CN1482239A - 用于生产慢病毒载体的人重组单纯疱疹病毒 - Google Patents
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Abstract
本发明描述的是一种重组人1型单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus Type,HSV1)“重组HSV1-Lenti-helper病毒”,它的基因组中插入了慢病毒载体包装所需的各种反式蛋白的表达盒(gag,pol,VSV-G,Rev等)。用该重组HSV病毒感染载体细胞株,能高水品表达gag,pol,VSV-G,Rev等蛋白,从而将载体细胞株染色体中以provirus形式存在的慢病毒载体基因组拯救出来,包装出慢病毒载体。用亲和层析、离子吸附层析或超离等方法,可以将慢病毒载体与HSV分离,达到纯化的目的。本方法的特点是用病毒感染的方式代替质粒转染方式生产慢病毒载体,载体滴度高,成本低,有利于大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于生物技术发明领域。具体涉及一组主要用于制备慢病毒载体的重组人1型单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus type 1,HSV1)“重组HSV1-Lenti-helper病毒”的构建及其用途。
背景技术
有关逆转录病毒:逆转录病毒载体(retroviral vector)在基因治疗和基因转移领域有非常广阔应用,它可以将外援基因导入包括鼠类、灵长类及人在内的体细胞中,并整合到细胞基因组中,达到长期稳定表达的目的,使其在包括遗传病治疗、移植、干细胞转导等许多领域的应用都有非常好的前景。
逆转录病毒是RNA病毒,其生活史中有DNA中间体。逆转录病毒颗粒包含2条完全相同的RNA分子,病毒核心蛋白中含有与复制相关的酶类,核心外包裹病毒的包膜,其上有来自宿主细胞膜和病毒编码的糖蛋白。逆转录病毒感染细胞的过程如下:病毒颗粒通过其包膜上的糖蛋白与细胞膜上的受体作用,两者发生膜融合,病毒核心颗粒通过内吞进入细胞浆,病毒RNA逆转录成双链DNA,后者被转运进细胞核,在核内病毒DNA永久整合至染色体中(称为原病毒provirus),成为宿主DNA的一部分,并随宿主细胞复制和分裂。Proviral DNA转录成RNA,并转运到胞浆,并在此处翻译成病毒蛋白前体,后者随后被分别切割成病毒结构蛋白和复制酶蛋白,与病毒RNA组装成病毒核衣壳,在细胞膜处装上包膜。经过对前体核衣壳蛋白的进一步处理最终得到成熟的、有感染性的子代病毒颗粒。
逆转录病毒载体主要有两种:致瘤逆转录病毒载体和慢病毒载体。
致瘤逆转录病毒载体
早期的逆转录病毒载体来源于禽类或鼠的致瘤性逆转录病毒(oncogenicretroviruses),这些病毒有着相似的基因组结构,在它们的自然宿主中都能引起转化。其代表病毒是鼠白血病病毒(MLV)。所有的逆转录病毒都有以下三种基因:gag、pol和env。在受感染的细胞内,provirus基因组在5’LTR(长末端重复序列,long terminal repeat)启动子和3’LTR的终止子和polyA的作用下,转录出单链前体mRNA。gag编码病毒核心蛋白(core protein),pol编码病毒复制酶类。以上两个基因最初是以Gag-Pol融合蛋白形式表达的,病毒的蛋白酶将Gag-Pol前体切开,并进一步加工。Pol蛋白成为各种蛋白酶(用于将病毒前体蛋白切割成成熟形式)、逆转录酶(用于复制病毒核酸)和整合酶(将病毒基因组整合进染色体DNA)。Gag蛋白被进一步切割成病毒核心组分:基质(matrix)、衣壳(capsid)和核衣壳(nucleocapsid)蛋白(在所有逆转录病毒中都相同)以及各种病毒特有的核心蛋白。env编码病毒包膜糖蛋白,后者被细胞中蛋白酶切割成外膜蛋白和穿膜蛋白。包膜上糖蛋白与细胞表面受体的特异性,决定了病毒的细胞亲嗜性。
由于逆转录病毒能永久性地将自身基因组整合到受其感染的细胞的染色体中,从而使被其转导的基因在受感染的细胞及其子代中稳定存在和表达。因此致瘤逆转录病毒被广泛研究,用来作为基因转移载体和基因治疗研究中。其中MLV载体是其中应用最多和最广的。MLV是鼠逆转录病毒,某些MLV病毒株,比如双嗜性群(amphotropic group)的包膜糖蛋白可以介导MLV进入人体细胞。
通常作为载体的逆转录病毒都是复制缺陷型的,它们可以感染并将外源基因整合到靶细胞中,但病毒无法复制和传播到其它细胞中。这是因为载体基因组中无病毒基因,只剩下一些单轮复制所必需的顺式元件。载体基因组中被保留的顺式元件有:与RNA逆转录相关的顺式元件(如LTR)、与病毒DNA整合相关的顺式元件(如att site)、与provirus的转录相关的顺式元件(LTR)以及病毒RNA包装相关的位点(ψ,psi)等顺式元件。
包含以上顺式元件的质粒在细胞中可以扩增,在反式提供gag、pol和env基因的条件下,该质粒可以作为基因转移载体。上述反式元件可以由野生型病毒DNA提供,其结果是在得到病毒载体的同时,得到有感染和复制能力的野生型病毒,这在临床上是无法接受的。
随后出现了不使用野生型病毒的构建方式。即将野生型病毒DNA中扩增所需的所有顺式元件去除,再与载体DNA共转染细胞,由于构建体只表达病毒蛋白,但不含复制所需的顺式元件,因此不产生辅助病毒。用这种方法得到的载体感染正常细胞,由于细胞不表达病毒蛋白,所以载体不再扩增。这种方法得到的载体滴度较低。
第三种改进的构建逆转录病毒载体的方法是运用包装细胞株。后者表达载体扩增所需的病毒蛋白。这种方法大大提高了载体的包装效率。通常的做法是将病毒的结构蛋白基因和复制酶基因转导到细胞中,并使其稳定表达或可诱导表达。将载体基因组转染到该细胞中,就能产生载体病毒。这种方法同样不产生辅助病毒,载体在非包装细胞株上也不会复制和扩增。与上一种方法相比,该方法的优点有二:第一,产生病毒载体的过程更简单而有效,产生的载体滴度高于共转染法。第二,减少了载体质粒与反式蛋白基因间发生重组的几率,因此更安全。
慢病毒载体
慢病毒(lentivirus)基因组比致瘤逆转录病毒更复杂一些,从而导致其复制过程也更复杂。HIV-1载体是目前研究得最充分的慢病毒载体。其基因组基本组成与致瘤逆转录病毒一样,包括gag,pol和env。但HIV-1还含有另外一些辅助基因,包括vif,vpr,tat,rev,vpu,nef和vpx等。其中某些在病毒复制过程中起着重要作用。比如,Tat和Rev蛋白是病毒基因高效表达所必需的。Tat激活HIV-1的LTR中的启动子功能,提高病毒RNA的转录效率。Rev与病毒基因组RNA上的RRE(Rev-responsive element)区域相互作用,促进病毒RNA从胞核向胞浆的转移。
慢病毒载体与致瘤逆转录病毒载体相比,取得的最大进展是它可以感染非分裂细胞和终末分化的细胞。致瘤逆转录病毒载体虽然也能感染非分裂细胞,但病毒基因组被核膜阻挡在细胞核之外,只有细胞分裂时,核膜的完整性被打破,载体基因组才能进入核内。因此致瘤逆转录病毒载体的RNA的反转录和整合只有在分裂细胞中才能得以完成。虽然慢病毒感染非分裂细胞的准确机制还不清楚,但目前看来HIV能感染非分裂细胞得益于以下几种病毒蛋白:整合酶蛋白、基质蛋白以及辅助蛋白Vpr等。整合酶和基质蛋白含有核定位信号,Vpr可能与核孔复合物直接结合。
慢病毒载体在许多需要以非分裂细胞作为靶细胞的基因治疗(包括极少分裂的造血干细胞、终末分化的神经细胞甚至肿瘤细胞等)方案中具有优势,将可能成为首选。由于慢病毒可以感染非分裂细胞,(某些细胞类型中,需要细胞处于G0期到G1b期),慢病毒载体的临床研究前景是非常诱人的。但是,由于慢病毒基因组和复制的复杂性,导致载体和包装细胞株的研究进展比致瘤逆转录病毒更困难。致瘤逆转录病毒载体的包装细胞只要提供Gag、Pol和Env蛋白就可以,而HIV载体还需要提供Tat和Rev蛋白,而且其它辅助基因的功能还不清楚,而且要产生稳定的包装细胞系也有很大难度,分析原因可能与HIV某些蛋白的毒性有关。
由于存在上述困难,最初的HIV载体的包装系统简单地采用含HIV-1病毒的核心蛋白、酶、辅助基因以及VSV-G基因等的质粒。VSV的G蛋白(VSV-G)等可以扩大慢病毒载体的可感染细胞的类型。而且用VSV-G还可以得到滴度更高、稳定性更好的慢病毒载体。
第二代慢病毒载体包装质粒成分减少到只有HIV-1的gag、pol、tat、rev和VSV-G,载体质粒只含有HIV-1转录、包装、反转录和整合相关的顺式元件。载体质粒所包括的基因元件的顺序从5’至3’依次是:HIV-15’LTR、前导序列、5’SD位点(splice donor site)、360bp gag基因部分、700bp env(含RRE和SA位点splice acceptor site)、内部启动子(CMV的IE增强子/启动子或PGK(phosphoglycerokinase)启动子)、外源基因和HIV-1的3’LTR。重组慢病毒载体的生产方式是将携带了各种必需元件的三种质粒共转染到293T细胞中。该慢病毒载体只在有Tat和Rev蛋白的条件下,才能激活LTR的转录活性和未切割的基因组RNA在胞浆中的聚集。
第三代慢病毒载体是在第二代的基础上,进一步删除了一些病毒序列,使包装质粒成分进一步减少到只有gag、pol、rev和VSV-G。比如,5’LTR的U3被RSV(Rous肉瘤病毒)增强子/启动子代替,使病毒mRNA的转录不受Tat蛋白的限制,Tat基因及其作用位点被分别从包装质粒和载体质粒中删除;另外,3’LTR中的U3区也被完全删除,而后者是LTR转录的模板,U3区的缺失导致载体基因组感染细胞后,不会产生新的子代病毒,成为“自灭活载体”(self-inactivating vector,SIN),安全性得到了进一步保障。
慢病毒载体目前还只用于HIV复制机制和对慢病毒载体系统的研究等方面,在基因治疗临床应用上仍落后于致瘤逆转录病毒载体。其中主要原因有二:一是人们对HIV载体安全性的关注和担心远大于对致瘤逆转录病毒的,前者含有的某些顺式元件,比如RRE序列,在载体质粒和辅助质粒上都存在,因此存在重组出野生型病毒的可能。另外,HIV的包装信号延伸到了gag基因中,因此HIV载体中包含部分gag基因序列,同样有可能导致载体与辅助质粒的同源重组;另一个限制因素是VSV-G对细胞有毒性,因此难以构建HIV载体包装细胞株。有专利(US PATENT 6218181)用可调控启动子,如四环素启动子来启动VSV-G的表达,从而构建出HIV载体包装细胞株,再用转染的方式将载体质粒导入该细胞株中,生产出HIV载体。但目前通用的方法仍是多个(2~4个)质粒共转染,因此载体滴度低,而且能产生重组的可复制型载体。
人1型单纯疱疹病毒:人1型单纯疱疹病毒HSV1基因组的全长152kb,共72个基因,其中约1/3是非必需基因,即这些基因缺失或失活不影响HSV1载体细胞中的感染和繁殖。HSV1基因组中插入15kb以下的外源基因,不影响其基因组的包装和病毒的感染性。另外,HSV1对大部分动物或人的细胞都有较高水平的感染,其携带的外源基因能在这些细胞中以较高水平表达。因此,HSV1成为用来携带外源基因到细胞中比较理想的载体。
发明内容
本发明描述了一种重组人1型单纯疱疹病毒(Herpes Simplex VirusType 1,HSV1)“重组HSV1-Lenti-helper病毒”,它的基因组中插入了慢病毒载体包装所需的各种反式蛋白的表达盒(gag、pol、VSV-G、Rev等)。用该重组HSV病毒感染载体细胞株,能高水品表达gag,pol,VSV-G,Rev等蛋白,从而将载体细胞株染色体中以provirus形式存在的慢病毒载体基因组拯救出来,包装出慢病毒载体。用亲和层析、离子吸附层析或超离等方法,可以将慢病毒载体与HSV分离,达到纯化的目的。本方法的特点是用病毒感染的方式代替质粒转染方式生产慢病毒载体,载体滴度高,成本低,有利于大规模生产。
在本发明中,插入到HSV1基因组的外源DNA片段包括:
(1)gag/pol:为逆转录病毒、特别是人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的病毒核心蛋白/复制及整合酶的编码基因。gag/pol基因上游的启动子是真核强启动子,比如含人beta-globin intron增强子的人巨细胞病毒CMV启动子等。gag/pol基因下游是HIV-1的Rev效应元件(RRE),RRE在Rev的作用下,表达Gag和Pol蛋白。RRE下游是真核转录终止和加尾信号,比如人beta-globin polyA。gag/pol的DNA片段组成的示意图参见说明书附图中的图1。gag/pol的核苷酸序列参见附加文件之核苷酸或氨基酸序列表的软盘中之文件(文件名称:gag-pol.prj)。
(2)Rev:为逆转录病毒、特别是人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的调控蛋白的编码基因。其上游是真核强启动子,比如Rous肉瘤病毒RSV的增强子/启动子。Rev基因下游是真核转录终止和加尾信号,比如HIV-1的LTR的polyA。Rev的DNA片段组成的示意图参见说明书附图中的图2。Rev的核苷酸序列参见附加文件之核苷酸或氨基酸序列表的软盘中之文件(文件名称:rev.prj)。
(3)非HIV-1的包膜蛋白:包括、但不局限于以下病毒的包膜蛋白的编码基因:Moloney鼠白血病病毒(MoMuLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、人水泡口炎病毒的G蛋白(VSV-G)等。基因上游的启动子是真核强启动子,比如含人beta-globin intron增强子的人巨细胞病毒CMV启动子。下游是真核转录终止和加尾信号,比如人beta-globin polyA。非HIV-1的包膜蛋白的DNA片段组成的示意图参见说明书附图中的图3。vsv的核苷酸序列参见附加文件之核苷酸或氨基酸序列表的软盘中之文件(文件名称:vsv.prj)。
上述(1)、(2)、(3)中的三种DNA片段分别通过酶切插入或同源臂重组等方法插入或取代HSV1的非必需基因区。
上述(1)、(2)、(3)中的三种DNA片段可以分别插入三株单纯疱疹病毒基因组中,也可以将(1)、(2)、(3)插入同一株单纯疱疹病毒基因组中,或是(1)、(3)插入同一株单纯疱疹病毒基因组中,(2)插入另一株单纯疱疹病毒基因组中。
所谓“酶切插入”方法是指:利用一套粘粒系统SetC,通过酶切、连接、共转染的方法重组出含上述(1)、(2)、(3)三种DNA片段的重组单纯疱疹病毒。
Set C粘粒按HSV1病毒全基因顺序由依次分载了HSV1病毒(17株)全基因组的5个粘粒组成:cos6、cos28、cos14、cos56、cos48。为Davision AJ赠送(Conningham C,Davision AJ.Virology,1993,197:116-124)。(cos6,cos14cos28,cos48,cos56的序列分别见Seq6、Seq7、Seq8、Seq9、Seq10)。该套粘粒中,从cos6开始,按顺序至cos28、cos14、cos56,最后到cos48,其中所装载的HSV1病毒基因组的各片段的3’末端与装载于下一粘粒中的HSV1片段的5’末端序列重复,即:cos6中所装载的HSV1病毒基因组的片段的3’末端与cos28中所装载的HSV1病毒基因组的片段的5’末端序列重复,cos28中所装载的HSV1病毒基因组的片段的3’末端与cos14中所装载的HSV1病毒基因组的片段的5’末端序列重复,依次类推,cos14中所装载的HSV1病毒基因组的片段的3’末端与cos56中所装载的HSV1病毒基因组的片段的5’末端序列重复,cos56中所装载的HSV1病毒基因组的片段的3’末端与cos48中所装载的HSV1病毒基因组的片段的5’末端序列重复,cos48中所装载的HSV1病毒基因组的片段的3’末端与cos6中所装载的HSV1病毒基因组的片段的5’末端序列重复。这是5个HSV1基因组片段在细胞中发生同源重组从而产生重组HSV1的基础。SetC粘粒图谱的示意图参见说明书附图中的图4。
在SetC中的cos6上的HSV1的非必需基因UL2和cos56上的HSV1的非必需基因UL44中各有一个XbaI单切点,cos28上的HSV1的非必需基因TK中有一个NsiI单切点。这三个单酶切位点被用于将外源基因插入其中,并通过将5个粘粒共转染至HSV1敏感的真核细胞(如BHK-21),通过5个HSV1基因组片段的重组产生插入了外源基因的重组HSV1病毒,本重组HSV1病毒被命名为“重组HSV1-Lenti-helper病毒”。
上述(1)、(2)、(3)中的三种DNA片段可以分别插入cos6的UL2的XbaI单切点、cos56的UL44的XbaI单切点或cos28的TK的NsiI单切点中,位置不限。
所谓“同源臂重组方法”是指:分别在要插入(1)、(2)、(3)三种DNA片段的HSV1非必需基因的上、下游各找一段序列,长约100~2000bp,用DNA合成或PCR方法将其调出,分别放在(1)、(2)、(3)三种DNA片段的两端,将这样构建好的DNA构建体与HSV1病毒或含相应非必需基因的SetC粘粒共同导入对HSV1敏感的真核细胞(如BHK-21)中,筛选出含有(1)、(2)、(3)三种DNA片段的HSV1重组病毒,或筛选出含有(1)、(2)、(3)三种DNA片段的粘粒,与SetC的其它几种粘粒共转染对HSV1敏感的真核细胞(如BHK-21),同样将得到含有(1)、(2)、(3)三种DNA片段的HSV1重组病毒“重组HSV1-Lenti-helper病毒”。
上述(1)、(2)、(3)中的三种DNA片段可以分别用同源重组的方法插入HSV1的任何非必需基因区,位置不限。
上述(1)、(2)中提到的逆转录病毒可以是除HIV-1外的其它逆转录病毒。
用以上方法得到的重组HSV1病毒“重组HSV1-Lenti-helper病毒”可以用对HSV1敏感的真核细胞(如BHK-21)制备并进行稳定地长期传代,或-70℃保存。
本发明提出的重组单纯疱疹病毒的用途
以上方法得到的含有(1)、(2)、(3)三种DNA片段的重组HSV1病毒“重组HSV1-Lenti-helper病毒”主要用途是生产携带外源基因的慢病毒载体,特别是HIV-1载体。
具体方法是,先构建一个载体质粒,该质粒含有以下成分:1、两端带有慢病毒、特别是HIV-1的长末端重复序列(LTR)的外源基因表达盒,该外源基因的启动子是强真核启动子,如人巨细胞病毒CMV的IE启动子,外源基因下游是真核转录终止和加尾信号,比如SV40病毒的polyA;2、两个LTR之间还含有慢病毒、特别是HIV-1基因组包装和定位所需的两个顺式元件psi(包装信号)和RRE(将完整的病毒RNA基因组带出细胞核);3、在真核细胞中表达的抗性基因表达盒,如neor、blasticidinr、kanr等;4、使该质粒在原核细胞,如大肠杆菌中复制的复制起点序列,如pUC ori以及抗性筛选基因,如ampr等。
将该载体质粒通过脂质体等转染试剂转导到对HSV1敏感的真核细胞(如BHK-21)中,再在培养液中加入合适浓度的抗生素,经过一定时间的培养,筛选出载体质粒被稳定携带和或整合到细胞染色体中的细胞株。
该细胞株感染含有(1)、(2)、(3)三种DNA片段的重组HSV1病毒“重组HSV1-Lenti-helper病毒”(三种DNA片段在同一重组HSV1病毒基因组上)后,表达gag/pol、VSV-G和Rev蛋白,将整合到细胞染色体中的载体DNA反转录成慢病毒RNA基因组,并包装出慢病毒载体。
该细胞株以一定比例感染两种分别含有(1)、(3)两种DNA片段和(2)一种DNA片段的重组HSV1病毒后,表达gag/pol、VSV-G和Rev蛋白,将整合到细胞染色体中的载体DNA反转录成慢病毒RNA基因组,并包装出慢病毒载体。
用本发明提出的重组单纯疱疹病毒(“重组HSV1-Lenti-helper病毒”)感染载体细胞株的方法生产的慢病毒载体的细胞裂解液中混杂有重组单纯疱疹病毒(“重组HSV1-Lenti-helper病毒”),后者对动物或人细胞是有细胞毒性,需要除去。可以采用针对VSV-G蛋白的亲和层析、离子吸附层析或CsCl密度梯度离心等方法将其去除。
附图说明
说明书附图之图1是gag/pol的DNA片段组成的结构示意图,它的上游(即5’端)是人巨细胞病毒CMV启动子(CMV promoter),其后依次是:beta-globin intron增强子、gag/pol、RRE、beta-globin polyA。说明书附图之图2是Rev的DNA片段组成的结构示意图,它的5’端从上游至下游依次是RSV启动子(RSV enhancer/promoter)、Rev、HIV的LTR polyA。说明书附图之图3是非HIV-1的包膜蛋白的DNA片段组成的结构示意图,它的5’端从上游至下游依次是人巨细胞病毒CMV启动子(CMV promoter)、beta-globin intron增强子、VSV-G、beta-globin polyA。说明书附图之图4是SetC的结构示意图图谱,Set C粘粒按HSV1病毒全基因顺序由依次分载了HSV1病毒(17株)全基因组且相邻的粘粒首位DNA序列有部分完全相同的5个粘粒cos6、cos28、cos14、cos56、cos48组成。
具体实施方式
以下实施例对本发明的用于重组慢病毒载体生产的全功能辅助病毒(“重组HSV1-Lenti-helper病毒”)的制备和用途作了详细说明,但并不意味着限制本发明的内容。
实施例1 cos6-VSVG的构建
将质粒pLP/VSVG(Invitrogen)中的VSV-G表达盒(CMV启动子/beta-globin增强子+VSV-G+beta-globin polyA)用PCR的方式调出(长约3770bp),引物是:上游5’TCTAGACTTGGCCCATTGCATA 3’;下游5’TCTAGAACTGCCATGTCGAGGG 3’。两端是XbaI位点。反应条件是:94℃,30”;56℃,30”;72℃,4’。PCR产物用XbaI酶切后,装入cos6的XbaI位点中,得到粘粒cos6-VSVG。
实施例2 cos56-gag/pol的构建
将质粒pLP1(Invitrogen)中的gag/pol表达盒(CMV启动子/beta-globin增强子+gag/pol+RRE+beta-globin polyA)用PCR的方式调出(长约6837bp),引物是:上游5’TCTAGATTGGCCCATTGCATAC 3’;下游5’TCTAGAACTGCCATGTCGAGGG 3’。两端是XbaI位点。反应条件是:94℃,30”;56℃,30”;72℃,7’。PCR产物用XbaI酶切后,装入cos56的XbaI位点中,得到粘粒cos56-gag/pol。
实施例3 cos6-rev的构建
将质粒pLP2(Invitrogen)中的Rev表达盒(RSV启动子+Rev+HIV polyA)用PCR的方式调出(长约971bp),引物是:上游5’TCTAGACAATGTAGTCTTATGC 3’;下游5’TCTAGACCAGGGTTTTCCTGAT3’。两端是XbaI位点。反应条件是:94℃,30”;56℃,30”;72℃,1’。PCR产物用XbaI酶切后,装入cos6的XbaI位点中,得到粘粒cos6-rev。
实施例4 重组单纯疱疹病毒rHSV-VSVG-gag/pol的构建
将cos6-VSVG、cos56-gag/pol与cos14,cos28,cos48等5个粘粒等摩尔混合,用PacI酶切去cos骨架(不必分离去除),用酚、酚/氯仿(1∶1)和氯仿各抽提一次,吸取上清,用2.5倍无水乙醇沉淀DNA。用lipofactamine(GIBCO BRL)20ul与10ug DNA按产品说明书共转染80%铺满的BHK-21细胞(约2×106)细胞,5个HSV1片段将在细胞内发生同源重组而分别产生rHSV-VSVG-gag/pol重组病毒。转染24h后换用含2%FBS的1640培养液37℃培养,每天换液一次。5天后细胞开始出现病变,待细胞完全病变后收培养液上清,2000r/min离心5min,上清分装保存于-20℃。对获得的重组病毒进行两次空斑纯化,可得到纯一的rHSV-VSVG-gag/pol重组病毒。
实施例5 重组单纯疱疹病毒rHSV-rev的构建
将cos6-rev与cos56、cos14,cos28,cos48等5个粘粒等摩尔混合,用PacI酶切去cos骨架(不必分离去除),用酚、酚/氯仿(1∶1)和氯仿各抽提一次,吸取上清,用2.5倍无水乙醇沉淀DNA。用lipofactamine(GIBCO BRL)20ul与10ug DNA按产品说明书共转染80%铺满的BHK-21细胞(约2×106)细胞,5个HSV1片段将在细胞内发生同源重组而分别产生rHSV-rev重组病毒。转染24h后换用含2%FBS的1640培养液37℃培养,每天换液一次。5天后细胞开始出现病变,待细胞完全病变后收培养液上清,2000r/min离心5min,上清分装保存于-20℃。对获得的重组病毒进行两次空斑纯化,可得到纯一的rHSV-rev重组病毒。
实施例6 携带报告基因EGFP的载体质粒pLenti-EGFP的构建用PCR的方法将pEGFP(Gibco)中的EGFP基因调出(长度约730bp),引物是:上游5’cacc atg gtg agc aag ggc gag 3’;下游5’gaattc cct cta gag tcg cgg ccg ctt t 3’。PCR反应条件:94℃,30”;56℃,30”;72℃,1’。再通过TOPO酶定向插入慢病毒载体质粒pLenti6/D-TOPO(Invitrogen)中,得到重组载体质粒pLenti-EGFP。
实施例7 稳定整合载体质粒pLenti-EGFP的载体细胞株的构建
将载体质粒pLenti-EGFP用lipofactamine(GIBCO BRL)转染至80%铺满的BHK-21细胞(约2×106)细胞。24h后,在培养液(1640)中加入终浓度为50μg/ml的抗生素“Blasticdin”,约10d后,挑选出单细胞克隆,分别在荧光显微镜下观察,挑选出GFP表达较高的细胞株。成为稳定整合载体质粒pLenti-EGFP的载体细胞株。
实施例8 慢病毒载体Lenti-EGFP的产生
用实施例4产生的rHSV-VSVG-gag/pol和实施例5产生的rHSV-rev两个重组单纯疱疹病毒按一定滴度比例(比如10∶1)感染上述载体细胞株pLenti-EGFP(MOI=1),37℃继续培养2~3d,至细胞病变完全。反复冻融3次后,离心得到上清,即是混有重组单纯疱疹病毒的慢病毒载体Lenti-EGFP。
实施例9 慢病毒载体Lenti-EGFP的纯化
上述混有重组单纯疱疹病毒的慢病毒载体Lenti-EGFP的上清加到含有VSV-G单克隆抗体的亲和层析柱中,通过提高盐离子浓度的梯度洗脱方式,将慢病毒载体Lenti-GFP洗脱下来,得到纯化了的慢病毒载体Lenti-EGFP。
实施例10 慢病毒载体Lenti-EGFP的滴度测定
将用PBS进行10倍比稀释的慢病毒载体Lenti-EGFP分别感染80%铺满的BHK-21细胞,24h后,在培养液(10%FBS 1640)中加入终浓度为50μg/ml的抗生素“Blasticdin”,约10d后,分别在荧光显微镜下观察,计算细胞克隆数,即得到慢病毒载体Lenti-EGFP的滴度。
Claims (7)
1.一组重组人1型单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus type 1,HSV1),命名为“重组HSV1-Lenti-helper病毒”。
2.根据权利要求1,重组HSV1-Lenti-helper病毒是用于制备慢病毒载体的。
3.根据权利要求1,重组HSV1-Lenti-helper病毒的基因组中插入了慢病毒载体包装所需的各种反式蛋白的表达盒gag、pol、VSV-G、Rev等。
4.根据权利要求1,用重组HSV1-Lenti-helper病毒感染载体细胞株,能高水品表达gag、pol、VSV-G、Rev等蛋白。
5.根据权利要求4,所表达的gag、pol、VSV-G、Rev等蛋白能将载体细胞株染色体中以provirus形式存在的慢病毒载体基因组拯救出来,包装出慢病毒载体。
6.根据权利要求1,重组HSV1-Lenti-helper病毒的获得是在一套Set C粘粒的基础上进行操作完成的。
7.根据权利要求1,用人1型单纯疱疹病毒HSV-1携带慢病毒的各种基因元件。
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