KR20010033064A - 높은 역가를 갖는 안전한 재조합 렌티바이러스 벡터를생성시키는 방법 및 수단 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재조합 렌티바이러스 벡터의 생성에 유용한 5' LTR 또는 5' 및 3' LTR 둘 모두에서 변형된 렌티바이러스 벡터에 관한 것이다. 이러한 벡터는 작용성 tat 유전자의 부재하에 생성될 수 있다. 이식유전자를 지니는 벡터로 숙주 세포를 다중 형질전환시키는 것은 바이러스 생성을 증진시킨다.

Description

높은 역가를 갖는 안전한 재조합 렌티바이러스 벡터를 생성시키는 방법 및 수단 {METHOD AND MEANS FOR PRODUCING HIGH TITER, SAFE, RECOMBINANT LENTIVIRUS VECTORS}
레트로바이러스 벡터는 유전자 전달에 일반적인 도구이다[문헌: Miller, Nature (1992) 357:455-460]. 광범위한 범위의 설치동물, 영장류 및 사람 체세포내로 비재배열된 단일의 복제 유전자를 전달하는 레트로바이러스 벡터의 능력은 레트로바이러스 벡터가 유전자를 세포로 전달하기에 적합하게 한다.
재조합 레트로바이러스 벡터를 생성하는 유용한 부가물은 감염성 비리온을 생성하는데 필요한 단백질을 트랜스로 공급하는 패키징 세포주이지만, 이들 세포는 내생성의 바이러스 게놈 핵산을 패키징할 수 없다[문헌: Watanabe ＆ Temin, Molec. Cell. Biol. (1983) 3(12):2241-2249; Mann et al., Cell (1983) 33:153-159; Embretson ＆ Temin, J. Viron. (1987) 61(9):2675-2683]. 레트로바이러스 패키징 세포주의 구성에서 고려될 사항은 설치동물[문헌: Cloyd et al., J. Exp. Med. (1980) 151:542-552] 및 영장류[문헌: Donahue et al., J. Exp. Med. (1992) 176:1125-1135]에서 T 세포 임파종을 생성하는 것으로 밝혀진 재조합 복제 가능한 레트로바이러스(RCR)로부터의 높은 역가 상등물의 생성이다.
패키징 세포에서 RCR를 생성시키는 가능성을 최소화하는 한 가지 방법은 패키징 작용을, 예를 들어, gag 및 pol 유전자를 발현하는 한 게놈과 env 유전자 생성물을 발현하는 다른 게놈인 두 게놈내로 분할하는 것이다[문헌: Bosselman et al., Molec. Cell. Biol. (1987) 7(5):1797-1806; Markowitz et al., J. Virol. (1988) 62(4):1120-1124; Danos ＆ Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. (1988) 85:6460-6464]. 이러한 방법은 두 게놈의 보조-패키징 및 이어진 전달 뿐만 아니라, RCR을 생성시키는 패키징 세포에서의 3 레트로바이러스 게놈의 존재에 기인된 재조합의 빈도를 현저하게 감소시키는 능력을 최소화시킨다.
재조합체가 발생되는 상황에서, 돌연변이(Danos ＆ Mulligan, supra), 또는 결실(Boselman et al., supra; Markowitz et al., supra)이 어떠한 가능한 재조합체가 비작용성이 되게 하는 바람직하지 않은 유전자 생성물내에서 형성될 수 있다. 또한, 둘 모두의 패키징 구성물상에서의 3' LTR의 결실은 또한 작용성 재조합체를 형성하는 능력을 감소시킨다.
렌티바이러스는, 공통의 레트로바이러스 유전자 gag, pol 및 env에 추가로, 조절성 또는 구조성 작용을 지닌 다른 유전자를 함유하는 복합 레트로바이러스이다. 보다 높은 복합성은 잠재성 감염증의 과정에서와 같이 렌티바이러스가 그의 수명을 조절할 수 있게 한다.
전형적인 렌티바이러스는 사람 면역결핍바이러스(HIV), 즉, AIDS의 병인학적 제제이다. 생체내에서, HIV는 임파구 및 대식세포와 같이 거의 분할되지 않는 말단적으로 분화된 세포를 감염시킬 수 있다. 시험관내에서, HIV는 아피디콜린 또는 ?? 선 조사에 의한 처리에 의해서 세포 사이클에서 억류된 HeLa-Cd4 또는 T 임파 세포 뿐만 아니라, 단구 유도된 대식세포(MDM)의 일차 배양물을 감염시킬 수 있다.
세포의 감염증은 표적 세포의 핵 세공을 통한 HIV 선삽입 복합체의 활성 핵 유입에 좌우된다. 이러한 감염증은 표적 세포의 핵 유입 장치와의 복합에서 다중의 부분적으로 과다한 분자 결정체의 상호작용에 의해서 발생된다. 동정된 결정체에는 gag 매트릭스(MA) 단백질, 친핵성 비리온 연관된 단백질, vpr에서의 작용성 핵 편재 시그날(NLS)과 gag MA 단백질에서의 C-말단 포스포티로신 잔기를 포함한다.
발명의 개요
따라서, 본 발명은 패키징될 수 있는 렌티바이러스 벡터 전사체 둘 모두의 합성을 유도하는 신규한 무력화된 렌티바이러스 벡터 및 포유동물 세포에서 높은 역가 재조합 렌티바이러스를 신속하게 생성시키는 렌티바이러스 단백질에 관한 것이다. 이러한 생성물은 목적 외래 유전자를 표적 세포로 전달하는 감염성 입자이다. 본 발명은 또한 바이러스 생성에 요구되는 세포주를 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 다양한 렌티바이러스 벡터를 도시하고 있는 도면이다. RSV는 로우스 육종 바이러스 인핸서(Rous sarcoma virus enhancer)/프로모터이고; R은 LTR의 R 영역이고; U5는 LTR의 U5 영역이고; SD는 HIV 5' 주요 스플라이스 공여체 부위와 같은 슬라이스 공여체 부위이고; ψ는 Psi 엔캡시데이션 시그날 서열(Psi encapsidation signal sequence)이고; Ga는 gag 유전자의 일부이고; RRE는 rev 반응성 구성요소이고; SA는 스플라이스 수용체 서열이고; U3은 LTR의 U3 영역이다.
도 2는 추가의 렌티바이러스 벡터를 도시하고 있는 도면이다. CMV는 사이토메갈로바이러스이다. 또한 부호는 도 1의 설명에서와 같다.
도 3은 전달 벡터의 양을 증가시킴에 따른 등급화된 벡터 생성을 도시하는 그래프이다.
본 발명은 신규한 렌티바이러스 패키징 벡터, 목적하는 외래 유전자를 함유하는 전달 벡터, 안정한 패키징 세포주, 안정한 프로듀서 세포주 및 포유동물 세포에서 재조합 렌티바이러스를 생성시키는 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 비-분할 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스 뿐만 아니라 이를 제조하는 방법 및 수단을 제공한다. 바이러스는 핵산 서열의 생체내 및 생체외 전달 및 발현에 유용하다.
렌티바이러스 게놈 및 프로바이러스 DNA는 레트로바이러스에서 발견된 3개의 유전자: 두 개의 장 말단 반복체(LTR) 서열에 의해서 플랭킹되는 gag, pol 및 env를 지닌다. gag 유전자는 내부 구조(매트릭스, 캡시드 및 누클레오캡시드) 단백질을 암호하고; pol 유전자는 RNA 유도된 DNA 폴리머라제(역전사효소), 프로테아제 및 인테그라제를 암호하고; env 유전자는 바이러스 엔벨로프 당단백질을 암호한다. 5' 및 3' LTR's은 비리온 RNA's의 전사 및 폴리아데닐화를 촉진하는 작용을 한다. LTR은 바이러스 복제에 필요한 모든 다른 cis-작용 서열을 함유한다. 렌티바이러스는 vif, vpr, tat, rev, vpu, nef 및 vpx(HIV-1, HIV-2 및/또는 SIV내의)를 포함하는 추가의 유전자를 지닌다.
5' LTR에 인접하여 게놈(tRNA 프라이머 결합부위)의 역전사 및 바이러스 RNA의 입자(Psi 부위)내로의 효율적인 엔캡시데이션에 필요한 서열이 있다. 엔캡시데이션(또는 감염성 비리온내로의 레트로바이러스 RNA의 패키징)에 필요한 서열이 바이러스 게놈으로부터 손실되는 경우에, cis 결함은 게놈성 RNA의 엔캡시데이션을 억제한다. 그러나, 생성되는 돌연변이체는 모든 비리온 단백질의 합성을 유도할 수 있다.
본 발명은 패키징 기능을 함유하는 둘 이상의 벡터, 즉 gag, pol 및 env, 뿐만 아니라 rev 및 tat로 적합한 숙주 세포를 형질감염시킴을 포함하여, 비-분할 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스를 생성시키는 방법을 제공한다. 이하 기재되는 바와 같이, 작용성 tat 유전자가 결여된 벡터는 특정의 적용에 요구된다. 따라서, 예를 들어, 제 1 벡터는 바이러스 gag 및 바이러스 pol을 암호하는 핵산을 제공할 수 있으며, 또 다른 벡터는 패키징 세포를 생성하도록 바이러스 env를 암호하는 핵산을 제공할 수 있다. 본원에서 전달 벡터로 확인된 이종성 유전자를 제공하는 벡터를 패키징 세포내로 도입하면 목적하는 외래 유전자를 지니는 감염성 바이러스 입자를 방출하는 프로듀서 세포가 생성된다.
본원에 기재된 바와 같이 새롭게 구성된 벡터를 제외한 벡터 그 자체는 본 기술분야에 공지되어 있다[문헌: Naldini et al., Sci. (1996) 272;263-267; and Zufferey et al., Nat. Biotech. (1997) 15:871-875]. 일반적으로 벡터는 플라스미드를 기본으로 하거나 바이러스를 기본으로 하며, 외래 핵산의 혼입, 선택, 및 숙주세포내로의 핵산의 전달에 기본적인 서열을 지니도록 형성된다. 목적하는 벡터의 gag, pol 및 env 유전자가 또한 본 기술분야에 공지되어 있다. 따라서, 관련 유전자가 선택된 벡터내로 클로닝되며, 목적하는 표적 세포를 형질전환시키는데 사용된다.
벡터 및 외래 유전자의 상기된 형태에 따르면, 제 2 벡터가 바이러스 엔벨로프 (env) 유전자를 암호하는 핵산을 제공할 수 있다. 이러한 env 유전자는 레트로바이러스를 포함한 어떠한 바이러스로부터 유도될 수 있다. 이러한 env는 바람직하게는 사람 및 다른 종의 세포의 형질도입을 가능하게 하는 암포트로픽(amphotropic) 엔벨로프 단백질이다.
특정의 세포형의 수용체를 표적하는 특정의 리간드 또는 항체와의 엔벨로프 단백질의 결합에 의해서 재조합 바이러스를 표적하는 것이 바람직할 수 있다. 특이적 표적세포상에서 수용체에 대한 리간드를 암호하는 다른 유전자와 함께, 목적하는 서열(조절 영역을 포함)을 바이러스 벡터내로 삽입함으로써, 예를 들어, 벡터가 표적 특이성이 된다. 레트로바이러스 벡터는 예를 들어 당지질 또는 단백질을 삽입함으로써 표적 특이적이 될 수 있다. 표적화는 종종 단일 쇄 항체와 같은 재조합 항체형 분자 또는 항체의 항원 결합 부분을 사용하여 레트로바이러스 벡터를 표적함으로써 수행된다. 당업자라면 레트로바이러스 벡터를 특이적 표적에 전달하는 특이적 방법을 불필요한 실험을 하지 않고도 알 수 있거나 용이하게 확인할 수 있다.
레트로바이러스 유도된 env 유전자의 예에는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus: MoMuLV 또는 MMLV), 하베이 쥐 종양 바이러스(Harvey murine sarcoma virus: HaMuSV 또는 HSV), 쥐 유방암 바이러스(MuMTV 또는 MMTV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV 또는 GALV), 사람 면역결핍바이러스(HIV) 및 로우스 육종 바이러스(RSV)가 포함된다. 베시쿨러 스토마토티티스 바이러스(Vesicular stomatitis virus: VSV) 단백질 G(VSV G)와 같은 다른 env 유전자, 간염 바이러스의 유전자 및 인플루엔자(influenza)의 유전자가 또한 사용될 수 있다.
바이러스 env 핵산 서열을 제공하는 벡터는 조절 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서와 작동적으로 결합된다. 조절 서열은, 예를 들어, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 프로모터-인핸서 구성요소, 사람 사이토메갈로바이러스 인핸서 또는 백시니아 P7.5 프로모터를 포함한 진핵성 프로모터 또는 인핸서일 수 있다. 일부의 경우에, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 프로모터-인핸서 구성요소와 같은, 프로모터-인핸서 구성요소는 LTR 서열에 인접하거나 그 내에 위치된다.
바람직하게는, 조절 서열은 벡터가 구성되는 렌티바이러스에 대해서 내생성이 아닌 서열이다. 따라서, 벡터가 SIV로부터 형성되는 경우에, SIV LTR에서 발견된 SIV 조절 서열은 SIV로부터 기원되지 않는 조절 구성요소에 의해서 대체될 것이다.
VSV G 단백질은 VSV G가 재조합 바이러스에 광범위한 숙주 범위를 부여하기 때문에 바람직한 env 유전자이지만, VSV G는 숙주세포에 유해할 수 있다. 따라서, VSV G에 대한 유전자와 같은 유전자가 사용되는 경우에, 유도 가능한 프로모터 시스템을 사용하여 VSV G 발현은 VSV G 발현이 요구되지 않는 경우의 숙주 독성을 최소화하도록 조절될 수 있게 하는 것이 바람직하다.
예를 들어, 문헌[Gossen ＆ Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. (1992) 89:5547-5551]의 테트라사이클린 조절 가능한 유전자 발현 시스템은 테트라사이클린이 전달된 세포로부터 유도되는 경우의 VSV G의 유도 가능한 발현을 제공하는데 사용될 수 있다. 따라서, tet/VP16 트랜스 활성화제는 제 1 벡터상에 존재하며, VSV G 코딩 서열은 또 다른 벡터상의 tet 오퍼레이터 서열에 의해서 조절된 프로모터의 다운스트림에서 클로닝된다.
이종성 또는 외래 핵산 서열, 즉, 이식 유전자는 조절 핵산 서열에 작동적으로 결합된다. 본원에 기재된 용어 "이종성" 핵산 서열은 외래종으로부터 기원되는 서열을 의미하거나, 동일한 종으로부터 기원되는 경우에는 본래의 형태로부터 실질적으로 변형된 형태일 수 있다. 또한, 세포에서 정상적으로 발현되지 않는 비변화된 핵산 서열도 이종성 핵산서열이다.
용어 "작동적으로 결합된"은, 이종성 핵산 서열의 발현을 유도하는, 조절서열과 이종성 핵산서열 사이의 작용적 결합을 의미한다. 바람직하게는, 이종성 서열은 프로모터에 결합되어 키메라 유전자를 생성시킨다. 이종성 핵산 서열은 바람직하게는 바이러스 LTR 프로모터-인핸서 시그날 또는 내부 프로모터의 조절하에 있으며, 레트로바이러스 LTR내에 보유된 시그날은 이식 유전자의 충분한 발현을 여전히 유발시킬 수 있다.
외래 유전자는 전사될 수 있는 어떠한 목적 핵산일 수 있다. 일반적으로 외래 유전자는 폴리펩티드를 암호한다. 바람직하게는 폴리펩티드는 약간의 치료학적 이점이 있다. 폴리펩티드는 숙주 세포에서 내생성 단백질의 부족한 발현 또는 존재하지 않는 발현을 보조할 수 있다. 폴리펩티드는 키메라 시그날링 수용체와 같은 숙주 세포에 새로운 특성을 부여한다(미국특허 제5,359,046호). 당업자라면 본원에 교시된 기술과 본 기술분야에 공지된 기술을 실시함으로써 외래 유전자의 적절성을 측정할 수 있다. 예를 들어, 당업자라면 외래 유전자가 엔캡시데이션에 적합한 크기인지 및 외래 유전자 생성물이 적절하게 발현되는 지를 알 수 있을 것이다.
본 발명의 방법에 의해서 분자를 도입시킴으로써 세포에서 유전자 조절 분자의 발현을 변화시키는 것이 바람직할 수 있다. 용어 "변화"는 과발현되는 경우의 유전자의 발현의 억제 또는 저발현되는 경우의 발현의 증가를 의미한다. 세포 증식성 질환은 유전자의 발현과 관련되는 경우에, 번역 수준의 유전자의 발현을 억제하는 핵산 서열이 사용될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 안티센스 핵산 또는 3중 제제(triplex agent)로 mRNA를 마스킹하거나, 리보자임으로 mRNA를 분해시킴으로써 특이적 mRNA의 전사 또는 번역을 차단하도록 안티센스 핵산, 리보자임 또는 3중 제제를 사용할 수 있다.
안티센스 핵산은 특이적 mRNA 분자의 적어도 일부에 상보성인 DNA 또는 RNA 분자이다[문헌: Weintraub, Sci. Am. (1990) 262:40]. 세포에서, 안티센스 핵산은 상응하는 mRNA에 혼성화되어 이중 가닥 분자를 형성한다. 안티센스 핵산은 mRNA의 번역을 억제하는데, 그 이유는 세포가 이중가닥을 형성하는 mRNA를 번역하지 않기 때문이다. 약 15 이상의 누클레오티드의 안티센스 올리고머가 바람직한데, 그 이유는 그러한 올리고머가 용이하게 합성되고 표적 세포내로 도입되는 경우의 큰 분자보다도 문제를 적게 유발시키기 때문이다. 유전자의 시험관내 번역을 억제하는 안티센스 방법의 용도는 본 기술분야에 공지되어 있다[문헌: Marcus-Sakura, Anal. Biochem. (1988) 172:289].
안티센트 핵산은, 알쯔하이머 질환에서 축적되는 아밀로이드 전구체 단백질과 같은, 돌연변이 단백질 또는 우세한 활성 유전자 생성물의 발현을 차단하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 또한 헌팅톤 질환(Huntington's disease), 유전성 파킨슨 증후군 및 그 밖의 질환의 치료에 유용한다. 안티센스 핵산은 또한 독성과 연관된 단백질의 발현을 억제하는데 유용하다.
전사를 억제하는 올리고누클레오티드의 사용은 3중 방법으로 공지된 메카니즘에 의할 수 있는데, 그 이유는 올리고머가 이중나선 DNA 주위에 감겨서, 3중 가닥 나선을 형성하기 때문이다. 따라서, 3중 화합물은 주어진 유전자상의 독특한 부위를 인식하도록 디자인될 수 있다[문헌: Maher et al., Antisense Res and Dev. (1991) 1(3):227; Helene, Anticancer Drug Dis. (1991) 6(6):569].
리보자임은 DNA 제한 엔도누클레아제와 유사한 방법으로 다른 단일 가닥 RNA를 특이적으로 분해하는 능력을 보유하는 RNA 분자이다. RNA's를 암호하는 누클레오티드 서열의 변화를 통해서, RNA 분자에서 특이적 누클레오티드 서열을 인식하고 분해하는 분자를 조작하는 것이 가능하다[문헌: Cech, J. Amer. Med Assn. (1988) 260:3030]. 이러한 방법의 주요 이점은 특정의 서열이 불활성화된 단지 mRNA's이다.
생물학적 반응 변화제를 암호하는 핵산을 전달하는 것이 요구될 수 있다. 이러한 종류의 제제에는, "인터루킨", 예를 들어, 인터루킨 1 내지 12로 분류되는 많은 시토킨을 암호하는 핵산을 포함하는 면역강화제가 포함된다. 이러한 종류의 제제에는 또한, 동일한 메카니즘에 따라서 필요적으로 작용하지는 않지만, 인터페론, 특히, 감마 인터페론(γ-IFN), 종양괴사인자(TNF) 및 과립구-대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF)가 포함된다. 이러한 핵산을 골수 세포 또는 대식세포로 전달하여 유아 효소결핍 또는 면역 결함을 치료하는 것이 요구될 수 있다. 성장인자, 독성 펩티드, 리간드, 수용체 또는 다른 생리학적으로 중요한 단백질을 암호하는 핵산이 또한 특이적 비-분할 세포내로 도입될 수 있다.
따라서, 본 발명의 재조합 렌티바이러스는 항-HIV 분자로 HIV-감염된 세포(예, T-세포 또는 대식세포)를 처리하는데 사용될 수 있다. 또한, 호흡성 상피가, 예를 들어, 낭포성 섬유증을 치료하기 위한 낭포성 섬유증 경막 전도성 조절제(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator: CFTR)에 대한 유전자를 지닌 본 발명의 재조합 렌티바이러스로 감염될 수 있다.
본 발명의 방법은 본 발명의 재조합 렌티바이러스로 생체외 감염된 세포의 이식, 또는 중추신경계내로의 생체내 감염, 뇌실 공동내로의 감염 또는 숙주 뇌의 표면상으로의 경막 감염을 포함하는 뉴로날 세포, 신경교 세포, 섬유아세포 또는 간엽 세포 이식, 또는 "접목"에 유용할 수 있다. 이러한 접목 방법은 본 기술분야에 공지되어 있으며, 문헌[Neural Grafting in the Mammalian CNS, Bjorklund ＆ Stenevi, eds. (1985)]에 기재되어 있다.
단백질 생성물의 결핍에 기인된 질환의 경우에, 유전자 전달은 정상의 유전자를 대체 치료를 위한 감염된 조직내로 도입시킬 뿐만 아니라, 안티센스 돌연변이를 사용함으로써 질환에 대한 동물 모델을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 핵산을 암호하는 인자 VIII 또는 IX를 근육, 비장 또는 간 세포의 감염에 대한 렌티바이러스내로 삽입하는 것이 요구될 수 있다.
프로모터 서열은 요구된 유전자 서열에 동족성 또는 이종성일 수 있다. 바이러스성 또는 포유동물 프로모터를 포함한 광범위한 범위의 프로모터가 사용될 수 있다. 세포 또는 조직 특이적 프로모터는 특이적 세포 군에서 유전자 서열의 발현을 표적하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 적합한 포유동물 및 바이러스성 프로모터는 본 기술분야에서 얻을 수 있다.
임의로 클로닝 단계 동안에, 패키징 시그날 및 이종성 클로닝 부위를 지니는 전달 벡터라 일컬어지는 핵산 구성물은 또한 선택 가능한 마아커 유전자를 함유한다. 마아커 유전자는 벡터의 존재를 검정하는데 사용되며, 그로 인해서, 감염 및 삽입을 확인하는데 사용된다. 마아커 유전자의 존재는 삽입체를 발현하는 단지 이들 숙주세포의 선택 및 성장을 가능하게 한다. 전형적인 선택 유전자는 항생제 및 다른 독성 물질, 예를 들어, 히스티디놀, 푸로마이신, 히그로마이신, 네오마이신, 메토트렉세이트 등 및 세포 표면 마아커에 내성을 부여하는 단백질을 암호한다.
본 발명의 재조합 바이러스는 핵산 서열을 포유동물 세포내로 전달할 수 있다. 용어 "핵산 서열"은 본원에 상세히 기재된 바와 같은 어떠한 핵산 분자, 바람직하게는 DNA를 의미한다. 핵산 분자는 DNA, cDNA, 합성 DNA, RNA 또는 이의 조합물을 포함하는 다양한 공급원으로부터 유도될 수 있다. 핵산 서열은 천연의 인트론을 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 게놈 DNA를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 게놈 DNA는 프로모터 영역, 폴리 A 서열 또는 다른 관련 서열과 함께 얻을 수 있다. 게놈 DNA는 본 기술분야에 공지된 수단에 의해서 적합한 세포로부터 추출되고 정제될 수 있다. 또한, 메신저 RNA(mRNA)가 세포로부터 분리될 수 있으며 역전사 또는 다른 수단에 의해서 cDNA를 생성시키는데 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법에 의해서 생성된 재조합 렌티바이러스는 사람 면역결핍바이러스(HIV)의 유도체이다. env는 HIV가 아닌 바이러스로부터 유도될 것이다.
본 발명의 방법은 일부 구체예에서 상기된 바와 같은 gag, pol, env, tat 및 rev와 같은 재조합 비리온의 패키징에 요구된 모든 기능을 제공하는 3개의 벡터를 제공한다. 본원에서 주지된 바와 같이, tat는 예측되지 않은 이점을 위해서 기능적으로 결실될 수 있다. 벡터가 재조합 렌티바이러스를 생성시키도록 패키징 세포주를 형질전환시키고 생성시키는데 사용되는 한, 이용되는 벡터의 수에 대해서는 제한이 없다.
벡터는 패키징 세포주내로의 형질감염 또는 감염을 통해서 도입된다. 패키징 세포주는 벡터 게놈을 함유하는 바이러스 입자를 생성시킨다. 형질감염 또는 감염에 대한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 패키징 세포주에 대한 패키징 벡터 및 전달 벡터의 공동 형질감염후에, 재조합 바이러스는 배양 배지로부터 회수되고, 본 기술분야에서 이용되는 표준 방법에 의해서 역가된다.
따라서, 패키징 구성물은 일반적으로 우세한 선택 가능한 마아커, 예컨대, neo, DHFR, Gln 합성효소, 또는 DNA와 함께 인산칼슘 형질감염, 지질감염 또는 전기영동 후, 적절한 약물의 존재하의 선택 및 클론의 분리에 의해서 사람 세포주내로 도입될 수 있다. 선택 가능한 마아커 유전자는 구성물에서 패키징 유전자에 물리적으로 결합될 수 있다.
패키징 기능이 적합한 패키징 세포에 의해서 발현되게 형성되는 안정한 세포주가 공지되어 있다. 예를 들어, 패키징 세포를 기재하고 있는 미국특허 제5,686,279호, 및 문헌[Ory et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1996) 93:11400-11406]을 참조할 수 있다.
주퍼레이(Zufferey)등은 HIV-1 env 유전자를 포함한 pol의 서열 3'가 결실되는 렌티바이러스 패키징 플라스미드를 교시하고 있다. 구성물은 tat 및 rev 서열을 함유하고, 3' LTR은 폴리 A 서열로 대체된다. 5' LTR과 psi 서열은 유도 가능한 프로모터와 같은 다른 프로모터로 대체된다. 예를 들어, CMV 프로모터 또는 이의 유도체가 사용될 수 있다.
목적하는 패키징 벡터는 렌티바이러스 단백질 발현을 증진시키고 안전성을 증진시키는 패키징 기능에 대한 추가의 변화를 함유한다. 예를 들어, gag의 업스트림에 있는 모든 HIV 서열이 제거될 수 있다. 또한, env의 다운스트림에 있는 서열이 제거될 수 있다. 게다가, 단계는 벡터를 변화시켜 RNA의 스플라이싱 및 번역을 증진시키도록 수행될 수 있다.
복제 억제 렌티바이러스를 생성하는 보다 원격의 가능성을 지니는 벡터를 제공하기 위해서, 본 발명은 전사 메카니즘을 통해서 바이러스성 발현을 촉진하는 tat 서열, 즉 조절 단백질이 기능적으로 결실되는 렌티바이러스 패키징 플라스미드를 제공한다. 따라서, tat 유전자가 부분적으로 또는 전체적으로 결실되거나, 다양한 포인트 돌연변이 또는 그 밖의 돌연변이가 tat 서열에 수행되어 유전자가 비작용성이 되게 할 수 있다. 당업자라면 공지된 기술을 이용하여 tat 유전자가 비작용성이 되게 할 수 있다.
벡터를 구성시키고, 형질감염시키고, 세포를 감염시키는데 사용된 기술이 본 기술분야에서 광범위하게 실행되고 있다. 연구자라면 특정의 조건 및 과정을 기재하고 있는 표준 공급 재료에 친숙할 것이다. 그러나, 편의를 위해서, 이하의 설명을 기재한다.
본 발명의 벡터의 구성법은 본 기술분야에서 이해되고 있는 표준 결찰 및 제한 기술을 사용한다[문헌: Maniatis et al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1982]. 분리된 플라스미드, DNA 서열 또는 합성된 올리고누클레오티드는 요구된 형태로 분해되고, 테일러되고 재결찰된다.
부위 특이적 DNA 분해는 본 기술분야에서 이해되고 있으며 구매 가능한 제한 효소의 제조자에 의해서 특정화되는 조건하에 적합한 제한 효소(또는 효소들)로 처리함으로써 수행된다(참조예, New England Biolabs, Product Catalog). 일반적으로, 약 1㎍의 플라스미드 또는 DNA 서열이 약 20㎕의 완충 용액중의 한 단위의 효소에 의해서 분해된다. 전형적으로는, 과량의 제한 효소가 DNA 기질을 완전히 분해시키는데 사용된다. 약 37℃에서 약 1시간 내지 2 시간의 인큐베이션이 가능할 수 있지만, 변화가 있을 수 있다. 각각의 인큐베이션 후에, 단백질을 페놀/클로로크롬으로 추출에 의해서 제거하는데, 후속하여 에테르로 추출될 수 있고, 핵산은 에탄올에 의한 침전에 의해서 수성 분획으로부터 회수될 수 있다. 요구되는 경우, 분해된 단편의 크기 분리를 표준기술을 이용한 폴리아크릴아미드 겔 또는 아가로스 겔 전기영동에 의해서 수행할 수 있다. 크기 분리의 일반적인 설명은 문헌[Methods of Enzymology 65:499-560 (1980)]에 기재되어 있다.
제한 분해된 단편은 50 mM 트리스(Tris)(pH 7.6), 50 mM NaCl, 6 mM MgCl2, 6 mM DTT 및 5-10 μM dNTP's중의 20℃에서 약 15분 내지 25분의 인큐베이션을 사용하여 4개의 데옥시누클레오티드 트리포스페이트(dNTP's)의 존재하에 이. 코라이 DNA 폴리머라제 I(E. coli DNA polymerase I)(Klenow)의 큰 단편으로 처리함으로써 블런트 말단될 수 있다. 4개의 dNTP's가 존재하는 경우에도, 클레노우(Klenow) 단편은 5' 스티키 말단(5' sticky end)에 충전되지만, 역 돌출 3' 단일 스트렌드를 파괴한다. 요구되는 경우에, 선택성 복구가 dNTP's중의 단지 하나를 공급함으로써 수행되거나, 스티키 말단의 특성에 의해서 지시된 제한 내에서 선택된 dNTP's로 수행될 수 있다. 클레노우로 처리한 후에, 혼합물을 침전된 페놀/클로로포름 및 에탄올로 추출한다. S1 누클레아제 또는 Bal-31에 의한 적절한 조건하에서의 처리는 어떠한 단일 가닥된 부분의 가수분해를 유도한다.
결찰은 다음 표준 조건 및 온도하에 15-50㎕ 용적으로 수행될 수 있다: 20 mM 트리스-Cl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 10mM DTT, 33 mg/ml BSA, 10 mM-50 mM NaCl, 및 40 μM ATP, 0℃의 0.01-0.02 (Weiss) 단위 T4 DNA 리가제("스티키 말단(sticky end)" 결찰의 경우) 또는 1mM ATP, 14℃의 0.3-0.6 (Weiss) 단위 T4 DNA 리가제("블런드 말단" 결찰의 경우). 분자간 "스티키 말단" 결찰은 일반적으로 33-100 ㎍/ml 전체 DNA 농도(5-100 mM 전체 말단 농도)에서 수행된다. 분자간 블런트 말단 결찰(일반적으로 10 내지 30배 몰 과량의 링커를 사용함)은 1μM 전체 말단 농도에서 수행된다.
따라서, 본 발명에 따르면, 렌티바이러스 패키징 벡터는 당업자에 의해서 결정되는 바와 같은 프로모터 및 다른 임의의 또는 필수의 조절 서열, 즉, gag, pol, rev, env, 또는 이의 조합물, 및 tat의 특이적 작용성 또는 실질적인 절제부, 및 임의로 다른 렌티바이러스 부수 유전자를 함유하도록 형성된다.
렌티바이러스 전달 벡터[문헌: Naldini et al., supra; Proc. Natl. Acad. Sci. (1996) 93:11382-11388]는 시험관내 성장 정지된 사람 세포를 감염시키고 직접적인 주입 후에 뉴우런을 성숙한 래트의 뇌내로 형질도입하는데 사용된다. 이러한 벡터는 생체내에서 마아커 유전자를 뉴우런내로 전달하는데 효율적이며, 검출 가능한 병리상태의 부재하에서 장시간의 발현이 달성되었다. 최장 시간의 시험으로서 벡터의 1회 주입 10개월 후에 분석된 동물에서는 이식 유전자 발현의 평균 수준이 감소하지 않았으며 조직 병원성 또는 면역 반응의 신호가 없었다. [문헌: Blomer et al., J. Virol. (1997) 71:6641-6649]. HIV 독성 유전자 env, vif, vpr, vpu, 및 nef가 비-분할 세포를 형질도입하는 벡터의 능력을 포함하지 않으면서 결실되는 렌티바이러스 벡터의 개선된 버전이 발생되었다. 다중으로 변성된 버전이 벡터의 생안전성을 실질적으로 개선시키고 있다(Zufferey et al., supra).
형질 도입된 세포에서, 삽입된 렌티바이러스 벡터는 일반적으로 각각의 말단에 LTR을 지닌다. 5' LTR은 특히 HIV 감염된 세포에서 재조합의 기질일 수 있는 "바이러스성" 전사체를 축적시킬 수 있다. 3' LTR은 세포 원시종양을 활성화하는 위험과 함께 다운스트림 전사를 촉진할 수 있다.
U3 서열은 주요 HIV LTR를 포함한다. U3 영역은 세포 활성화에 대한 반응에서 및 감염된 세포에서의 HIV 게놈의 기초 발현 및 유도된 발현을 변화시키는 인핸서 및 프로모터 구성요소를 함유한다. 몇몇의 프로모터 구성요소는 바이러스 복제에 기본이다. 일부의 인핸서 구성요소는 바이러스 분리물중에서 고도로 보존되고, 바이러스 발병에서 중요한 독성 인자로서 관련된다. 인핸서 구성요소는 바이러스의 상이한 세포 표적에서 복제 속도에 영향을 주는 작용을 할 수 있다[문헌: Marthas et al. J. Virol. (1993) 67:6047-6055].
5' LTR의 U3 영역의 3' 말단에서의 바이러스 전사 출발물로서, 이들 서열은 바이러스 mRNA의 일부가 아니며, 3' LTR로부터의 이의 복사체는 삽입된 프로바이러스중의 LTR's 둘 모두의 생성을 위한 주형으로 작용한다. U3 영역의 3' 복사체가 레트로바이러스 벡터 구성물에서 변경되는 경우, 벡터 RNA는 여전히 프로듀서 세포내의 무상의 5' LTR로부터 생성되지만, 표적 세포에서 재생될 수는 없다. 이러한 벡터의 형질 도입은 자손 바이러스에서 LTR's 둘 모두의 불활성화를 유도한다. 따라서, 레트로바이러스는 자가 불활성화(SIN) 바이러스이며, 이들 벡터는 신 전달 벡터(Sin transfer vector)로 공지되어 있다.
그러나, 3' LTR에서의 결실 범위에 대한 제한이 있다. 먼저, U3 영역의 5' 말단은 벡터 전달에서 또 다른 기본 기능을 나타내어서 삽입에 요구된다(말단 디누클레오티드 + att 서열). 따라서, 말단 디누클레오티드 및 att 서열은 결실될 수 있는 U3 서열의 5' 경계를 나타낼 수 있다. 또한, 약간의 느슨하게 한정된 영역은 R 영역내의 다운스트림 폴리아데닐화 부위의 활성에 영향을 줄 수 있다. 3' LTR로부터의 U3 서열의 과다한 결실은 프로듀서 세포내의 벡터의 역가 및 표적 세포내의 이식 유전자 발현 둘 모두에 대한 역효과로 벡터 전사체의 폴리아데닐화를 감소시킬 수 있다. 반면, 제한된 결실은 형질도입된 세포내의 LTR의 전사 활성을 억제할 수 없다.
본원에 기재된 렌티바이러스 전달 벡터의 새로운 버전은 3' LTR의 U3 영역의 증가된 결실을 지닌다(도 1: U3 결실은 U3 LTR의 누클레오티드-418로부터 지시된 위치: SIN-78, SIN-45, SIN-36 및 SIN-18까지 이어진다). 3' LTR로부터의 U3 서열의 거의 완전한 결실이 있는 렌티바이러스 벡터를 프로듀서 세포내의 벡터의 역가 또는 표적 세포내의 이식 유전자 발현을 약화시키지 않으면서 발달시켰다. 가장 광범위한 결실(-418 내지 -18)은 TATA box까지 연장되어, 형질도입된 세포내의 LTR의 어떠한 전사 활성을 억제한다. 따라서, TATA box를 포함하는 한 3' 결실의 낮은 제한이 연장될 수 있다. 결실은 R 영역에 이르는 U3 영역의 잔류부일 수 있다. 본 기술분야에 공지된 방법을 실행하는 다양한 결실부가 생성되었다.
놀랍게도, 이식 유전자의 평균 발현 수준은 모다 무상의 벡터에 비해서 SIN 벡터에 의해 유도된 세포에서 보다 높았다. 이러한 결과는 내부 프로모터상의 업스트림 HIV LTR로부터의 전사 방해의 제거에 기인되는 듯하다. U3 영역의 이러한 연장성 결실을 나타낸 SIN 형 벡터는 형질도입의 효율을 약화시키지 않으면서 쥐 백혈병 바이러스(MLV) 기재된 레트로바이러스 벡터에 대해서 생성될 수 없다.
전달 벡터 구성물의 5' LTR은 U3 영역의 전사 조절 구성요소 전부 또는 일부를 이종성 인핸서/프로모터로 치환함으로써 변화되었다. 변화는 프로듀서 세포내의 전달 벡터 RNA의 발현을 증진시키고; HIV tat 유전자의 부재하에 벡터가 생성되게 하고; 3' 결실된 버전과 재조합하여 상기된 SIN 벡터를 회복시킬 수 있는 HIV LTR의 업스트림 야생형 복사체를 제거하도록 형성되었다.
따라서, 5' LTR, 5' 벡터에서의 상기된 변화를 함유하는 벡터는 발현을 증진시키는 서열 때문에 전달 벡터로 사용될 수 있으며, tat를 발현하지 않는 패키징 세포와 함께 사용될 수 있다.
그러한 5' 벡터는 또한 상기된 바와 같은 3' LTR에서의 변화를 지녀서 발현을 단지 증진시키지 않는 개선된 전달 벡터를 생성시키며, tat를 발현시키지 않지만 자가 불활성화를 할 수 있는 패키징 세포에 사용될 수 있다.
HIV LTR로부터의 전사는 tat 단백질의 트랜스 활성화제 기능에 매우 의존적이다. 프로듀서 세포에 존재하는 코어 패키징 구성물에 의해서 발현되는 tat의 존재하에, HIV LTR로부터의 벡터 전사가 강하게 자극된다. 전장 "바이러스" RNA가 패키징 시그날의 전체 보충물을 지니는 바와 같이, RNA는 벡터 입자내로 효율적으로 엔캡시데이션되고 표적 세포로 전달된다. 프로듀서 세포에 패키징할 수 있는 벡터 RNA의 양은 감염성 벡터의 생성에서 속도 제한 단계이다.
5' LTR의 인핸서 또는 인핸서 및 프로모터 영역은 각각 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 또는 쥐 로우스 육종 바이러스(RSV)의 인핸서 또는 인핸서 및 프로모터로 치환되었다(참조, 하이브리드 벡터의 코드 명칭 및 구성물의 도식적인 도면에 대한 도 2). CCL과 RRL 벡터는 5' U3 영역이 완전히 치환된다.
대조 렌티벡터 HR2 및 5' 하이브리드의 패널을 전달 벡터로 형질 감염된 프로듀서 세포에서 비교하고, tat 트랜스 활성화제를 제공하는 패키징 구성물 없이 또는 그와 함께 비교하였다. 4개의 키메라 벡터의 전사 수준은 패키징 구성물의 존재 및 부재 둘 모두하에서 대조 렌티벡터의 수준 보다 높다. 모든 키메라 벡터는 이식 유전자를 표적 세포내로 효율적으로 전달하고 대조 HR2 벡터 뿐만 아니라 RRL 벡터도 수행한다. 결과적으로, 표적 세포내의 벡터의 삽입이 형질 도입 후 초기 및 후기 단계에서 형질도입된 세포를 시험함으로써 확인되었다. 이식 유전자 양성 세포의 백분율이 증가되지 않아서 벡터가 삽입되었음을 나타냈다.
패키징 구성물의 부재하에 프로듀서 세포에서 얻은 5' LTR 변화된 전달 벡터 RNA의 높은 발현 수준은 생성 벡터가 작용성 tat 유전자의 부재하에 작용성임을 나타낸다. 상기된 패키징 플라스미드에 대해 지시된 바와 같은 tat 유전자의 작용성 결실은 주어진 렌티바이러스 벡터 시스템에 높은 생안정성를 부여하여, 발병 활성의 횟수가 tat 단백질과 연관되게 한다. 따라서, 현저하게 개선된 생안정성의 랜티바이러스 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 적은 tat 패키징 벡터와 함께 사용되는 5' 말단 또는 3' 말단에서의 HIV LTR의 야생형 복사체를 함유하지 않는 SIN 전달 벡터이다.
바이러스 상등물은 형질감염 48시간 후에 상등물 여과와 같은 표준 기술을 사용함으로써 수거된다. 바이러스 역가는 8㎍/ml 폴리브렌(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)의 존재하에 적절한 양의 바이러스 상등물로, 예를 들어, 106NIH 3T3 세포 또는 105HeLa 세포를 감염시킴으로써 결정된다. 48 시간 후에, 형질도입 효율을 검정한다.
따라서, 본 발명은 고 역가 재조합 바이러스를 생성시키는 방법 및 수단을 제공한다. 이들 바이러스 입자 제제는 본 기술분야에 공지된 표준 기술을 사용함으로써 표적세포를 감염시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 표적세포가 숙주로부터 제거되고 공지된 기술을 사용함으로써 배양중에 형질전환되고, 숙주로 되돌려지는 생체외 유전자 치료용으로 사용될 수 있다.
본 발명을 이하 상세히 기재하고 있는데, 이하의 설명은 본 발명의 다양한 구체예를 입증하는 실시예로서 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1
렌티바이러스 패키징 플라스미드의 구성
렌티바이러스 패키징 플라스미드를 상기 주퍼레이(Zufferey)등의 문헌에 기재된 플라스미드 pCMV△R8.9(△Vpr△Vif△Vpu△Nef)로부터 유도하였다. pCMV△R8.9내의 nef 유전자의 모든 잔류 서열을 XhoI와 BstEII으로 분해시키고, 클레노우에 충전시키고 재결찰시킴으로써 제거하였다. 구성물을 100 염기쌍을 결실시켜, HIV-1의 절단된 env 리딩 프레임을 게놈 인슐린 폴리아데닐화 부위에 결합시키고 플라스미드 pCMV△R8.73을 생성시켰다.
또 다른 구체예에서, CMV 프로모터의 다운스트림에 있는 CMV-유도된 서열중 133 염기쌍을 플라스미드 pCMV△R8.73에서 결실시켰다. 이러한 서열은 스플라이스 공여체 부위를 함유하며, 플라스미드 pCMV△R8.73을 SacII으로 분해하고 큰 단편을 재결찰시킴으로써 제거되어, 플라스미드 pCMV△R8.74를 형성시켰다.
또 다른 구체예에서, gag 유전자의 개시코돈의 업스트림에 있는 플라스미드 pCMV△R8.74에 잔류하는 모든 HIV-유도된 서열을 교감 5' 스플라이스 공여체 부위를 제외하고 제거하였다. 동시에, gag 유전자의 업스트림에 있는 서열을 최적의 번역 효율을 위해서 변화시켜서, 플라스미드 pCMV△R8.75를 얻었다. pCMV△R8.75는 94 bp SstII-ClaI 단편을 5'-GGGACTGGTGAGTGAATTCGAGATCTGCCGCCGCCATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGAT-3' (서열: ) 및 5'-CGATCTAATTCTCCCCCGCTTAATACTGACGCTCTCGCACCCATGGCGGCGGCAGATCTCGAATTCACTCACCAGTCCCGC-3' (서열: )으로 구성되는 SstII-ClaI 올리고누클레오티드 링커로 대체함으로써 pCMV△R8.74로부터 유도하였다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 유도 가능한 패키징 구성물은 CMV 프로모터를 함유하는 pCMV△R8.74의 PstI-SacII 단편을 최소 CMV 프로모터에 결합된 테트라사이클린 오퍼레이터 서열의 일곱 개의 직렬 복사체로 대체함으로써 얻었다. tet-조절된 패키징 플라스미드 pTet △R8.74를 얻었다.
실시예 2
렌티바이러스 전달 벡터의 구성
렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드를 문헌[Naldini et al., Sci. (1996) 272:263-267]에 기재된 바와 같이 플라스미드 pHR'-CMV-LacZ로부터 유도하였다. pHR2는 PHR'내의 3' LTR의 업스트림에 존재하는 nef 서열의 124bp가 폴리링커로 대체되어 HIV1 서열을 감소시키고 이식유전자 클로닝을 촉진하는 렌티바이러스 전달 벡터이다. pHR2는 주형으로서 pHR'-CMV-LacZ 및 올리고누클레오티드, 5'-CCATCGATCACGAGACTAGTCCTACGTATCCCCGGGGACGGGATCCGCGGAATTCCGTTTAAGAC-3' (서열: )과 5'-TTATAATGTCAAGGCCTCTC-3' (서열: )을 3 부분 결찰에서 pHR'-CMV-LacZ로부터의 4.4kb StuI-NcoI 단편 및 4.5 kb NcoI-claI 단편과 함께 사용하는 PCR에 의해서 생성된 828 bp ClaI-StuI 단편으로 4.6kb ClaI-StuI 단편을 대체함으로써 pHR'-CMV-LacZ로부터 유도하였다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, pHR3은 pHR2내의 Rev 반응 구성요소(RRE)의 업스트림에 존재하는 env 코딩서열(ATG를 포함)의 148bp가 결실되는 렌티바이러스 전달 벡터이다. pHR3은 주형으로서 pHR2를 올리고누클레오티드 프라이머, 5'-GCGGCCGCAGGAGCTTTGTTCCTTGG-3' (서열: )과 5'-TACGTAGGACTAGTCTCG-3' (서열: )과 함께 사용하는 PCR에 의해서 생성된 747 bp NotI-SpeI 단편으로 pHR2의 893bp NotI-SpeI 단편을 대체함으로써 pHR2로부터 유도하였다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, pHR5는 310 bp gag 코딩 서열(Gag 단백질의 아미노산 15의 다운스트림에 있는 모든 gag 코딩 서열)이 pHR2로부터 결실되는 렌티바이러스 전달 벡터이다. pHR5는 pHR2를 NruI로 분해시키고, NotI 링커(합성 올리고누클레오티드 5'-TTGCGGCCGCAA-3', 서열: )를 첨가하고, NotI로 분해시켜서 310bp 단편을 절제한 다음, 재결찰시킴으로써 유도되었다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, pHR6는 5' 스플라이스 공여체 시그날이 돌연변이(TGGT에서 TGAT로)되어, 패키징될 수 있는 전장 전사체의 생성을 증진시키는 렌티바이러스 벡터이다. pHR6는 주형으로서 pHR2를 올리고누클레오티드 프라이머 5'-CCACTGCTTAAGCCT-3' (서열: )과 5'-CAAAATTTTTGGCGTACTCATCAGTCGCCGCCCCTCG-3' (서열: )과 함께 사용하는 PCR에 의해서 생성된 239 bp AflII-ApoI 단편으로 239bp AflII-ApoI 단편을 대체함으로써 pHR5로부터 유도하였다.
모든 PCR 단편은 먼저 PCR 반응 생성물을 TA 클로닝 벡터 pCR2.1(Invitrogen)내로 직접적으로 클로닝한 다음, 서열 확인하고 적절한 효소로 절제함으로써 생성되었다.
실시예 3
5' LTR 키메라 렌티바이러스 전달 벡터의 구성
본 발명의 또 다른 구체예에서, 렌티바이러스 벡터의 5' LTR은 HIV-1의 R 영역에 결합된 로우스 육종 바이러스(RSV)의 U3 영역으로부터의 인핸서 및 프로모터를 함유한다.
pRRL은 RSV의 인핸서 및 프로모터(전사 출발부위와 관련된 누클레오티드 -233 내지 -1)는 올리고누클레오티드 링커를 사용함으로써 HIV-1의 R 영역에 정확하게 융합된다. pRRL은 플라스미드 pRT43.RSV.F3(참조, WO97/07225호)으로부터 유도되며, 올리고누클레오티드 5'-AATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGGGTCTCTCTGGTTAGACCA-3' (서열: ) 및 5'-GATCTGGTCTAACCAGAGAGACCCGTTTATTGTATCGAGCTAGGCACTTAAATACAATATCTCTGCAATGCGGC-3' (서열: )로 구성되는 합성 EcoRI-BglII 올리고누클레오티드 링커와 함께 pHR2로부터의 1.7kb NotI-StuI 단편과 pHR2로부터의 .67 kb BglII-NotI 단편으로 pRT43.RSV.F3의 3.4kb EcoRI-HpaI 단편을 대체함으로써 pHR2로부터 유도되었다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 렌티바이러스 벡터의 5' LTR은 HIV-1(플라스미드 pRLL)의 프로모터 영역(전사 출발 부위와 관련된 위치 -78bp로부터)에 결합된 로우스 육종 바이러스(RSV)의 인핸서(전사 출발 부위와 관련된 누클레오티드-233 내지 -50)를 함유한다.
pRLL은 RSV의 인핸서가 올리고누클레오티드 링커를 사용함으로써 HIV-1의 프로모터 영역에 융합된다. pRRL은 올이고누클레오티드 5'-AATTGGAGGCGTGGCCTGGGCGGGACTGGGGAGTGGCGAGCCCTCAGATC-3' (서열: ) 및 올리고누클레오티드, 5'-CTGAGGGCTCGCCACTCCCCAGTCCCGCCCAGGCCACGCCTCC-3' (서열: )로 구성되는 합성 EcoRI-AlwNI 올리고누클레오티드 링커와 함께 pHR2로부터의 1.7 kb NotI-StuI 단편과 pHR2로부터의 .724kb AlwNI-NotI 단편으로 pRT43.RSV.F3의 3.4 kb EcoRI-HpaI 단편을 대체함으로써 pHR2 및 플라스미드 pRT43.RSV.F3으로부터 유도되었다.
본 발명의 또 다른 구체예(플라스미드 pCCL)에서, 렌티바이러스 벡터의 5' LTR은 HIV-1의 R 영역에 결합된 사람 사이토메갈로바이러스(CMV)의 초기 인핸서 및 프로모터(문헌[Boshart et al. (Cell (1985) 41:521-530]에 따른 전사 출발 부위와 관련된 누클레오티드 -673 내지 -1)를 함유한다. pCCL은 올리고누클레오티드, 5'- CGTTTAGTGAACCGGGGTCTCTCTGGTTAGACCA-3' (서열: ) 및 5'-GATCTGGTCTAACCAGAGAGACCCCGGTTCACTAAACGAGCT-3' (서열: )로 구성되는 합성 SstI-BglII 올리고누클레오티드 링커와 함께 pHR2로부터의 1.7kb NotI-StuI 단편과 pHR2로부터의 1.7kb BglII-NotI 단편으로 pRT43.2F3의 3.8kb SstI-HpaI 단편을 대체함으로써 pHR2 및 플라스미드 pRT43.2F3(미국특허 제5,686,279호)으로부터 유도되었다.
본 발명의 또 다른 구체예(플라스미드 pCLL)에서, 렌티바이러스 벡터의 5' LTR은 HIV-1의 프로모터 영역(전사 출발 부위와 관련된 위치 -78 bp로부터)에 결합된 사이토메갈로바이러스(CMV)의 전사 출발 부위와 관련된 인헨서 누클레오티드 -220 내지 -673을 함유한다. pCLL은 올리고누클레오티드, 5'-CATGGAGGCGTGGCCTGGGCGGGACTGGGGAGTGGCGAGCCCTCAGATC-3' (서열: ) 및 올리고누클레오티드, 5'-CTGAGGGCTCGCCACTCCCCAGTCCCGCCCAGGCCACGCCTC-3' (서열: )로 구성되는 합성 NcoI-AlwNI 올리고누클레오티드 링커와 함께 pHR2로부터의 1.7kb NotI-StuI 단편과 pHR2로부터의 .724 kb AlwNI-NotI 단편으로 pRT43.2F3의 3.6 kb NcoI-HpaI 단편을 대체함으로써 pHR2 및 플라스미드 pRT43.2F3으로부터 유도되었다.
실시예 4
자가 불활성화 렌티바이러스 벡터의 구성
pRRL.SIN-18은 분해 및 재결찰에 의해서 3' LTR에서 400 bp EcoRV-PvuII 단편을 결실시킴으로써 pRRL로부터 유도되었다.
pRRL.SIN-36은 pRRL로부터의 .54 kb AlwN-AvrII 단편과 6.1 kb AvrII-BbsI 단편과 함께 3 부분 결찰에서 합성 올리고누클레오티드, 5'-GATATGATCAGATC-3' (서열: ) 및 5'-CTGATCA-3'로 구성되는 올리고누클레오티드 링커로 3' LTR내의 493 bp BbsI-AlwNI 단편을 대체함으로써 pRRL로부터 유도되었다.
pRRL.SIN-45는 pRRL로부터의 .54 kb AlwNl-AvrII 단편 및 6.1 kb AvrII-BbsI 단편과 함께 3 부분 결찰에서 합성 올리고누클레오티드, 5'-GATATGATCAGAGCCCTCAGATC-3' (서열: ) 및 5'-CTGAGGGCTCTGATCA-3' (서열: )로 구성되는 올리고누클레오티드 링커로 3' LTR내의 493 bp BbsI-AlwNI 단편을 대체함으로써 pRRL로부터 유도되었다.
pRRL.SIN-78은 pRRL로부터의 .54 kb AlwNI-AvrII 단편 및 6.1 kb AvrII-BbsI 단편과 함께 3 부분 결찰에서 5'-GATATGATCAGGAGGCGTGGCCTGGGCGGGACTGGGGAGTGGCGAGCCCTCAGATC-3' (서열: ) 및 올리고누클레오티드 5'-CTGAGGGCTCGCCACTCCCCAGTCCCGCCCAGGCCACGCCTCCTGATCA-3' (서열: )로 구성되는 올리고누클레오티드 링커로 3' LTR내의 493 bp BbsI-AlwNI 단편을 대체함으로써 pRRL로부터 유도되었다.
실시예 5
안정한 렌티바이러스 패키징 세포 00-28 및 렌티바이러스 벡터의 안정한 프로듀서의 구성
293G 세포주를 안정한 렌티바이러스 패키징 세포를 생성시키는데 사용하였다. 293G 세포는 MD 카세트로부터의 tetR/VP16 트랜스 활성화제(사람 β 글로빈 유전자로부터의 CMV 프로모터 및 중재 서열-엑손 2 및 3, 인트론 2- 및 폴리(A) 부위)를 발현하고, 최소 CMV 프로모터로부터의 VSV 엔벨로프는 7개의 테트라사이클린 오퍼레이터 부위 (tet0)의 직렬 반복체에 결합된다. VSV G의 발현은 따라서 배양 배지에서 테트라사이클린의 수준에 의해서 조절되어, 항생제의 존재하에 억제된다[문헌: Gossen ＆ Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:5547-5551; Ory et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 93:11400-11406]. 293G 세포는 통상적으로 10% 공여체 송아지 혈청으로 보충되고 1㎍/ml 테트라사이클린을 함유하는 DMEM/저 글루코스 배양 배지에서 유지되었다. 293G 세포의 15cm 플레이트를 리포펙타민(GIBCO BRL)을 사용하여 13.36㎍의 패키징 플라스미드 pCMV△R8.74 및 1.33㎍의 선택 플라스미드 pZeoSV2로 형질감염시켰다. 배지를 24 시간에서 바꾸고, 48시간에서 세포를 250㎍/ml 제오신(zeocin) 및 1㎍/ml 테트라사이클린을 함유하는 배지내로 따라냈다. 선택 3 내지 4주 후에, 250 클론을 취하여 96 웰 플레이트에 전달하고, 배지를 구매 가능한 키트를 사용함으로써 면역포집에 의해서 HIV-1 p24 Gag 항원에 대해서 스크리닝하였다. 52의 p24 양성 클론을 추가의 분석을 위하여 성장시켰다. 최대 5 클론을 12-23 ng/ml의 p24 값을 지니도록 결정하였다. 5 클론중 4클론은 웨스턴 블롯 분석에 의한 테트라사이클린 회수 후의 VSV.G 발현에 대해서 양성이었다.
4개의 p24/VSV.G 양성 클론을 렌티바이러스 전달 벡터를 패키징하는 능력에 대해서 추가로 분석하였다. 이러한 클론을 10회 감염의 다중성에서 폴리브렌 (8㎍/ml)의 존재하에, CMV 프로모터에 의해서 유도된 그린 플루오레슨트 프로테인 오브 에이. 빅토리아(Green Fluorescent Protein of A. victoria)(gFP)에 대한 발현 카세트를 함유하는 일시적으로 생성된 렌티바이러스 벡터(VSV.G 의사형)로 감염시켰다. 감염된 클론을 이어서 확장시키고 테트라사이클린을 제거하였다. 인큐베이션 72시간 후에, 24 시간 배지수거를 수행하고, 상등물을 여과하고 플래시 동결시켰다. 동결된 상등물을 GFP 유전자의 형질도입을 위한 원시 HeLa 세포에 대해서 적정하였다. FACS 분석에 의해서, 패키징 클론 00-28의 감염으로부터 생성된 세포 군(10-28로 명명됨)이 5 x 104형질도입 단위(T.U.)/ml의 가장 높은 역가를 지님을 측정하였다.
감염된 패키징 군, 즉, 10-28을 GFP 렌티바이러스 벡터의 고 역가 프로듀서 클론의 생성을 위해서 사용하였다. 10-28 세포를 FACS에 의해서 분류하고, 가장 높은 GFP 발현 세포를 유지시키고 확장시켰다. 이러한 세포 군을 이어서 일시적으로 생성된 GFP 렌티바이러스(VSV.G 의사형)로 추가로 4회 연속적으로("핀지드(pinged)") 감염시켰다. 각각의 감염 후에, 상등물을 VSV.G 유도 72 내지 96시간 후에 수거하였다. 상등물을 HeLa 세포상에서 적정하고 면역포집 검정에 의해서 p24 함량에 대해 분석하였다. 감염성 역가는 3 차 핑(ping)이 1.5 x 106T.U./ml에 달한 후에 최대가 되었다(도 3). 3차 핑으로부터의 세포 군을 서브클로닝하여, 고 역가 벡터 프로듀서를 분리하였다.
본 명세서에서 인용된 모든 문헌 및 특허원은 각각의 문헌 또는 특허원이 참조로 인용되는 것으로 특별히 개별적으로 기재되고 있는 바와 같이 본원에서 전체 내용이 참조로 인용되고 있는 것이다.
본 발명이 속하는 기술분야의 전문가에게는 자명한 바와 같이, 본 발명은 상기 본원에서 특별히 기재하고 있는 형태 이외의 형태로서, 예를 들어, 본 발명의 기본적인 특징 또는 사상을 벗어나지 않으면서 다른 포유동물 세포형을 형질감염시키고 형질도입시키는 것을 포함한다. 상기된 본 발명의 특정의 구체예는 따라서 본 발명을 단지 예시하고자 하는 것이며 이로써 본 발명을 제한하는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 상기된 설명에 함유된 실시예로 한정되는 것이 아니라 첨부된 청구범위에 기재된 사항으로 보아야 한다.
서열 목록

Claims (18)

  1. U3 영역을 각각 함유하는 5' LTR 및 3' LTR를 포함하는 렌티바이러스 전달 벡터로서, 5' LTR의 U3 영역의 조절 구성요소중의 일부 또는 전부가 렌티바이러스에 내생성이 아닌 포유동물 세포에서 작동 가능한 또 다른 조절 구성요소에 의해서 대체되는 렌티바이러스 전달 벡터.
  2. 제 1항에 있어서, 3' LTR의 U3 영역의 하나 이상의 누클레오티드 염기가 결실됨을 특징으로 하는 렌티바이러스 전달 벡터.
  3. 제 1항에 있어서, 렌티바이러스에 내생성이 아닌 조절 구성요소가 사이토메갈로바이러스 인핸서, 프로모터 또는 인핸서/프로모터임을 특징으로 하는 렌티바이러스 전달 벡터.
  4. 제 1항에 있어서, 렌티바이러스에 내생성이 아닌 조절 구성요소가 로우스 육종 바이러스 인핸서, 프로모터 또는 인핸서/프로모터임을 특징으로 하는 렌티바이러스 전달 벡터.
  5. 제 2항에 있어서, 결실된 U3 영역이 5' 말단 디누클레오티드 및 att 서열을 제외한 모든 U3 영역임을 특징으로 하는 렌티바이러스 전달 벡터.
  6. 제 5항에 있어서, 결실된 U3 영역이 TATA box 서열을 포함함을 특징으로 하는 렌티바이러스 전달 벡터.
  7. 제 1항에 있어서, 벡터가 발현되는 이종성 유전자를 지님을 특징으로 하는 렌티바이러스 전달 벡터.
  8. 제 1항에 있어서, 렌티바이러스가 사람 면역결핍바이러스(HIV)임을 특징으로 하는 렌티바이러스 전달 벡터.
  9. 제 8항에 있어서, HIV가 HIV-1임을 특징으로 하는 렌티바이러스 전달 벡터.
  10. 렌티바이러스에 내생성인 gag의 업스트림에 있는 서열이 결여되고 렌티바이러스에 내생성인 env의 다운스트림에 있는 서열이 결여된 렌티바이러스 패키징 플라스미드.
  11. 제 10항에 있어서, 플라스미드가 발현되는 gag, 발현되는 pol 또는 발현되는 gag 및 pol 유전자를 지님을 특징으로 하는 렌티바이러스 패키징 플라스미드.
  12. 제 10항에 있어서, 플라스미드가 비작용성 tat 유전자를 지님을 특징으로 하는 렌티바이러스 패키징 플라스미드.
  13. 제 10항에 있어서, 렌티바이러스가 사람 면역결핍바이러스(HIV)임을 특징으로 하는 렌티바이러스 패키징 플라스미드.
  14. 제 13항에 있어서, HIV가 HIV-1임을 특징으로 하는 렌티바이러스 패키징 플라스미드.
  15. 재조합 렌티바이러스 벡터를 생성시키는 방법으로서,
    a) 세포를 i) 렌티바이러스에 내생성인 gag의 업스트림에 있는 서열이 결여되고 렌티바이러스에 내생성인 env의 다운스트림에 있는 서열이 결여되어 있으며, 하나 이상이 발현되는 gag, 발현되는 pol 또는 발현되는 gag 및 pol 유전자를 지니는 하나 이상의 렌티바이러스 패키징 플라스미드, 및 ii) 렌티바이러스에 내생성이 아닌 발현되는 env 유전자를 지니는 렌티바이러스에 내생성이 아닌 발현 플라스미드로 형질전환시켜서, 패키징 세포를 생성시키고;
    b) 패키징 세포를 발현되는 이종성 유전자를 지니는 렌티바이러스 전달 벡터로 다중 형질전환시켜서, 프로듀서 세포를 생성시키고;
    c) 배지에서 프로듀서 세포를 배양하고;
    d) 배지로부터 프로듀서 세포를 분리하여 배지로부터 재조합 렌티바이러스 벡터를 회수함을 포함하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 패키징 세포가 비작용성 tat 유전자를 지님을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 15항에 있어서, 렌티바이러스 전달 벡터가 U3 영역을 각각 함유하는 5' LTR 및 3' LTR을 포함하며, 5' LTR의 U3 영역의 조절 구성요소 일부 또는 모두가 렌티바이러스에 내생성이 아닌 포유동물 세포에서 작동 가능한 또 다른 조절 구성요소에 의해서 대체됨을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 3' LTR의 U3 영역의 하나 이상의 누클레오티드 염기가 결실됨을 특징으로 하는 방법.
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