JPH051096A - 抗血液凝固活性を持つオリゴペプチド - Google Patents
抗血液凝固活性を持つオリゴペプチドInfo
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 下記のアミノ酸配列からなるオリゴペプチ
ド。 Asp His Thr Leu Ile Arg 【効果】 本発明のオリゴペプチドは、強い抗血液凝固
活性を示すことからＤＩＣ（汎発性血管内凝固症候群）
等を初めとした血液疾患に対して、有効な治療薬および
予防薬の開発を可能にするものである。さらに、本発明
のオリゴペプチドは、このような血液疾患の診断を行う
際にも、診断薬の構成材料として利用されるため、該疾
患のより有効な診断方法をも可能にするものである。
ド。 Asp His Thr Leu Ile Arg 【効果】 本発明のオリゴペプチドは、強い抗血液凝固
活性を示すことからＤＩＣ（汎発性血管内凝固症候群）
等を初めとした血液疾患に対して、有効な治療薬および
予防薬の開発を可能にするものである。さらに、本発明
のオリゴペプチドは、このような血液疾患の診断を行う
際にも、診断薬の構成材料として利用されるため、該疾
患のより有効な診断方法をも可能にするものである。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗血液凝固活性を持つ
新規なオリゴペプチドに関する。
新規なオリゴペプチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】血液凝固反応は、セリンプロテアーゼイ
ンヒビター系や、プロテインＣ／プロテインＳ／トロン
ボモジュリン系を代表とする数多くの抗凝固物質により
制御されることが知られている。血液凝固連鎖反応（カ
スケード）における、その鍵となる重要な反応において
は、リン脂質表面の部分が深く関与していると考えら
れ、このような部分のペプチドは、血液凝固の生理学的
または薬学的制御を可能ならしめる領域として重要と考
えられ、その研究が期待されている。組織因子もまた同
様に、膜リン脂質と結合することにより外傷部位での血
液凝固を開始することが確認されており、血液凝固第Ｖ
ＩＩａ因子／組織因子複合体（小文字のａは活性化され
た因子を意味する）は、高濃度の血清リポプロテインに
より複合体形成が阻止されることが知られている。
ンヒビター系や、プロテインＣ／プロテインＳ／トロン
ボモジュリン系を代表とする数多くの抗凝固物質により
制御されることが知られている。血液凝固連鎖反応（カ
スケード）における、その鍵となる重要な反応において
は、リン脂質表面の部分が深く関与していると考えら
れ、このような部分のペプチドは、血液凝固の生理学的
または薬学的制御を可能ならしめる領域として重要と考
えられ、その研究が期待されている。組織因子もまた同
様に、膜リン脂質と結合することにより外傷部位での血
液凝固を開始することが確認されており、血液凝固第Ｖ
ＩＩａ因子／組織因子複合体（小文字のａは活性化され
た因子を意味する）は、高濃度の血清リポプロテインに
より複合体形成が阻止されることが知られている。
【０００３】血液凝固反応には、外因系凝固経路（extr
insic pathway ）および内因系凝固経路（intrinsic pa
thway ）と呼ばれる別個の系が存在する。内因系凝固経
路とは、血漿中に存在する因子によりトロンビン形成を
導く反応を指し、その中間的反応としては、ファクター
ＸＩａおよびカルシウムイオンにより触媒されてファク
ターＩＸがファクターＩＸａに活性化され、その活性化
ファクターＩＸａが、ファクターＶＩＩＩａ、ホスホリ
ピッドおよびカルシウムイオンの存在下でファクターＸ
を活性化する反応である。一方、外因系凝固経路とは、
血漿因子並びに組織抽出物中に存在する成分から血液凝
固反応を導く反応を指し、血液凝固因子のひとつである
ファクターＶＩＩ（ａ）が組織因子およびカルシウムイ
オンの存在下でファクターＸをＸａに活性化する反応を
指す。
insic pathway ）および内因系凝固経路（intrinsic pa
thway ）と呼ばれる別個の系が存在する。内因系凝固経
路とは、血漿中に存在する因子によりトロンビン形成を
導く反応を指し、その中間的反応としては、ファクター
ＸＩａおよびカルシウムイオンにより触媒されてファク
ターＩＸがファクターＩＸａに活性化され、その活性化
ファクターＩＸａが、ファクターＶＩＩＩａ、ホスホリ
ピッドおよびカルシウムイオンの存在下でファクターＸ
を活性化する反応である。一方、外因系凝固経路とは、
血漿因子並びに組織抽出物中に存在する成分から血液凝
固反応を導く反応を指し、血液凝固因子のひとつである
ファクターＶＩＩ（ａ）が組織因子およびカルシウムイ
オンの存在下でファクターＸをＸａに活性化する反応を
指す。
【０００４】最近、ヒト胎盤から数種の血液凝固阻止因
子が単離・同定され、これらは胎盤由来抗血液凝固蛋白
質（アネキシン−Ｖ〜ＩＩ／ＰＡＰ−Ｉ〜ＩＶ）と命名
された〔船越ら、Biochemistry ２６，ｐ５５７２−５
５７８（１９８７）〕。アネキシン−Ｖは、この中でも
最も量的に多く存在し、既に血液凝固阻止因子として報
告されているカルフォビンディンＩ（calphobindin I／
ＣＰＢ−Ｉ）〔岩崎ら、J. Biochem. １０２，ｐ１２６
１−１２７３（１９８７）〕および血管内抗凝固物質
（vasculer anticoagulant）〔Reutelingspergerら、Eu
r. J. Biochem.,１５１，ｐ６２５−６２９（１９８
５）〕と相同性が極めて高く、同一グループの物質であ
ると考えられている。
子が単離・同定され、これらは胎盤由来抗血液凝固蛋白
質（アネキシン−Ｖ〜ＩＩ／ＰＡＰ−Ｉ〜ＩＶ）と命名
された〔船越ら、Biochemistry ２６，ｐ５５７２−５
５７８（１９８７）〕。アネキシン−Ｖは、この中でも
最も量的に多く存在し、既に血液凝固阻止因子として報
告されているカルフォビンディンＩ（calphobindin I／
ＣＰＢ−Ｉ）〔岩崎ら、J. Biochem. １０２，ｐ１２６
１−１２７３（１９８７）〕および血管内抗凝固物質
（vasculer anticoagulant）〔Reutelingspergerら、Eu
r. J. Biochem.,１５１，ｐ６２５−６２９（１９８
５）〕と相同性が極めて高く、同一グループの物質であ
ると考えられている。
【０００５】上記のアネキシン−Ｖは、外因系および内
因系のいずれの血液凝固反応も阻止することができ、カ
ルシウムイオン存在のもとで陰イオン性リン脂質表面に
特異的に結合する性質を有する。
因系のいずれの血液凝固反応も阻止することができ、カ
ルシウムイオン存在のもとで陰イオン性リン脂質表面に
特異的に結合する性質を有する。
【０００６】また、ヒト胎盤由来血液凝固蛋白質をコー
ドする塩基配列に関して、ＰＰ４、ＶＡＣおよびカルフ
ォビンディンＩＩのそれぞれについて既に報告されてい
る〔Grundmann ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ８
５，ｐ３７０８−３７１２（１９８８）；Maurer-Fogy
ら、Eur. J. Biochem., １７４，ｐ５８５−５９２（１
９８８）および岩崎ら、J. Biochem., １０６，ｐ４３
−４９（１９８９）〕。これらの蛋白およびｃＤＮＡ解
析により、アネキシン−Ｖは、カルシウム依存性リン脂
質結合蛋白であるリポコルチン／カルパクティン／アネ
キシンファミリーに属する蛋白であることが示された。
ドする塩基配列に関して、ＰＰ４、ＶＡＣおよびカルフ
ォビンディンＩＩのそれぞれについて既に報告されてい
る〔Grundmann ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ８
５，ｐ３７０８−３７１２（１９８８）；Maurer-Fogy
ら、Eur. J. Biochem., １７４，ｐ５８５−５９２（１
９８８）および岩崎ら、J. Biochem., １０６，ｐ４３
−４９（１９８９）〕。これらの蛋白およびｃＤＮＡ解
析により、アネキシン−Ｖは、カルシウム依存性リン脂
質結合蛋白であるリポコルチン／カルパクティン／アネ
キシンファミリーに属する蛋白であることが示された。
【０００７】このアネキシン−Ｖは、３１９アミノ酸か
ら構成され、さらに４つの反復配列を有する。このアミ
ノ酸配列については船越らにより報告されている〔Bioc
hemistry ２７，ｐ６２６８−６２７６（１９８
８）〕。さらにアネキシン−Ｖの各反復配列は、リン脂
質結合蛋白質に通常存在する２つの領域を含んでおり、
そのひとつの領域は、ＫＧＸＧＴＤＥＸＸｈｈＸｈｈＸ
ＳＲ（Ｘは任意のアミノ酸、ｈは疎水性アミノ酸を示
す）の１７アミノ酸からなる領域であり、このようなア
ミノ酸配列は、エンドネクシン（endonexin ）、カレレ
クトリン（calelectrin）およびリポコルチン（lipocor
tins ）のようなカルシウムイオン依存性膜結合蛋白質
にも多くみられる配列である。もうひとつは、それぞれ
の反復配列のカルボキシ末端側にあたる６アミノ酸から
なる疎水性の強い領域である。これらの２つの領域は、
リン脂質との結合に直接関係するものと考えられる。
ら構成され、さらに４つの反復配列を有する。このアミ
ノ酸配列については船越らにより報告されている〔Bioc
hemistry ２７，ｐ６２６８−６２７６（１９８
８）〕。さらにアネキシン−Ｖの各反復配列は、リン脂
質結合蛋白質に通常存在する２つの領域を含んでおり、
そのひとつの領域は、ＫＧＸＧＴＤＥＸＸｈｈＸｈｈＸ
ＳＲ（Ｘは任意のアミノ酸、ｈは疎水性アミノ酸を示
す）の１７アミノ酸からなる領域であり、このようなア
ミノ酸配列は、エンドネクシン（endonexin ）、カレレ
クトリン（calelectrin）およびリポコルチン（lipocor
tins ）のようなカルシウムイオン依存性膜結合蛋白質
にも多くみられる配列である。もうひとつは、それぞれ
の反復配列のカルボキシ末端側にあたる６アミノ酸から
なる疎水性の強い領域である。これらの２つの領域は、
リン脂質との結合に直接関係するものと考えられる。
【０００８】また、アネキシン−Ｖにおいては、カルシ
ウムイオン非存在下では、この蛋白が全く抗凝固活性ま
たはリン脂質結合性を示さないことから、カルシウムイ
オンまたはリン脂質結合部位が本蛋白質の作用部位に重
要な関係があると考えられる。
ウムイオン非存在下では、この蛋白が全く抗凝固活性ま
たはリン脂質結合性を示さないことから、カルシウムイ
オンまたはリン脂質結合部位が本蛋白質の作用部位に重
要な関係があると考えられる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】このような抗血液凝固
活性等の性質を持つアネキシン−Ｖのアミノ酸配列から
活性領域部位を見い出し、そのオリゴペプチドを合成す
ることは、ＤＩＣ（汎発性血管内凝固症候群）等の血液
疾患の治療・予防薬を開発するために重要である。この
様な状況においてアネキシン−Ｖのアミノ酸配列の活性
部位について研究され、配列番号２のアミノ酸配列を持
つオリゴペプチドが抗血液凝固活性を有することがすで
に報告されている〔船越ら、Biochemical and Biophysi
cal Research Communications, １６８，ｐ１２５−１
３４（１９９０）〕。しかし、このオリゴペプチドは活
性が低くアネキシン−Ｖの主活性部位とは考えにくい。
従って、本発明の目的はアネキシン−Ｖの抗血液凝固活
性部位に由来し、さらに活性の強い新規オリゴペプチド
を提供することにある。
活性等の性質を持つアネキシン−Ｖのアミノ酸配列から
活性領域部位を見い出し、そのオリゴペプチドを合成す
ることは、ＤＩＣ（汎発性血管内凝固症候群）等の血液
疾患の治療・予防薬を開発するために重要である。この
様な状況においてアネキシン−Ｖのアミノ酸配列の活性
部位について研究され、配列番号２のアミノ酸配列を持
つオリゴペプチドが抗血液凝固活性を有することがすで
に報告されている〔船越ら、Biochemical and Biophysi
cal Research Communications, １６８，ｐ１２５−１
３４（１９９０）〕。しかし、このオリゴペプチドは活
性が低くアネキシン−Ｖの主活性部位とは考えにくい。
従って、本発明の目的はアネキシン−Ｖの抗血液凝固活
性部位に由来し、さらに活性の強い新規オリゴペプチド
を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者は上記実状に鑑
み、アネキシン−Ｖのアミノ酸配列のうち活性領域部位
に関連があると考えられる多種のオリゴペプチドを合成
し、これらの抗血液凝固活性を測定したところ、下記に
示すアミノ酸配列を有するペプチドが強い抗血液凝固活
性を有することを見い出し本発明を完成した。
み、アネキシン−Ｖのアミノ酸配列のうち活性領域部位
に関連があると考えられる多種のオリゴペプチドを合成
し、これらの抗血液凝固活性を測定したところ、下記に
示すアミノ酸配列を有するペプチドが強い抗血液凝固活
性を有することを見い出し本発明を完成した。
【００１１】すなわち本発明は、下記のアミノ酸配列
（配列番号１）からなるオリゴペプチドを提供するもの
である。 Asp His Thr Leu Ile Arg
（配列番号１）からなるオリゴペプチドを提供するもの
である。 Asp His Thr Leu Ile Arg
【００１２】本発明のオリゴペプチドは、アネキシン−
Ｖのアミノ酸配列とその抗血液凝固活性に関する研究を
進めて行く中で、ヒスチジン残基を有する領域に特に着
目して見い出されたものであるが、さらに下記のヒスチ
ジンを含む６アミノ酸からなる公知のオリゴペプチドＢ
（配列番号２）とオリゴペプチドＣ（配列番号３）を合
成した。 オリゴペプチドＡ：Asp His Thr Leu Ile Arg （本発明品） （配列番号１） オリゴペプチドＢ：Ser His Leu Arg Lys Val （配列番号２） オリゴペプチドＣ：Lys His Ala Leu Lys Gly （配列番号３）
Ｖのアミノ酸配列とその抗血液凝固活性に関する研究を
進めて行く中で、ヒスチジン残基を有する領域に特に着
目して見い出されたものであるが、さらに下記のヒスチ
ジンを含む６アミノ酸からなる公知のオリゴペプチドＢ
（配列番号２）とオリゴペプチドＣ（配列番号３）を合
成した。 オリゴペプチドＡ：Asp His Thr Leu Ile Arg （本発明品） （配列番号１） オリゴペプチドＢ：Ser His Leu Arg Lys Val （配列番号２） オリゴペプチドＣ：Lys His Ala Leu Lys Gly （配列番号３）
【００１３】これらの６アミノ酸からなるペプチドのア
ネキシン−Ｖにおける領域は、アネキシン−Ｖのアミノ
末端のアラニンを１として数えて、９６〜１０１番目
（Ｃ）、２０３〜２０８番目（Ｂ）および２６５〜２７
０番目（Ａ）の領域に相当する。
ネキシン−Ｖにおける領域は、アネキシン−Ｖのアミノ
末端のアラニンを１として数えて、９６〜１０１番目
（Ｃ）、２０３〜２０８番目（Ｂ）および２６５〜２７
０番目（Ａ）の領域に相当する。
【００１４】上記の３種のオリゴペプチドの抗血液凝固
活性を、カオリン活性化血液凝固反応を用いて、血液凝
固時間における遅延反応として測定した。その結果、公
知のオリゴペプチドＢおよび本発明のオリゴペプチドＡ
において抗血液凝固活性があることが確認された。その
中でも、アネキシン−Ｖの２０３番目から２７０番目の
アミノ酸にあたるオリゴペプチドＡが、オリゴペプチド
Ｂに比べて極めて強い抗血液凝固活性を有することを見
い出した。一方、このオリゴペプチドＡ中のヒスチジン
（Ｈｉｓ）をアラニン（Ａｌａ）に置換したところ、こ
の改変ペプチドにはもはや抗凝固活性を見い出すことは
できなかった。〔船越ら、Biochemicaland Biophysical
Research Communications, １６８，ｐ１２５−１３４
（１９９０）〕。
活性を、カオリン活性化血液凝固反応を用いて、血液凝
固時間における遅延反応として測定した。その結果、公
知のオリゴペプチドＢおよび本発明のオリゴペプチドＡ
において抗血液凝固活性があることが確認された。その
中でも、アネキシン−Ｖの２０３番目から２７０番目の
アミノ酸にあたるオリゴペプチドＡが、オリゴペプチド
Ｂに比べて極めて強い抗血液凝固活性を有することを見
い出した。一方、このオリゴペプチドＡ中のヒスチジン
（Ｈｉｓ）をアラニン（Ａｌａ）に置換したところ、こ
の改変ペプチドにはもはや抗凝固活性を見い出すことは
できなかった。〔船越ら、Biochemicaland Biophysical
Research Communications, １６８，ｐ１２５−１３４
（１９９０）〕。
【００１５】また、アネキシン−Ｖの抗血液凝固活性を
阻害することが確認されている抗アネキシン−Ｖモノク
ローナル抗体を用いて、オリゴペプチドＡと事前に反応
させ、このモノクローナル抗体処理オリゴペプチドの抗
血液凝固活性を測定したところ処理をしないペプチドと
は異なり、ほとんど抗血液凝固活性を見い出すことはで
きなかった。この結果からも、本発明のオリゴペプチド
は、アネキシン−Ｖの有する抗血液凝固活性部位として
極めて重要であることが確認された。
阻害することが確認されている抗アネキシン−Ｖモノク
ローナル抗体を用いて、オリゴペプチドＡと事前に反応
させ、このモノクローナル抗体処理オリゴペプチドの抗
血液凝固活性を測定したところ処理をしないペプチドと
は異なり、ほとんど抗血液凝固活性を見い出すことはで
きなかった。この結果からも、本発明のオリゴペプチド
は、アネキシン−Ｖの有する抗血液凝固活性部位として
極めて重要であることが確認された。
【００１６】また、本発明においては、実質的な抗血液
凝固作用部位として上記オリゴペプチドＡのみを有し、
他に抗血液凝固活性を有さないペプチドをも含むもので
ある。
凝固作用部位として上記オリゴペプチドＡのみを有し、
他に抗血液凝固活性を有さないペプチドをも含むもので
ある。
【００１７】本発明のオリゴペプチドを製造する方法は
特に限定されないが、例えばペプチド合成機を用いて容
易に合成することができる。
特に限定されないが、例えばペプチド合成機を用いて容
易に合成することができる。
【００１８】
【発明の効果】本発明により、アネキシン−Ｖの抗血液
凝固活性を示す最も重要な領域が提供され、また、この
領域がオリゴペプチドの形でも、非常に強い抗血液凝固
活性を示すことが確認された。よって、このようなオリ
ゴペプチドは、ＤＩＣ（汎発性血管内凝固症候群）等を
初めとした血液疾患に対して、有効な治療薬および予防
薬の開発を可能にするものである。さらに、本発明のオ
リゴペプチドは、このような血液疾患の診断を行う際に
も、診断薬の構成材料として利用されるため、該疾患の
より有効な診断方法をも可能にするものである。
凝固活性を示す最も重要な領域が提供され、また、この
領域がオリゴペプチドの形でも、非常に強い抗血液凝固
活性を示すことが確認された。よって、このようなオリ
ゴペプチドは、ＤＩＣ（汎発性血管内凝固症候群）等を
初めとした血液疾患に対して、有効な治療薬および予防
薬の開発を可能にするものである。さらに、本発明のオ
リゴペプチドは、このような血液疾患の診断を行う際に
も、診断薬の構成材料として利用されるため、該疾患の
より有効な診断方法をも可能にするものである。
【００１９】以下、実施例に沿って本発明をさらに詳細
に説明する。
に説明する。
実施例１ オリゴペプチドの調製：アネキシン−Ｖの
アミノ酸配列の一部である、下記のオリゴペプチドＡ〜
Ｃをペプチド合成機を用いて調製した後、フッ化水素法
により合成機から分離した。各ペプチドの精製は、逆相
高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により行い、Ｈ
ＰＬＣおよびアミノ酸分析によりその精製度を確認し
た。 オリゴペプチドＡ：Asp His Thr Leu Ile Arg （本発明品） （配列番号１） オリゴペプチドＢ：Ser His Leu Arg Lys Val （配列番号２） オリゴペプチドＣ：Lys His Ala Leu Lys Gly （配列番号３）
アミノ酸配列の一部である、下記のオリゴペプチドＡ〜
Ｃをペプチド合成機を用いて調製した後、フッ化水素法
により合成機から分離した。各ペプチドの精製は、逆相
高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により行い、Ｈ
ＰＬＣおよびアミノ酸分析によりその精製度を確認し
た。 オリゴペプチドＡ：Asp His Thr Leu Ile Arg （本発明品） （配列番号１） オリゴペプチドＢ：Ser His Leu Arg Lys Val （配列番号２） オリゴペプチドＣ：Lys His Ala Leu Lys Gly （配列番号３）
【００２０】試験例１ 抗血液凝固活性：実施例１で
得たオリゴペプチドＡ〜Ｃの抗血液凝固活性を下記の如
くして測定した。まず、ウサギ脳セファリン（シグマ
社）１バイアルを１００mlの生理食塩水に懸濁し、これ
を１mlずつに分注し−２０℃で保存した。このセファリ
ン懸濁液と３３mMの塩化カルシウム溶液を各試験前に混
合し、酸で十分に洗浄されたカオリン溶液（５０mM／ml
の濃度になるように生理食塩水に溶解したもの）を添加
し各ペプチドによる内因系血液凝固の阻害を測定した。
すなわち、２０μｌの血漿と２０μｌのテストサンプル
（５０mMのNaClを含む５０mMトリス塩酸溶液（pH7.9）
に溶解したもの）を１０分間３７℃にて保温し、カオリ
ンを２０μｌ添加し、さらに塩化カルシウムセファリン
混合液を添加することにより各凝固時間を測定した。
得たオリゴペプチドＡ〜Ｃの抗血液凝固活性を下記の如
くして測定した。まず、ウサギ脳セファリン（シグマ
社）１バイアルを１００mlの生理食塩水に懸濁し、これ
を１mlずつに分注し−２０℃で保存した。このセファリ
ン懸濁液と３３mMの塩化カルシウム溶液を各試験前に混
合し、酸で十分に洗浄されたカオリン溶液（５０mM／ml
の濃度になるように生理食塩水に溶解したもの）を添加
し各ペプチドによる内因系血液凝固の阻害を測定した。
すなわち、２０μｌの血漿と２０μｌのテストサンプル
（５０mMのNaClを含む５０mMトリス塩酸溶液（pH7.9）
に溶解したもの）を１０分間３７℃にて保温し、カオリ
ンを２０μｌ添加し、さらに塩化カルシウムセファリン
混合液を添加することにより各凝固時間を測定した。
【００２１】終濃度１mM〜５mMになるように各ペプチド
溶液を調製し、これを血液に添加して凝固時間の遅延を
調べたところ、図１の結果が得られた。すなわち、オリ
ゴペプチドＡおよびＢでは、添加するペプチドの濃度を
増やすに従い、血液の凝固時間が長くなることが確認さ
れた。終濃度５mMで各ペプチドを添加した場合の各血液
の凝固時間は、何も添加していない対照群の凝固時間を
基準として、オリゴペプチドＢではその凝固時間が約２
倍に、本発明のオリゴペプチドＡでは約６倍に遅延され
ることが確認された。終濃度５mMでの結果を時間で示す
と表１の通りである。
溶液を調製し、これを血液に添加して凝固時間の遅延を
調べたところ、図１の結果が得られた。すなわち、オリ
ゴペプチドＡおよびＢでは、添加するペプチドの濃度を
増やすに従い、血液の凝固時間が長くなることが確認さ
れた。終濃度５mMで各ペプチドを添加した場合の各血液
の凝固時間は、何も添加していない対照群の凝固時間を
基準として、オリゴペプチドＢではその凝固時間が約２
倍に、本発明のオリゴペプチドＡでは約６倍に遅延され
ることが確認された。終濃度５mMでの結果を時間で示す
と表１の通りである。
【００２２】
【表１】
【００２３】さらに、対照として、このオリゴペプチド
Ａ中のヒスチジンをアラニンに置換したオリゴペプチド
として、下記のオリゴペプチドＤを調製した。 オリゴペプチドＤ：Asp Ala Thr Leu Ile Arg（配列番
号４）
Ａ中のヒスチジンをアラニンに置換したオリゴペプチド
として、下記のオリゴペプチドＤを調製した。 オリゴペプチドＤ：Asp Ala Thr Leu Ile Arg（配列番
号４）
【００２４】上記と同様にオリゴペプチドＤの溶液を１
mM〜５mMの濃度に調製し、これを血液に添加して凝固時
間の遅延を調べたところ（図１）、先の実験結果とは異
なり、ペプチド添加による凝固時間の遅延はほとんど見
い出すことはできなかった。
mM〜５mMの濃度に調製し、これを血液に添加して凝固時
間の遅延を調べたところ（図１）、先の実験結果とは異
なり、ペプチド添加による凝固時間の遅延はほとんど見
い出すことはできなかった。
【００２５】試験例２ 抗アネキシン−Ｖモノクロー
ナル抗体を用いた本オリゴペプチドの抗血液凝固活性の
確認：本発明のオリゴペプチドの抗血液凝固活性を確認
するために、抗アネキシン−Ｖモノクローナル抗体を用
いた下記の実験を行った。
ナル抗体を用いた本オリゴペプチドの抗血液凝固活性の
確認：本発明のオリゴペプチドの抗血液凝固活性を確認
するために、抗アネキシン−Ｖモノクローナル抗体を用
いた下記の実験を行った。
【００２６】抗アネキシン−Ｖモノクローナル抗体の調
製は、常法に従い（Kohler & Milstein 法）以下の如く
して行った。まずマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１を１０
％牛胎児血清を３００mg／ｌのグルタミンを含むＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地にて培養した。ミエローマ細胞および
下記のハイブリドーマの培養は、二酸化炭素培養機を用
いて３７℃で培養した。
製は、常法に従い（Kohler & Milstein 法）以下の如く
して行った。まずマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１を１０
％牛胎児血清を３００mg／ｌのグルタミンを含むＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地にて培養した。ミエローマ細胞および
下記のハイブリドーマの培養は、二酸化炭素培養機を用
いて３７℃で培養した。
【００２７】アネキシン−Ｖ抗原１００μｇを５００μ
ｌのカルシウムイオンおよびマグネシウムイオンを含ま
ないリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））に溶解し、これに同
容量のフロイント完全アジュバントを混合し、これを１
０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス皮下に接種した。さらに１週
間後、同量のアネキシン−Ｖを追加免疫しこれを４週間
続けた。ＰＢＳ（−）にアネキシン−Ｖ抗原を０．１mg
を懸濁した溶液を、各マウスに静脈接種し最終免疫を行
った。最終免疫から４日後各マウスから脾臓細胞を摘出
し、Ｐ３Ｕ１細胞と融合させた。ハイブリドーマの選択
は、Littlefield の方法に従い行った〔Littlefield
ら、Science, １４５，ｐ７０９−７１０（１９６
４）〕。これにより得られた陽性ハイブリドーマは、Ｅ
ＬＩＳＡによりアネキシン−Ｖとの結合性を調べた。こ
のようにしてクローニングされたハイブリドーマから産
生される抗アネキシン−Ｖモノクローナル抗体は、アフ
ィゲルプロテインＡ ＭＡＰＳＩＩキット（米国バイオ
ラッド社）を用いて精製した。このようにして得られた
抗アネキシン−Ｖモノクローナル抗体は、ＩｇＧ1、κ
に属する抗体であることがアガロース沈澱法により確認
された。
ｌのカルシウムイオンおよびマグネシウムイオンを含ま
ないリン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））に溶解し、これに同
容量のフロイント完全アジュバントを混合し、これを１
０匹のＢＡＬＢ／ｃマウス皮下に接種した。さらに１週
間後、同量のアネキシン−Ｖを追加免疫しこれを４週間
続けた。ＰＢＳ（−）にアネキシン−Ｖ抗原を０．１mg
を懸濁した溶液を、各マウスに静脈接種し最終免疫を行
った。最終免疫から４日後各マウスから脾臓細胞を摘出
し、Ｐ３Ｕ１細胞と融合させた。ハイブリドーマの選択
は、Littlefield の方法に従い行った〔Littlefield
ら、Science, １４５，ｐ７０９−７１０（１９６
４）〕。これにより得られた陽性ハイブリドーマは、Ｅ
ＬＩＳＡによりアネキシン−Ｖとの結合性を調べた。こ
のようにしてクローニングされたハイブリドーマから産
生される抗アネキシン−Ｖモノクローナル抗体は、アフ
ィゲルプロテインＡ ＭＡＰＳＩＩキット（米国バイオ
ラッド社）を用いて精製した。このようにして得られた
抗アネキシン−Ｖモノクローナル抗体は、ＩｇＧ1、κ
に属する抗体であることがアガロース沈澱法により確認
された。
【００２８】この抗アネキシン−Ｖモノクローナル抗体
について、アネキシン−Ｖの抗血液凝固活性に及ぼす影
響を次の通り調べた。
について、アネキシン−Ｖの抗血液凝固活性に及ぼす影
響を次の通り調べた。
【００２９】すなわち、上記試験例１の血液凝固時間を
測定した場合と同様の反応系に、最終濃度０．１５μＭ
になるようにアネキシン−Ｖを添加し、その凝固遅延時
間を測定したところ、アネキシン−Ｖ無添加では７５秒
であったカオリン依存性の凝固時間が、アネキシン−Ｖ
添加により２９５秒に遅延させることができた。また、
トロンボプラスチン依存性血液凝固は、アネキシン−Ｖ
無添加の４３秒からアネキシン−Ｖ添加では２１０秒に
遅延させた。これと同様の反応において添加するアネキ
シン−Ｖを抗アネキシン−Ｖモノクローナル抗体２μｇ
を用いて前処理したところ、本来のアネキシン−Ｖの有
する抗血液凝固活性は完全に抑制された。
測定した場合と同様の反応系に、最終濃度０．１５μＭ
になるようにアネキシン−Ｖを添加し、その凝固遅延時
間を測定したところ、アネキシン−Ｖ無添加では７５秒
であったカオリン依存性の凝固時間が、アネキシン−Ｖ
添加により２９５秒に遅延させることができた。また、
トロンボプラスチン依存性血液凝固は、アネキシン−Ｖ
無添加の４３秒からアネキシン−Ｖ添加では２１０秒に
遅延させた。これと同様の反応において添加するアネキ
シン−Ｖを抗アネキシン−Ｖモノクローナル抗体２μｇ
を用いて前処理したところ、本来のアネキシン−Ｖの有
する抗血液凝固活性は完全に抑制された。
【００３０】上記試験例１で用いたペプチドＡを、試験
例１と同様の凝固時間測定を行う際に、ペプチドＡを反
応前に上記のようにして調製された抗アネキシン−Ｖモ
ノクローナル抗体と事前に反応させた。すなわち、各濃
度のペプチドを７μｇの抗アネキシン−Ｖモノクローナ
ル抗体（５０mMのNaClを含む５０mMトリスリン酸緩衝液
２０μｌに懸濁）と３７℃で３０分間反応させ、その後
上記と同様に凝固時間測定を行った。その結果を図２に
示す。
例１と同様の凝固時間測定を行う際に、ペプチドＡを反
応前に上記のようにして調製された抗アネキシン−Ｖモ
ノクローナル抗体と事前に反応させた。すなわち、各濃
度のペプチドを７μｇの抗アネキシン−Ｖモノクローナ
ル抗体（５０mMのNaClを含む５０mMトリスリン酸緩衝液
２０μｌに懸濁）と３７℃で３０分間反応させ、その後
上記と同様に凝固時間測定を行った。その結果を図２に
示す。
【００３１】この結果から、抗アネキシン−Ｖモノクロ
ーナル抗体との事前処理を行っていないペプチドＡは、
濃度依存的に血液凝固時間を遅延させているが、抗アネ
キシン−Ｖモノクローナル抗体処理を行ったペプチドＡ
は、血液凝固を殆ど遅延させていないことが確認され
る。何も処理をしないオリゴペプチドＡでは、カオリン
依存性血液凝固時間を１０６秒から６２５秒へ遅延させ
たのに対して、抗アネキシン−Ｖモノクローナル抗体処
理したペプチドＡでは、凝固時間の遅延は１１６秒から
１５０秒に多少延びた程度に留まり、確実に抗アネキシ
ン−Ｖモノクローナル抗体によりペプチドがブロックさ
れていることが確認された。
ーナル抗体との事前処理を行っていないペプチドＡは、
濃度依存的に血液凝固時間を遅延させているが、抗アネ
キシン−Ｖモノクローナル抗体処理を行ったペプチドＡ
は、血液凝固を殆ど遅延させていないことが確認され
る。何も処理をしないオリゴペプチドＡでは、カオリン
依存性血液凝固時間を１０６秒から６２５秒へ遅延させ
たのに対して、抗アネキシン−Ｖモノクローナル抗体処
理したペプチドＡでは、凝固時間の遅延は１１６秒から
１５０秒に多少延びた程度に留まり、確実に抗アネキシ
ン−Ｖモノクローナル抗体によりペプチドがブロックさ
れていることが確認された。
【００３２】
配列番号：１
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
配列の種類：ペプチド
配列
Asp His Thr Leu Ile Arg
1 5
【００３３】配列番号：２
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
配列の種類：ペプチド
配列
Ser His Leu Arg Lys Val
1 5
【００３４】配列番号：３
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
配列の種類：ペプチド
配列
Lys His Ala Leu Lys Gly
1 5
【００３５】配列番号：４
配列の長さ：６
配列の型：アミノ酸
配列の種類：ペプチド
配列
Asp Ala Thr Leu Ile Arg
1 5
【図１】試験例１における、各オリゴペプチドの抗血液
凝固活性を示した図である。
凝固活性を示した図である。
【図２】試験例２における、本発明のオリゴペプチドを
抗アネキシン−Ｖモノクローナル抗体で前処理した場合
の抗血液凝固活性を示した図である。
抗アネキシン−Ｖモノクローナル抗体で前処理した場合
の抗血液凝固活性を示した図である。
Claims (3)
- 【請求項１】 下記のアミノ酸配列からなるオリゴペプ
チド。 Asp His Thr Leu Ile Arg - 【請求項２】 化学的に合成されたものである請求項１
記載のオリゴペプチド。 - 【請求項３】 実質的な抗血液凝固作用部位として下記
のアミノ酸配列を有するペプチド。 Asp His Thr Leu Ile Arg
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3154811A JPH051096A (ja) | 1991-06-26 | 1991-06-26 | 抗血液凝固活性を持つオリゴペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3154811A JPH051096A (ja) | 1991-06-26 | 1991-06-26 | 抗血液凝固活性を持つオリゴペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH051096A true JPH051096A (ja) | 1993-01-08 |
Family
ID=15592397
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3154811A Withdrawn JPH051096A (ja) | 1991-06-26 | 1991-06-26 | 抗血液凝固活性を持つオリゴペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH051096A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7407475B2 (en) | 2001-02-21 | 2008-08-05 | Alavita Pharmaceuticals, Inc. | Modified annexin proteins, and methods and compositions for using them |
| US7635680B2 (en) | 2001-02-21 | 2009-12-22 | Alavita Pharmaceuticals, Inc. | Attenuation of reperfusion injury |
| US7635676B2 (en) | 2001-02-21 | 2009-12-22 | Alavita Pharmaccuticals, Inc. | Modified annexin proteins and methods for their use in organ transplantation |
| US7645739B2 (en) | 2001-02-21 | 2010-01-12 | Alavita Pharmaceuticals, Inc. | Modified annexin compositions and methods of using same |
-
1991
- 1991-06-26 JP JP3154811A patent/JPH051096A/ja not_active Withdrawn
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7407475B2 (en) | 2001-02-21 | 2008-08-05 | Alavita Pharmaceuticals, Inc. | Modified annexin proteins, and methods and compositions for using them |
| US7635680B2 (en) | 2001-02-21 | 2009-12-22 | Alavita Pharmaceuticals, Inc. | Attenuation of reperfusion injury |
| US7635676B2 (en) | 2001-02-21 | 2009-12-22 | Alavita Pharmaccuticals, Inc. | Modified annexin proteins and methods for their use in organ transplantation |
| US7635678B2 (en) | 2001-02-21 | 2009-12-22 | Alavita Pharmaceuticals, Inc. | Modified annexin compositions and methods of using same |
| US7645739B2 (en) | 2001-02-21 | 2010-01-12 | Alavita Pharmaceuticals, Inc. | Modified annexin compositions and methods of using same |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19980903 |