培养人二倍体细胞株;在每一级的生物反应器中的人二倍体细胞株达到106/ml后进行下一级的生物反应器的接种;在最后一级生物反应器中人二倍体细胞在微载体上生长到密度达到106/ml以上后,再将狂犬病毒毒株接种;接种病毒株使得该病毒在细胞上进行增殖,然后收获病毒原液,将收获的病毒原液进行灭活、浓缩、纯化处理过程后,制备成人用狂犬疫苗。由于使用反应器线性放大技术培养人二倍体细胞,该细胞不含外源污染因子和致瘤性,并且该细胞的残余DNA无危险性,具有免疫效果好,安全性高的优点,符合大规模产业化生产狂犬疫苗的要求。

Description

一种生产人用狂犬疫苗的方法
技术领域
[0001 ] 本发明涉及疫苗的生产方法,特别是指一种人用狂犬疫苗的生产方法。
背景技术
[0002] 狂犬病是由狂犬病毒引起的人畜共患的病毒性传染病。人一旦被病畜咬伤致病,病毒率极高。及时注射疫苗和预防性接种疫苗是临床上有效的防治狂犬病的有效手段。
[0003]目前市场上存在的狂犬疫苗品种主要有4种:第一种是鸡胚、鸭胚疫苗,这种疫苗产量较低,生产强度大,有外源毒性因子存在可能性;第二种是地鼠肾细胞原代培养疫苗,同样存在疫苗产量较低,生产强度大,有外源毒性因子存在可能性的问题;第三种是Vero传代细胞生产的疫苗,该品种可以解决产能问题,但不能保证细胞基质的安全性和致瘤性的问题,因此该品种疫苗需保证DNA残余量不能超标;第四种是以二倍体细胞为基质的疫苗,该疫苗由于使用了健康的人二倍体细胞,该细胞不含外源污染因子和致瘤性,并且该细胞的残余DNA无危险性,因而生产出来的疫苗具有免疫效果好,安全性高的优点。
[0004] 狂犬疫苗的产品质量取决于生产用的细胞基质、病毒毒种,产量取决于生产工艺。中国专利公开号为CN1274607A的专利申请,公开了一种使用转瓶工艺生产狂犬疫苗的方法,病毒株为CTN株,该专利由于采用的是转瓶工艺,因而产能较低;中国专利公开号为CN1712068A的专利申请,公开了应用二倍体细胞生产狂犬疫苗的方法,生产工艺为转瓶,病毒株为aG株和CTN株,该专利由于采用的是转瓶工艺,因而产能较低;中国专利公开号为CN101028514A的专利申请,公开了利用生物反应器培养Vero细胞生产狂犬疫苗的方法,病毒株为PV株,该专利由于使用的细胞基质是VeiO细胞,因而存在DNA残余的生物安全性问题,也没有使用生物反应器的线性放大技术;中国专利公开号为CN101716341A的专利申请,公开了利用二倍体细胞生产狂犬疫苗的方法,细胞基质为MRC-5、IMR-90, WI 38、2BS、KMB17,病毒株为PM株。
`[0005] 我国一直以来投入大量人力物力致力于防治狂犬病,也取得了一定的成效。然而狂犬疫苗生产技术发展到现在,仍然存在产能过低,疫苗质量不高的问题。
发明内容
[0006] 本发明目的在于提供一种生物反应器线性放大技术利用健康人二倍体细胞生产狂犬疫苗进行规模化生产的新方法。:
[0007] 本发明的方法采用三级或三级以上生物反应器线性放大技术培养人二倍体细胞株,在每一级的生物反应器中的人二倍体细胞株达到107ml后进行下一级的生物反应器的接种;在最后一级生物反应器中人二倍体细胞在微载体上生长到密度达到107ml以上后,再将狂犬病毒毒株接种;接种病毒株使得该病毒在细胞上进行增殖,然后收获病毒原液,将收获的病毒原液进行灭活、浓缩、纯化处理过程后,制备成人用狂犬疫苗。
[0008] 本发明的可以米用的狂犬病毒毒株为PV病毒株、AG病毒株、CTN病毒株、ERA中的任——种;所用的健康人二倍体细胞株为MRC-5、MRC-9、HFL1、MR-90、WI38、2BS、KMB17、CCC-HPF-1P5的任——种。
[0009] 作为本发明的改进,本方法亦可采用狂犬病毒毒株为PM病毒株;所用的健康人二倍体细胞株为MRC-9、HFL1、CCC-HPF-1P5的任——种。
[0010] 作为本发明的改进,本方法亦可采用的狂犬病毒毒株为Flury病毒株;所用的健康人二倍体细胞株为LYSSAVAC细胞株。
[0011] 在本发明的生产方法中,生物反应器进行线性放大的方式是将前一级生物反应器中的细胞通过洗脱后经管道抽取流动的方式接种到下一级生物反应器中。
[0012] 在本发明的生产方法中,所用的细胞培养生物反应器为搅拌式生物反应器。生物反应器中的微载体为颗粒状微球微载体或者多孔性微载体。
具体实施方式
[0013] 第一实施方式
[0014] (I)、复苏人二倍体细胞(W1-38),接种到方瓶中;
[0015] (2)、待细胞长满方瓶后,按1:3的比例放大传代;
[0016] (3)、待细胞生长到一定数量时,接种到7.5L生物反应器中;生物反应器的工作体积5L,配有2-20g/L微载体;
[0017] (4)、待7.5L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时,将细胞接种到50L生物反应器中;生物反应器的工作体积35L,配有2-20g/L微载体;
[0018] (5)、待50L生物反·应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时,接种到500L生物反应器中;生物反应器的工作体积350L,配有2-20g/L微载体;
[0019] (6)、待500L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时,接种PV病毒株毒种;
[0020] (7)、每天收获上清液300L,同时取样检测滴度;
[0021] (8)、连续收获20-25天病毒原液;
[0022] (9 )、将病毒原液经过过滤、浓缩、纯化后,制成狂犬疫苗。
[0023] 第二实施方式
[0024] (I)、复苏人二倍体细胞(2BS),接种到方瓶中;
[0025] (2)、待细胞长满方瓶后,按1:3的比例放大传代;
[0026] (3)、待细胞细胞密度达到106/ml以上,将细胞接种到14L生物反应器中;生物反应器的工作体积10L,配有2-20g/L微载体;
[0027] (4)、待14L生物反应器内的微载体长满细胞,即细胞密度达到106/ml以上时,将细胞接种到100L生物反应器中;生物反应器的工作体积70L,配有2-20g/L微载体;
[0028] (5)、待100L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时,将细胞接种到1000L生物反应器中;生物反应器的工作体积700L,配有2-20g/L微载体;
[0029] (6)、待1000L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时,接种PV病毒株毒种;
[0030] (7)、每天收获上清液650L,同时取样检测滴度;
[0031] (8)、连续收获20-25天病毒原液;
[0032] (9 )、将病毒原液经过过滤、浓缩、纯化后,制成狂犬疫苗。[0033] 第三实施方式
[0034] (I)、复苏人二倍体细胞(2BS),接种到方瓶中;
[0035] (2)、待细胞长满方瓶后,按1:3的比例放大传代;
[0036] (3)、待细胞生长到一定数量时,将细胞接种到14L生物反应器中;生物反应器的工作体积10L,配有2-20g/L微载体;
[0037] (4)、待14L生物反应器内的微载体长满细胞时即细胞密度达到106/ml以上时,将细胞接种到100L生物反应器中;生物反应器的工作体积70L,配有2-20g/L微载体;
[0038] (5)、待100L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时,将细胞接种到1000L生物反应器中;生物反应器的工作体积700L,配有2-20g/L微载体;
[0039] (6)、待1000L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时,接种CTN病毒株毒种;
[0040] (7)、每天收获上清液650L,同时取样检测滴度;
[0041] (8)、连续收获20-25天病毒原液;
[0042] (9 )、将病毒原液经过过滤、浓缩、纯化后,制成狂犬疫苗。
[0043] 第四实施方式
[0044] (I)、复苏人二倍体细胞(MRC-9),接种到方瓶中;
[0045] (2)、待细胞长满方瓶后,按1:3的比例放大传代;
[0046] (3)、待细胞生长到一定数量时,将细胞接种到14L生物反应器中;生物反应器的工作体积10L,配有2_20g/L微载体;
[0047] (4)、待14L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时,将细胞接种到100L生物反应器中;生物反应器的工作体积70L,配有2-20g/L微载体;;
[0048] (5)、待100L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时,将细胞接种到1000L生物反应器中;生物反应器的工作体积700L,配有2-20g/L微载体;
[0049] (6)、待1000L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时,接种PM病毒株毒种;
[0050] (7)、每天收获上清液650L,同时取样检测滴度;
[0051] (8)、连续收获20-25天病毒原液;
[0052] (9 )、将病毒原液经过过滤、浓缩、纯化后,制成狂犬疫苗。
[0053] 第五实施方式
[0054] (I)、复苏人二倍体细胞(MRC-5),接种到方瓶中;
[0055] (2)、待细胞长满方瓶后,按1:3的比例放大传代;
[0056] (3)、待细胞生长到一定数量时,将细胞接种到即细胞密度达到106/ml以上时,将细胞接种到3L生物反应器中;生物反应器的工作体积2L,配有2-20g/L微载体;
[0057] (4)、待3L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时,将细胞接种到30L生物反应器中;生物反应器的工作体积20L,配有2-20g/L微载体;
[0058] (5)、待30L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时,将细胞接种到300L生物反应器中;生物反应器的工作体积200L,配有2-20g/L微载体;
[0059] (6)、待300L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时,接种PV病毒株毒种;[0060] (7)、每天收获上清液180L,同时取样检测滴度;
[0061] (8)、连续收获20-25天病毒原液;
[0062] ( 9 )、将病毒原液经过过滤、浓缩、纯化后,制成狂犬疫苗。
[0063] 第六实施方式
[0064] (I)、复苏人二倍体细胞(2BS),接种到方瓶中;
[0065] (2)、待细胞长满方瓶后,按1:3的比例放大传代;
[0066] (3)、待细胞生长到细胞密度达到106/ml以上时,将细胞接种到3L生物反应器中;生物反应器的工作体积2L,配有2-20g/L微载体;
[0067] (4)、待3L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时,将细胞接种到30L生物反应器中;生物反应器的工作体积20L,配有2-20g/L微载体;
[0068] (5)、待30L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时,将细胞接种到300L生物反应器中;生物反应器的工作体积200L,配有2-20g/L微载体;
[0069] (6)、待300L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时,接种ERA病毒株毒种;
[0070] (7)、每天收获上清液180L,同时取样检测滴度;
[0071] (8)、连续收获20-25天病毒原液;
[0072] ( 9 )、将病毒原液经过过滤`、浓缩、纯化后,制成狂犬疫苗。

Claims (4)

1.一种生产人用狂犬疫苗的方法,其特征在于:采用三级或三级以上生物反应器线性方法技术培养人二倍体细胞株;在每一级的生物反应器中的人二倍体细胞株达到IOfVml后进行下一级的生物反应器的接种;在最后一级生物反应器中人二倍体细胞在微载体上生长到密度达到106/ml以上后,再将狂犬病毒毒株接种;接种病毒株使得该病毒在细胞上进行增殖,然后收获病毒原液,将收获的病毒原液进行灭活、浓缩、纯化处理过程后,制备成人用狂犬疫苗; 所用的狂犬病毒毒株为PV病毒株、AG病毒株、CTN病毒株、ERA病毒株中的任意一种; 所用的健康人二倍体细胞株为 MRC-5、MRC-9、HFLU IMR-90, WI38、2BS、KMB17、CCC-HPF-1P5中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的生产人用狂犬疫苗的方法,其特征在于,生物反应器进行线性放大的方式是将前一级生物反应器中的细胞通过洗脱后经管道抽取流动的方式接种到下一级生物反应器中。
3.根据权利要求1所述的生产人用狂犬疫苗的方法,其特征在于,所用的细胞培养生物反应器为通用搅拌式生物反应器。
4.根据权利要求1所述的生产人用狂犬疫苗的方法,其特征在于,生物反应器中的微载体为颗粒状微球微载体 或者多孔性微载体。
CN 201010559283 2010-11-25 2010-11-25 一种生产人用狂犬疫苗的方法 CN102000326B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201010559283 CN102000326B (zh) 2010-11-25 2010-11-25 一种生产人用狂犬疫苗的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201010559283 CN102000326B (zh) 2010-11-25 2010-11-25 一种生产人用狂犬疫苗的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102000326A CN102000326A (zh) 2011-04-06
CN102000326B true CN102000326B (zh) 2013-10-16

Family

ID=43808196

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 201010559283 CN102000326B (zh) 2010-11-25 2010-11-25 一种生产人用狂犬疫苗的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102000326B (zh)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102552899A (zh) * 2012-03-07 2012-07-11 长春百克生物科技股份公司 应用生物反应器灌流培养制备狂犬疫苗的方法
CN102671194B (zh) * 2012-05-07 2013-08-14 成都康华生物制品有限公司 一种人用预防狂犬病和破伤风的疫苗
CN103083654A (zh) * 2012-08-27 2013-05-08 万里明 Celligen310生物反应器制备人二倍体细胞狂犬病疫苗工艺
CN103060276B (zh) * 2013-01-10 2014-12-03 北京民海生物科技有限公司 人二倍体细胞狂犬病疫苗病毒液制备方法
CN103397000B (zh) * 2013-07-11 2016-01-06 北京天坛生物制品股份有限公司 狂犬病病毒人二倍体细胞适应株及其制备方法与应用
CN104357406A (zh) * 2014-09-30 2015-02-18 施耐克江苏生物制药有限公司 狂犬病毒snk-ctn株及其应用
CN104353068A (zh) * 2014-11-18 2015-02-18 成都康华生物制品有限公司 一种利用人二倍体细胞大规模生产狂犬疫苗的方法
CN105288608A (zh) * 2015-10-19 2016-02-03 成都天邦生物制品有限公司 猪圆环病毒2型灭活疫苗连续收毒悬浮培养生产方法
CN108384748A (zh) * 2018-03-14 2018-08-10 广州齐志生物工程设备有限公司 一种自动化培养二倍体细胞的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1147833A (zh) * 1994-03-08 1997-04-16 麦克公司 甲型肝炎病毒培养工艺
CN101044237A (zh) * 2004-10-09 2007-09-26 爱库里斯股份有限两合公司 制备病毒材料的方法
CN101716341A (zh) * 2009-12-14 2010-06-02 成都康华生物制品有限公司 一种人用二倍体细胞狂犬灭活疫苗及其制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1147833A (zh) * 1994-03-08 1997-04-16 麦克公司 甲型肝炎病毒培养工艺
CN101044237A (zh) * 2004-10-09 2007-09-26 爱库里斯股份有限两合公司 制备病毒材料的方法
CN101716341A (zh) * 2009-12-14 2010-06-02 成都康华生物制品有限公司 一种人用二倍体细胞狂犬灭活疫苗及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Jason O. Veleza et al.Microcarrier culture of COS-1 cells producing Japanese encephalitis and dengue virus serotype 4 recombinant virus-like particles.《Journal of Virological Methods》.2008,第151卷(第2期), *
用多孔微载体大规模培养rCHO细胞;胡显文 等;《生物工程学报》;19980731;第14卷(第3期);第348-351页 *
胡显文 等.用多孔微载体大规模培养rCHO细胞.《生物工程学报》.1998,第14卷(第3期),
许刚 等.VERO细胞生物反应器放大培养初探.《生物技术》.2010,第20卷(第2期), *

Also Published As

Publication number Publication date
CN102000326A (zh) 2011-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Westermeier et al. A new approach to kelp mariculture in Chile: production of free‐floating sporophyte seedlings from gametophyte cultures of Lessonia trabeculata and Macrocystis pyrifera
Polatnick et al. Production and purification of milligram amounts of foot-and-mouth disease virus from baby hamster kidney cell cultures
CN102093987B (zh) 微生物发酵生产低温植酸酶的方法
CN103053425B (zh) 一种铁皮石斛茎段组培快速繁殖方法
CN103087919B (zh) 连续培养与原位自絮凝采收微藻的方法及装置
CN101100657B (zh) 大规模生产病毒抗原的方法
CN102119655B (zh) 铁皮石斛自然光快繁育苗方法
US9416347B2 (en) Method of treating bacterial contamination in a microalgae culture with pH shock
MX2009002741A (es) MDCK CELL LINES THAT SUPPORT VIRAL GROWTH FOR HIGH TITLES AND BIREACTOR PROCESS USING THE SAME.
AR077314A1 (es) PRODUCTION OF ELEVATED POLIOVIRUS TITLES FOR THE PRODUCTION OF VACCINES
KR20130073930A (ko) 순환식 수경재배 시스템을 이용한 순환식 수경재배 방법
CN103060220B (zh) 一种高效猪肺炎支原体培养基及其制备方法
CN102816732B (zh) 适应全悬浮无血清培养的mdck细胞系及其在培养流感病毒、生产流感病毒疫苗中的应用
CN1216147C (zh) 一种微藻养殖设备
CN103120126B (zh) 利用间歇浸没生物反应器进行金线莲组织培养扩繁方法
CN102260649B (zh) 传染性法氏囊病毒及用鸡胚细胞系和生物反应器繁殖法氏囊病毒制备灭活疫苗和联苗的方法
CN203563477U (zh) 一种封闭式管道基质栽培装置
NZ596595A (en) Method for orthopoxvirus production and purification
CN102936569B (zh) 盐藻培养基、半连续培养方式及藻液中原生动物杀灭方法
CN104826101B (zh) 冻干人用狂犬病疫苗及其制备方法
CN105028992B (zh) 一种生物活性钙及其制备方法和应用
CN102440147A (zh) 还原法食用菌液体菌种生产工艺
CN103773687B (zh) 一种微藻的培养方法
CN101352570B (zh) 二倍体细胞狂犬疫苗及纯化狂犬疫苗的制备方法
CN102988972B (zh) 一种运用激流式生物反应器生产猪细小病毒灭活疫苗的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Cai Yong

Inventor after: Yang Gangqiang

Inventor before: Wu Huolian

Inventor before: Yin Shunyi

Inventor before: Ren Zhenghua

TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20111201

Address after: 610100 No. 182, Beijing Road, Longquan economic and Technological Development Zone, Chengdu, Sichuan

Applicant after: Chengdu Kanghua Biological Products Co., Ltd.

Co-applicant after: Cai Yong

Address before: 510800 Guangdong city in Guangzhou Province, Xinhua Street, Huadu District days Road No. 88 room 512

Applicant before: Guangzhou Qizhi Biology Engineering Equipment Co., Ltd.

COR Change of bibliographic data

Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 510800 GUANGZHOU, GUANGDONG PROVINCE TO: 610100 CHENGDU, SICHUAN PROVINCE

Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: WU HUOLIAN YIN SHUNYI REN ZHENGHUA TO: CAI YONG YANG GANGQIANG

ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: CHENGDU KANGHUA BIOLOGICAL PRODUCTS CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: GUANGZHOU QIZHI BIOLOGICAL ENGINEERING EQUIPMENT CO., LTD.

Effective date: 20111201

Owner name: CAI YONG

Effective date: 20111201

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
C53 Correction of patent for invention or patent application
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: 610100 Beijing Road, Longquan economic and Technological Development Zone, Chengdu, Sichuan, 182

Co-patentee after: Cai Yong

Patentee after: Chengdu Hong Wah biological products Limited by Share Ltd

Address before: 610100 Beijing Road, Longquan economic and Technological Development Zone, Chengdu, Sichuan, 182

Co-patentee before: Cai Yong

Patentee before: Chengdu Kanghua Biological Products Co., Ltd.