CN102000326B - 一种生产人用狂犬疫苗的方法 - Google Patents
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Abstract
一种生产人用狂犬疫苗的方法，采用三级或三级以上生物反应器线性放大技术培养人二倍体细胞株；在每一级的生物反应器中的人二倍体细胞株达到106/ml后进行下一级的生物反应器的接种；在最后一级生物反应器中人二倍体细胞在微载体上生长到密度达到106/ml以上后，再将狂犬病毒毒株接种；接种病毒株使得该病毒在细胞上进行增殖，然后收获病毒原液，将收获的病毒原液进行灭活、浓缩、纯化处理过程后，制备成人用狂犬疫苗。由于使用反应器线性放大技术培养人二倍体细胞，该细胞不含外源污染因子和致瘤性，并且该细胞的残余DNA无危险性，具有免疫效果好，安全性高的优点，符合大规模产业化生产狂犬疫苗的要求。
Description
技术领域
本发明涉及疫苗的生产方法，特别是指一种人用狂犬疫苗的生产方法。
背景技术
狂犬病是由狂犬病毒引起的人畜共患的病毒性传染病。人一旦被病畜咬伤致病，病毒率极高。及时注射疫苗和预防性接种疫苗是临床上有效的防治狂犬病的有效手段。
目前市场上存在的狂犬疫苗品种主要有4种：第一种是鸡胚、鸭胚疫苗，这种疫苗产量较低，生产强度大，有外源毒性因子存在可能性；第二种是地鼠肾细胞原代培养疫苗，同样存在疫苗产量较低，生产强度大，有外源毒性因子存在可能性的问题；第三种是Vero传代细胞生产的疫苗，该品种可以解决产能问题，但不能保证细胞基质的安全性和致瘤性的问题，因此该品种疫苗需保证DNA残余量不能超标；第四种是以二倍体细胞为基质的疫苗，该疫苗由于使用了健康的人二倍体细胞，该细胞不含外源污染因子和致瘤性，并且该细胞的残余DNA无危险性，因而生产出来的疫苗具有免疫效果好，安全性高的优点。
狂犬疫苗的产品质量取决于生产用的细胞基质、病毒毒种，产量取决于生产工艺。中国专利公开号为CN1274607A的专利申请，公开了一种使用转瓶工艺生产狂犬疫苗的方法，病毒株为CTN株，该专利由于采用的是转瓶工艺，因而产能较低；中国专利公开号为CN1712068A的专利申请，公开了应用二倍体细胞生产狂犬疫苗的方法，生产工艺为转瓶，病毒株为aG株和CTN株，该专利由于采用的是转瓶工艺，因而产能较低；中国专利公开号为CN101028514A的专利申请，公开了利用生物反应器培养Vero细胞生产狂犬疫苗的方法，病毒株为PV株，该专利由于使用的细胞基质是Vero细胞，因而存在DNA残余的生物安全性问题，也没有使用生物反应器的线性放大技术；中国专利公开号为CN101716341A的专利申请，公开了利用二倍体细胞生产狂犬疫苗的方法，细胞基质为MRC-5、IMR-90、WI 38、2BS、KMB17，病毒株为PM株。
我国一直以来投入大量人力物力致力于防治狂犬病，也取得了一定的成效。然而狂犬疫苗生产技术发展到现在，仍然存在产能过低，疫苗质量不高的问题。
发明内容
本发明目的在于提供一种生物反应器线性放大技术利用健康人二倍体细胞生产狂犬疫苗进行规模化生产的新方法。：
本发明的方法采用三级或三级以上生物反应器线性放大技术培养人二倍体细胞株，在每一级的生物反应器中的人二倍体细胞株达到106/ml后进行下一级的生物反应器的接种；在最后一级生物反应器中人二倍体细胞在微载体上生长到密度达到106/ml以上后，再将狂犬病毒毒株接种；接种病毒株使得该病毒在细胞上进行增殖，然后收获病毒原液，将收获的病毒原液进行灭活、浓缩、纯化处理过程后，制备成人用狂犬疫苗。
本发明的可以采用的狂犬病毒毒株为PV病毒株、AG病毒株、CTN病毒株、ERA中的任一一种；所用的健康人二倍体细胞株为MRC-5、MRC-9、HFL1、IMR-90、WI38、2BS、KMB17、CCC-HPF-1P5的任一一种。
作为本发明的改进，本方法亦可采用狂犬病毒毒株为PM病毒株；所用的健康人二倍体细胞株为MRC-9、HFL1、CCC-HPF-1P5的任一一种。
作为本发明的改进，本方法亦可采用的狂犬病毒毒株为Flury病毒株；所用的健康人二倍体细胞株为LYSSAVAC细胞株。
在本发明的生产方法中，生物反应器进行线性放大的方式是将前一级生物反应器中的细胞通过洗脱后经管道抽取流动的方式接种到下一级生物反应器中。
在本发明的生产方法中，所用的细胞培养生物反应器为搅拌式生物反应器。生物反应器中的微载体为颗粒状微球微载体或者多孔性微载体。
具体实施方式
第一实施方式
（1）、复苏人二倍体细胞（WI-38），接种到方瓶中；
（2）、待细胞长满方瓶后，按1:3的比例放大传代；
（3）、待细胞生长到一定数量时，接种到7.5L生物反应器中；生物反应器的工作体积5L，配有2-20g/L微载体；
（4）、待7.5L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，将细胞接种到50L生物反应器中；生物反应器的工作体积35L，配有2-20g/L微载体；
（5）、待50L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，接种到500L生物反应器中；生物反应器的工作体积350L，配有2-20g/L微载体；
（6）、待500L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，接种PV病毒株毒种；
（7）、每天收获上清液300L，同时取样检测滴度；
（8）、连续收获20-25天病毒原液；
（9）、将病毒原液经过过滤、浓缩、纯化后，制成狂犬疫苗。
第二实施方式
（1）、复苏人二倍体细胞（2BS），接种到方瓶中；
（2）、待细胞长满方瓶后，按1:3的比例放大传代；
（3）、待细胞细胞密度达到106/ml以上，将细胞接种到14L生物反应器中；生物反应器的工作体积10L，配有2-20g/L微载体；
（4）、待14L生物反应器内的微载体长满细胞，即细胞密度达到106/ml以上时，将细胞接种到100L生物反应器中；生物反应器的工作体积70L，配有2-20g/L微载体；
（5）、待100L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，将细胞接种到1000L生物反应器中；生物反应器的工作体积700L，配有2-20g/L微载体；
（6）、待1000L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，接种PV病毒株毒种；
（7）、每天收获上清液650L，同时取样检测滴度；
（8）、连续收获20-25天病毒原液；
（9）、将病毒原液经过过滤、浓缩、纯化后，制成狂犬疫苗。
第三实施方式
（1）、复苏人二倍体细胞（2BS），接种到方瓶中；
（2）、待细胞长满方瓶后，按1:3的比例放大传代；
（3）、待细胞生长到一定数量时，将细胞接种到14L生物反应器中；生物反应器的工作体积10L，配有2-20g/L微载体；
（4）、待14L生物反应器内的微载体长满细胞时即细胞密度达到106/ml以上时，将细胞接种到100L生物反应器中；生物反应器的工作体积70L，配有2-20g/L微载体；
（5）、待100L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，将细胞接种到1000L生物反应器中；生物反应器的工作体积700L，配有2-20g/L微载体；
（6）、待1000L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，接种CTN病毒株毒种；
（7）、每天收获上清液650L，同时取样检测滴度；
（8）、连续收获20-25天病毒原液；
（9）、将病毒原液经过过滤、浓缩、纯化后，制成狂犬疫苗。
第四实施方式
（1）、复苏人二倍体细胞（MRC-9），接种到方瓶中；
（2）、待细胞长满方瓶后，按1:3的比例放大传代；
（3）、待细胞生长到一定数量时，将细胞接种到14L生物反应器中；生物反应器的工作体积10L，配有2-20g/L微载体；
（4）、待14L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，将细胞接种到100L生物反应器中；生物反应器的工作体积70L，配有2-20g/L微载体；；
（5）、待100L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，将细胞接种到1000L生物反应器中；生物反应器的工作体积700L，配有2-20g/L微载体；
（6）、待1000L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，接种PM病毒株毒种；
（7）、每天收获上清液650L，同时取样检测滴度；
（8）、连续收获20-25天病毒原液；
（9）、将病毒原液经过过滤、浓缩、纯化后，制成狂犬疫苗。
第五实施方式
（1）、复苏人二倍体细胞（MRC-5），接种到方瓶中；
（2）、待细胞长满方瓶后，按1:3的比例放大传代；
（3）、待细胞生长到一定数量时，将细胞接种到即细胞密度达到106/ml以上时，将细胞接种到3L生物反应器中；生物反应器的工作体积2L，配有2-20g/L微载体；
（4）、待3L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，将细胞接种到30L生物反应器中；生物反应器的工作体积20L，配有2-20g/L微载体；
（5）、待30L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，将细胞接种到300L生物反应器中；生物反应器的工作体积200L，配有2-20g/L微载体；
（6）、待300L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，接种PV病毒株毒种；
（7）、每天收获上清液180L，同时取样检测滴度；
（8）、连续收获20-25天病毒原液；
（9）、将病毒原液经过过滤、浓缩、纯化后，制成狂犬疫苗。
第六实施方式
（1）、复苏人二倍体细胞（2BS），接种到方瓶中；
（2）、待细胞长满方瓶后，按1:3的比例放大传代；
（3）、待细胞生长到细胞密度达到106/ml以上时，将细胞接种到3L生物反应器中；生物反应器的工作体积2L，配有2-20g/L微载体；
（4）、待3L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，将细胞接种到30L生物反应器中；生物反应器的工作体积20L，配有2-20g/L微载体；
（5）、待30L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，将细胞接种到300L生物反应器中；生物反应器的工作体积200L，配有2-20g/L微载体；
（6）、待300L生物反应器内的微载体长满细胞即细胞密度达到106/ml以上时，接种ERA病毒株毒种；
（7）、每天收获上清液180L，同时取样检测滴度；
（8）、连续收获20-25天病毒原液；
（9）、将病毒原液经过过滤、浓缩、纯化后，制成狂犬疫苗。
Claims (4)
1.一种生产人用狂犬疫苗的方法，其特征在于：采用三级或三级以上生物反应器线性方法技术培养人二倍体细胞株；在每一级的生物反应器中的人二倍体细胞株达到106/ml后进行下一级的生物反应器的接种；在最后一级生物反应器中人二倍体细胞在微载体上生长到密度达到106/ml以上后，再将狂犬病毒毒株接种；接种病毒株使得该病毒在细胞上进行增殖，然后收获病毒原液，将收获的病毒原液进行灭活、浓缩、纯化处理过程后，制备成人用狂犬疫苗；
所用的狂犬病毒毒株为PV病毒株、AG病毒株、CTN病毒株、ERA病毒株中的任意一种；
所用的健康人二倍体细胞株为MRC-5、MRC-9、HFL1、IMR-90、WI38、2BS、KMB17、CCC-HPF-1P5中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的生产人用狂犬疫苗的方法，其特征在于，生物反应器进行线性放大的方式是将前一级生物反应器中的细胞通过洗脱后经管道抽取流动的方式接种到下一级生物反应器中。
3.根据权利要求1所述的生产人用狂犬疫苗的方法，其特征在于，所用的细胞培养生物反应器为通用搅拌式生物反应器。
4.根据权利要求1所述的生产人用狂犬疫苗的方法，其特征在于，生物反应器中的微载体为颗粒状微球微载体或者多孔性微载体。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: CHENGDU KANGHUA BIOLOGICAL PRODUCTS CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: GUANGZHOU QIZHI BIOLOGICAL ENGINEERING EQUIPMENT CO., LTD. Effective date: 20111201 Owner name: CAI YONG Effective date: 20111201 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| C53 | Correction of patent for invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Cai Yong Inventor after: Yang Gangqiang Inventor before: Wu Huolian Inventor before: Yin Shunyi Inventor before: Ren Zhenghua |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 510800 GUANGZHOU, GUANGDONG PROVINCE TO: 610100 CHENGDU, SICHUAN PROVINCE Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: WU HUOLIAN YIN SHUNYI REN ZHENGHUA TO: CAI YONG YANG GANGQIANG |
|
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20111201 Address after: 610100 No. 182, Beijing Road, Longquan economic and Technological Development Zone, Chengdu, Sichuan Applicant after: Chengdu Kanghua Biological Products Co., Ltd. Co-applicant after: Cai Yong Address before: 510800 Guangdong city in Guangzhou Province, Xinhua Street, Huadu District days Road No. 88 room 512 Applicant before: Guangzhou Qizhi Biology Engineering Equipment Co., Ltd. |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 610100 Beijing Road, Longquan economic and Technological Development Zone, Chengdu, Sichuan, 182 Co-patentee after: Cai Yong Patentee after: Chengdu Hong Wah biological products Limited by Share Ltd Address before: 610100 Beijing Road, Longquan economic and Technological Development Zone, Chengdu, Sichuan, 182 Co-patentee before: Cai Yong Patentee before: Chengdu Kanghua Biological Products Co., Ltd. |