KR20240021898A - 돌연변이된 아넥신 a5 폴리펩타이드 및 치료 목적을 위한 이의 용도 - Google Patents

돌연변이된 아넥신 a5 폴리펩타이드 및 치료 목적을 위한 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20240021898A
KR20240021898A KR1020247001242A KR20247001242A KR20240021898A KR 20240021898 A KR20240021898 A KR 20240021898A KR 1020247001242 A KR1020247001242 A KR 1020247001242A KR 20247001242 A KR20247001242 A KR 20247001242A KR 20240021898 A KR20240021898 A KR 20240021898A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
annexin
mutated
polypeptide
amino acid
leu
Prior art date
Application number
KR1020247001242A
Other languages
English (en)
Inventor
올리비에 블랑-브뤼드
룹카 루메니나
Original Assignee
인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔)
쏘흐본느 유니베흐시테
유니베르시떼 파리 시테
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔), 쏘흐본느 유니베흐시테, 유니베르시떼 파리 시테 filed Critical 인쎄름 (엥스띠뛰 나씨오날 드 라 쌍떼 에 드 라 흐쉐르슈 메디깔)
Publication of KR20240021898A publication Critical patent/KR20240021898A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4721—Lipocortins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)

Abstract

본 발명자는, 새로운 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드로서 이에 대한 헴의 결합이 급격하게 감소하지만, 포스파티딜세린을 지닌 막에 대한 결합은 헴의 존재하에서 또는 혈관내 용혈 동안에 동일한 수준으로 유지되는 새로운 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드를 생성하였다. 따라서, 돌연변이된 폴리펩타이드는 PS 또는 PS를 지닌 막에 의해 향상된 반응을 이용하기 위해, 가장 특히 혈전성, 혈관-폐쇄성 및 용혈 상태가 공존하는 병리학에서 치료학적 목적에 특히 적합할 수 있다.

Description

돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드 및 치료 목적을 위한 이의 용도
본 발명은 의약(medicine), 특히 혈액학 분야에 관한 것이다.
아넥신 A5는 진화 과정에서 고도로 보존된 단백질의 그룹인 아넥신 계열(Annexin family)에 속한다. 이는 구조적으로 상동성이며, Ca2+에 의해 조절된 막 결합 성분(membrane-bound element)으로 고려된다. 아넥신 A5는 혈장막 소엽(plasma membrane leaflet)에 노출된 포스파티딜세린(phosphatidylserine; PS)에 대해 높은 친화성을 갖는다. 그 외에도, 아넥신 A5는 혈액 혈소판, 엑소좀(exosome), 또는 심지어 나노구조 리포좀(nanostructured liposome)과 같은 거의 막 소포(membranous vesicle)의 모든 작은 형태(tiny form)의 어떠한 PS-함유 인지질 이중층(PS-containing phospholipid bilayer)에도 결합할 수 있다. 아넥신 A5는 직접적인 치료 효과를 제공하는 데 있어 의약에서 광범위한 효용성을 갖는 것으로 알려져 있다. 예는, WO 2012120130에 기술된 바와 같이 낫형 세포 질환(sickle cell disease)을 앓고 있는 환자의 혈관 폐색 위기(vaso-occlusive crisis)를 방지하기 위한; WO 2005099744에 기술된 바와 같이 죽상 혈전증 및/또는 플라크 파열(plaque rupture)의 방지를 위한; WO 2009077764에 기술된 바와 같이 혈관 기능장애의 치료, 허혈성 통증의 감소 및/또는 혈관 질환 파열의 치료를 위한; WO 2009103977에 기술된 바와 같이 재협착의 예방 또는 치료를 위한; WO 2010/069605에 기술된 바와 같은 산화된 카디오리핀(oxCL)의 활성 억제에서 사용하기 위한 및 심혈관 질환, 자가 면역 질환 또는 염증 상태의 치료, 방지 및/또는 발병 위험을 감소시키기 위한; 및 WO 2012136819에 기술된 바와 같은 수술 개입 후 수술 전후(perioperative) 또는 수술 후(postoperative) 합병증, 예를 들면, 혈관 수술, 특히 말초 혈관 수술 후 합병증의 방지 및/또는 감소를 위한 아넥신 A5의 용도를 포함한다. 따라서, 아넥신 A5는 치료학적 관심과 잠재력이 높은 단백질을 나타낸다. 최근에 헴(heme)이 용혈 동안 아넥신 A5에 결합하여 세포막 포스파티딜세린과의 상호작용을 방지함이 밝혀졌다. 따라서, 이러한 결과는 아넥신 A5의 치료 효과가 용혈 상태에서 감소될 수 있음을 시사한다.
본 발명은 청구범위에 의해 정의된다. 특히, 본 발명은 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드 및 이의 치료학적 용도에 관한 것이다.
주요 정의:
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이 용어는 또한 변형된 아미노산 중합체, 예를 들어 이황화물 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 포스포릴화, 또는 표지 구성성분(labeling component)과의 접합을 포함한다. 유전자 치료요법의 맥락에서 논의될 때 폴리펩타이드는 각각의 온전한 폴리펩타이드, 또는 이의 임의의 단편 또는 유전적으로 조작된 유도체를 지칭하며, 이는 온전한 단백질의 원하는 생화학적 기능을 유지한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드, 또는 이들의 유사체를 포함하는, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 메틸화된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체와 같은 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 비-뉴클레오타이드 구성성분에 의해 중단될 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 중합체의 조립 전 또는 조립 후에 부여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 폴리뉴클레오타이드는 이중 가닥 및 단일 가닥 분자를 상호교환적으로 지칭한다. 달리 명시되거나 요구되지 않는 한, 폴리뉴클레오타이드인 본원에 기술된 발명의 임의의 구현예는 이중 가닥 형태, 및 이중 가닥 형태를 구성하는 것으로 공지되거나 예측되는 2개의 상보적인 단일 가닥 형태 각각 둘 다를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 표현 "로부터 유래된"은 제1 구성성분(예를 들어, 제1 폴리펩타이드), 또는 이러한 제1 구성성분으로부터의 정보가 상이한 제2 구성성분(예를 들어, 제1 폴리펩타이드와 상이한 제2 폴리펩타이드)을 단리, 유도 또는 제조하는데 사용되는 공정을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "아넥신 A5"는 당업계에서 일반적인 의미를 가지며, 아넥신 계열에 속하고 칼슘 의존적 방식으로 외부화된(externalized) 포스파티딜세린에 결합하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 이 용어는 안코린(Anchorin) CII, 아넥신 V, 아넥신-5n 칼포빈딘 I(CBP-I), 엔도넥신 II, 리포코르틴 V, 태반 항응고 단백질 4(Placental anticoagulant protein; PP4), 태반 항응고 단백질 I(Placental anticoagulant protein; PAP-I), 트롬보플라스틴 억제제 및 혈관 항응고제-알파(Vascular anticoagulant-alpha; VAC-알파)로서 또한 알려져 있다. 아넥신 A5의 예시적인 아미노산 서열은 서열번호: 1로 나타난다.
서열번호: 1 >NP_001145.1 아넥신 A5 [호모 사피엔스]
MAQVLRGTVTDFPGFDERADAETLRKAMKGLGTDEESILTLLTSRSNAQRQEISAAFKTLFGRDLLDDLK
SELTGKFEKLIVALMKPSRLYDAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVYEEEYGSSLEDD
VVGDTSGYYQRMLVVLLQANRDPDAGIDEAQVEQDAQALFQAGELKWGTDEEKFITIFGTRSVSHLRKVF
DKYMTISGFQIEETIDRETSGNLEQLLLAVVKSIRSIPAYLAETLYYAMKGAGTDDHTLIRVMVSRSEID
LFNIRKEFRKNFATSLYSMIKGDTSGDYKKALLLLCGEDD
본원에서 사용된 바와 같이, 두 서열 사이의 "동일성 퍼센트(percent identity)"는, 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는, 갭(gap)의 수, 및 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수(즉, 동일성 % = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100)이다. 두 서열 사이의 서열 비교 및 동일성 퍼센트의 측정은 하기에 기술된 바와 같이, 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 두 아미노산 서열 간의 동일성 퍼센트는 니들만(Needleman ) 및 운슈(Wunsch) 알고리즘(Needleman, Saul B. & Wunsch, Christian D. (1970). "A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins". Journal of Molecular Biology. 48 (3): 443-53.)을 이용하여 측정할 수 있다. 2개의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 또한 예를 들어, EMBOS Needle(쌍식 정렬(pair wise alignment); www.ebi.ac.uk 에서 이용 가능)과 같은 알고리즘을 사용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, EMBOSS Needle은 BLOSUM62 매트릭스, "갭 개방 페널티(gap open panalty)" 10, "갭 확장 페널티(gap extend penalty)" 0.5, 잘못된 "엔드 갭 페널티(end gap penalty)", "말단 갭 개방 페널티(end gap open penalty)" 10 및 "말단 갭 연장 페널티(end gap extend penalty)" 0.5과 함께 사용될 수 있다. 일반적으로 "동일성 퍼센트"는 일치하는 위치 수를 비교한 위치의 수로 나누고 100을 곱한 함수이다. 예를 들어, 정렬 후 2개의 비교된 서열 사이에 10개의 서열 위치 중 6개가 동일한 경우, 동일성은 60%이다. 일반적으로 동일성 %는 분석이 수행되는 질의(query) 서열의 전체 길이에 걸쳐 전형적으로 측정된다. 동일한 1차 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 갖는 2개의 분자는 임의의 화학적 및/또는 생물학적 변형에 관계없이 동일하다. 본 발명에 따라서, 제2 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 제1 아미노산 서열은 제1 서열이 제2 아미노산 서열과 90; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 99 또는 100%의 동일성을 가짐을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "돌연변이"는 당해 분야에서 이의 일반적인 의미를 가지며, 치환, 결실 또는 삽입을 지칭한다. 특히, 용어 "치환"은 특정 위치의 특정 아미노산 잔기가 제거되고 동일한 위치에 다른 아미노산 잔기가 삽입됨을 의미한다. 명세서 내에서, 돌연변이는 표준 돌연변이 명명법에 따른 참고이다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "포스파티딜세린" 또는 "PS"라는 용어는 당해 분야에서 일반적인 의미를 가지며, 세포막의 구성성분인 인지질을 지칭한다. 보다 구체적으로, PS는 인지질, 보다 구체적으로는 글리세롤의 제1 탄소 및 제2 탄소에 에스테르 결합으로 부착된 2개의 지방산과 글리세롤의 제3 탄소에 포스포디에스테르 결합을 통해 부착된 세린으로 이루어진 인지질, 보다 구체적으로는 글리세롤 인지질이다.
본원에 사용되는 용어 "헴"은 포르피린(또는 이의 유도체)과 주로 2가 또는 3가 철의 배위 화합물을 지칭하며, 이는 또한 철 포르피린 및 헤마틴으로 불린다. 본 발명에서 사용되는 헴 및 천연 헴에는 특별한 제한을 두지 않으며, 예를 들어 헴 a, 헴 b(프로토헴(protoheme) IX), 헴 c, 변이체 헴 c, 헴 d, 헴 d1, 시로헴(sirohem)(시로헴(Sirohaem)), 헴 o가 사용될 수 있다 (참고: A. Messerschmidt, R. Huber, T. Poulos, and K. Wieghardt (Eds), Handbook of Metalloproteins Vol. 1, John Wiley & Sons, New York, 2001, etc.).
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "친화성"은 특수한 리간드에 대한 폴리펩타이드(예를 들어, 아넥신 A5 폴리펩타이드)의 결합 강도를 의미한다. 폴리펩타이드의 친화성은 해리 상수(dissociation constant) Kd로 제공된다. 친화성 상수 Ka는 1/Kd로 정의된다. 폴리펩타이드의 KD를 측정하는 방법은 당해 기술분야에 잘 알려져 있으며, 제한 없이 BIAcore 3000 장치 내의 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance; SPR) 기술을 포함한다. BIACORE®(GE Healthcare, 뉴저지주 피스카타웨이 소재)는 친화성을 결정하기 위해 통상적으로 사용되는 다양한 표면 플라즈몬 공명 검정 포맷 중 하나이다. 항체의 친화성은 다른 통상적인 기술, 예를 들면, Scatchard et al.(Ann. N.Y. Acad. Sci. USA 51:660(1949))에 기술된 것을 사용하여 용이하게 측정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "용혈"은 헤모글로빈(유리 헤모글로빈으로서) 및 헴의 방출과 함께 적혈구의 파괴 또는 용해를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "용혈성 빈혈"이란, mm 당 적혈구(적혈 세포)의 수 또는 100 ml의 혈액 내 헤모글로빈의 양이 적혈구의 파괴로 인해 정상 미만인 임의의 상태를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "치료" 또는 "치료하다"는 질환에 걸릴 위험이 있거나 질환에 걸린 것으로 의심되는 환자뿐만 아니라 아프거나 질환 또는 의학적 상태를 앓고 있는 것으로 진단된 환자의 치료를 포함하는, 예방적 또는 방지적 치료뿐만 아니라 치유적 또는 질환 변형 치료(disease modifying treatment) 둘 다를 지칭하고, 임상적 재발의 억제를 포함한다. 치료는 장애 또는 재발성 장애의 하나 이상의 증상의 발생을 방지, 치유, 지연하거나, 이의 중증도를 감소시키거나 또는 이를 개선하기 위해, 또는 이러한 치료의 부재하에서 예측되는 것 이상으로 환자의 생존을 연장시키기 위해, 의학적 장애를 가지거나 궁극적으로 장애를 획득할 수 있는 환자에게 투여될 수 있다. "치료 요법"은 질병의 치료 패턴, 예컨대, 치료요법 동안 사용된 투여 패턴을 의미한다. 치료 요법은 유도 요법(induction regimen) 및 유지 요법(maintenance regimen)을 포함할 수 있다. 어구, "유도 요법" 또는 "유도 기간"은 질병의 초기 치료에 사용되는 치료 요법(또는 치료 요법의 일부)을 지칭한다. 유도 요법의 일반적인 목표는 치료 요법의 초기 기간 동안 환자에게 높은 수준의 약물을 제공하는 것이다. 유도 요법은 (부분적으로 또는 전체적으로) "로딩 요법(loading regimen)"을 사용할 수 있는데, 이는 유지 요법 동안 의사가 사용할 수 있는 것보다 더 많은 양의 약물을 투여하는 것, 유지 요법 동안 의사가 약물을 투여할 수 있는 것보다 더 자주 약물을 투여하는 것, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 어구, "유지 요법" 또는 "유지 기간"은 질병의 치료 동안 환자의 유지를 위해, 예컨대, 긴 기간(수개월 또는 수년) 동안 환자가 차도(remission)를 유지하기 위해 사용된 치료 요법(또는 치료 요법의 일부)를 지칭한다. 유지 요법은 연속적인 치료요법(예컨대, 약물을 일정 간격, 예컨대, 매주, 매월, 매년 등마다 투여하는 것) 또는 간헐적인 치료요법(예컨대, 중단 치료(interrupted treatment), 간헐적 치료(intermittent treatment), 재발 시 치료, 또는 특수한 예정된 기준(예컨대, 통증, 질환 발현 등) 달성 시 치료)을 사용할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은, 표현 "치료학적 유효량"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 이점/위험 비(benefit/risk ratio)에서 면역 반응을 유도하기에 충분한 본 발명의 활성 성분의 양을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "약제학적학 조성물"은 담체 및/또는 부형제와 같은 다른 제제와 함께, 본원에 기술된 조성물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 지칭한다. 본원에 제공된 바와 같은 약제학적 조성물은 전형적으로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 요구된 특수한 투여량 형태에 적합한, 임의의 및 모든 용매, 희석제 또는 다른 액체 비히클(vehicle), 분산제 또는 현탁 보조제, 표면 활성제, 등장성 제제(isotonic agent), 증점제 또는 유화제, 방부제, 고체 결합제, 윤활제 등을 포함한다. 문헌: Remington's Pharmaceutical-Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980)에는 약제학적 조성물을 제형화하는데 사용된 다양한 담체 및 이의 제조를 위한 공지된 기술을 개시하고 있다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드"는 상기 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 폴리펩타이드 둘 다를 지칭한다.
본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드:
본 발명의 제1 목적은 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드에 관한 것이며, 여기서 위치 227, 228 또는 257번에서의 적어도 하나의 아미노산은 돌연변이되어 있다.
일부 구현예에서, 서열 번호: 1의 위치 227, 228 또는 257번에서의 아미노산은 치환되어 있다. 일부 구현예에서, 서열 번호: 1의 위치 227, 228 및 257번에서의 적어도 하나의 아미노산은 치환되어 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드는 서열 번호: 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 여기서 위치 72번에서의 아미노산(E)은 아미노산(D)으로 치환되고, 위치 144번에서의 아미노산(D)은 아미노산(N)으로 치환되고, 위치 228번에서의 아미노산(E)은 아미노산(A)으로 치환되고, 위치 303번에서의 아미노산(D)은 아미노산(N)으로 치환된다(Kenis et al. J Nucle Med 2010 및 Kenis et al. JBC Phapers 2004에 개시된 바와 같은 AA5 돌연변이체 M1234).
일부 구현예에서, 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드는 서열 번호: 1에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하지 않으며, 여기서 위치 144번에서의 아미노산(D)은 아미노산(N)으로 치환되고, 위치 228번에서의 아미노산(E)은 아미노산(A)으로 치환된다 (Kenis et al. J Nucl Med 2010 및 Kenis et al. JBC Papers 2004에 개시된 바와 같은 AA5 돌연변이체 M23).
일부 구현예에서, 서열 번호: 1의 위치 227번에서의 아미노산(R)은 아미노산(A)(rhA5-'R')로 치환된다.
일부 구현예에서, 서열 번호: 1의 위치 228번에서의 아미노산(E)은 아미노산(A)(rhA5-'E')로 치환된다.
일부 구현예에서, 서열 번호: 1의 위치 257번에서의 아미노산(Y)은 아미노산(A)(rhA5-'Y')로 치환된다.
따라서 일부 구현예에서, 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드는 R227A, E228A 및 Y257A로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드는 서열 번호: 2, 3 또는 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
서열번호: 2> NP_001145.1.2 Mutant2 R227A 아넥신 A5 [호모 사피엔스]
MAQVLRGTVTDFPGFDERADAETLRKAMKGLGTDEESILTLLTSRSNAQRQEISAAFKTLFGRDLLDDLK
SELTGKFEKLIVALMKPSRLYDAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVYEEEYGSSLEDD
VVGDTSGYYQRMLVVLLQANRDPDAGIDEAQVEQDAQALFQAGELKWGTDEEKFITIFGTRSVSHLRKVF
DKYMTISGFQIEETID A ETSGNLEQLLLAVVKSIRSIPAYLAETLYYAMKGAGTDDHTLIRVMVSRSEID
LFNIRKEFRKNFATSLYSMIKGDTSGDYKKALLLLCGEDD
서열번호: 3>NP_001145.1.3 Mutant3 E228A 아넥신 A5 [호모 사피엔스]
MAQVLRGTVTDFPGFDERADAETLRKAMKGLGTDEESILTLLTSRSNAQRQEISAAFKTLFGRDLLDDLK
SELTGKFEKLIVALMKPSRLYDAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVYEEEYGSSLEDD
VVGDTSGYYQRMLVVLLQANRDPDAGIDEAQVEQDAQALFQAGELKWGTDEEKFITIFGTRSVSHLRKVF
DKYMTISGFQIEETIDR A TSGNLEQLLLAVVKSIRSIPAYLAETLYYAMKGAGTDDHTLIRVMVSRSEID
LFNIRKEFRKNFATSLYSMIKGDTSGDYKKALLLLCGEDD
서열번호: 4>NP_001145.1.5 Mutant5 Y257A 아넥신 A5 [호모 사피엔스]
MAQVLRGTVTDFPGFDERADAETLRKAMKGLGTDEESILTLLTSRSNAQRQEISAAFKTLFGRDLLDDLK
SELTGKFEKLIVALMKPSRLYDAYELKHALKGAGTNEKVLTEIIASRTPEELRAIKQVYEEEYGSSLEDD
VVGDTSGYYQRMLVVLLQANRDPDAGIDEAQVEQDAQALFQAGELKWGTDEEKFITIFGTRSVSHLRKVF
DKYMTISGFQIEETIDRETSGNLEQLLLAVVKSIRSIPAYLAETLY A AMKGAGTDDHTLIRVMVSRSEID
LFNIRKEFRKNFATSLYSMIKGDTSGDYKKALLLLCGEDD
일부 구현예에서, 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드는 서열 번호: 2, 3 또는 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드는 서열 번호: 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 따르면, 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드는 비-돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드와 같이 포스파티딜세린에 대해 동일한 친화성을 유지하지만 헴에 대해 감소된 친화력을 갖는다. 전형적으로, 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드는 비-돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드보다 헴에 대해 더 높은 Kd 값을 갖는다. 전형적으로, 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드의 헴에 대한 Kd 값은 비-돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드의 Kd 값보다 2; 2.5; 3, 3.5; 4; 4.5배 더 높다. 일부 구현예에서, 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드의 PS에 대한 Kd 값은 헴의 존재하에 비-돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드의 Kd 값보다 2; 2.5; 3, 3.5; 4; 4.5배 더 낮다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드는 통상적인 자동화된 펩타이드 합성 방법 또는 재조합 발현에 의해 생산된다. 단백질을 설계하고 제조하기 위한 일반적인 원리는 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드는 통상적인 기술에 따라 용액 속에서 또는 고체 지지체 상에서 합성될 수 있다. 다양한 자동 합성기가 상업적으로 이용가능하며 문헌: Stewart and Young; Tam et al., 1983; Merrifield, 1986 및 Barany and Merrifield, Gross and Meienhofer, 1979에 기술된 공지된 프로토콜에 따라 사용될 수 있다. 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드는 또한 Applied Biosystems Inc.의 Model 433A와 같은 예시적인 펩타드 합성기를 사용하는 고체-상 기술에 의해 합성될 수 있다. 자동화된 펩타드 합성을 통해 또는 재조합 방법을 통해 생성된 임의의 주어진 단백질의 순도는 역상 HPLC 분석을 사용하여 측정될 수 있다. 각 펩타이드의 화학적 진위성은 당업자에게 잘 알려진 임의의 방법에 의해 확립될 수 있다. 자동화된 펩타이드 합성에 대한 대안으로서, 선택된 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 발현 벡터에 삽입되고, 적절한 숙주 세포로 형질전환 또는 형질감염되고, 본원에서 하기에 기술된 바와 같이 발현에 적합한 조건 하에서 배양되는 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다. 재조합 방법은 특히 더 긴 폴리펩타이드를 생산하기 위해 바람직하다. 펩타이드 또는 단백질 코딩(coding) 서열을 함유하고 발현하기 위한 다양한 발현 벡터/숙주 시스템이 이용될 수 있다. 이는 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드(cosmid) DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균; 박테리아, 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(Giga-Hama et al., 1999), 바이러스 발현 벡터로 감염된 곤충 세포 시스템(예를 들어, 바큘로바이러스, Ghosh et al., 2002 참조), 바이러스 발현 벡터로 형질전환된 식물 세포 시스템(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV), 또는 박테리아 발현 벡터로 형질전환된 식물 세포 시스템(예를 들어, Ti 또는 pBR322 플라스미드, 예컨대, Babe et al., 2000 참고), 또는 동물 세포 시스템을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 당업자는 단백질의 포유동물 발현을 최적화하기 위한 다양한 기술을 알고 있다, 예컨대, Kaufman, 2000; Colosimo et al., 2000을 참조한다. 재조합 단백질 생산에 유용한 포유동물 세포는 VERO 세포, HeLa 세포, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary; CHO) 세포주, COS 세포(예를 들어, COS-7), W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 및 293 세포를 포함한다. tprbs, 효모 및 기타 무척추동물에서 펩타이드 기질 또는 융합 폴리펩타이드의 재조합 발현을 위한 예시적인 프로토콜은 당업자 및 본원의 하기에 간략하게 기재된 프로토콜에 공지되어 있다. 재조합 단백질의 발현을 위한 포유동물 숙주 시스템 또한 당업자에게 잘 알려져 있다. 숙주 세포 균주는 발현된 단백질을 프로세싱(processing)하거나 단백질 활성을 제공하는 데 유용할 특정의 해독후 변형(post-translation modification)을 생산하는 특수한 능력을 위해 선택될 수 있다. 이러한 폴리펩타이드의 변형은 아세틸화, 카르복실화, 글리코실화, 인산화, 지질화 및 아실화가 포함되나, 이에 한정되지는 않는다. 단백질의 "프레프로(prepro)" 형태를 절단하는 해독 후 프로세싱이 또한 올바른 삽입, 폴딩(folding) 및/또는 기능을 위해 중요할 수 있다. CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38 등과 같은 상이한 숙주 세포는 이러한 해독 후 활성을 위한 특정 세포의 기계적인 및 특징적인 메카니즘을 가지며, 도입된 외래 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱를 보장하기 위해 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 성장 인자 1에 융합되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1) 또는 뉴레귤린 1(NRG)에 융합되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1)에 융합되지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1)에 융합되지 않으며, 여기서 IGF-1은 US2020/0207826에 기술된 서열 번호: 18, 19, 23, 24, 28, 29, 또는 120에 제시된 아미노 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 치료 방법에 사용되는 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드는 치료 효능을 증진시키기 위해 변형될 수 있는 것으로 고려된다. 이러한 치료학적 화합물의 변형은 독성을 감소시키거나, 순환 시간을 증가시키거나, 또는 생체분포(biodistribution)를 변형시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 잠재적으로 중요한 치료학적 화합물의 독성은 생체분포를 변형시키는 다양한 약물 담체 비히클과 조합하여 유의적으로 감소시킬 수 있다. 약물 생존능을 증진시키기 위한 전략은 수용성 중합체를 사용하는 것이다. 다양한 수용성 고분자는 생체 분포를 변형시키고, 세포 흡수 방식을 증진시키고, 생리학적 장벽을 통해 투과성을 변화시키며; 신체로부터 제거되는 속도를 변형시키는 것으로 밝혀졌다. 표적화(targeting) 또는 지속-방출 효과를 달성하기 위해, 약물 모이어티(moiety)을 말단 그룹으로서, 골격(backbone)의 부분으로서, 또는 중합체 쇄 상의 펜던트 그룹(pendent group)으로서 함유하는 수용성 중합체가 합성되었다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 고도의 생체 적합성과 변형의 용이성을 고려하여 약물 담체로 널리 사용되어 왔다. 다양한 약물, 단백질, 리포솜에 대한 부착은 체류 시간을 개선시키고 독성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. PEG는 쇄 말단에서 하이드록실 그룹 통해 및 다른 화학적 방법을 통해 활성제와 커플링될 수 있지만; PEG 자체는 분자당 최대 2개의 활성제로 제한된다. 다른 접근법으로, PEG와 아미노산의 공중합체가 PEG의 생체 적합성 특성을 유지할 수 있지만, 분자당 다수의 부착점(더 큰 약물 부하 제공)의 추가 이점을 가질 수 있고, 다양한 응용 분야에 적합하도록 합성적으로 설계될 수 있는 새로운 생체물질(biomaterial)로 탐구되었다.
본 발명의 추가의 목적은 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 플라스미드, 코스미드, 에피솜, 인공 염색체, 파지 또는 바이러스 벡터와 같은 적합한 벡터에 포함된다. 따라서, 본 발명의 추가 목적은 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 전형적으로, 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV), 레트로바이러스, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 박시니아 바이러스, 폴리오마 바이러스, 또는 감염성 바이러스인 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 AAV 벡터이다. 본원에 사용된 바와 같은, "AAV 벡터"는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 및 이들의 돌연변이된 형태를 포함하는, 아데노-관련 바이러스 혈청형으로부터 유래된 벡터를 의미한다. AAV 벡터는 전체 또는 부분적으로 결실된 AAV 야생형 유전자 중 하나 이상, 바람직하게는 rep 및/또는 cap 유전자를 가질 수 있지만 기능적인 플랭킹 ITR 서열(functional flanking ITR sequence)을 보유한다. 레트로바이러스는 이의 유전자를 숙주 게놈에 통합하여 많은 양의 외래 유전 물질을 전달하고, 종 및 세포 유형의 광범위한 스펙트럼을 감염시키며, 특수한 세포주 내에 패키징하는 이의 능력으로 인하여, 유전자 전달 벡터로 선택될 수 있다. 레트로바이러스 벡터를 작제하기 위하여, 특정의 바이러스 서열 대신 목적한 유전자를 코딩하는 핵산을 바이러스 게놈 내로 삽입하여 복제 결함이 있는 바이러스를 생산한다. 비리온(virion)을 생산하기 위해, gag, pol 및/또는 env 유전자를 포함하지만 LTR 및/또는 패키징 구성성분은 포함하지 않는 패키징 세포주를 작제한다. 레트로바이러스 LTR 및 패키징 서열과 함께, cDNA를 함유하는 재조합 플라스미드가 (예를 들어 인산칼슘 침전에 의해) 이러한 세포주에 도입된 경우, 패키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체가 바이러스 입자로 패키징되도록 하며, 이는 이어서 배양 배지로 분비된다. 이후에, 재조합 레트로바이러스를 포함하는 배지를 수집하고, 임의로 농축시켜 유전자 전달에 사용한다. 레트로바이러스 벡터는 다양한 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 렌티바이러스는 일반적인 레트로바이러스 유전자인 gag, pol 및 env 외에, 조절 또는 구조적 기능을 가진 다른 유전자를 포함하는 복합(complex) 레트로바이러스이다. 복합성(complexity)이 높을수록 바이러스는 잠복 감염 과정에서와 같이 이의 수명 주기를 조절할 수 있다. 렌티바이러스의 일부 예는 인간 면역결핍 바이러스(HIV 1, HIV 2) 및 유인원 면역결핍 바이러스(Simian Immunodeficiency Virus; SIV)를 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 HIV 독성 유전자(virulence gene)를 다중 감쇠(attenuating)시켜 생성시켰으며, 예를 들어, env, vif, vpr, vpu 및 nef 유전자를 결실시켜 벡터가 생물학적으로 안전하도록 한다. 렌티바이러스 벡터는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 6,013,516 및 5,994,136를 참조하여, 이들 둘 다는 본원에 참조로 포함되어 있다. 일반적으로, 벡터는 플라스미드-기반 또는 바이러스-기반이며, 외래 핵산을 숙주 세포 내로 혼입하기 위한, 선택을 위한 및 핵산을 숙주 세포 내로 전달하기 위한 필수 서열을 운반하도록 구성된다. 관심 벡터의 gag, pol 및 env 유전자도 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 관련 유전자는 선택된 벡터에 클로닝된 후 관심 표적 세포를 형질전환하는데 사용된다. 적합한 숙주 세포가 패키징 기능을 운반하는 2개 이상의 벡터, 즉 gag, pol 및 env뿐만 아니라 rev 및 tat로 형질감염된 비-분할 세포(non-dividing cell)를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스는 본원에 참조로 포함된 미국 특허 5,994,136에 기재되어 있다. 이는 바이러스 gag 및 pol 유전자를 인코딩하는 핵산을 제공할 수 있는 제1 벡터와 패키징 세포를 생산하기 위해 바이러스 env를 코딩하는 핵산을 제공할 수 있는 또 다른 벡터를 설명한다. 이종 유전자를 제공하는 벡터를 패키징 세포에 도입하는 것은 관심 있는 외래 유전자를 운반하는 감염성 바이러스 입자를 방출하는 생산자 세포를 생성한다. env는 바람직하게는 인간 및 다른 종의 세포의 형질도입을 허용하는 양쪽성 엔벨로프 단백질(amphotropic envelope protein)이다. 전형적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터는 수용체 세포에서 코딩 서열의 복제, 전사 및 해독을 총괄적으로 제공하는 프로모터 서열, 폴리아데닐화 신호, 전사 종결 서열, 상부 조절 도메인(upstream regulatory domain), 복제의 기원, 내부 리보솜 도입 부위(internal ribosome entry site; "IRES"), 인핸서 등을 총괄적으로 지칭하는 "제어 서열(control sequence)"을 포함한다. 선택된 코딩 서열이 적절한 숙주 세포에서 복제, 전사 및 해독될 수 있는 한, 이들 제어 서열 모두가 항상 존재할 필요는 없다. 다른 핵산 서열은 DNA 조절 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 영역을 지칭하는 이의 통상적인 의미로 본원에서 사용되는 "프로모터" 서열이며, 여기서 조절 서열은 RNA 폴리머라제를 결합하여 하부(3'-방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 유전자로부터 유래된다. 전사 프로모터는 "유도성 프로모터"(프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현이 분석물, 보조인자, 조절 단백질 등에 의해 유도되는 경우), "억제성 프로모터(repressible promoter)"(프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현이 분석물, 보조인자, 조절 단백질 등에 의해 유도되는 경우) 및 "구성적 프로모터"를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가적인 목적은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다. 용어 "형질전환"은, 숙주 세포에 "외래"(즉, 외인성 또는 세포외) 유전자, DNA 또는 RNA 서열을 도입하여, 숙주 세포가 도입된 유전자 또는 서열을 발현함으로써 목적한 물질, 전형적으로 도입된 유전자 또는 서열에 의해 코딩된 단백질 또는 효소를 생산하도록 하는 것을 의미한다. 도입된 DNA 또는 RNA를 받아 발현하는 숙주세포는 "형질전환"된 것이다. 특수한 구현예에서, 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드를 발현 및 생산하기 위해, 원핵 세포, 특히 이. 콜라이 세포가 선택될 것이다. 실제로, 본 발명에 따르면, 해독 후 변형(예를 들어, 글리코실화)을 유리하게 할 진핵세포 맥락에서 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드를 생산하는 것이 필수적인 것은 아니다. 또한, 원핵세포는 단백질을 대량으로 생산할 수 있다는 장점이 있다. 진핵생물 환경이 필요한 경우, 효모(예: 사카로마이세스(saccharomyces) 균주)는 다량의 단백질을 생산하도록 하므로 특히 적합할 수 있다. 달리는, 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드의 올바른 해독 후 변형으로 프로세싱하는 이의 능력으로 인하여, CHO, BHK-21, COS-7, C127, PER.C6, YB2/0 또는 HEK293과 같은 전형적인 진핵 세포주를 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 발현 벡터의 작제, 및 숙주 세포의 형질전환은 통상적인 분자 생물학 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드는, 예를 들어, 본 발명에 따라 유전적으로 형질전환된 세포를 배양하고 상기 세포에 의해 발현된 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드를 배양물로부터 회수함으로써 수득할 수 있다. 그 후, 필요에 따라, 이는 당업자에게 공지된 통상의 방법, 예를 들어, 분획 침전(fractinal precipitation), 특히 황산암모늄 침전, 전기영동, 겔 여과, 친화성 크로마토그래피 등에 의해 정제할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 단백질을 생산하기 위해 재조합 단백질을 제조 및 정제하기 위한 통상의 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 전형적으로 의약으로서 사용된다. 특히, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드(벡터에 삽입되거나 삽입되지 않음)가 유전자 치료요법에 특히 적합하다.
따라서, 본 발명의 추가적인 목적은 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체(subject)에서의 치료 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드는 혈관내 용혈 또는 용혈성 빈혈이 발생하는 임의의 질환 또는 상태의 치료에 특히 적합하다.
본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드는,
(a) 혈전증(예: 죽상혈전증) 및/또는 플라크 파열의 위험을 방지 또는 감소시키기 위해, 또는 위험 그룹에 속하는 환자, 예를 들면, 그러나 이에 한정되지 않는, 전신홍반루푸스(SLE) 환자 및/또는 항인지질 관련 항체의 수준을 증가시킬 수 있는 상기도 또는 기타 감염(폐렴구균 감염 포함)을 가지거나 가졌던(또는 가질 위험이 있는) 환자에게 투여하기 위해, 또는 혈전색전증, 출혈성 또는 혈관염 뇌졸중, 심근경색, 협심증 또는 간헐적 파행, 불안정 협심증, 기타 중증 협심증 또는 일과성 허혈 발작(TIA)을 치료(활성적으로 또는 예방적으로) 치료하거나 이의 위험을 감소시키기 위해,
(b) 혈관기능장애, 협심증, 허혈성 심장질환, 말초 동맥질환, 수축기 고혈압, 편두통, 제2형 당뇨병 및 발기부전의 치료, 예방 또는 이의 위험의 감소, 및/또는, 허혈성 통증의 감소 및/또는 혈관질환 파열의 치료를 위해,
(c) 재협착(특히 내막 형성 또는 비후), 또는 혈관 염증의 예방 또는 치료를해;
(d) 산화된 카디오리핀(oxCL)의 활성을 억제하고 다음 질환을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 심혈관 질환, 자가면역 질환 또는 염증 상태로 발달할 위험을 치료, 방지 및/또는 감소시키기는데 사용하기 위해: 심혈관 질환(CVD), 당뇨병 II, 알츠하이머병, 일반 치매, 류마티스 질환, 죽상동맥경화증, 고혈압, 급성 및/또는 만성 염증 질환, 심근경색, 급성 관상동맥 증후군, 뇌졸중, 일과성 허혈 발작(TIA), 파행 협심증, 제1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 건선, 건선 관절염, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 전신 홍반 루푸스, 피부근염, 쇼그렌 증후군, 홍반루푸스, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 천식, 뇌염, 염증성 장 질환, 만성 폐쇄성 폐질환 질환(COPD), 골관절염을 포함하는 관절염, 특발성 염증성 근육병증(IIM), 피부근염(DM), 다발근염(PM), 봉입체 근염, 알레르기 장애 및/또는 포유동물의 골관절염; 및
(e) 외과적 개입 후 수술-전후 또는 수술후 합병증, 예를 들면, 혈관 수술, 특히 말초 혈관 수술 후 합병증의 방지 및/또는 감소를 위해 특히 적합하다.
일부 구현예에서, 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드는 겸상 적혈구 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 혈액학적 장애의 치료에 사용된다. 본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "낫형 세포 질환" 또는 "SCD"는 당해 기술분야에서 이의 일반적인 의미를 가지며, 적혈구가 비정상적이고 경직된, 낫 모양으로 추정되는 유전성 혈액 장애를 지칭한다. 적혈구의 겸상화는 세포 경직성과 삼투압 취약성을 증가시키고, 모세혈관을 통한 적혈구 이동을 어렵게 만들고, 혈관 층(vascular bed)을 손상시키고, 염증을 개시(trigger)하고, 다세포 혈관 폐색(multicellular vaso-occlusion)에 참여하고, 여러 조직과 기관에서 국소 허혈 에피소드를 생성한다. 조합된, 이러한 다수의 세포 및 조직 변형은 생명을 위협하는 다양한 합병증의 위험이 크게 증가시킨다. 이 용어는 낫형 세포 빈혈, 헤모글로빈 SC 질환 및 헤모글로빈 낫형 베타-탈레스혈증을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드는 혈관-폐색의 치료에 특히 적합하다. 본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "혈관 폐색"은 당업계에서 일반적인 의미를 가지며, 모세혈관의 폐색 및 기관으로의 혈류 제한을 초래하여, 혈관 기능 장애, 조직 괴사 및 흔히 장기 손상과 함께 허혈을 야기하는 낫형 세포 질환의 일반적인 합병증을 지칭한다. 혈관 폐색은 일반적으로 혈관 폐색 위기의 구성 요소이지만, 이는 또한 더 제한적이고, 임상적으로 사일런스(silence)하며 혈관 폐색 위기에 대한 입원을 유발하지 않을 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "혈관 폐색 위기"는 당업계에서 이의 일반적인 의미를 가지며, 모세혈관의 폐색과 관련하여 입원을 초래하고 기관으로의 혈류를 제한하여, 허혈, 심각한 통증, 괴사, 및 가장 흔히 일시적인 혈관 폐색 및 기관 손상을 야기하는 낫형 세포 질환의 일반적인 고통스러운 합병증을 지칭한다. 특히, 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드는 모세혈관의 재관류에 특히 적합하다.
일부 구현예에서, 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드는 급성 및 만성 혈관염, 자가면역 구성성분을 지닌 혈관염을 포함하지만 이에 제한되지 않는 1차 또는 2차 혈관염, 및/또는 약물 유발 혈관염의 치료에 특히 적합하다. 따라서, 본 발명은 또한, 베체트 질환, 피부혈관염, 다발혈관염(EGPA)을 동반한 호산구성 육아종증, 거대세포동맥염, 다발혈관염(GPA)을 동반한 육아종증, 면역글로불린 A-연관혈관염(IgAV), 미세다혈관염(MPA), 다발동맥염(Polyarteritis Nodosa), 다발혈관염(Polymyalgia Rheumata) 및 타카야수동맥염(Takayasu Arteritis)을 포함하는 혈관염의 치료, 방지 또는 이의 위험을 감소시키는 예방학적 또는 치료학적 방법을 제공한다. 류마티스 다발성 근육통은 특히 관심이 있을 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 돌연변이 아넥신 A5 폴리펩타이드는 허혈성 망막병증의 치료에 특히 적합하다. 본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "허혈성 망막병증"은 당업계에서 이의 일반적인 의미를 가지며, 망막 신생혈관화의 결과로 진행성의 비가역적 시각 손실이 발생하는 질환의 그룹을 지칭한다. 허혈성 망막병증의 예는 당뇨병성 망막병증, 노화-관련 황반변성, 신생혈관 녹내장, 미숙아성 망막병증, 낫형세포성 망막병증, 망막 정맥 폐쇄, 산소유도된 망막병증, 안구 손상, 예를 들면, 외상성 또는 수술적 손상, 또는 눈 조직의 이식으로 인한 신생혈관병증을 포함한다.
일부 실시예에서, 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드는 바이러스 감염의 치료에 특히 적합하다. 전형적으로, 감염은 (a) 출혈열(VHF)을 유발할 수 있는 바이러스, 및 (b) 포스파티딜세린(PS)을 제시(present)하고 PS 결합을 통한 세포 감염 및/또는 내재화를 매개하는 바이러스로 이루어진 그룹에서 선택된 바이러스에 의해 유발된다. 바이러스성 출혈열(또는 출혈열)(VHF)은 아레나비리다에(Arenaviridae) 과(family), 필로비리다에(Filoviridae) 과, 분야비리다에(Bunyaviridae) 과, 플라비비리다에(Flaviviridae) 과, 랍도비리다에(Rhabdoviridae) 과의 적어도 5개의 별개의 RNA 바이러스 과에 의해 유발될 수 있는 다양한 동물 및 인간 질병의 그룹이다. 모든 유형의 VHF는 발열 및 출혈 장애를 특징으로 할 수 있으며 많은 경우 모두 고열, 쇼크 및 사망으로 진행될 수 있다. VHF의 징후와 증상은 특징적으로 발열, 및 출혈에 대한 민감성 증가(출혈 체질)를 포함한다. VHF의 징후는 흔히 얼굴과 가슴의 홍조, 작은 빨간색 또는 보라색 반점(점상출혈), 명백한 출혈, 부종으로 인한 팽윤(swelling), 낮은 혈액 압(저혈압) 및 쇼크를 포함한다. 권태감, 근육 통증(근육통), 두통, 구토, 설사 등이 자주 나타난다. 증상의 중증도는 바이러스의 유형에 따라 다르며, 필로바이러스 출혈열(예: 에볼라 및 마르부르크), CCHF, 및 남미 출혈열 환자의 대부분에서 나타나는 "VHF 증후군"(모세관 누출, 출혈 투석, 및 쇼크로 이어지는 순환 장애)이 나타나지만, 뎅기열, RVF, 라사열을 지닌 환자가 소수로 나타난다. 일부 구현예에서, 상기 VHF는 에볼라의 증상일 수 있으며, 대상체는 초기 임상 증상으로부터 선택된 증상, 예를 들어 과도하거나 지나친 발한, 발열, 근육통, 일반적인 권태감 및/또는 오한과 같은 증상 및/또는 임의로 위장 증상을 동반하는 독감 유사 증상, 황반-구진 발진, 소엽, 결막 출혈, 비출혈(epistaxis), 흑색변, 혈종, 쇼크 및/또는 뇌증; 백혈구 감소증(예를 들어, 림프구 세포 세포자멸사 증가와 관련됨), 혈소판감소증, 아미노트랜스퍼라제, 트롬빈 및/또는 부분 트롬보플라스틴 시간의 증가된 수준, 혈액에서 검출 가능한 피브린 분할 생성물(fibrin split product) 및/또는 파종성 혈관 내 응고(DIC)와 같은 하나 이상의 에볼라 증상을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드는 바이러스 감염으로 고통받는 환자의 정맥 혈전색전증 및 동맥 혈전증의 치료에 특히 적합하다. 일부 구현예에서, 환자는 인플루엔자 감염으로 고통받는다. 본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "인플루엔자 감염"은 당업계에서 그 일반적인 의미를 가지며, 인플루엔자 바이러스에 감염되어 발생하는 질환을 의미한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 인플루엔자 감염은 인플루엔자 바이러스 A 또는 B와 관련된다. 본 발명의 일부 구현예에서, 인플루엔자 감염은 인플루엔자 바이러스 A와 관련되어 있다. 본 발명의 일부 구체적인 구현예에서, 인플루엔자 감염은 HlN1, H2N2, H3N2 또는 H5N1인 인플루엔자 바이러스 A에 의해 유발된다. 일부 구현예에서, 환자는 코로나바이러스 감염으로 고통받는다. 본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "코로나바이러스"는 당업계에서 일반적인 의미를 가지며, 코로나비리다에(Coronaviridae) 과 계통의 구성원 중 어느 하나를 지칭한다. 코로나바이러스는 이의 게놈이 특수한 바이러스에 따라 길이가 약 27kb내지 약 33kb인 플러스-가닥 RNA인 바이러스이다. 비리온 RNA는 5' 말단에 캡이 있고 3' 말단에 폴리 A 테일(poly A tail)이 있다. RNA의 길이는 코로나바이러스가 RNA 바이러스 게놈 중 가장 크도록 한다. 특히, 코로나바이러스 RNA는 (1) RNA-의존성 RNA 폴리머라제; (2) N-단백질; (3) 3개의 엔벨로프 당단백질, 및 (4) 3개의 비-구조 단백질을 암호화한다. 이러한 코로나바이러스는 다양한 포유류 및 조류를 감염시킨다. 이들은 호흡기 감염(흔히), 장 감염(주로 12개월 초과의 유아에게서), 및 아마도 신경 증후군을 유발한다. 코로나바이러스는 호흡기 분비물의 에어로졸(Aerosol)에 의해 전염된다. 일부 구현예에서, 환자는 SARS-CoV-2 감염으로 고통받는다. 본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "중증의 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2" 또는 "SARS-CoV-2"는 당업계에서 일반적인 의미를 가지며, 코로나바이러스 2019(COVID-19)를 유발하는 코로나바이러스의 균주를 지칭하는데, 호흡기 증후군은 가벼운 상기도 질환(일반적인 감기 유사 증상)과 유사한 임상적 병리를 나타내고, 때때로 심각한 하기도 질병 및 폐외 증상을 나타내어 다장기 부전 및 사망에 이르게 한다. 특히, 용어는 이에 대한 완전한 게놈이 NCBI 수탁 번호 MN975262 하에 접근가능한 중증의 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 단리체 2019-nCoV_HKU-SZ-005b_2020을 지칭한다. 일부 구현예에서, 상기 환자는 코비드-19(Covid-19)를 앓고 있다. 본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "코비드-19"는 중증의 급성호흡기증후군 코로나바이러스 2에 의해 유발되는 호흡기 질환을 지칭한다.
본 발명의 화합물 및 조성물의 총 1일 투여량은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 주치의에 의해 결정될 것임이 이해될 것이다. 임의의 특수한 대상체에 대한 구체적인 치료학적 유효 용량 수준은 대상체의 연령, 체중, 전반적인 건강 상태, 성별 및 식이요법; 사용된 구체적인 화합물의 투여 시간, 투여 경로 및 배설 속도; 치료 기간; 사용된 특정 폴리펩타이드와 함께 또는 동시에 사용된 약물; 및 의학 분야에서 잘 알려진 유사 요인을 포함하는 다양한 요인에 의존할 것이다. 예를 들어, 목적한 치료학적 효과를 달성하는 데 필요한 것보다 낮은 수준에서 화합물의 용량을 시작하고 목적한 효과가 달성될 때까지 용량을 점진적으로 증가시키는 것이 당업계에 잘 알려져 있다. 그러나 생성물의 1일 투여량은 성인 1인당 하루 0.01mg에서 1,000mg까지 광범위하게 다양할 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 치료될 대상체에 대한 투여량의 증상 조절을 위해 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100, 250 및 500 mg의 활성 성분을 포함한다. 의약은 전형적으로 약 0.01 mg 내지 약 500 mg의 활성 성분을 포함하고, 바람직하게는 1 mg 내지 약 100 mg의 활성 성분을 포함한다. 약물의 유효량은 통상적으로 1일 당, 0.0002 mg/kg의 체중 내지 약 20 mg/kg의 체중, 특히 1일 당 약 0.001 mg/kg의 체중 내지 약 7 mg/kg의 체중의 투여량 수준으로 공급된다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드 또는 핵산 분자(벡터에 삽입되거나 삽입되지 않음)는 약제학적 조성물의 형태로 대상체에게 투여된다. 전형적으로, 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드 또는 핵산 분자(벡터에 삽입되거나 삽입되지 않음)는 약제학적으로 허용되는 부형제, 및 임의으로 생분해성 중합체와 같은 지속-방출 매트릭스와 조합되어 약제학적 조성물을 형성할 수 있다. "약제학적으로" 또는 "약제학적으로 허용되는"은 포유동물, 특히 인간에게 적절하게 투여될 때 유해한, 알레르기 또는 기타 원치 않은 반응을 일으키지 않는 분자 실체 및 조성물을 지칭한다. 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 임의의 유형의 무-독성 고체, 반-고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 제형 보조제를 지칭한다. 경구, 설하, 피하, 근육내, 정맥내, 경피, 국소 또는 직장 투여를 위한 본 발명의 약제학적 조성물에 있어서, 상기 활성 원리는 단독으로 또는 다른 활성 원리와 함께, 통상의 약제학적 원리와 지지체와의 혼합물로서, 동물 및 인간에게 단위 투여 형태로 투여될 수 있다. 적합한 단위 투여 형태는 정제, 겔 캡슐제, 산제, 과립제 및 경구 현탁제 또는 액제, 설하 및 협측 투여 형태, 에어로졸제, 임플란트, 피하, 경피, 국소, 복강내, 근육내, 정맥내, 피하, 경피내, 경피내, 흉강내 및 비강내 투여 형태 및 직장 투여 형태와 같은 경구-경로 형태를 포함한다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 주입될 수 있는 제형에 대해 약제학적으로 허용가능한 비히클을 포함한다. 이는 특히 등장성, 멸균성, 식염수(인산일나트륨, 인산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등 또는 이러한 염의 혼합물), 또는 경우에 따라, 멸균수 또는 생리식염수의 첨가시 주사가능한 용액의 구성을 허용하는 건조, 특히 동결 건조된 조성물일 수 있다. 주사 가능한 용도에 적합한 약제학적 형태는 멸균 수성용액 또는 분산액; 참깨 오일, 땅콩 오일 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형; 및 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 임시 제조를 위한 멸균 산제를 포함한다. 모든 경우에, 형태는 무균 상태이어야 하며, 주사가 쉬운 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 보관 조건에서 안정하여야 하며, 세균 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대하여 보존되어야 한다. 유리 염기 또는 약리학적으로 허용가능한 염으로서 본 발명의 화합물을 포함하는 용액은 하이드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제와 적절히 혼합된 물 속에서 제조될 수 있다. 분산제는 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물 및 오일 속에서도 제조될 수 있다. 통상적인 보관 및 사용 조건하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 방부제를 함유한다. 본 발명의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드 또는 핵산 분자(벡터에 삽입되거나 삽입되지 않음)는 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 (단백질의 유리 아미노 그룹으로 형성된) 산 부가염을 포함하고 이는 예를 들면, 염산 또는 인산과 같은 무기 산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기 산으로 형성된다. 유리 카복실 그룹으로 형성된 염은 또한 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화 제2철과 같은 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 담체는 또한, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산의 경우에 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등과 같은 다양한 항세균 및 항진균제에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우에, 등장성 제제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수 지연제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 사용함으로써 이루어질 수 있다. 멸균 주사용 액제는 필요에 따라 위에 열거된 여러 가지 다른 성분과 함께 적절한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼입한 후 여과 멸균하여 제조된다. 일반적으로, 분산제는 기본 분산 매질과 위에 열거된 것 중 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 다양한 멸균 활성 성분을 혼입하여 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 산제의 경우, 전형적인 제조 방법은 진공-건조 및 동결-건조 기술로서, 이전에 이의 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분의 분말과 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말을 생성한다. 직접 주입을 위한 더 많은 또는 고농축 용액의 제조가 또한 고려되며, 여기서 용매로서 DMSO의 사용은 활성제의 고농도를 작은 종양 영역에 전달하는 매우 빠른 침투를 초래할 것으로 예상된다. 제형화 시, 용액은 투여량 제형과 양립가능한 방식 및 치료학적으로 효과적인 양으로 투여될 것이다. 제형은 위에서 기술한 주사가능한 용액 형태와 같은 다양한 투여량 형태로 쉽게 투여할 수 있지만, 약물 방출 캡슐 등도 사용할 수 있다. 예를 들어, 수용액에서의 비경구 투여를 위해, 용액은 필요한 경우 적절하게 완충되어야 하고 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 글루코스로 등장성이 되도록 하여야 한다. 이들 특수한 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시내용의 측면에서 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 투여량의 일부 변화는 치료받는 대상체의 상태에 따라 필연적으로 발생할 것이다. 어떤 경우에도 투여 책임자는 개별 대상체에게 적절한 용량을 결정할 것이다.
본 발명은 다음의 도면 및 예시에 의해 더 상세히 설명될 것이다. 그러나, 이러한 예시들과 도면들은 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안될 것이다.
도 1: 아넥신-A5 및 아넥신-A5 돌연변이체의 폴리펩타이드 서열
도 2: 활성 혈관내 용혈이 있는 낫 세포 질환 환자.
본 발명자는 이의 PFP에서 415 nm에서 헴-관련 흡광도를 측정함으로써, 활성 혈관 내 용혈을 겪고 있는 낫 세포 질환 환자(지속적인 수산화요소(HU) 치료가 없는 동형접합성 HbS)를 확인하였다. 본 발명자는 Abs415가 건강한 대조군 수준에 비해 적어도 2배 증가한 PFP 샘플을 선택하였다. 이는 본 발명자들의 선언된 생물학적 수집에서 200명 이상의 본 발명자들의 환자의 수집에서 수집한 혈장의 약 20%를 차지하였다. Abs415가 상승한 PFP는 '활성 혈관 내 용혈'(SCD hemol.)로 분류하였고, 아넥신-A5 폴리펩타이드를 사용한 억제 연구의 우선 순위를 유지하였다.
도 3: 건강한 지원자와 낫 세포 질환 환자로부터의 혈장 내 트롬빈 생성 시간
트롬빈 생성 역학 곡선을 건강한 지원자(EFS의 혈액 기증자, 왼쪽 패널) 또는 활동적인 혈관 내 용혈(415 nm에서 헴 관련 흡광도 상승)을 나타내는 낫 세포 질환 환자(동형 HbS, 하이드록시우레아로 치료되지 않음, 오른쪽 패널)로부터 재석회화된(recalcified) PFP에서 생성하였다. 트롬빈 생성 역학 곡선은 30nM에서 야생형 재조합 아넥신-A5 폴리펩타이드(rhA5-WT) 또는 3개의 재조합 아넥신-A5 돌연변이 폴리펩타이드(rhA5-E, rhA5-R 및 rh-A5-Y)의 부재(비히클, PBS) 또는 존재하에서 생산하였다.
도 4: 하이드록시우레아(HU) 치료를 진행 중인 낫 세포 질환 환자로부터의 혈장 내 트롬빈 생성 시간.
트롬빈 생성 역학 곡선을 현재 많은 서구 국가에서 낫 세포 질환 환자의 유의적인 부분을 나타내는, 하이드록시우레아(HU) 치료요법 하의 낫 세포 질환 환자(동형 접합 HbS)의 재석회화된 PFP에서 생성하였다. 트롬빈 생성 역학 곡선을 30nM에서 야생형 재조합 아넥신-A5 폴리펩타이드(rhA5-WT) 또는 3개의 재조합 아넥신-A5 돌연변이 폴리펩타이드(rhA5-E, rhA5-R 및 rh-A5-Y)의 부재(비히클, PBS) 또는 존재하에서 생산하였다.
도 5: 입원한 COVID19 환자로부터의 혈장 내 트롬빈 생성 시간.
입원한 COVID19 환자의 재석회화된 PFP에서 트롬빈 생성 역학 곡선을 생성하였다. 중증 COVID19 환자는 호흡 곤란으로 입원한 후, 입원 후 2~3일 째에, 산소 요법(기계 환기 없음)과 저분자량 헤파린(1명을 제외하고 모두 고용량의 예방학적 항응고 치료)을 받은 후 포함되었다. 트롬빈 생성 역학 곡선은 30nM에서 야생형 재조합 아넥신-A5 폴리펩타이드(rhA5-WT) 또는 3개의 재조합 아넥신-A5 돌연변이 폴리펩타이드(rhA5-E, rhA5-R 및 rh-A5-Y)의 부재(비히클, PBS) 또는 존재하에서 생산하였다.
도 6: 낫 세포 질환을 앓고 있는 유전자이식 마우스의 혈관-폐쇄 사건.
HbSAD 유전자이식 마우스의 저산소증/재산소화는 주요 혈관-폐쇄 에피소드(H/R 기준선)를 생산하였으며, 정상 산소 수치(Normoxia)와 비교하여 폐동맥의 에코-도플러(echo-Doppler)에 의해 관찰된 심박출량이 감소했다(상단 패널). 대조적으로, 심박수는 영향을 받지 않았다(하단 패널). 이러한 특징의 조합은 폐의 혈관 저항성의 급격한 증가로 해독되었고, 폐 모세혈관층 전체에 혈관 폐색이 분산되었다. 혈관-폐쇄성 에피소드가 입증된 후, 재조합 아넥신-A5 돌연변이체 폴리펩타이드(rhA5-E, rhA5-R; 2.5 μg/마우스)의 정맥내 주사는 비히클 단독(PBS)에 비해 폐 재관류를 유의적으로 가속화함이 발견되었다(주사 후 15분 및 20분에 p<0.05; n= 4-6). 아넥신-A5 돌연변이체의 주사 후 15분 이내에 거의 정상에 가까운 심박출량이 회복된 반면, 자발성 폐 재관류(vehicle, PBS)는 H/R 후 약 4-8시간 내에만 발생한다. 이는 재조합 돌연변이체 아넥신-A5 폴리펩타이드가 혈관-폐색을 방출하도록 작용하고 모세혈관 층을 통해 스트레스를 받은 적혈구 순환을 촉진하였으며, 미리-확립된 혈관 폐색에 대한 '치유적' 치료학적 적용에서 조직 관류를 개선할 수 있음을 시사하였다.
실시예:
방법
혈액샘플의 수집
정맥 혈액 샘플은 1/10 부피의 0.106 M 시트르산나트륨을 함유하는 Monovette®(Sarstedt, 독일 눔레크트 소재) 주사기에 수집되었다. 모든 분석은 채혈 후 2시간 이내에 수행되었다. 혈소판-풍부 혈장(Platelet-Rich Plasma; PRP)은 190g에서 20℃에서 10분 동안 혈액 원심분리하여 제조하였다. PRP를 회수하고 20℃에서 15분 동안 2500g에서 PRP를 이중 원심분리하여 혈소판이 없는 혈장(PFP)을 수득하였다. PFP를 -80℃에서 즉시 동결시키고 필요한 경우 37℃에서 15분 동안 해동하였다. PFP는 건강한 자원자(혈액 공여자), 하이드록시유레아(HU) 치료가 없거나 진행 중인 낫 세포 질환 환자(동형 HbS)뿐만 아니라 입원한 COVID-19 환자(입원 후 2-3일째, 및 고 용량에서 저 분자량 헤파린으로 예방적 항응고 치료를 받은 후, 및 산소 치료를 받은 후)를 포함한, 상이한 유형의 환자로부터 생성하였다.
트롬빈 생성 분석
보정된 자동 혈전조영술(CAT)은 전용 소프트웨어 프로그램(Thrombinscope BV, 네덜란드 마아스트리크트 소재)을 사용하여 미세역가 플레이트 형광계(microtiter plate fluorometer)(Fluoroskan Ascent, ThermoLabsystems, 핀란드 헬싱키 소재) 내에서 37℃에서 수행하였다. 응고 캐스케이드(cascade) 활성화는 조직 인자의 외인성 인지질 첨가 없이, 샘플의 재석회화에 의해서만 개시되었다. 이는 각 유형의 환자의 혈장 속에 존재하기 때문에, 아넥신-A5 폴리펩타이드가 이의 고유 상태 및 이의 복잡한 다인자 환경(용혈 생성물 포함)에서 내인성 생리학적 막(예: 세포외 소포)에 의해 운반되는 PS의 억제를 평가하도록 하였다. 트롬빈 생성 곡선은 여러 최종 농도(0.3, 3, 30, 300nM)에서 재조합 아넥신-A5(WT) 및 아넥신-A5 돌연변이체의 존재 또는 부재 하에 PFP를 사용하여 3중으로 기록하였다. 트롬빈 생성은 최대 90분에 걸쳐 트롬빈 활성의 역학적 곡선으로 제시되었다. 반응 곡선의 주요 구성성분으로부터 네 가지 주요 유형의 데이터, 예를 들면, 트롬빈 활성의 총량(즉, 내인성 트롬빈 전위(ETP, 곡선 하 영역(area under the curve)으로 평가됨) 뿐만 아니라 최대 트롬빈 생성률, 지연 시간(lag time), 피크까지의 시간) 등으로부터 추출할 수 있다. 야생형 아넥신-A5(rhAnn-A5-WT 또는 rhA5-WT)의 농도, 또는 ETP의 50%를 억제하는 아넥신-A5 돌연변이체의 농도를 해당 폴리펩타이드에 대한 IC50으로 정의하였다.
낫 세포 질환 및 혈관-폐색 에피소드의 뮤린(murine) 모델.
본 발명자는 10-18주령의 HbSAD 형질전환 수컷 마우스(SAD 돌연변이된 헤모글로빈 쇄를 발현함)를 사용하였고 SCD 환자의 혈관-폐색 위기와 유사한 혈관-폐색 사건을 유도하였다. HbSAD 마우스는, 특히 RBC 분해 생성물 및 이의 억제제의 연구에 적합한, 유도성 VOC에 대한 검증된 모델이다. SCD 환자와 같이, HbSAD 마우스도 호중구 고백혈구증을 나타낸다.
출혈성 매개변수는 에코-도플러에 의해 휴식 시(정상 산소 동안) 먼저 수집하였다. 본 발명자는 심장 박동수와 폐동맥의 심장 출력을 특성화하였다. 이후에, 저산소증/재산소화(H/R)에 의해 혈관-폐색 에피소드를 개시하였고, 마우스를 밤새(12-16시간) 9% O2 속에 넣은 다음, 30분 동안 갑작스러운 재산소화(실내 공기)를 개시하였다. 폐동맥 내 심박수와 심장 출력은 에코-도플러 (H/R 기준 측정)에 의해 다시 수집하였다. 마우스는 저산소증/재산소화가 심장 출력의 급격한 하락을 생산한 경우 주요 혈관 폐색 에피소드를 겪는 것으로 고려된 반면, 심박수는 영향을 받지 않았다. 이러한 현상의 조합은 원위 모세혈관 층 전체에 분산된 혈관-폐색으로 인해 혈액이 폐 혈관계를 횡단하기 어려운, 폐에서 혈관 저항의 급격한 증가로 해석되었다.
혈관-폐색 에피소드가 특성화된 후, 재조합 아넥신-A5 폴리펩타이드를 정맥 주사하였다. 주사 후 약 45분의 관찰 기간에 걸쳐 폐동맥 내 심박수 및 심박출량을 에코-도플러에 의해 다시 수집하였다. 폐 재관류는 심박출량(폐동맥에서 관찰된 바와 같이)이 정상산소증 수준(프레(pre)-H/R)으로 돌아왔을 때 달성되는 것으로 고려되었다. 완전 자발성 폐 재관류는 H/R 후 약 4-8시간에 발생하는 것으로 알려져 있다.
결과
본 발명자는 낮은 헴 상호작용, 및 높은 TGT(트롬빈 생성 시간)-억제의 2개 특성을 갖는 재조합체 인간 돌연변이된 아넥신-A5 폴리펩타이드를 생성하였다(도 1). 본 발명자는 다음에 SCD 환자에서 상기 아넥신 A5 폴리펩타이드의 기능을 평가하였다. 본 발명자는 환자를 2개의 그룹, 활발하게 진행 중인 혈관 내 용혈을 입증하는 그룹 및 채혈 당시 그렇지 않은 그룹으로 나누었다. 이는 415 nm(소렛 밴드(Soret band))에서의 증가된 흡광도에 의해 측정될 수 있고, 여기서 혈장 내 임의의 단위 0.5를 초과하는 임계값(threshold)은 비용혈성 환자를 혈관 내 용혈이 진행 중인 환자로부터 구별하기 위한 것이다(도 2). 활성 혈관 내 용혈이 있는 SCD 환자는 TGT 곡선에서 유도된 주요 데이터(표시되지 않음)에서 입증된 바와 같이, 비용혈성 환자에 비해 가속화되고 증가된 혈장에서 트롬빈 생성을 나타내었다. 본 발명자는 돌연변이된 A5 폴리펩타이드가 특히 용혈성 SCD 환자에서 트롬빈 생성을 감소시키는 데 효과적이라는 것을 입증하였다(도 3). 하이드록시우레아로 치료받은 SCD 환자는 TGT 곡선에서 입증된 바와 같이(표시되지 않음), 하이드록시우레아 치료에도 불구하고, 건강한 대상체에 비해 혈장에서 가속화되고 증가된 트롬빈 생성을 입증하였다. 본 발명자는 rhA5-'E' 돌연변이와 rhA5-WT가 하이드록시우레아가 가져오는 이점을 넘어서, 이러한 혈장에서 트롬빈 생성을 감소시키는 유의적이고 구체적인 능력을 나타냄을 입증하였다(도 4). 이후에, 본 발명자는 rhA5-'E'(즉, E228A 돌연변이를 포함하는 A5 폴리펩타이드), rhA5-'R'(R227A 돌연변이를 포함하는 A5 폴리펩타이드) 및 rhA5-'Y' 돌연변이체(Y257A 돌연변이를 포함하는 A5 폴리펩타이드)가 rhA5-WT와 같이, 예방학적 항응고의 이점을 넘어 입원한 COVID-19 환자의 혈장에서 트롬빈 생성을 감소시키는 유의적이고 구체적인 능력을 나타내었음을 입증하였다(도 5). 최종적으로, 혈관-폐색성 에피소드가 있는 낫 세포 질환의 뮤린 모델에서, 본 발명자는 rhA5-'E'(E228A) 및 rhA5-'R'(R227A) 돌연변이체가 hdA5-WT와 같이, 비히클(PBS)과 비교하여, 예비-확립된 혈관-폐색 이벤트 후 폐 재관류를 가속화하였음을 입증하였다(도 6).
참고문헌:
본 출원에서, 본 발명이 속하는 기술 분야를 설명하기 위하여 여러 참고문헌들이 기술되었다. 이러한 참고문헌들의 개시는 본 명세서에 참조로서 통합된다.
SEQUENCE LISTING <110> INSERM (INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE) SORBONNE UNIVERSITE UNIVERSITE PARIS CITE <120> MUTATED ANNEXIN A5 POLYPEPTIDES AND USES THEREOF FOR THERAPEUTIC PURPOSES <130> IP20234391FR <160> 4 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 320 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Gln Val Leu Arg Gly Thr Val Thr Asp Phe Pro Gly Phe Asp 1 5 10 15 Glu Arg Ala Asp Ala Glu Thr Leu Arg Lys Ala Met Lys Gly Leu Gly 20 25 30 Thr Asp Glu Glu Ser Ile Leu Thr Leu Leu Thr Ser Arg Ser Asn Ala 35 40 45 Gln Arg Gln Glu Ile Ser Ala Ala Phe Lys Thr Leu Phe Gly Arg Asp 50 55 60 Leu Leu Asp Asp Leu Lys Ser Glu Leu Thr Gly Lys Phe Glu Lys Leu 65 70 75 80 Ile Val Ala Leu Met Lys Pro Ser Arg Leu Tyr Asp Ala Tyr Glu Leu 85 90 95 Lys His Ala Leu Lys Gly Ala Gly Thr Asn Glu Lys Val Leu Thr Glu 100 105 110 Ile Ile Ala Ser Arg Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Ile Lys Gln Val 115 120 125 Tyr Glu Glu Glu Tyr Gly Ser Ser Leu Glu Asp Asp Val Val Gly Asp 130 135 140 Thr Ser Gly Tyr Tyr Gln Arg Met Leu Val Val Leu Leu Gln Ala Asn 145 150 155 160 Arg Asp Pro Asp Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gln Val Glu Gln Asp Ala 165 170 175 Gln Ala Leu Phe Gln Ala Gly Glu Leu Lys Trp Gly Thr Asp Glu Glu 180 185 190 Lys Phe Ile Thr Ile Phe Gly Thr Arg Ser Val Ser His Leu Arg Lys 195 200 205 Val Phe Asp Lys Tyr Met Thr Ile Ser Gly Phe Gln Ile Glu Glu Thr 210 215 220 Ile Asp Arg Glu Thr Ser Gly Asn Leu Glu Gln Leu Leu Leu Ala Val 225 230 235 240 Val Lys Ser Ile Arg Ser Ile Pro Ala Tyr Leu Ala Glu Thr Leu Tyr 245 250 255 Tyr Ala Met Lys Gly Ala Gly Thr Asp Asp His Thr Leu Ile Arg Val 260 265 270 Met Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp Leu Phe Asn Ile Arg Lys Glu Phe 275 280 285 Arg Lys Asn Phe Ala Thr Ser Leu Tyr Ser Met Ile Lys Gly Asp Thr 290 295 300 Ser Gly Asp Tyr Lys Lys Ala Leu Leu Leu Leu Cys Gly Glu Asp Asp 305 310 315 320 <210> 2 <211> 320 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutant2 R227A annexin A5 <400> 2 Met Ala Gln Val Leu Arg Gly Thr Val Thr Asp Phe Pro Gly Phe Asp 1 5 10 15 Glu Arg Ala Asp Ala Glu Thr Leu Arg Lys Ala Met Lys Gly Leu Gly 20 25 30 Thr Asp Glu Glu Ser Ile Leu Thr Leu Leu Thr Ser Arg Ser Asn Ala 35 40 45 Gln Arg Gln Glu Ile Ser Ala Ala Phe Lys Thr Leu Phe Gly Arg Asp 50 55 60 Leu Leu Asp Asp Leu Lys Ser Glu Leu Thr Gly Lys Phe Glu Lys Leu 65 70 75 80 Ile Val Ala Leu Met Lys Pro Ser Arg Leu Tyr Asp Ala Tyr Glu Leu 85 90 95 Lys His Ala Leu Lys Gly Ala Gly Thr Asn Glu Lys Val Leu Thr Glu 100 105 110 Ile Ile Ala Ser Arg Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Ile Lys Gln Val 115 120 125 Tyr Glu Glu Glu Tyr Gly Ser Ser Leu Glu Asp Asp Val Val Gly Asp 130 135 140 Thr Ser Gly Tyr Tyr Gln Arg Met Leu Val Val Leu Leu Gln Ala Asn 145 150 155 160 Arg Asp Pro Asp Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gln Val Glu Gln Asp Ala 165 170 175 Gln Ala Leu Phe Gln Ala Gly Glu Leu Lys Trp Gly Thr Asp Glu Glu 180 185 190 Lys Phe Ile Thr Ile Phe Gly Thr Arg Ser Val Ser His Leu Arg Lys 195 200 205 Val Phe Asp Lys Tyr Met Thr Ile Ser Gly Phe Gln Ile Glu Glu Thr 210 215 220 Ile Asp Ala Glu Thr Ser Gly Asn Leu Glu Gln Leu Leu Leu Ala Val 225 230 235 240 Val Lys Ser Ile Arg Ser Ile Pro Ala Tyr Leu Ala Glu Thr Leu Tyr 245 250 255 Tyr Ala Met Lys Gly Ala Gly Thr Asp Asp His Thr Leu Ile Arg Val 260 265 270 Met Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp Leu Phe Asn Ile Arg Lys Glu Phe 275 280 285 Arg Lys Asn Phe Ala Thr Ser Leu Tyr Ser Met Ile Lys Gly Asp Thr 290 295 300 Ser Gly Asp Tyr Lys Lys Ala Leu Leu Leu Leu Cys Gly Glu Asp Asp 305 310 315 320 <210> 3 <211> 320 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutant3 E228A annexin A5 <400> 3 Met Ala Gln Val Leu Arg Gly Thr Val Thr Asp Phe Pro Gly Phe Asp 1 5 10 15 Glu Arg Ala Asp Ala Glu Thr Leu Arg Lys Ala Met Lys Gly Leu Gly 20 25 30 Thr Asp Glu Glu Ser Ile Leu Thr Leu Leu Thr Ser Arg Ser Asn Ala 35 40 45 Gln Arg Gln Glu Ile Ser Ala Ala Phe Lys Thr Leu Phe Gly Arg Asp 50 55 60 Leu Leu Asp Asp Leu Lys Ser Glu Leu Thr Gly Lys Phe Glu Lys Leu 65 70 75 80 Ile Val Ala Leu Met Lys Pro Ser Arg Leu Tyr Asp Ala Tyr Glu Leu 85 90 95 Lys His Ala Leu Lys Gly Ala Gly Thr Asn Glu Lys Val Leu Thr Glu 100 105 110 Ile Ile Ala Ser Arg Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Ile Lys Gln Val 115 120 125 Tyr Glu Glu Glu Tyr Gly Ser Ser Leu Glu Asp Asp Val Val Gly Asp 130 135 140 Thr Ser Gly Tyr Tyr Gln Arg Met Leu Val Val Leu Leu Gln Ala Asn 145 150 155 160 Arg Asp Pro Asp Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gln Val Glu Gln Asp Ala 165 170 175 Gln Ala Leu Phe Gln Ala Gly Glu Leu Lys Trp Gly Thr Asp Glu Glu 180 185 190 Lys Phe Ile Thr Ile Phe Gly Thr Arg Ser Val Ser His Leu Arg Lys 195 200 205 Val Phe Asp Lys Tyr Met Thr Ile Ser Gly Phe Gln Ile Glu Glu Thr 210 215 220 Ile Asp Arg Ala Thr Ser Gly Asn Leu Glu Gln Leu Leu Leu Ala Val 225 230 235 240 Val Lys Ser Ile Arg Ser Ile Pro Ala Tyr Leu Ala Glu Thr Leu Tyr 245 250 255 Tyr Ala Met Lys Gly Ala Gly Thr Asp Asp His Thr Leu Ile Arg Val 260 265 270 Met Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp Leu Phe Asn Ile Arg Lys Glu Phe 275 280 285 Arg Lys Asn Phe Ala Thr Ser Leu Tyr Ser Met Ile Lys Gly Asp Thr 290 295 300 Ser Gly Asp Tyr Lys Lys Ala Leu Leu Leu Leu Cys Gly Glu Asp Asp 305 310 315 320 <210> 4 <211> 320 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Mutant5 Y257A annexin A5 <400> 4 Met Ala Gln Val Leu Arg Gly Thr Val Thr Asp Phe Pro Gly Phe Asp 1 5 10 15 Glu Arg Ala Asp Ala Glu Thr Leu Arg Lys Ala Met Lys Gly Leu Gly 20 25 30 Thr Asp Glu Glu Ser Ile Leu Thr Leu Leu Thr Ser Arg Ser Asn Ala 35 40 45 Gln Arg Gln Glu Ile Ser Ala Ala Phe Lys Thr Leu Phe Gly Arg Asp 50 55 60 Leu Leu Asp Asp Leu Lys Ser Glu Leu Thr Gly Lys Phe Glu Lys Leu 65 70 75 80 Ile Val Ala Leu Met Lys Pro Ser Arg Leu Tyr Asp Ala Tyr Glu Leu 85 90 95 Lys His Ala Leu Lys Gly Ala Gly Thr Asn Glu Lys Val Leu Thr Glu 100 105 110 Ile Ile Ala Ser Arg Thr Pro Glu Glu Leu Arg Ala Ile Lys Gln Val 115 120 125 Tyr Glu Glu Glu Tyr Gly Ser Ser Leu Glu Asp Asp Val Val Gly Asp 130 135 140 Thr Ser Gly Tyr Tyr Gln Arg Met Leu Val Val Leu Leu Gln Ala Asn 145 150 155 160 Arg Asp Pro Asp Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gln Val Glu Gln Asp Ala 165 170 175 Gln Ala Leu Phe Gln Ala Gly Glu Leu Lys Trp Gly Thr Asp Glu Glu 180 185 190 Lys Phe Ile Thr Ile Phe Gly Thr Arg Ser Val Ser His Leu Arg Lys 195 200 205 Val Phe Asp Lys Tyr Met Thr Ile Ser Gly Phe Gln Ile Glu Glu Thr 210 215 220 Ile Asp Arg Glu Thr Ser Gly Asn Leu Glu Gln Leu Leu Leu Ala Val 225 230 235 240 Val Lys Ser Ile Arg Ser Ile Pro Ala Tyr Leu Ala Glu Thr Leu Tyr 245 250 255 Ala Ala Met Lys Gly Ala Gly Thr Asp Asp His Thr Leu Ile Arg Val 260 265 270 Met Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp Leu Phe Asn Ile Arg Lys Glu Phe 275 280 285 Arg Lys Asn Phe Ala Thr Ser Leu Tyr Ser Met Ile Lys Gly Asp Thr 290 295 300 Ser Gly Asp Tyr Lys Lys Ala Leu Leu Leu Leu Cys Gly Glu Asp Asp 305 310 315 320

Claims (17)

  1. 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드(mutated Annexin A5 polypeptide)로서, 위치 227, 228 또는 257번에서 적어도 하나의 아미노산이 돌연변이되어 있는, 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    위치 227, 228 또는 257번에서 아미노산이 치환되는, 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드.
  3. 제1항에 있어서,
    위치 227번에서 아미노산(R)이 아미노산(A)로 치환되는, 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드.
  4. 제1항에 있어서,
    위치 228번에서 아미노산(E)이 아미노산(A)로 치환되는, 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드.
  5. 제1항에 있어서,
    위치 257번에서 아미노산(Y)이 아미노산(A)로 치환되는, 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드.
  6. 제1항에 있어서,
    R227A, E228A 및 Y257A로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 서열 번호: 1에 제시된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드.
  7. 제1항에 있어서,
    서열 번호: 2, 3 또는 4에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 90% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드.
  8. 제1항에 있어서,
    서열 번호: 3에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드.
  9. 제1항의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  10. 제9항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터.
  11. 제9항의 폴리뉴클레오타이드 또는 제10항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  12. 제1항의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체(subject)에서의 치료 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 대상체는 혈관내 용혈 또는 용혈성 빈혈이 발생하는 질환 또는 상태를 겪고 있는, 치료 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    혈전증의 위험을 방지 또는 감소시키기 위한, 치료 방법.
  15. 제12항에 있어서,
    낫형 세포 질환(sickle cell disease) 환자에서 혈관 폐색(vaso-occlusion)을 치료하기 위한, 치료 방법.
  16. 제12항에 있어서,
    SAR-CoV-2 감염과 같은 바이러스 감염을 앓고 있는 환자의 정맥 혈전색전증 및 동맥 혈전증의 치료를 위한, 치료 방법.
  17. 제1항의 돌연변이된 아넥신 A5 폴리펩타이드의 일 량을 포함하는 약제학적 조성물.
KR1020247001242A 2021-06-14 2022-06-14 돌연변이된 아넥신 a5 폴리펩타이드 및 치료 목적을 위한 이의 용도 KR20240021898A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP21305810 2021-06-14
EP21305810.0 2021-06-14
PCT/EP2022/066102 WO2022263407A2 (en) 2021-06-14 2022-06-14 Mutated annexin a5 polypeptides and uses thereof for therapeutic purposes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240021898A true KR20240021898A (ko) 2024-02-19

Family

ID=76845151

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020247001242A KR20240021898A (ko) 2021-06-14 2022-06-14 돌연변이된 아넥신 a5 폴리펩타이드 및 치료 목적을 위한 이의 용도

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20240141001A1 (ko)
EP (1) EP4355765A2 (ko)
JP (1) JP2024523030A (ko)
KR (1) KR20240021898A (ko)
CN (1) CN117897399A (ko)
WO (1) WO2022263407A2 (ko)

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
US6982154B2 (en) * 2002-02-21 2006-01-03 Surromed, Inc. Modified annexin proteins and methods for treating vaso-occlusive sickle-cell disease
CA2559167A1 (en) * 2004-03-11 2005-09-22 Alavita, Inc. Modified annexin proteins and methods for preventing thrombosis
JP2007532617A (ja) 2004-04-15 2007-11-15 アテラ バイオテクノロジーズ エービー アテローム血栓症およびプラーク破壊を予防するためのアネキシンｖ
PL2234631T3 (pl) 2007-12-18 2013-03-29 Athera Biotechnologies Ab Związki i metody stosowane w terapii choroby naczyniowej
ES2630013T3 (es) 2008-02-22 2017-08-17 Annexin Pharmaceuticals Ab Compuestos y procedimientos para la prevención o tratamiento de reestenosis
EP2380023A2 (en) 2008-12-19 2011-10-26 Medirista Biotechnologies AB Oxidized cardiolipin as a novel pro-inflammatory factor
EP2684045B2 (en) 2011-03-09 2023-03-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods to characterize patients suffering from hemolysis
DK2694538T3 (da) 2011-04-05 2017-01-02 Annexin Pharmaceuticals Ab Terapeutiske og profylaktiske fremgangsmåder, anvendelser og sammensætninger omfattende anexin a5
EP3865147A1 (en) * 2015-10-02 2021-08-18 Silver Creek Pharmaceuticals, Inc. Bi-specific therapeutic proteins for tissue repair

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022263407A2 (en) 2022-12-22
WO2022263407A3 (en) 2023-02-02
EP4355765A2 (en) 2024-04-24
CN117897399A (zh) 2024-04-16
JP2024523030A (ja) 2024-06-25
US20240141001A1 (en) 2024-05-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2286247T3 (es) Proteinas anexinicas modificacdas y tratamiento de la trombosis.
RU2580756C2 (ru) Лекарственное средство для терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе
ES2700149T3 (es) Proteínas de fusión de UTI
KR20240021898A (ko) 돌연변이된 아넥신 a5 폴리펩타이드 및 치료 목적을 위한 이의 용도
US7074399B2 (en) Treatment of inflammation with p20
US11085032B2 (en) Mutated factor X polypeptides and uses thereof for the treatment of haemophilia
US20190100602A1 (en) Anti-antithrombin single-domain antibodies and polypeptides comprising thereof
US20200299666A1 (en) Mutated factor x polypeptides and uses thereof for the treatment of haemophilia
RU2799764C2 (ru) Лекарственное средство для терапевтического лечения и/или улучшения состояния при сепсисе, сопровождающемся коагулопатией
AU2019366008B2 (en) Drug for treating and/or improving septicemia associated with coagulation abnormality
JP7104622B2 (ja) Ｐｈａ １ｂ型の治療のための環状ポリペプチド
JPH083065A (ja) 肝臓障害に対する治療剤
NZ624542B2 (en) Medicament for therapeutic treatment and/or improvement of sepsis