ES2286247T3

ES2286247T3 - Proteinas anexinicas modificacdas y tratamiento de la trombosis.

Info

Publication number: ES2286247T3
Application number: ES02721083T
Authority: ES
Inventors: Anthony Allison
Original assignee: Alavita Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Alavita Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2001-02-21
Filing date: 2002-02-21
Publication date: 2007-12-01
Anticipated expiration: 2022-02-21
Also published as: JP2010189405A; DE60219611T2; US20030166532A1; DE60219611D1; JP2004528025A; AU2002252035A1; JP2008263991A; EP1839670A2; US20050197295A1; WO2002067857A3; EP1379266A4; US7407475B2; EP1379266A2; EP1839670A3; WO2002067857A2; US6962903B2; EP1379266B1; ATE359807T1

Abstract

Composición farmacéutica que comprende una cantidad antitrombóticamente eficaz de una proteína anexínica modificada aislada que consiste esencialmente en una primera proteína anexínica acoplada a una segunda proteína anexínica vía un segmento de fusión.

Description

Proteínas anexínicas modificadas y prevención y tratamiento de la trombosis.

Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente a métodos y composiciones para tratar la trombosis. Más particularmente, se refiere a proteínas anexínicas modificadas y a su uso.

Antecedentes de la invención

La trombosis - la formación, el desarrollo, o la presencia de un coágulo de sangre (trombo) en un vaso sanguíneo - es el trastorno médico grave más habitual. El ejemplo más frecuente de trombosis arterial es la trombosis coronaria, que conduce a la oclusión de las arterias coronarias y, a menudo, al infarto de miocardio (ataque al corazón). Cada año, en América del Norte, ingresan más de 1,3 millones de pacientes en el hospital por infarto de miocardio. La terapia estándar es la administración de una proteína trombolítica mediante infusión. Se estima que el tratamiento trombolítico del infarto agudo de miocardio salva 30 vidas de cada 1000 pacientes tratados; no obstante, la mortalidad a los 30 días para este trastorno sigue siendo importante (Mehta et al., Lancet 356:449-454 (2000)). Sería conveniente administrar agentes antitrombóticos y trombolíticos mediante inyección de bolo, puesto que se pueden usar antes de la admisión en el hospital, con beneficio adicional (Rawles, J. Am. Coll. Cardiol. 30:1181-1186 (1997)). Sin embargo, la inyección mediante bolo (en oposición a una infusión intravenosa más gradual) aumenta significativamente el riesgo de hemorragia cerebral (Mehta et al., 2000). Sería deseable el desarrollo de un agente capaz de prevenir la trombosis y/o incrementar la trombolisis, sin aumentar el riesgo de hemorragia.

La angina inestable, provocada por un suministro inadecuado de oxígeno al corazón debido a la oclusión coronaria, es la causa más habitual de admisión hospitalaria, con 1,5 millones de casos al año en los Estados Unidos sólo. Cuando los pacientes con oclusión de arterias coronarias son tratados con angioplastia y endoprótesis vascular, el uso de un anticuerpo contra gp IIb/IIIa plaquetaria disminuye la probabilidad de restenosis. Sin embargo, el mismo anticuerpo no ha mostrado beneficio en angina inestable sin angioplastia, y es necesario un método mejor para prevenir la oclusión coronaria en estos pacientes.

Otro ejemplo importante de trombosis arterial es la trombosis cerebral. El activador de plasminógeno tisular recombinante (rtPA) intravenoso es el único tratamiento para el accidente cerebrovascular isquémico aprobado por la Food and Drug Administration. Cuanto más pronto se administre, mejor (Ernst et al., Stroke 31:2552-2557 (2000)). Sin embargo, la administración intravenosa de rtPA está asociada con un aumento del riesgo de hemorragia intracerebral. A menudo, los accidentes cerebrovasculares totalmente sintomáticos están precedidos por ataques isquémicos transitorios (TIA), y se estima que aproximadamente 300.000 personas sufren TIA cada año en los Estados Unidos de América. Sería deseable tener un agente seguro y eficaz que se pudiese administrar como un bolo y que previniese, durante varios días, la recaída de la trombosis cerebral sin aumentar el riesgo de hemorragia cerebral. La trombosis también contribuye a la oclusión periférica en diabéticos y en otros pacientes, y es necesario un agente antitrombótico eficaz y seguro para uso en tales pacientes.

La trombosis venosa es una combinación frecuente de procedimientos quirúrgicos, tales como artroplastias de cadera y de rodilla. Sería deseable prevenir la trombosis sin aumentar la hemorragia en el campo de operación. Se aplican consideraciones similares a la trombosis venosa asociada con el embarazo y el parto. Algunas personas tienen tendencia a sucesos trombóticos venosos repetidos, y actualmente están siendo tratadas mediante agentes antitrombóticos tales como fármacos de tipo cumarínico. La dosis de tales fármacos se debe medir en cada paciente, y el margen entre las dosis antitrombóticas eficaces y aquellas que aumentan la hemorragia es muy pequeña. Es deseable tener un tratamiento con una mejor separación de la actividad antitrombótica del riesgo creciente de hemorragia. Todas las terapias antitrombóticas recientemente introducidas, incluyendo ligandos de gp IIb/IIIa plaquetaria, heparinas de bajo peso molecular, y un inhibidor pentasacárido del factor Xa, conllevan un riesgo creciente de hemorragia (Levine et al., Chest 119:108S-121S (2001)). Por tanto, existe la necesidad de explorar estrategias alternativas para prevenir la trombosis arterial y venosa sin aumentar el riesgo de hemorragia.

Para inhibir la extensión de los trombos arteriales o venosos sin aumentar la hemorragia, es necesario explotar diferencias potenciales entre mecanismos implicados en la hemostasis y aquellos implicados en trombosis en grandes vasos sanguíneos. Los mecanismos hemostáticos primarios incluyen la formación de microagregados plaquetarios, que taponan capilares y se acumulan sobre células endoteliales dañadas o activadas, en pequeños vasos sanguíneos. Los inhibidores de la agregación plaquetaria, incluyendo agentes que suprimen la formación o acción de tromboxano A_{2}, los ligandos de gp IIa/IIIb, y los fármacos que actúan sobre los receptores de ADP, tales como clopidrogel (Hallopeter, Nature 409:202-207 (2001)), interfieren con este proceso y, por lo tanto, aumentan el riesgo de hemorragia (Levine et al., 2001). En contraste con la formación de microagregados, la oclusión mediante un trombo arterial o venoso requiere el reclutamiento e incorporación continuos de plaquetas en el trombo. Para superar la desunión mediante fuerzas de cizallamiento en grandes vasos sanguíneos, las plaquetas se deben de unir fuertemente entre sí y a la red de fibrina depositada aproximadamente ellas.

Se han acumulado indicios de que la formación de macroagregados compacto de plaquetas está facilitada por un mecanismo de amplificación celular y humoral, que se refuerzan entre sí. En el mecanismo celular, la formación de microagregados relativamente sueltos de plaquetas, inducida por concentraciones moderadas de agonistas tales como ADP, tromboxano A_{2}, o colágeno, está acompañada por la liberación, desde los gránulos \alpha de las plaquetas, de la proteína Gas6 de 85 kD (Angelillo-Scherrer et al., Nature Medicine 7:215-221 (2001)). La unión de Gas6 liberada a las tirosina quinasas receptoras (Axl, Sky, Mer), expresadas sobre la superficie de plaquetas, induce la desgranulación completa y la formación de macroagregados compactos de estas células. En el mecanismo de amplificación humoral, se forma un complejo de protrombinasa sobre la superficie de las plaquetas activadas y de las microvesículas. Esto genera trombina y fibrina. La trombina es en sí misma un activador plaquetario potente e inductor de la liberación de Gas6 (Ishimoto y Nakano, FEBS Lett. 446:197-199 (2000)). Las plaquetas completamente activadas se unen fuertemente a la red de fibrina depositada aproximadamente ellas. Las observaciones histológicas muestran que tanto las plaquetas como la fibrina son necesarias para la formación de un trombo coronario estable en seres humanos (Falk et al. Interrelationship between atherosclerosis and thrombosis. In Vanstraete et al. (editors), Cardiovascular Thrombosis: Thrombocardiology and Thromboneurology. Philadelphia: Lipincott-Raven Publishers (1998), p. 45-58). Otra molécula de adhesión plaquetaria, la anfoterina, se mueve hacia la superficie de las plaquetas durante la activación, y se une a fosfolípido aniónico (Rouhainen et al., Thromb. Hemost. 84:1087-1094 (2000), incorporado en la presente memoria como referencia). Al igual que Gas6, la anfoterina podría formar un puente durante la agregación plaquetaria.

La cuestión surge de si es posible inhibir estos mecanismos de amplificación pero no la etapa de agregación plaquetaria inicial, previniendo de ese modo la trombosis sin incrementar la hemorragia. La importancia de la amplificación celular se ha establecido recientemente mediante estudios de ratones con inactivación intencionada de Gas6 (Angelillo-Scherrer et al., 2001). Se encontró que los ratones Gas6-/- están protegidos contra la trombosis y embolia inducidas por colágeno y epinefrina. Sin embargo, los ratones Gas6-/- no sufrieron hemorragia espontánea, y sangraron normalmente después de cortarles la cola. Además, los anticuerpos contra Gas6 inhibieron la agregación plaquetaria in vitro así como la trombosis inducida in vivo por colágeno y epinefrina. En principio, tales anticuerpos, o ligandos que compiten por la unión de Gas6 a tirosina quinasas receptoras, se pueden usar para inhibir la trombosis. Sin embargo, a la vista de la potencia de la amplificación humoral, puede ser preferible inhibir esa etapa. Idealmente, tal inhibidor también tendría una actividad supresiva adicional sobre el mecanismo de amplificación celular mediado por Gas6.

Una estrategia para prevenir la amplificación tanto humoral como celular de la agregación plaquetaria es la proporcionada por las anexinas, una familia de proteínas antitrombóticas muy homólogas, de las cuales diez se expresan en varios tejidos humanos (Benz y Hofmann, Biol. Chem. 378:177-183 (1997)). Las anexinas comparten la propiedad de unirse al calcio y a fosfolípidos cargados negativamente, que se requieren para la coagulación de la sangre. En condiciones fisiológicas, el fosfolípido negativamente cargado está suministrado principalmente por fosfatidilserina (PS) en membranas celulares activadas o dañadas. En células intactas, la PS está confinada en la cara interna de la bicapa de la membrana plasmática, y no es accesible sobre la superficie. Cuando se activan las plaquetas, aumentan enormemente las cantidades de PS accesible sobre su superficie, y por lo tanto el grado de unión de las anexinas (Sun et al., Thrombosis Res. 69:289-296 (1993)). Durante la activación de las plaquetas, se liberan microvesículas desde sus superficies, aumentando enormemente el área de la superficie que expresa fosfolípidos aniónicos con actividad procoagulante (Merten et al., Circulation 99:2577-2582 (1999); Chow et al., J. Lab. Clin. Med. 135:66-72 (2000)). Estos pueden desempeñar un papel importante en la propagación de trombos arteriales mediados por plaquetas.

Las proteínas implicadas en la cascada de la coagulación de la sangre (factores X, Xa y Va) se unen a membranas que tienen PS sobre sus superficies, y entre sí, formando un complejo de protrombinasa estable, fuertemente unido. Varias anexinas, incluyendo II, V y VIII, se unen a PS con una afinidad elevada, previniendo de ese modo la formación de un complejo de protrombinasa, y ejerciendo actividad antitrombótica. La anexina V se une a PS con una afinidad muy elevada (K_{d} = 1,7 nmoles/l), mayor que la afinidad de los factores X, Xa y Va por los fosfolípidos cargados negativamente (Thiagarajan y Tait, J. Biol. Chem. 265:17420-17423 (1990)). La coagulación de la sangre dependiente de factores tisulares sobre la superficie de células endoteliales activadas o dañadas también requiere la expresión superficial de PS, y la anexina V puede inhibir este proceso (van Heerde et al., Arterioscl. Thromb. 14:824-830 (1994)), aunque la anexina es menos eficaz en esta actividad que en la inhibición de la generación de protrombinasa (Rao et al., Thromb. Res. 62:517-531 (1992)).

La unión de la anexina V a plaquetas activadas y a células dañadas explica probablemente la retención selectiva de la proteína en los trombos. Esto se ha demostrado en modelos experimentales de animales de trombosis venosa y arterial (Stratton et al., Circulation 92:3113-3121 (1995); Thiagarajan y Benedict, Circulation 96:2339-2347 (1997)), y se ha propuesto una anexina marcada para la formación de imágenes médicas de trombos vasculares en seres humanos, con ruido reducido y aumento de seguridad (Reno y Kasina, Solicitud de Patente Internacional PCT/US95/07599 (WO 95/34315) (publicada el 21 de diciembre de 1995)). La unión a trombos de un agente antitrombótico potente, tal como la anexina V, proporciona una estrategia para prevenir la extensión o recidiva de la trombosis. La isquemia transitoria de miocardio también aumenta la unión de anexina V (Dumont et al., Circulation 102:1564-1568 (2000)). La formación de imágenes con anexina V en seres humanos ha mostrado un aumento de la unión de la proteína en corazones transplantados cuando la biopsia endomiocárdica ha demostrado rechazo vascular (Acio et al., J. Nuclear Med. 41 (5 Suppl.):127P (2000)). Esta unión es debida presumiblemente a PS exteriorizada sobre la superficie de células endoteliales dañadas, así como de miocitos apoptóticos en corazones que están siendo rechazados. Se concluye que la administración de anexina tras el infarto de miocardio debe prevenir la formación de complejos protrombóticos tanto en plaquetas como en células endoteliales, previniendo de ese modo la extensión o recidiva de la trombosis. La unión de anexina V también está aumentada tras la hipoxia cerebral en seres humanos (D'Arceuil et al., Stroke 2000:2692-2700 (2000)), lo que apoya la hipótesis de que la administración de anexina tras TIA puede disminuir la probabilidad de desarrollar un accidente cerebrovascular con todos los síntomas.

Las anexinas han mostrado actividad anticoagulante en varios ensayos in vitro dependientes de trombina, así como en modelos experimentales de animales de trombosis venosa (Römisch et al., Thrombosis Res. 61:93-104 (1991); Van Ryn-McKenna et al., Thrombosis Hemostasis 69:227-230 (1993)) y trombosis arterial (Thiagarajan y Benedict, 1997). Notablemente, la anexina, en dosis antitrombóticas, no tuvo ningún efecto demostrable sobre ensayos de coagulación ex vivo tradicionales en conejos tratados (Thiagarajan y Benedict, 1997), y no prolongó significativamente los tiempos de hemorragia de ratas tratadas (Van Ryn-McKenna et al., 1993). En conejos tratados, la anexina no aumentó la hemorragia en una incisión quirúrgica (Thiagarajan y Benedict, 1997). De este modo, únicamente entre todos los agentes investigados hasta ahora, las anexinas ejercen actividad antitrombótica sin aumentar la hemorragia. Las anexinas no inhiben la agregación plaquetaria accionada por agonistas distintos de la trombina (van Heerde et al., 1994), y la agregación plaquetaria es el mecanismo hemostático principal. En las paredes de vasos sanguíneos dañados y en tejidos extravasculares, el complejo del factor tisular/VIIa también ejerce efectos hemostáticos, y este sistema es menos susceptible a la inhibición por anexina V que lo que lo es el complejo de protrombinasa (Rao et al., 1992). Este es un argumento para confinar a la anexina V administrada al compartimiento vascular tan lejos como sea posible; es probable que se reduzca el riesgo de hemorragia.

A pesar de tales resultados prometedores para prevenir la trombosis, un problema importante asociado con el uso terapéutico de anexinas es su corta semivida en la circulación, que se estima en animales experimentales que es de 5 a 15 minutos (Römisch et al., 1991; Stratton et al., 1995; Thiagarajan y Benedict, 1997); la anexina V también tiene una semivida corta en la circulación de seres humanos (Strauss et al., J. Nuclear Med. 41 (5 Suppl.):149P (2000)). La mayor parte de la anexina se pierde en la orina, como es de esperar de una proteína de 36 kDa (Thiagarajan y Benedict, 1997). Por lo tanto, existe la necesidad de un método para prevenir la pérdida de anexina desde el compartimiento vascular en el compartimiento extravascular y en la orina, prolongando de ese modo la actividad antitrombótica tras una única inyección.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a compuestos y a medios para prevenir la trombosis arterial o venosa sin aumentar la hemorragia. Una anexina humana recombinante, preferentemente la anexina V, se modifica de manera que se prolongue su semivida en el compartimiento vascular. Una forma de realización preferida es una composición farmacéutica que comprende una anexina acoplada a otra proteína anexínica vía un segmento de fusión. La anexina modificada se une con afinidad elevada a fosfatidilserina sobre la superficie de plaquetas activadas o de células lesionadas, previniendo de ese modo la unión de Gas6 así como de proteínas procoagulantes, y previniendo la formación de un complejo de protrombinasa. Por lo tanto, la anexina modificada inhibe los mecanismos tanto celular como humoral mediante los cuales se amplifica la agregación plaquetaria, previniendo de ese modo la trombosis.

En una forma de realización, una proteína anexínica modificada aislada contiene una proteína anexínica acoplada a por lo menos una proteína anexínica adicional (formando un homodímero). La proteína adicional tiene preferentemente un peso molecular de por lo menos 30 kDa. También se proporcionan mediante la presente invención composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad antitrombóticamente eficaz de cualquiera de las proteínas anexínicas modificadas de la invención.

En usos de la invención, la anexina modificada se administra a un sujeto con riesgo de trombosis en una composición farmacéutica que tiene una cantidad antitrombóticamente eficaz de una cualquiera de las proteínas anexínicas modificadas de la presente invención. Por ejemplo, la composición farmacéutica se puede administrar después de una trombosis arterial, tal como trombosis coronaria, trombosis cerebral, o un ataque isquémico cerebral transitorio. También se puede administrar tras una operación quirúrgica asociada con trombosis venosa. Adicionalmente, se puede administrar a sujetos que tienen afecciones sujetas a trombosis arterial o venosa, tales como diabetes, embarazo, o parto.

También se proporcionan mediante la presente invención una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un homodímero de anexina, una molécula recombinante que contiene por lo menos una porción de la molécula de ácido nucleico, y una célula recombinante que contiene por lo menos una porción de la molécula de ácido nucleico. La célula recombinante se cultiva en condiciones adecuadas en un método de la invención, para producir un homodímero de anexina.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra un constructo de ADN para obtener un homodímero de anexina V.

La Fig. 2 es una gráfica del tiempo de coagulación de un ensayo de coagulación in vitro que compara la potencia anticoagulante de la anexina V humana recombinante con la anexina V humana recombinante pegilada.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona compuestos y medios para prevenir la trombosis en mamíferos, sin aumentar la hemorragia. La invención reside, en parte, en el reconocimiento de que los mecanismos primarios de la agregación plaquetaria son diferentes de los mecanismos de amplificación de la agregación plaquetaria, que se requieren para la formación de un trombo arterial o venoso. Mediante la inhibición de la formación del trombo, pero no de la agregación plaquetaria primaria, se puede prevenir la trombosis sin aumentar la hemorragia.

Los compuestos de la invención incluyen cualquier producto que contiene secuencias de aminoácidos anexínicas que se han modificado para aumentar la semivida del producto en seres humanos o en otros mamíferos, según se define en las reivindicaciones. Cuando se dice "secuencia de aminoácidos" en este documento para referirse a una secuencia de aminoácidos de una molécula proteínica de origen natural, la "secuencia de aminoácidos" y términos similares, tales como "polipéptido" o "proteína", no quieren limitar la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos natural, completa, asociada con las proteínas citadas. Las anexinas son una familia de proteínas membránicas homólogas que se unen a fosfolípidos, de las cuales diez representan productos génicos distintos expresados en mamíferos (Benz y Hofmann, 1997). El análisis cristalográfico ha revelado una estructura terciaria común para todos los miembros de la familia estudiados hasta ahora, ejemplificados por la anexina V (Huber et al., EMBO Journal 9:3867 (1990)). El dominio del núcleo es una estructura discoide cóncava que se puede yuxtaponer estrechamente a membranas fosfolipídicas. Contiene cuatro subdominios, constando cada uno de ellos de una repetición de anexina de 70 aminoácidos formada por cinco hélices \alpha. Las anexinas también tienen un dominio de cola más hidrófilo, que varía en longitud y en secuencia de aminoácidos entre las diferentes anexinas. Las secuencias de genes que codifican anexinas son bien conocidas (por ejemplo, Funakoshi et al., Biochemistry 26:8087-8092 (1987) (anexina V)).

En la presente invención, las proteínas anexínicas se modifican para aumentar su semivida en seres humanos o en otros mamíferos. En una forma de realización preferida, la proteína anexínica es anexina V. Una modificación adecuada de la anexina es un aumento en su tamaño eficaz, que evita la pérdida desde el compartimiento vascular hacia el compartimiento extravascular y hacia la orina, prolongando de ese modo la actividad antitrombótica tras una única inyección. Cualquier aumento del tamaño eficaz, que mantiene una afinidad de unión suficiente con fosfatidilserina, está dentro del alcance de la presente invención.

En una forma de realización de la invención, la proteína anexínica modificada es un polímero de proteínas anexínicas que tiene un tamaño eficaz incrementado. Se cree que el incremento del tamaño eficaz da como resultado una semivida prolongada en el compartimiento vascular, y una actividad antitrombótica prolongada. Una de tales anexinas modificadas es un dímero de anexina V. Otro de tales polímeros es el heterotetrámero de anexina II con p11, un miembro de la familia S100 de proteínas que se unen a calcio. La unión de una proteína S100 a una anexina aumenta la afinidad de la anexina por Ca^{2+}. El homopolímero o heterotetrámero de anexina se puede producir mediante métodos de bioconjugados o mediante métodos recombinantes, y se puede administrar por sí mismo o en forma conjugada con PEG.

Preferentemente, una proteína anexínica modificada de la invención es una proteína anexínica modificada aislada. La proteína anexínica modificada puede contener anexina II, anexina V o anexina VIII. En realizaciones preferidas, la proteína es anexina humana modificada. En realizaciones particularmente preferida, la anexina modificada contiene anexina humana recombinante. Según la presente invención, una proteína aislada o biológicamente pura es una proteína que se ha retirado de su entorno natural. Como tal, "aislada" y "biológicamente pura" no refleja necesariamente el grado en el que se ha purificado la proteína. Una proteína anexínica modificada aislada de la presente invención se puede obtener a partir de su fuente natural; se puede producir usando tecnología de ADN recombinante, o se puede producir mediante síntesis química. Como se usa en la presente memoria, una proteína anexínica modificada aislada puede ser una proteína modificada de longitud completa, o cualquier homólogo de tal proteína. También puede ser (por ejemplo, para una proteína pegilada) una proteína de longitud completa modificada, o un homólogo modificado de tal proteína.

El tamaño mínimo de un homólogo proteínico de la presente invención es un tamaño suficiente para ser codificado mediante una molécula de ácido nucleico capaz de formar un híbrido estable con la secuencia complementaria de una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína natural correspondiente. Como tal, el tamaño de la molécula de ácido nucleico que codifica tal homólogo proteínico depende de la composición del ácido nucleico y del porcentaje de homología entre la molécula de ácido nucleico y la secuencia complementaria, así como de las condiciones de hibridación per se (por ejemplo, temperatura, concentración salina, y concentración de formamida). El tamaño mínimo de tales moléculas de ácidos nucleicos es típicamente por lo menos aproximadamente 12 hasta aproximadamente 15 nucleótidos de longitud si las moléculas de ácidos nucleicos son ricas en GC, y por lo menos aproximadamente 15 hasta aproximadamente 17 bases de longitud si son ricas en AT. Como tal, el tamaño mínimo de una molécula de ácido nucleico usada para codificar un homólogo proteínico de la presente invención es desde aproximadamente 12 hasta aproximadamente 18 nucleótidos de longitud. No hay ningún límite en el tamaño máximo de tal molécula de ácido nucleico, por cuanto la molécula de ácido nucleico puede incluir una porción de un gen, un gen completo, o múltiples genes o porciones de la misma. De forma similar, el tamaño mínimo de un homólogo de proteína anexínica o de un homólogo de proteína anexínica modificada de la presente invención es desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 6 aminoácidos de longitud, dependiendo los tamaños preferidos de si se desean una proteína de longitud completa, multivalente (es decir, una proteína de fusión que tiene más de un dominio, cada uno de los cuales tiene una función), o porciones funcionales de tales proteínas. La anexina y los homólogos de anexina modificada de la presente invención tienen preferentemente actividad que corresponde a la proteína natural, tal como el hecho de ser capaces de realizar la actividad de la proteína anexínica previniendo la formación del trombo.

La proteína anexínica y los homólogos de anexina modificada pueden ser el resultado de la variación alélica natural o de la mutación natural. Los homólogos proteínicos también se pueden producir usando técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, modificaciones directas de la proteína, o modificaciones del gen que codifica la proteína, usando, por ejemplo, técnicas de ADN clásicas o recombinantes para efectuar la mutagénesis aleatoria o dirigida a una diana concreta.

También se prefiere una proteína anexínica modificada que contiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 95%, y lo más preferible por lo menos aproximadamente 98%, idéntica a la secuencia de aminoácidos SEC ID nº:6, o una proteína codificada por una variante alélica de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína que contiene cualquiera de estas secuencias. Los métodos para determinar los porcentajes de identidades entre secuencias de aminoácidos y entre secuencias de ácidos nucleicos son conocidos por los expertos en la materia. Los métodos preferidos para determinar los porcentajes de identidades entre secuencias incluyen programas de ordenador tales como el paquete GCG® Wisconsin Package^{TM} (disponible de Accelrys Corporation), el programa DNAsis^{TM} (disponible de Hitachi Software, San Bruno, CA), el Vector NTI Suite (disponible de Informax, Inc., North Bethesda, MD), o el programa de ordenador BLAST disponible en el sitio web de NCBI.

En una forma de realización, una proteína anexínica modificada aislada preferida de la presente invención es una proteína modificada codificada por una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de ácidos nucleicos SEC ID nº:4, o mediante una variante alélica de una molécula de ácido nucleico que tiene esta secuencia. Como alternativa, la proteína anexínica modificada contiene una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de ácidos nucleicos SEC ID nº:1, o mediante una variante alélica de una molécula de ácido nucleico que tiene esta secuencia.

También se describe una proteína anexínica modificada no nativa codificada por una molécula de ácido nucleico que se hibrida en condiciones de hibridación restrictivas con un gen de anexina. Como se usa en la presente memoria, condiciones de hibridación restrictivas se refiere a condiciones de hibridación estándares bajo las cuales se usan moléculas de ácidos nucleicos, incluyendo oligonucleótidos, para identificar moléculas que tienen secuencias de ácidos nucleicos similares. Tales condiciones estándar se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press (1989). Las condiciones de hibridación restrictivas permiten típicamente el aislamiento de moléculas de ácidos nucleicos que tienen por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con la molécula de ácido nucleico que se está usando para la sonda en la reacción de hibridación. Las fórmulas para calcular las condiciones de hibridación y de lavado apropiadas para lograr la hibridación que permita un desemparejamiento de 30% o menos de nucleótidos se describen, por ejemplo, en Meinkoth et al., Anal. Biochem. 138:267-284 (1984). En realizaciones preferidas, las condiciones de hibridación permitirán el aislamiento de moléculas de ácidos nucleicos que tienen por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con la molécula de ácido nucleico que se está usando como sonda. En realizaciones más preferidas, las condiciones de hibridación permitirán el aislamiento de moléculas de ácidos nucleicos que tienen por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con la molécula de ácido nucleico que se está usando como sonda. En realizaciones más preferidas, las condiciones de hibridación permitirán el aislamiento de moléculas de ácidos nucleicos que tienen por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con la molécula de ácido nucleico que se está usando como sonda.

Una proteína anexínica modificada preferida incluye una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico que tiene por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos y que se hibrida en condiciones que permiten preferentemente un desemparejamiento de aproximadamente 20% de pares de bases, más preferentemente en condiciones que permitan un desemparejamiento de pares de bases de aproximadamente 15%, más preferentemente en condiciones que permitan un desemparejamiento de pares de bases de aproximadamente 10%, más preferentemente en condiciones que permitan un desemparejamiento de pares de bases de aproximadamente 5%, e incluso más preferentemente en condiciones que permitan un desemparejamiento de pares de bases de aproximadamente 2%, con una molécula de ácido nucleico de SEC ID nº:4, o con un complemento de cualquiera de estas moléculas de ácidos nucleicos.

Como se usa en la presente memoria, un gen de anexina incluye todas las secuencias de ácidos nucleicos relacionadas con un gen de anexina natural, tales como regiones reguladoras que controlan la producción de la proteína anexínica codificada por ese gen (tal como, pero sin limitarse a, regiones de control de la transcripción, de la traducción o de la post-traducción), así como la propia región codificante. En una forma de realización, un gen de anexina incluye la secuencia de ácidos nucleicos SEC ID nº:1. Se debe observar que, puesto que la tecnología de secuenciación de ácidos nucleicos no está completamente libre de error, la SEC ID nº:1 (así como otras secuencias presentadas en la presente memoria), como mucho, representa una secuencia de ácidos nucleicos aparente de la molécula de ácido nucleico que codifica una proteína anexínica de la presente invención.

En otra forma de realización, un gen de anexina puede ser una variante alélica que incluye una secuencia similar pero no idéntica a SEC ID nº:1. Una variante alélica de un gen de anexina que incluye SEC ID nº:1 es un gen que aparece esencialmente en el mismo lugar (o lugares) en el genoma que el gen que incluye SEC ID nº:1, pero que, debido a variaciones naturales provocadas por, por ejemplo, mutación o recombinación, tiene una secuencia similar pero no idéntica. Las variantes alélicas codifican típicamente proteínas que tienen actividad similar a la de la proteína codificada por el gen con el que se están comparando. Las variantes alélicas también pueden comprender alteraciones en las regiones no traducidas 5' ó 3' del gen (por ejemplo, en regiones de control reguladoras). Las variantes alélicas son bien conocidas por los expertos en la materia, y sería de esperar que se encontrasen dentro de un ser humano dado, puesto que el genoma es diploide, y/o entre una población que comprenda dos o más seres humanos.

Una proteína anexínica modificada aislada de la presente invención se puede obtener a partir de su fuente natural, se puede producir usando tecnología de ADN recombinante, o se puede producir mediante síntesis química. Como se usa en la presente memoria, una proteína anexínica modificada aislada puede contener una proteína de longitud completa, o cualquier homólogo de tal proteína. Los ejemplos de anexina y de homólogos de anexina modificados incluyen anexina y proteínas anexínicas modificadas en las que se han suprimido (por ejemplo, una versión truncada de la proteína, tal como un péptido o mediante una reacción de corte y empalme de proteína cuando se ha eliminado una inteina o se han unido dos exteinas), insertado, invertido, sustituido y/o derivatizado (por ejemplo, mediante glicosilación, fosforilación, acetilación, metilación, miristilación, prenilación, palmitoilación, amidación y/o adición de glicerofosfatidil inositol) aminoácidos de tal manera que el homólogo incluye por lo menos un epítopo capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra una proteína anexínica. Esto es, cuando el homólogo se administra a un animal como un inmunógeno, usando técnicas conocidas por los expertos en la materia, el animal producirá una respuesta inmunitaria humoral y/o celular contra por lo menos un epítopo de una proteína anexínica. La anexina y los homólogos de anexina modificados también se pueden seleccionar mediante su capacidad para unirse selectivamente a suero inmune. Los métodos para medir tales actividades están descritos en la presente memoria. La anexina y los homólogos de anexina modificados incluyen aquellas proteínas que son capaces de realizar la función de la anexina nativa en un ensayo funcional; esto es, son capaces de unirse a fosfatidilserina o a plaquetas activadas, o de mostrar actividad antitrombótica. Los métodos para tales ensayos se describen en la sección de Ejemplos y en otras partes en la presente memoria.

Una proteína anexínica modificada de la presente invención se puede identificar por su capacidad para realizar la función de una proteína anexínica en un ensayo funcional. La frase "capaz de realizar la función de esa proteína en un ensayo funcional" significa que la proteína o proteína modificada tiene por lo menos aproximadamente 10% de la actividad de la proteína natural en el ensayo funcional. En otras realizaciones preferidas, tiene por lo menos aproximadamente 20% de la actividad de la proteína natural en el ensayo funcional. En otras realizaciones preferidas, tiene por lo menos aproximadamente 30% de la actividad de la proteína natural en el ensayo funcional. En otras realizaciones preferidas, tiene por lo menos aproximadamente 40% de la actividad de la proteína natural en el ensayo funcional. En otras realizaciones preferidas, tiene por lo menos aproximadamente 50% de la actividad de la proteína natural en el ensayo funcional. En otras realizaciones preferidas, la proteína o proteína modificada tiene por lo menos aproximadamente 60% de la actividad de la proteína natural en el ensayo funcional. En realizaciones más preferidas, la proteína o proteína modificada tiene por lo menos aproximadamente 70% de la actividad de la proteína natural en el ensayo funcional. En realizaciones más preferidas, la proteína o proteína modificada tiene por lo menos aproximadamente 80% de la actividad de la proteína natural en el ensayo funcional. En realizaciones más preferidas, la proteína o proteína modificada tiene por lo menos aproximadamente 90% de la actividad de la proteína natural en el ensayo funcional. Los ejemplos de ensayos funcionales se describen en la presente memoria.

Una proteína aislada de la presente invención se puede producir en una variedad de formas, incluyendo la recuperación de tal proteína a partir de una bacteria, y produciendo tal proteína recombinantemente. Una forma de realización de la presente invención es un método para producir una proteína anexínica modificada aislada de la presente invención usando tecnología de ADN recombinante. Tal método incluye las etapas de (a) cultivar una célula recombinante que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína anexínica modificada de la presente invención para producir la proteína, y (b) recuperar la proteína a partir de ella. Los detalles para producir células recombinantes y su cultivo se presentan más abajo. La frase "recuperar la proteína" se refiere simplemente a recoger todo el medio de fermentación que contiene la proteína, y no necesita implicar etapas adicionales de separación o de purificación. Las proteínas de la presente invención se pueden purificar usando una variedad de técnicas estándares de purificación de proteínas.

Las proteínas aisladas de la presente invención se recogen preferentemente en forma "sustancialmente pura". Como se usa en la presente memoria, sustancialmente pura "se refiere a una pureza que permita el uso eficaz de la proteína en un ensayo funcional".

Moléculas de ácidos nucleicos o genes de anexina modificada

También se describe una molécula de ácido nucleico aislada capaz de hibridarse en condiciones restrictivas con un gen que codifica una proteína anexínica modificada tal como un homodímero de anexina V. Tal molécula de ácido nucleico también se denomina en la presente memoria como molécula de ácido nucleico de anexina modificada. Se prefiere particularmente una molécula de ácido nucleico aislada que se hibrida en condiciones restrictivas con un gen de anexina modificada. Las características de tales genes se describen en la presente memoria. Según la presente invención, una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico que se ha retirado de su medio natural (es decir, que se ha sometido a manipulación humana. Como tal, "aislada" no refleja el grado en el que la molécula de ácido nucleico se ha purificado. Una molécula de ácido nucleico aislada puede incluir ADN, ARN, o derivados de ADN o ARN.

Como se establece anteriormente, un gen de anexina modificada incluye todas las secuencias de ácidos nucleicos relacionadas con un gen de anexina natural, tales como regiones reguladoras que controlan la producción de una proteína anexínica codificada por ese gen (tal como, pero sin limitarse a, regiones de control transcripcionales, traduccionales o post-traduccionales), así como la propia región codificante. Una molécula de ácido nucleico de la presente invención puede ser una molécula de ácido nucleico de anexina aislada modificada, o un homólogo de la misma. Una molécula de ácido nucleico de la presente invención puede incluir una o más regiones reguladoras, regiones codificantes parciales o de longitud completa, o sus combinaciones. El tamaño mínimo de una molécula de ácido nucleico de anexina modificada de la presente invención es el tamaño mínimo capaz de formar un híbrido estable en condiciones de hibridación respectivas con un gen natural correspondiente. Las moléculas de ácidos nucleicos de anexinas también pueden incluir una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína híbrida, una proteína de fusión, una proteína multivalente o un fragmento de truncamiento.

Una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención se puede obtener a partir de su fuente natural como un gen entero (es decir, completo) o una porción del mismo capaz de formar un híbrido estable con ese gen. Como se usa en la presente memoria, la frase "por lo menos una porción de" una entidad se refiere a una cantidad de la entidad que es por lo menos suficiente para tener los aspectos funcionales de esa entidad. Por ejemplo, por lo menos una porción de una secuencia de ácidos nucleicos, como se usa en la presente memoria, es una cantidad de una secuencia de ácidos nucleicos capaz de formar un híbrido estable con el gen correspondiente en condiciones de hibridación respectivas.

Una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención también se puede producir usando tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, amplificación mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR), clonación, etc.) o síntesis química. Las moléculas de ácidos nucleicos de anexina modificada aislada incluyen moléculas de ácidos nucleicos naturales y sus homólogos, incluyendo, pero sin limitarse a, variantes alélicas naturales y moléculas de ácidos nucleicos modificadas en las que se han insertado, suprimido, sustituido y/o invertido nucleótidos de tal manera que tales modificaciones no interfieren sustancialmente con la capacidad de la molécula de ácido nucleico para codificar una proteína anexínica modificada de la presente invención, o para formar híbridos estables en condiciones restrictivas con aislados de moléculas de ácidos nucleicos naturales.

Un homólogo de una molécula de ácido nucleico de anexina modificado se puede producir usando un número de métodos conocidos por los expertos en la materia (por ejemplo, véase, Sambrook et al., 1989). Por ejemplo, las moléculas de ácidos nucleicos se pueden modificar usando una variedad de técnicas que incluyen, pero no se limitan a, técnicas de mutagénesis clásicas y técnicas de ADN recombinantes, tales como mutagénesis dirigida al sitio, tratamiento químico de una molécula de ácido nucleico para inducir mutaciones, escisión mediante enzimas de restricción de un fragmento de ácido nucleico, ligación de fragmentos de ácidos nucleicos, amplificación mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) y/o mutagénesis de regiones seleccionadas de una secuencia de ácidos nucleicos, síntesis de mezclas oligonucleotídicas, y ligación de grupos de mezcla para "construir" una mezcla de moléculas de ácidos nucleicos y sus combinaciones. Los homólogos de moléculas de ácidos nucleicos se pueden seleccionar a partir de una mezcla de ácidos nucleicos modificados mediante la selección sistemática de la función de la proteína codificada por el ácido nucleico (por ejemplo, la capacidad de un homólogo para provocar una respuesta inmunitaria contra una proteína anexínica y/o para funcionar en un ensayo de coagulación, u otro ensayo funcional), y/o mediante hibridación con ácidos nucleicos que codifican anexinas aislados, en condiciones restrictivas.

Una molécula de ácido nucleico de anexina modificada aislada de la presente invención puede incluir una secuencia de ácidos nucleicos que codifica por lo menos una proteína anexínica modificada de la presente invención, describiéndose en la presente memoria ejemplos de tales proteínas. Aunque la frase "molécula de ácido nucleico" se define principalmente a la molécula de ácido nucleico física, y la frase "secuencia de ácidos nucleicos" se refiere principalmente a la secuencia de nucleótidos en la molécula de ácido nucleico, las dos frases se pueden usar de forma intercambiable, especialmente con respecto a una molécula de ácido nucleico, o una secuencia de ácidos nucleicos, que es capaz de codificar una proteína anexínica modificada.

Una forma de realización de la presente invención es una molécula de ácido nucleico de anexina modificada que es capaz de hibridarse en condiciones restrictivas a una hebra de ácido nucleico que codifica por lo menos una porción de una proteína anexínica modificada o un homólogo de la misma, o al complemento de tal hebra de ácido nucleico. Un complemento de secuencia de ácidos nucleicos de cualquier secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención se refiere a la secuencia de ácidos nucleicos de la hebra de ácido nucleico que es complementaria a (es decir, puede formar una doble hélice completa con) la hebra para la que se cita la secuencia. Se debe observar que una molécula de ácido nucleico bicatenaria de la presente invención, para la cual se ha determinado una secuencia de ácidos nucleicos para una hebra, que está representada por SEC ID nº, también comprende una hebra complementaria que tiene una secuencia que es un complemento de esa SEC ID nº. Como tal, las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención, que pueden ser bicatenarias o monocatenarias, incluyen aquellas moléculas de ácidos nucleicos que forman híbridos estables en condiciones de hibridación respectivas con una SEC ID nº dada representada en la presente memoria, y/o con el complemento de esa SEC ID nº, que puede o no estar representada en la presente memoria. Los métodos para deducir una secuencia complementaria son conocidos por los expertos en la materia. Se prefiere una molécula de ácido nucleico de anexina modificada que incluye una secuencia de ácidos nucleicos que tiene por lo menos aproximadamente 60 por ciento, preferentemente por lo menos aproximadamente 70 por ciento, más preferentemente por lo menos aproximadamente 75 por ciento, más preferentemente por lo menos aproximadamente 80 por ciento, más preferentemente por lo menos aproximadamente 85 por ciento, más preferentemente por lo menos aproximadamente 90 por ciento e incluso más preferentemente por lo menos aproximadamente 95 por ciento de homología con la región o regiones correspondientes de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica por lo menos una porción de una proteína anexínica modificada. Se prefiere particularmente una molécula de ácido nucleico de anexina modificada capaz de codificar un homodímero de una proteína anexínica o su
homólogo.

Las moléculas de ácidos nucleicos de anexinas preferidas incluyen SEC ID nº:4 y variantes alélicas de SEC ID nº:4.

El conocimiento de una molécula de ácido nucleico de una proteína anexínica modificada de la presente invención permite al experto en la materia obtener copias de esa molécula de ácido nucleico, así como obtener una molécula de ácido nucleico que incluye porciones adicionales de genes que codifican la proteína anexínica (por ejemplo, moléculas de ácidos nucleicos que incluyen el sitio de comienzo de la traducción y/o regiones de control de la transcripción y/o traducción), y/u homólogos de la molécula de ácido nucleico de anexina. El conocimiento de una porción de una secuencia de aminoácidos de una proteína anexínica de la presente invención permite al experto en la materia clonar secuencias de ácidos nucleicos que codifican tal proteína anexínica. Además, una molécula de ácido nucleico de anexina modificada deseada se puede obtener en una variedad de formas, incluyendo la selección sistemática de librerías de expresión apropiadas con anticuerpos que se unen a proteínas anexínicas de la presente invención; técnicas tradicionales de clonación que usan sondas oligonucleotídicas de la presente invención para identificar librerías apropiadas o ADN; y la amplificación mediante PCR de librerías apropiadas, o ARN o ADN usando cebadores oligonucleotídicos de la presente invención (se pueden usar librerías genómicas y/o de ADNc).

La presente invención también incluye moléculas de ácidos nucleicos que son oligonucleótidos capaces de hibridarse, en condiciones restrictivas, con regiones complementarias de otras, preferentemente más largas, moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención que codifican por lo menos una porción de una proteína anexínica modificada. Los oligonucleótidos de la presente invención pueden ser ARN, ADN, o derivados de cualquiera de ellos. El tamaño mínimo de tales oligonucleótidos es el tamaño requerido para formar un híbrido estable entre un oligonucleótido dado y la secuencia complementaria sobre otra molécula de ácido nucleico de la presente invención. Las características de tamaños mínimos se describen en la presente memoria. El tamaño del oligonucleótido debe ser también suficiente para el uso del oligonucleótido según la presente invención. Los oligonucleótidos de la presente invención se pueden usar en una variedad de aplicaciones, incluyendo, pero sin limitarse a, como sondas para identificar moléculas de ácidos nucleicos adicionales, como cebadores para amplificar o extender moléculas de ácidos nucleicos, o en aplicaciones terapéuticas para modular la producción de anexinas modificadas. Tales aplicaciones terapéuticas incluyen el uso de tales oligonucleótidos en, por ejemplo, tecnologías a base de antisentido, de formación de tríplex, de ribozimas y/o de fármacos de ARN. Por lo tanto, la presente invención incluye tales oligonucleótidos y métodos para modular la producción de proteínas anexínicas modificadas mediante uso de una o más de tales tecnologías.

Células bacterianas de tipo natural, salvaje, y moléculas y células recombinantes

La presente invención también incluye un vector recombinante, que incluye una molécula de ácido nucleico de anexina modificada de la presente invención insertada en cualquier vector capaz de suministrar la molécula de ácido nucleico en una célula huésped. Tal vector contiene secuencias de ácidos nucleicos heterólogas, esto es, secuencias de ácidos nucleicos que no se encuentran de forma natural adyacentes a las moléculas de ácidos nucleicos de la anexina modificada de la presente invención. El vector puede ser ARN o ADN, ya sea procariota o eucariota, y típicamente es un virus o un plásmido. Los vectores recombinantes se pueden usar en la clonación, secuenciación, y/o manipulación de otro modo de moléculas de ácidos nucleicos de anexinas modificadas de la presente invención. En la expresión de moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención se puede usar un tipo de vector recombinante, denominado en la presente memoria como una molécula recombinante, y descrita con más detalle a continuación. Los vectores recombinantes preferidos son capaces de replicarse en la célula transformada. Las moléculas de ácidos nucleicos preferidas a incluir en vectores recombinantes de la presente invención se describen en la presente memoria.

Como se ha descrito hasta ahora, una forma de realización de la presente invención es un método para producir una proteína anexínica modificada de la presente invención cultivando una célula capaz de expresar la proteína en condiciones eficaces para producir la proteína, y recuperar la proteína. En una forma de realización alternativa, el método incluye producir una proteína anexínica cultivando una célula capaz de expresar la proteína en condiciones eficaces para producir la proteína anexínica, recuperar la proteína, y modificar la proteína acoplándola a un agente que aumente su tamaño eficaz.

En una forma de realización preferida, la célula a cultivar es una célula bacteriana natural, y la anexina modificada se aísla de estas células. En otra forma de realización, una célula preferida a cultivar es una célula recombinante que es capaz de expresar la proteína anexínica modificada, produciéndose la célula recombinante transformando una célula huésped con una o más moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención. La transformación de una molécula de ácido nucleico en una célula se puede lograr mediante cualquier método a través del cual se puede insertar una molécula de ácido nucleico en la célula. Las técnicas de transformación incluyen, pero no se limitan a, transfección, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción, y fusión de protoplastos. Una célula recombinante puede seguir siendo unicelular, o puede crecer en un tejido, órgano o en un organismo multicelular. Las moléculas de ácidos nucleicos transformadas de la presente invención pueden permanecer siendo extracromosómicas, o se pueden integrar en uno o más sitios dentro de un cromosoma de la célula transformada (es decir, recombinante), de tal manera que se retenga su capacidad para ser expresadas. Las moléculas de ácidos nucleicos preferidas con las cuales se transforma una célula huésped se describen en la presente memoria.

Las células huéspedes adecuadas a transformar incluyen cualquier célula que se puede transformar y que puede expresar la proteína anexínica modificada introducida. Por lo tanto, tales células son capaces de producir proteínas anexínicas modificadas de la presente invención después de ser transformadas con por lo menos una molécula de ácido nucleico de la presente invención. Las células huéspedes pueden ser células no transformadas, o células que ya están transformadas con por lo menos una molécula de ácido nucleico. Las células huéspedes adecuadas de la presente invención pueden incluir células bacterianas, fúngicas (incluyendo levaduras), de insectos, de animales, y de plantas. Las células huéspedes preferidas incluyen células bacterianas, siendo particularmente preferidas las células de E. coli. Las células huéspedes preferidas alternativas son células bacterianas no transformadas (de tipo salvaje) que producen proteínas anexínicas modificadas emparentadas, incluyendo células atenuadas con patogenicidad reducida, según sea apropiado.

Una célula recombinante se produce preferentemente transformando una célula huésped con una o más moléculas recombinantes, comprendiendo cada una una o más moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención operativamente ligadas a un vector de expresión que contiene una o más secuencias de control de la transcripción. La frase "operativamente ligadas" se refiere a la inserción de una molécula de ácido nucleico en un vector de expresión de tal manera que la molécula sea capaz de ser expresada cuando se transforma en una célula huésped. Como se usa en la presente memoria, un vector de expresión es un vector de ADN o ARN que es capaz de transformar una célula huésped y de efectuar la expresión de una molécula de ácido nucleico específica. Preferentemente, el vector de expresión también es capaz de replicarse dentro de la célula huésped. Los vectores de expresión pueden ser procariotas o eucariotas, y son típicamente virus o plásmidos. Los vectores de expresión de la presente invención incluyen cualesquiera vectores que funcionan (es decir, expresión génica directa) en células recombinantes de la presente invención, incluyendo en células bacterianas, fúngicas, de insectos, de animales, y/o de plantas. Como tales, las moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención se pueden ligar operativamente a vectores de expresión que contienen secuencias reguladoras tales como promotores, operadores, represores, potenciadores, secuencias de terminación, orígenes de replicación, y otras secuencias reguladoras que son compatibles con la célula recombinante y que controlan la expresión de moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención. Como se usa en la presente memoria, una secuencia de control de la transcripción incluye una secuencia que es capaz de controlar la iniciación, el alargamiento y la terminación de la transcripción. Las secuencias de control de la transcripción particularmente importantes son aquellas que controlan la iniciación de la transcripción, tales como secuencias promotoras, potenciadoras, operadoras y represoras. Las secuencias de control de la transcripción adecuadas incluyen cualquier secuencia de control de la transcripción que puede funcionar en por lo menos una de las células recombinantes de la presente invención. En la técnica se conoce una variedad de tales secuencias de control de la transcripción. Las secuencias de control de la transcripción preferidas incluyen aquellas que funcionan en células bacterianas, de levadura, de insectos y de mamíferos, tales como, pero sin limitarse a, tac, lac, tzp, trc, oxy-pro, omp/lpp, rrnB, el bacteriófago lambda (\lambda) (tales como \lambdap_{L} y \lambdap_{R} y fusiones que incluyen tales promotores), el bacteriófago T7, T71ac, el bacteriófago T3, el bacteriófago SP6, el bacteriófago SP01, metalotioneina, el factor alfa de emparejamiento, la alcohol oxidasa de Pichia, los promotores subgenómicos de alfavirus (tales como los promotores subgenómicos del virus Sindbis), los baculovirus, el virus del insecto Heliothis zea, el virus de la vacuna, el virus del herpes, el poxvirus, los adenovirus, el virus 40 del simio, la actina retrovírica, la repetición terminal larga retrovírica, el virus del sarcoma de Rous, el choque térmico, las secuencias de control de la transcripción de fosfato y nitrato así como otras secuencias capaces de controlar la expresión génica en células procariotas o eucariotas. Las secuencias de control de la transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y potenciadores específicos de tejidos, así como promotores inducibles por linfoquinas (por ejemplo, promotores inducibles mediante interferones o interleuquinas). Las secuencias de control de la transcripción de la presente invención también pueden incluir secuencias de control de la transcripción de origen natural asociadas naturalmente con una secuencia de ADN que codifica una proteína anexínica. Una secuencia de control de la transcripción preferida es el promotor fuerte de Kozak y la secuencia de iniciación.

Los vectores de expresión de la presente invención pueden contener también señales secretoras (es decir, secuencias de ácidos nucleicos de segmentos señal) para permitir que se segregue una proteína anexínica expresada a partir de la célula que produce la proteína. Los segmentos señal adecuados incluyen un segmento señal de la proteína anexínica, o cualquier segmento señal heterólogo capaz de dirigir la secreción de una proteína anexínica, incluyendo proteínas de fusión, de la presente invención. Los segmentos señal preferidos incluyen, pero no se limitan a, segmentos señal del activador de plasminógeno tisular (t-PA), del interferón, de la interleuquina, de la hormona del crecimiento, de histocompatibilidad y de la glicoproteína de cubierta vírica.

Los vectores de expresión de la presente invención también pueden contener secuencias de fusión que conducen a la expresión de moléculas de ácidos nucleicos insertadas de la presente invención como proteínas de fusión. La inclusión de una secuencia de fusión como parte de una molécula de ácido nucleico de anexina modificada de la presente invención puede potenciar la estabilidad durante la producción, almacenamiento y/o uso de la proteína codificada por la molécula de ácido nucleico. Además, un segmento de fusión puede funcionar como una herramienta para simplificar la purificación de una proteína anexínica modificada, tal como para permitir la purificación de la proteína de fusión resultante usando cromatografía de afinidad. Un segmento de fusión preferido que se puede usar para la purificación de proteínas es la secuencia peptídica de 8 aminoácidos asp-tyr-lys-asp-asp-asp-lys (SEC ID nº:9).

Un segmento de fusión adecuado puede ser un dominio de cualquier tamaño que tenga la función deseada (por ejemplo, estabilidad incrementada y/o herramienta de purificación). Está dentro del alcance de la presente invención usar uno o más segmentos de fusión. Los segmentos de fusión se pueden unir a términos amino y/o carboxílicos de una proteína anexínica. Otro tipo de proteína de fusión preferida es una proteína de fusión en la que el segmento de fusión conecta dos o más proteínas anexínicas o proteínas anexínicas modificadas. Las uniones entre los segmentos de fusión y las proteínas anexínicas se pueden construir para que sean susceptibles a la escisión para permitir una recuperación directa de las proteínas anexínica o anexínica modificada. Las proteínas de fusión se producen preferentemente cultivando una célula recombinante transformada con una secuencia de ácidos nucleicos de fusión que codifica una proteína que incluye el segmento de fusión unido al extremo terminal carboxílico y/o amínico de una proteína anexínica.

Una molécula recombinante de la presente invención es una molécula que puede incluir por lo menos una de cualquier molécula de ácido nucleico descrita hasta ahora, ligada operativamente a por lo menos una de cualquier secuencia de control de la transcripción capaz de regular eficazmente la expresión de las moléculas de ácidos nucleicos en la célula a transformar. Una molécula recombinante preferida incluye una o más moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención, prefiriéndose particularmente aquellas que codifican una o más proteínas anexínicas modificadas. Las moléculas recombinantes preferidas de la presente invención y su producción se describen en la sección de Ejemplos. De forma similar, una célula recombinante preferida incluye una o más moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención, con aquellas que codifican una o más proteínas anexínicas modificadas. Las células recombinantes preferidas de la presente invención incluyen aquellas descritas en la sección de Ejemplos.

El experto en la materia puede apreciar que el uso de tecnologías de ADN recombinantes pueden mejorar la expresión de moléculas de ácidos nucleicos transformadas manipulando, por ejemplo, el número de copias de las moléculas de ácidos nucleicos dentro de una célula huésped, la eficacia con la que se transcriben esas moléculas de ácidos nucleicos, la eficacia con la que se traducen los transcritos resultantes, y la eficacia de las modificaciones post-traduccionales. Las técnicas recombinantes útiles para incrementar la expresión de moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, ligar operativamente moléculas de ácidos nucleicos a plásmidos de un número elevado de copias, la integración de las moléculas de ácidos nucleicos en uno o más cromosomas de la célula huésped, la adición de secuencias de estabilidad del vector a plásmidos, las sustituciones o modificaciones de señales de control de la transcripción (por ejemplo, promotores, operadores, potenciadores), las sustituciones o modificaciones de señales de control de la traducción (por ejemplo, sitios de unión a ribosomas, secuencias de Shine-Dalgamo), la modificación de moléculas de ácidos nucleicos de la presente invención para que correspondan al uso del codón de la célula huésped, la supresión de secuencias que desestabilicen los transcritos, y el uso de señales de control que separan temporalmente el crecimiento de la célula recombinante de la producción de la proteína recombinante durante la fermentación. La actividad de una proteína recombinante expresada de la presente invención se puede mejorar fragmentando, modificando o derivatizando la proteína resultante.

Según la presente invención, las células recombinantes se pueden usar para producir proteínas anexínicas o anexínicas modificadas de la presente invención cultivando tales células en condiciones eficaces para producir tal proteína, y recuperar la proteína. Las condiciones eficaces para producir una proteína incluyen, pero no se limitan a, condiciones apropiadas del medio, del biorreactor, de la temperatura, del pH y del oxígeno que permitan la producción de la proteína. Un medio apropiado, o eficaz, se refiere a cualquier medio en el que una célula de la presente invención, cuando se cultiva, es capaz de producir una proteína anexínica o anexínica modificada. Tal medio es típicamente un medio acuoso que comprende fuentes de hidratos de carbono, nitrógeno y fosfato asimilables, así como sales apropiadas, minerales, metales y otros nutrientes, tales como vitaminas. El medio puede comprender un complejo, nutrientes, o puede ser un medio mínimo definido.

Las células de la presente invención se pueden cultivar en biorreactores de fermentación convencionales, que incluyen, pero no se limitan a, fermentadores discontinuos, alimentados de forma discontinua, de recirculación de células, y continuos. El cultivo también se puede realizar en matraces de agitación, tubos de ensayo, placas de microtitulación, y placas de petri. El cultivo se lleva a cabo a una temperatura, pH y contenido de oxígeno apropiados para la célula recombinante. Tales condiciones de cultivo están dentro de la pericia de la persona experta normal en la
técnica.

Dependiendo del vector y del sistema huésped usados para la producción, las proteínas anexínicas modificadas resultantes pueden permanecer dentro de la célula recombinante, se pueden segregar en el medio de fermentación, se pueden segregar en un espacio entre dos membranas celulares, tales como el espacio periplásmico en E. coli, o se pueden retener en la superficie externa de una célula o membrana vírica. Los métodos para purificar tales proteínas se describen en la sección de Ejemplos.

Anticuerpos

También se describen anticuerpos anti-anexinas modificadas aislados, y su uso. Un anticuerpo anti-anexina modificada es un anticuerpo capaz de unirse selectivamente a una proteína anexínica modificada. Los anticuerpos aislados son anticuerpos que se han retirado de su medio natural. El término "aislado" no se refiere al estado de pureza de tales anticuerpos. Como tales, los anticuerpos aislados pueden incluir antisueros que contienen tales anticuerpos, o anticuerpos que se han purificado en grados variables. Como se usa en la presente memoria, la expresión "que se une selectivamente a" se refiere a la capacidad de tales anticuerpos para unirse preferentemente a la proteína contra la que se produce el anticuerpo (es decir, para ser capaz de distinguir esa proteína de componentes no relacionados en una mezcla). Las afinidades de unión, expresadas habitualmente como constantes de asociación en el equilibrio, oscilan típicamente desde aproximadamente 10^{3} M^{-1} hasta aproximadamente 10^{12} M^{-1}. La unión se puede medir usando una variedad de métodos conocidos por los expertos en la materia, incluyendo ensayos de inmunotransferencia, ensayos de inmunoprecipitación, radioinmunoensayos, inmunoensayos enzimáticos (por ejemplo, ELISA), ensayos con anticuerpos inmunofluorescentes, y microscopía inmunoelectrónica; véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989.

Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales. Los anticuerpos descritos en la presente memoria incluyen equivalentes funcionales tales como fragmentos de anticuerpos y anticuerpos modificados mediante ingeniería genética, incluyendo anticuerpos monocatenarios, que son capaces de unirse selectivamente a por lo menos uno de los epítopos de la proteína usada para obtener los anticuerpos. Los anticuerpos descritos en la presente memoria también incluyen anticuerpos quiméricos que se pueden unir a más de un epítopo. Los anticuerpos preferidos se producen en respuesta a proteínas que son codificadas, por lo menos en parte, por una molécula de ácido nucleico de anexina modificada de la presente invención.

Los anticuerpos anti-anexina modificada descritos en la presente memoria incluyen anticuerpos producidos en un animal al que se le ha administrado una anexina modificada. Los anticuerpos anti-anexina modificada de la presente invención también incluyen anticuerpos producidos en un animal contra una o más proteínas anexínicas modificadas que entonces se recuperan de la célula usando técnicas conocidas por los expertos en la materia. Aún unos anticuerpos adicionales de la presente invención se producen recombinantemente usando técnicas como se describen hasta ahora para la obtención de proteínas anexínicas modificadas de la presente invención. Los anticuerpos producidos contra proteínas definidas pueden ser ventajosos debido a que tales anticuerpos no están contaminados sustancialmente con anticuerpos contra otras sustancias que pueden provocar de otro modo interferencia en un ensayo de diagnóstico, o efectos secundarios si se usan en una composición terapéutica.

Los anticuerpos anti-anexina modificada descritos en la presente memoria tienen una variedad de usos que están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos anti-anexina modificada se pueden usar como herramientas para identificar sistemáticamente librerías de expresión y/o para recuperar proteínas deseadas de la presente invención a partir de una mezcla de proteínas y de otros contaminantes.

Un anticuerpo anti-anexina modificada preferido de la presente invención se puede unir selectivamente a una proteína anexínica modificada.

Usos terapéuticos

En los métodos de la invención se usa cualquiera de las proteínas anexínicas modificadas descritas anteriormente para tratar la trombosis arterial o venosa provocada por cualquier procedimiento médico o afección. Generalmente, los agentes terapéuticos usados en la invención se administran a un animal en una cantidad eficaz. Generalmente, una cantidad eficaz es una cantidad eficaz (1) para reducir los síntomas de la enfermedad que se quiere tratar, o (2) para inducir un cambio farmacológico pertinente para tratar la enfermedad que se quiere tratar.

Para la trombosis, una cantidad eficaz incluye una cantidad eficaz para ejercer actividad antitrombótica prolongada sin aumentar sustancialmente el riesgo de hemorragia, o para aumentar la expectativa de vida del animal afectado. Como se usa en la presente memoria, la actividad antitrombótica prolongada se refiere al tiempo de actividad de la proteína anexínica modificada con respecto al tiempo de actividad de la misma cantidad (molar) de una proteína anexínica no modificada. Preferentemente, la actividad antitrombótica se prolonga por por lo menos aproximadamente un factor de dos, más preferentemente por por lo menos aproximadamente un factor de cinco, y lo más preferible por por lo menos un factor de aproximadamente diez. Preferentemente, la cantidad eficaz no incrementa sustancialmente el riesgo de hemorragia, en comparación con el riesgo de hemorragia del mismo sujeto al que no se ha administrado la anexina modificada. Preferentemente, el riesgo de hemorragia es muy pequeño y, como mucho, por debajo del proporcionado por tratamientos antitrombóticos alternativos, disponibles en la técnica anterior. Las cantidades terapéuticamente eficaces de los agentes terapéuticos pueden ser cualquier cantidad o dosis suficiente para provocar el efecto antitrombótico deseado, y depende, en parte, del estado, del tipo y de la localización del trombo, del tamaño y estado del paciente, así como de otros factores conocidos por los expertos en la materia. Las dosis se pueden administrar como una dosis única, o como varias dosis, por ejemplo divididas a lo largo de varias semanas.

La administración se produce preferentemente mediante inyección de bolo o mediante infusión intravenosa, ya sea después de la trombosis, para evitar una segunda trombosis, o en condiciones en las que el sujeto es susceptible o tiene riesgo de padecer una trombosis.

Los agentes terapéuticos de la presente invención se pueden administrar por cualquier medio adecuado, incluyendo, por ejemplo, la administración parenteral o local, tal como la inyección intravenosa o subcutánea, o mediante aerosol. Una composición terapéutica se puede administrar en una variedad de formas de dosificación unitaria, dependiendo del método de administración. Los métodos de suministro preferidos para una composición terapéutica de la presente invención incluyen la administración intravenosa y la administración local, por ejemplo mediante inyección. Para modos particulares de administración, una composición terapéutica de la presente invención se puede formular en un excipiente de la presente invención. Un reactivo terapéutico de la presente invención se puede administrar a cualquier animal, preferentemente a mamíferos, y más preferentemente a seres humanos.

Un tiempo adecuado de administración se produce tras la trombosis coronaria, previniendo de ese modo la recidiva de la trombosis, sin incrementar sustancialmente el riesgo de hemorragia. La inyección de bolo de la anexina modificada se realiza preferentemente inmediatamente después de la trombosis, por ejemplo antes de la admisión en el hospital. La anexina modificada se puede administrar conjuntamente con un agente terapéutico trombolítico, tal como un activador del plasminógeno tisular, uroquinasa, o una enzima bacteriana.

Los usos de proteínas anexínicas modificadas de la presente invención incluyen enfoques para tratar trombosis cerebral, incluyendo trombosis cerebral abierta o ataques isquémicos cerebrales transitorios, administrando una cantidad eficaz de la proteína anexínica modificada a un paciente que lo necesite. Los ataques isquémicos cerebrales transitorios preceden frecuentemente a los accidentes cerebrovasculares abiertamente sintomáticos. La anexina modificada también se puede administrar a pacientes diabéticos y a otros pacientes que tienen riesgo de padecer trombosis en arterias periféricas. En consecuencia, la presente invención proporciona medios para reducir el riesgo de trombosis en un paciente que tiene un riesgo incrementado de sufrir trombosis, que incluye administrar una cantidad eficaz de una proteína anexínica modificada a un paciente que lo necesite. Para un paciente adulto, la anexina modificada se puede administrar intravenosamente o como un bolo, en un intervalo de dosificación de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 mg.

También se proporciona un medio para disminuir el riesgo de trombosis venosa asociada con algunos procedimientos quirúrgicos, tales como artroplastias de cadera y de rodilla, administrando una cantidad eficaz de una proteína anexínica modificada de la presente invención a un paciente que lo necesite. El tratamiento con la anexina modificada puede prevenir la trombosis sin incrementar la hemorragia en el campo de operación. En otra forma de realización, la presente invención proporciona un medio para prevenir la trombosis asociada con el embarazo y el parto, sin incrementar la hemorragia, administrando una cantidad eficaz de una proteína anexínica modificada de la presente invención a un paciente que lo necesite. En una forma de realización adicional, la presente invención proporciona un medio para el tratamiento de trombosis venosa recurrente, administrando una cantidad eficaz de una proteína anexínica modificada de la presente invención a un paciente que lo necesite. Para un paciente adulto, la anexina modificada se puede administrar intravenosamente como un bolo en el intervalo de dosificación de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 mg.

También se describe un método para identificar sistemáticamente una proteína anexínica modificada que modula la trombosis, poniendo en contacto un sistema de ensayo de trombosis con por lo menos una proteína anexínica modificada de ensayo, en condiciones que permitan la trombosis, y comparando la actividad antitrombótica en presencia de la proteína anexínica modificada de ensayo con la actividad antitrombótica en ausencia de la proteína anexínica modificada de ensayo, en el que un cambio en la actividad antitrombótica en presencia de la proteína anexínica modificada de ensayo es indicativo de que una proteína anexínica modificada modula la actividad trombótica. En una forma de realización preferida, el sistema de ensayo de trombosis es un sistema para medir el tiempo de tromboplastina parcial activada. También se incluyen dentro del alcance de la presente invención proteínas anexínicas modificadas que modulan la trombosis según se identifica mediante este método.

También se describe un método para identificar una proteína anexínica modificada en busca de la actividad de anexina, que incluye poner en contacto plaquetas activadas con por lo menos una proteína anexínica modificada de ensayo, en condiciones que permitan la unión, y comparar la actividad de unión a la anexina modificada de ensayo y la actividad de unión a la proteína S de las plaquetas en presencia de la proteína anexínica modificada de ensayo con la actividad de unión a anexina y la actividad de unión a la proteína S en presencia de la proteína anexínica no modificada, con lo que se puede identificar una proteína anexínica modificada con actividad de anexina. También se incluyen dentro del alcance de la invención proteínas anexínicas modificadas identificadas mediante el método.

También se describe un método para identificar una proteína anexínica modificada que modula la trombosis, poniendo en contacto un sistema de ensayo de trombosis in vivo con por lo menos una proteína anexínica modificada de ensayo, en condiciones que permitan la trombosis, y comparando la actividad antitrombótica en presencia de la proteína anexínica modificada de ensayo con la actividad antitrombótica en ausencia de la proteína anexínica modificada de ensayo. Un cambio en la actividad antitrombótica en presencia de la proteína anexínica modificada de ensayo es indicativo de que una proteína anexínica modificada modula la actividad trombótica. Adicionalmente, el tiempo durante el cual se sostiene la actividad antitrombótica en presencia de la proteína anexínica modificada de ensayo se compara con un tiempo de actividad antitrombótica en presencia de anexina no modificada, para determinar la prolongación de la actividad antitrombótica asociada con la proteína anexínica modificada de ensayo. El grado de hemorragia en presencia de la proteína anexínica modificada de ensayo se evalúa midiendo, por ejemplo, el tiempo de sangrado de la cola, y comparándolo con el grado de hemorragia en ausencia de la proteína anexínica modificada de ensayo. En una forma de realización preferida, el sistema de ensayo de trombosis in vivo es un modelo de ratón de trombo inducido fotoquímicamente en músculos cremáster. También se incluyen dentro del alcance de la presente invención proteínas anexínicas modificadas que modulan la trombosis según se identifican mediante este método.

Los agentes terapéuticos de la presente invención pueden ser útiles para la terapia génica. Como se usa en la presente memoria, la expresión "terapia génica" se refiere a la transferencia de material genético (por ejemplo, ADN o ARN) de interés a un huésped, para tratar o prevenir una enfermedad o afección genética o adquirida. El material genético de interés codifica un producto (por ejemplo, un polipéptido proteínico, un péptido o ARN funcional), cuya producción in vivo se desea. Por ejemplo, el material genético de interés puede codificar una hormona, un receptor, una enzima o un (poli)péptido de valor terapéutico. En una forma de realización específica, la presente invención utiliza una clase de moléculas lipídicas para uso en terapia génica no vírica, que se puede complejar con ácidos nucleicos como se describe en Hughes et al., patente U.S. nº 6.169.078, en la que se proporciona un ligador de disulfuro entre un grupo de cabeza polar y un grupo de cola lipófilo de un lípido.

Estos compuestos terapéuticos de la presente invención se complejan eficazmente con ADN, y facilitan la transferencia de ADN a través de una membrana celular en el espacio intracelular de una célula a transformar con ADN heterólogo. Además, estas moléculas lipídicas facilitan la liberación de ADN heterólogo en el citoplasma de la célula, incrementando de ese modo la transfección génica durante la terapia génica en un ser humano o en un animal.

Los agregados de macromoléculas polianiónicas con lípidos catiónicos se pueden formar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Los métodos representativos se describen por Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7413-7417 (1987); Eppstein et al., patente U.S. nº 4.897.355; Behr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6982-6986 (1989); Bangham et al., J. Mol. Biol. 23:238-252 (1965); Olson et al., Biochim. Biophys. Acta 557:9 (1979); Szoka, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 75:4194 (1978); Mayhew et al., Biochim. Biophys. Acta 775:169 (1984); Kim et al., Biochim. Biophys. Acta 728:339 (1983); y Fukunaga et al., Endocrinol. 115:757 (1984). En general, los agregados se pueden formar preparando partículas lipídicas que consisten en (1) un lípido catiónico, o (2) un lípido catiónico mezclado con un colípido, seguido de la adición de una macromolécula polianiónica a las partículas lipídicas, a aproximadamente la temperatura ambiente (aproximadamente 18 a 26ºC). En general, se eligen condiciones que no conduzcan a la desprotección de los grupos protectores. En una forma de realización, se deja entonces que la mezcla forme un agregado durante un período de aproximadamente 10 minutos hasta aproximadamente 20 horas, usándose más convenientemente aproximadamente 15 hasta 60 minutos. Pueden ser apropiados otros períodos de tiempo para tipos de lípidos específicos. Los complejos se pueden formar durante un período más prolongado, pero no se ganará una mejora adicional de la eficacia de la transfección mediante un período más prolongado de complejación.

Los compuestos y métodos de la presente invención se pueden usar para suministrar intracelularmente una molécula deseada, tal como, por ejemplo, un polinucleótido, a una célula diana. El polinucleótido deseado puede estar compuesto de ADN o ARN o sus análogos. Los polinucleótidos deseados, suministrados usando la presente invención, pueden estar compuestos de secuencias nucleotídicas que proporcionan diferentes funciones o actividades, tales como nucleótidos que tienen una función reguladora, por ejemplo secuencias promotoras, o que codifican un polipéptido. El polinucleótido deseado también puede proporcionar secuencias nucleotídicas que son antisentido a otras secuencias nucleotídicas en la célula. Por ejemplo, el polinucleótido deseado, cuando se transcribe en la célula, puede proporcionar un polinucleótido que tiene una secuencia que es antisentido a otras secuencias nucleotídicas en la célula. Las secuencias antisentido se pueden hibridar a las secuencias de hebras sentido en la célula. Los polinucleótidos que proporcionan secuencias antisentido se pueden preparar fácilmente por la persona experta normal. El polinucleótido deseado suministrado a la célula también puede comprender una secuencia nucleotídica que es capaz de formar un complejo triple con ADN bicatenario en la célula.

Los siguientes ejemplos ilustran la preparación de proteínas anexínicas modificadas de la invención, y ensayos in vitro e in vivo para determinar la actividad anticoagulante de proteínas anexínicas modificadas. También se debe de entender que la invención no está limitada a los ejemplos de trabajo descritos o a los detalles específicos expuestos en los ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1

Preparación de anexina modificada

Las anexinas se pueden purificar a partir de tejidos humanos, o se pueden producir mediante tecnología recombinante. Por ejemplo, la anexina V se puede purificar a partir de placentas humanas como se describe por Funakoshi et al. (1987). Los ejemplos de productos recombinantes son la expresión de anexina II y de anexina V en Escherichia coli (Kang, H.-M., Trends Cardiovasc. Med. 9:92-102 (1999); Thiagarajan y Benedict, 1997, 2000). Un método de purificación rápido y eficaz para la anexina V recombinante, basado en la unión, potenciada por Ca^{2+}, a liposomas que contienen fosfatidilserina, y la elución subsiguiente mediante EDTA, se ha descrito por Berger, FEBS Lett. 329:25-28 (1993). Este procedimiento se puede mejorar mediante el uso de fosfatidilserina acoplada a un soporte de base sólida.

Las anexinas se pueden acoplar a polietilenglicol (PEG) mediante cualquiera de los procedimientos bien consolidados (repasados por Hermanson, 1996), en un proceso denominado pegilación. La presente invención incluye moléculas de anexina químicamente derivatizadas que tienen restos mono- o poli- (por ejemplo 2-4) PEG. Los métodos para preparar una anexina pegilada incluyen generalmente las etapas de (a) hacer reaccionar la anexina con polietilenglicol (tal como un éster reactivo o derivado de aldehído de PEG), en condiciones en las cuales la anexina se une a uno o más grupos de PEG, y (b) obteniendo el producto o productos de reacción. En general, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones se deben determinar caso a caso basándose en parámetros conocidos y en el resultado deseado. Además, la reacción puede producir diferentes productos que tienen un número diferente de cadenas de PEG, y puede ser necesaria una purificación adicional para obtener el producto deseado.

La conjugación de PEG a anexina V se puede realizar usando el procedimiento de EDC más sulfo-NHS. La EDC (hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida) se usa para formar grupos de éster activos con grupos carboxilato, usando sulfo-NHS (N-hidroxisulfosuccinamida). Esto aumenta la estabilidad del intermedio activo, que reacciona con una amina para dar un enlace amídico estable. La conjugación se puede llevar a cabo como se describe en Hermanson, 1996.

Se pueden usar métodos de bioconjugados para producir homopolímeros o heteropolímeros de anexina; los métodos están repasados por Hermanson, 1996. También se pueden usar métodos recombinantes para producir proteínas de fusión, por ejemplo anexina expresada con la porción Fc de inmunoglobulina u otra proteína. El heterotetrámero de anexina II con P11 también se ha producido en E. coli (Kang et al., 1999). Todos estos procedimientos aumentan el peso molecular de la anexina y tienen el potencial para incrementar la semivida de la anexina en la circulación y prolongar su efecto anticoagulante.

Un homodímero de anexina V se puede producir usando un constructo de ADN mostrado esquemáticamente en la Fig. 1 (cadena de sentido 5'-3') (SEC ID nº:4), y codificando una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID nº:6. En este ejemplo, el gen de la anexina V se clona en el vector de expresión pCMV FLAG 2 (disponible de Sigma-Aldrich) en los sitios EcoRI y BglII. Las secuencias exactas antes y después de la secuencia de la anexina V son desconocidas y se representan como "x". Por lo tanto, es necesario secuenciar el constructo antes de la modificación, para asegurar un alineamiento apropiado del codón. El vector pCMV FLAG 2 tiene un promotor fuerte y una secuencia de iniciación (Kozak) y un sitio de comienzo (ATG) construido en ella. El codón de partida antes de cada gen de anexina V se debe de eliminar por lo tanto, y se debe de añadir una parada fuerte para la expresión estricta en el término del segundo gen de anexina V. El vector también tiene una secuencia peptídica de 8 aminoácidos que se puede usar para la purificación de la proteína (asp-tyr-lys-asp-asp-asp-asp-lys) (SEC ID nº:9). Un espaciador de 14 aminoácidos, con extremos de eslabones giratorios de glicina-serina, permite la rotación óptima entre los genes del tándem. La adición de sitios de restricción PvuII y ScaI permite la eliminación del ligador, si es necesario. La adición de un sitio de proteasa permite la escisión de las proteínas del tándem tras la expresión. La proteasa PreScission^{TM} está disponible de Amersham Pharmacia Biotech, y se puede usar para escindir las proteínas del tándem.

La anexina V tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

1

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La secuencia nucleotídica de la anexina V es la siguiente:

2

Ejemplo 2

Ensayos in vitro e in vivo

Los ensayos in vitro determinan la capacidad de las proteínas anexínicas modificadas para unirse a plaquetas activadas. La anexina V se une a plaquetas, y esta unión aumenta notablemente in vitro mediante activación de las plaquetas con trombina (Thiagarajan y Tait, 1990; Sun et al., 1993). Preferentemente, las proteínas anexínicas modificadas de la presente invención se preparan de tal forma que realizan la función de anexina, por cuanto se unen a plaquetas y evitan que la proteína S se una a plaquetas (Sun et al., 1993). Las proteínas anexínicas modificadas también realizan la función de mostrar la misma actividad anticoagulante in vitro que la que muestran las proteínas anexínicas no modificadas. Un método para medir el tiempo de coagulación es el tiempo de tromboplastina parcial activada (Fritsma, en Hemostasis y thrombosis in the clinical laboratory (Corriveau, D.M. y Fritsma, G.A., eds) J.P. Lipincott Co., Philadelphia (1989), p. 92-124).

Los ensayos in vivo determinan la actividad antitrombótica de proteínas anexínicas. Se ha demostrado que la anexina V disminuye la trombosis venosa inducida por un láser o fotoquímicamente en ratas (Römisch et al., 1991). El efecto anticoagulante máximo se observó entre 15 y 30 minutos después de la administración intravenosa de anexina V, según se determina funcionalmente mediante tromboelastografía. Las proteínas anexínicas modificadas de la presente invención muestran preferentemente una actividad más prolongada en tal modelo que la anexina no modificada. También se encontró que la anexina V disminuye la acreción de fibrina en un modelo de conejo de trombosis de vena yugular (Van Ryn-McKenna et al., 1993). Se usó una inyección de aire para eliminar el endotelio, y se mostró que la anexina V se une a la vena tratada pero no a la vena contralateral del control. La acumulación reducida de fibrina en la vena lesionada no estaba asociada con anticoagulación sistémica. La heparina no inhibió la acumulación de fibrina en la vena lesionada. Las proteínas anexínicas modificadas de la presente invención realizan preferentemente la función de anexina en este modelo de trombosis venosa. Se usó un modelo de conejo de trombosis arterial por Thiagarajan y Benedict, 1997. Se formó un trombo parcialmente oclusivo en la arteria carótida izquierda mediante la aplicación de una corriente eléctrica. La infusión de anexina V inhibió fuertemente la trombosis, según se manifestó por medidas de caudal de sangre, peso del trombo, deposición de fibrina marcada, y acumulación de plaquetas marcadas. Recientemente, se introdujo un modelo de ratón de trombo inducido fotoquímicamente en músculos cremáster (Vollmar et al. Thromb. Haemost. 85:160-164 (2001)). Usando esta técnica, se puede inducir trombosis en cualquier arteria o vena. Las proteínas anexínicas modificadas de la presente invención realizan preferentemente la función de anexina en tales modelos, incluso cuando se administran mediante inyección de bolo.

Ejemplo 3

Se compararon in vitro la capacidad anticoagulante de anexina V recombinante humana y de la anexina V recombinante humana pegilada.

Producción de anexina V. Se usó la reacción en cadena de polimerasa para amplificar el ADNc a partir de la metionina iniciadora al codón de parada con cebadores oligonucleotídicos específicos procedentes de una librería de ADNc de placenta humana. El cebador directo fue 5'-ACCTGAGTAGTCGCCATGGCACAGGTTCTC-3' (SEC ID nº:7), y el cebador inverso fue 5'-CCCGAATTCACGTTAGTCATCTTCTCCACAGAGCAG-3' (SEC ID nº:8). El fragmento de 1,1 kb amplificado se digirió con NcoI y EcoRI, y se ligó al vector de expresión procariota pTRC 99A. El producto de la ligación se usó para transformar la cepa JM 105 de Escherichia coli competente, y se secuenció.

La anexina V recombinante se aisló de lisados bacterianos como se describe por Berger et al., 1993, con alguna modificación. Un cultivo durante toda la noche de JM 105 de E. coli transformado con pTRC 99A-anexina V se expandió 50 veces en medio de Luria-Bertrani reciente, que contiene 100 mg/ml de ampicilina. Después de 2 horas, se añadió isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido hasta una concentración final de 1 mmol/l. Después de 16 horas de inducción, las bacterias se peletizaron a 3500 g durante 15 minutos a 4ºC. El pelete bacteriano se suspendió en TBS, pH 7,5, que contiene 1 mmol/l de PMSF, 5 mmoles/l de EDTA, y 6 moles/l de urea. La suspensión bacteriana se sometió a ultrasonidos con una sonda ultrasónica, a un ajuste de 6, en hielo durante 3 minutos. El lisado se centrifugó a 10.000 g durante 15 minutos, y el sobrenadante se dializó dos veces contra 50 volúmenes de TBS que contiene 1 mmol/l de EDTA, y una vez contra 50 volúmenes de TBS.

Se prepararon liposomas de múltiples laminillas disolviendo fosfatidilserina, extracto de cerebro bovino liofilizado, colesterol y fosfato de dicetilo, en cloroformo, en una relación molar de 10:15:1, y se secaron en una corriente de nitrógeno en un matraz cónico. Se añadió TBS (5 ml) al matraz, y se agitó vigorosamente en un mezclador de remolino durante 1 minuto. Los liposomas se lavaron mediante centrifugación a 3500 g durante 15 minutos, después se incubaron con el extracto bacteriano, y se añadió cloruro de calcio hasta una concentración de 5 mmoles/l. Después de 15 minutos de incubación a 37ºC, los liposomas se sedimentaron mediante centrifugación a 10.000 g durante 10 minutos, y la anexina V unida se eluyó con 10 mmoles/l de EDTA. La anexina V eluida se concentró mediante ultrafiltración Amicon, y se cargó en una columna Sephacryl S 200. La anexina V se recuperó en el volumen incluido, mientras que la mayoría de los liposomas estaban en el volumen vacío. Las fracciones que contienen anexina V se reunieron y se dializaron en 10 mmoles/l de Tris y 2 mmoles/l de EDTA, pH 8,1, se cargaron en una columna de intercambio aniónico, y se eluyeron con un gradiente lineal de 0 hasta 200 mmoles/l de NaCl en el mismo tampón. La preparación purificada mostró una única banda en SDS-PAGE en condiciones reductoras.

La anexina V producida como antes se pegiló usando el método de Hermanson, 1996, como se describe anteriormente.

Ensayos de anticoagulación. Se comparó la prolongación del tiempo de coagulación (tiempo de tromboplastina parcial activada) inducida por anexina V y por anexina V pegilada. Los tiempos de tromboplastina parcial activada se ensayaron con plasma reunido normal citrado, como se describe en Fritsma, 1989. Usando concentraciones diferentes de anexina V y de anexina V pegilada, producida como se describe anteriormente, se obtuvieron curvas de dosis frente a respuesta, para la prolongación de tiempos de coagulación. Los resultados se muestran en la Fig. 2, una gráfica del tiempo de coagulación frente a la dosis de anexina V y de anexina V pegilada. Como se muestra en la figura, la potencia anticoagulante de la anexina V humana recombinante y de la anexina V humana recombinante pegilada son sustancialmente equivalentes. La pequeña diferencia observada es atribuible al cambio en el peso molecular tras la pegilación. Este experimento valida la afirmación hecha en la presente memoria de que la pegilación de que la anexina V se puede lograr sin reducir significativamente sus efectos antitrombóticos.

Se debe de señalar que la descripción anterior sólo es ilustrativa de la invención. Se pueden concebir diversas alternativas y modificaciones por los expertos en la materia, sin separarse de la invención. En consecuencia, la presente invención pretende abarcar todas las citadas alternativas, modificaciones y variaciones que caen dentro del alcance de la invención descrita.

<110> Surromed, Inc.

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<120> Proteínas Anexínicas Modificadas y Métodos para Prevenir la Trombosis

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<130> SURR.90/PCT

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<150> 60/270.402

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<151> 2001-02-21

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<150> 60/332.582

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<151> 2001-11-21

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<160> 9

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 960

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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3

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<210> 2

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<211> 960

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(960)

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<223>

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<400> 2

4

5

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<210> 3

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<211> 319

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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6

7

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<210> 4

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<211> 2016

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> cebador

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (45)..(45)

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<223> n = a, c, t, o g

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1000)..(1002)

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<223> n = a, c, t, o g

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1051)..(1053)

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<223> n = a, c, t, o g

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<400> 4

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8

9

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<210> 5

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<211> 2016

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> gen de anexina modificada

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(2016)

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<223>

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (45)..(45)

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<223> n = a, c, g, o t

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<220>

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<221> misc feature

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<222> (1000)..(1002)

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<223> n = a, c, g, o t

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1051)..(1053)

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<223> n = a, c, g, o t

\newpage

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<400> 5

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10

11

12

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<210> 6

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<211> 669

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (15)..(15)

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<223> El "Xaa" en la localización 15 representa Ser.

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (334)..(334)

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<223> El "Xaa" en la localización 334 representa Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Gly, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, un codón de parada, Tyr, Trp, Cys, o Phe.

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (351)..(351)

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<223> El "Xaa" en la localización 351 representa Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, Ile, Met, Glu, Asp, Gly, Ala, Val, Gln, His, Pro, Leu, un codón de parada, Tyr, Trp, Cys, o Phe.

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<220>

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<223> gen de anexina modificada

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (45)..(45)

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<223> n = a, c, g, o t

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1000)..(1002)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = a, c, g, o t

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1051)..(1053)

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<223> n = a, c, g, o t

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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13

14

15

16

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<210> 7

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<211> 30

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> cebador

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(30)

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<223> cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acctgagtag tcgccatggc acaggttctc

\hfill

30

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccgaattca cgttagtcat cttctccaca gagcag

\hfill

36

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> etiqueta de purificación

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<400> 9

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\sa{Asp Tyr Leu Asp Asp Asp Asp Leu}

Claims

1. Composición farmacéutica que comprende una cantidad antitrombóticamente eficaz de una proteína anexínica modificada aislada que consiste esencialmente en una primera proteína anexínica acoplada a una segunda proteína anexínica vía un segmento de fusión.

2. Uso de una proteína anexínica modificada que consiste esencialmente en una primera proteína anexínica acoplada a una segunda proteína anexínica vía un segmento de fusión, para la preparación de un medicamento para tratar o prevenir la trombosis.

3. Uso según la reivindicación 2, para el tratamiento o prevención de trombosis coronaria.

4. Uso según la reivindicación 2, para el tratamiento o prevención de una afección seleccionada de entre el grupo constituido por trombosis cerebral abierta y ataque isquémico cerebral transitorio.

5. Uso según la reivindicación 2, para el tratamiento o prevención de trombosis venosa asociada con una operación quirúrgica.

6. Uso según la reivindicación 2, para el tratamiento o prevención de trombosis arterial en pacientes diabéticos.

7. Uso según la reivindicación 2, para el tratamiento o prevención de trombosis asociada con un estado seleccionado de entre el grupo constituido por embarazo y parto.

8. Molécula de ácido nucleico aislada, seleccionada de entre el grupo constituido por:

a): una molécula de ácido nucleico bacteriano aislada, que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína seleccionada de entre el grupo constituido por:

i): SEC ID nº:6; y

ii): una proteína que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia con SEC ID nº:6; y

b): una molécula de ácido nucleico que es completamente complementaria a cualquiera de dicha molécula de ácido nucleico citada en a).

9. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 8, en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende SEC ID nº:4.

10. Molécula recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 8.

11. Célula recombinante que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 8.

12. Método para producir una proteína anexínica modificada, que comprende cultivar la célula según la reivindicación 11 en condiciones que permitan la producción de dicha proteína anexínica modificada, y recuperar dicha proteína anexínica modificada a partir de dicho cultivo.