KR100767146B1 - Ａβ 펩티드를 격리시키는 인간화 항체 - Google Patents

Abstract

아밀로이드 플라크의 형성을 특징으로 하는 상태를 예방적 및 치유적으로 치료하는 방법을 기재했다. 상기 방법은 인간의 생물학적 유체로부터 가용성 Aβ 펩티드를 격리시키거나 아밀로이드 베타 펩티드 Aβ의 위치 13과 28 사이에 함유된 에피토프에 바람직하게는 특이적으로 결합하는 인간화 항체를 이용한다.

아밀로이드 플라크, 가용성 Aβ 펩티드, 에피토프, 인간화 항체, 단편

Description

Ａβ 펩티드를 격리시키는 인간화 항체 {Humanized Antibodies That Sequester Amyloid Beta Peptide}

관련 출원

본 출원은 2000년 2월 24일자로 출원된 미국 가출원 제60/184,601호, 2000년 12월 8일자로 출원된 동 제60/254,465호 및 2000년 12월 8일자로 출원된 동 제60/254,498호를 우선권으로 청구하며, 이들 각각의 내용은 본원에 참고로 도입된다.

본 발명은 Aβ 펩티드의 아미노산 13과 28 사이의 에피토프에 결합하는 인간화 항체에 관한 것이고, 베타-아밀로이드와 연관된 상태, 예를 들어 알쯔하이머병, 다운증후군 및 대뇌의 아밀로이드 혈관병증의 예방적 및 치유적 치료법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 혈장, 뇌 및 뇌척수액에서 아밀로이드 베타 (Aβ) 펩티드를 격리시켜 뇌 및 뇌혈관 내에서 Aβ 펩티드의 축적을 예방하거나, Aβ 펩티드의 침착을 전환시키고 인식력을 개선시키기 위한 인간화 모노클로날 항체의 용도에 관한 것이다.

인식 결손, 졸중, 뇌출혈 및 통상적인 정신 쇠약을 일으키는 수많은 증상들 은 아밀로이드 베타 펩티드 (Aβ)를 함유하는 뇌에서의 신경염성 및 뇌혈관성 플라크와 연관된 것으로 여겨진다. 이들 상태 중에는 전임상적 및 임상적 알쯔하이머병, 다운증후군 및 전임상적 및 임상적 대뇌의 아밀로이드 혈관병증 (CAA)이 속한다. 아밀로이드 플라크는 아밀로이드 베타 펩티드로부터 형성된다. 이들 펩티드는 전형적으로 지단백질과의 복합체 형태로 혈액 및 뇌척수액 (CSF)에서 순환한다. 순환 형태의 Aβ 펩티드는 통상적인 전구체 단백질인, 종종 APP라 지칭되는 아밀로이드 전구체 단백질의 절단으로 생성된 39 내지 43개 아미노산 (대개는 40 또는 42개 아미노산)으로 구성된다. 가용성 Aβ의 몇몇 형태는 그 자체가 신경독성이며 신경퇴행 및(또는) 인식 감퇴의 심각성을 결정지을 수 있다 [McLean, C. A., et al., Ann. Neurol. (1999) 46:860-866; Lambert, M. P., et al. (1998) 95:6448-6453; Naslund,J., J. Am. Med. Assoc. (2000) 283:1571].

Aβ가 뇌와 혈액 사이에서 자유롭게 수송될 수 있음을 제안한 증거가 있다 [Ghersi-Egea, J-F., et al., J Neurochem. (1996) 67:880-883; Zlokovic, B. V., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67:1034-1040; ShibataM, etal., J. Clin. Invest. (2000) 106:1489-1499]. 또한, 플라크 중의 Aβ는 뇌와 혈액 중의 가용성 Aβ와 평형상태이다 [Kawarabayashi T, et al., J Neurosci. (2001) 21:372-381].

PCT 출원 제USOO/35681호 및 미국 제09/153,130호 (상기 두가지 문헌 모두 본원에 참고로 도입됨)에 기재된 바와 같이, CSF 중에서 Aβ 펩티드의 총 순환 수준은 정상적인 개체 및 알쯔하이머 증상을 나타낼 소지가 있는 개체에서 유사하다. 그러나, Aβ₄₂ 수준의 평균치는 알쯔하이머병을 앓는 개체의 경우가 더 낮다 [Nitsch, R. M., et al., Ann. Neurol. (1995) 37:512-518]. Aβ₄₂가 Aβ₄₀ 보다 응집되기가 훨씬 쉬우며, Aβ₄₂가 응집되는 경우에는 부정적 결과, 예를 들어 아밀로이드 플라크 내 Aβ의 침착, Aβ의 독성 가용성 형태로의 전환, 신경 세포 손상 및 거동 장애, 예를 들어 치매를 초래한다는 것이 공지되어 있다 [Golde, T. E., et al., Biochem. Biophys. Acta. (2000) 1502:172-187].

아밀로이드 침착을 감소시키는 면역 반응의 유도 방법은 PCT 공개 W0 99/27944 (1999년 6월 10일자로 공개됨)에 기재되어 있다. 상기 문헌에서는 응집된 전장 Aβ 펩티드가 유용한 면역원일 것이라 가정한다. 양에서의 항-마우스 IgG와 접합된 Aβ 단편 (아미노산 13 내지 28)의 투여는 피질 아밀로이드 적재 (burden)에 아무런 변화를 일으키지 않았으며, Aβ 13 내지 28의 단편-접합체를 주사한 9마리의 동물 중 오직 1마리에서만 Aβ₄₀에 대한 임의의 림프구증식을 나타냈다. 또한, 이러한 적용은 Aβ 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체가 치료제로 사용될 수 있음을 지시한다. 그러나, 이는 지지하는 데이타가 Aβ₄₂ 등을 사용한 활성 면역화를 포함하는 프로토콜을 반영하기 때문에 단지 추정인 것으로 여겨진다. 상기 펩티드는 면역화로부터 형성된 항체 역가 및 아쥬반트를 사용하여 제공될 뿐 아니라, Aβ 펩티드 및 전구체 펩티드의 수준이 결정된다. 상기 공개 문헌은 알쯔하이머 증상을 경감시키기 위해서는 Aβ 플라크가 감소되어야 하며 Aβ 플라크의 성공적인 감소에 세포-매개 과정이 필요하다는 것을 강하게 시사한다.

WO 99/60024 (1999년 11월 25일자로 공개됨)는 항-아밀로이드 항체를 사용한 아밀로이드 제거 방법에 관한 것이다. 그러나, 미리 형성된 아밀로이드 침착물 (즉, 플라크)에 대한 항-Aβ항체의 결합력을 이용한 메카니즘이 언급되어 있으며, 이 결과로 이후 소교세포(小膠細胞)에 의한 국소화된 플라크의 국소적 제거가 이루어진다. 이러한 메카니즘은 생체내에서는 입증되지 않았다. 또한, 상기 공개 문헌은 Aβ 플라크에 대해 효과적이기 위해서는, 항-Aβ 항체가 뇌 실질에 접근하여 혈뇌장벽(血腦障壁)을 통과해야함을 언급하고 있다.

아밀로이드 플라크를 조절하기 위한 시도에 관한 여러 PCT 출원들이 2000년 12월 7일자로 공개되었다. WO 00/72880는 알쯔하이머병의 트랜스제닉 마우스 모델에 Aβ 펩티드의 N-말단 단편 및 이에 결합하는 항체를 처치한 경우에는 피질 및 해마에서 플라크가 유의하게 감소되지만, 양에서의 항-마우스 IgG와 접합시킨 Aβ 13 내지 28 단편 또는 13 내지 28 단편에 대한 항체인 항체 266를 처치한 경우에는 그렇지 않음을 기재하고 있다. 시험관내 연구를 통해, N-말단에 대해 지시된 항체는 혈뇌장벽을 통과하여 아밀로이드 플라크의 식작용을 유도하는 것으로 주장되었다.

WO 00/72876은 사실상 WO 00/72880과 동일한 내용을 개시하며, 아밀로이드 섬유 성분 자체를 사용한 면역화에 관한 것이다.

WO 00/77178은 베타-아밀로이드의 가수분해를 촉매하도록 고안된 항체를 기 재하며, 이 항체는 페닐알라닌 스타틴 전이 화합물 Cys-Aβ_10-25, 스타틴 Phe₁₉-Phe ₂₀ 및 Cys-Aβ_10-25 스타틴 Phe₂₀-Ala₂₁ 의 혼합물에 대해 생성된 항체 및 Phe₁₉ 및 Phe₂₀ 사이의 아미드 결합이 환원된 Aβ_10-25 에 대해 생성된 항체를 포함한다. 이 문헌은 Aβ의 격리를 언급하고 있으나, 그러한 격리의 증거가 전혀 없기 때문에 단지 추측일 뿐이다. 또한, 상기 문헌은 항체 투여가 중추신경계로부터 Aβ의 유출을 초래하거나, 플라크 형성을 방해하거나, 플라크 적재를 감소시키거나, 조직 샘플에서 항체와 Aβ사이에 복합체를 형성하거나, 인식력에 영향을 미친다는 생체내 증거를 제공하지 못한다.

Aβ 대사의 한가지 경로는 CNS로부터 혈장으로 수송되는 것임이 밝혀진 바 있다 [Zlokovic, B. V., et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) (1996) 93:4229-4234; Ghersi-Egea, J-F., et al., J. Neurochem. (1996) 67:880-883]. 추가로, 혈장 내 Aβ는 혈뇌장벽을 통과하여 뇌에 들어갈 수 있음도 밝혀졌다 [Zlokovic, B. V., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67:1034-1040]. 또한, 특정 폴리클로날 및 모노클로날 Aβ 항체의 투여가 알쯔하이머병의 APP^V717F 트랜스제닉 마우스 모델에서 아밀로이드 플라크 내 Aβ 침착을 감소시킨다는 것도 밝혀졌으나 [Bard, F., et al., Nature Med. (2000) 6:916-919], 특정 항-Aβ 항체가 혈뇌장벽을 통과하기 때문에 소교세포에 의한 아밀로이드 플라크의 식작용을 자극한다고 하는 이론이 있다. 바드 (Bard)의 실험에서, 생체외 뇌 슬라이스 분석은 외인성으로 첨가된 소교세포와 함께 첨가된 Aβ 항체의 존재가 Aβ의 식작용을 유도하여 Aβ 침착을 제거하는 것으로 나타났다.

CSF 및 혈액 중 가용성 Aβ₄₀ 및 Aβ₄₂의 수준은 둘다 에피토프에 대해 지시된 항체 및 Aβ 쇄를 사용한 표준화된 분석법을 사용하여 쉽게 검출될 수 있다. 이러한 분석법은 미국 특허 제5,766,846호, 동 제5,837,672호 및 동 제5,593,846호 등에서 보고된 바 있다. 이들 특허 문헌들은 Aβ 펩티드의 중심 도메인에 대한 쥐과 모노클로날 항체의 제조를 기재하고, 이들 항체는 위치 16 및 17 주변 및 이를 포함하는 에피토프를 보유한다고 보고했다. 또한, N-말단 영역에 대해 지시된 항체도 기재되어 있다. 여러 모노클로날 항체들이 Aβ 펩티드의 위치 13 내지 28과 면역반응을 일으키며 위치 17 내지 28을 제시하는 펩티드에는 결합하지 못하는 것으로 주장되었기 때문에, 상기 인용된 특허 문헌들에 따라 이들 항체의 표적인 위치 16 내지 17 (α-세크라타제 부위)을 포함하는 영역을 수립했다. Aβ의 아미노산 13과 28 사이에 결합하는 것으로 공지된 항체 중에는 마우스 항체 266, 4G8 및 1C2이 포함된다.

본 출원인들은 24개월 된 반접합 트랜스제닉 마우스 (APP^V717F)에서 266 항체의 투여가 인식력 (대상의 기억)을 매우 신속하고 거의 완벽하게 전환시킨다는 예상치못한 발견을 했다. 그러나, 상기 항체는 알쯔하이머병, 다운증후군 및 Aβ 펩티드와 관련된 다른 상태의 치료에 효과적이기 위해 당업계에서 항체에 요구하는 성질들을 보유하고 있지 않다. 더욱 놀랍게도, 본 출원인들은 위치 13과 28 사이에서 Aβ에 결합하는 항체 (266 및 4G8)가 Aβ의 가용성 형태를 Aβ 펩티드가 결합 한 혈액내 순환 형태로부터 격리시킬 수 있으며, 항체 266의 말초 투여가 비교적 다량의 Aβ 펩티드를 CNS로부터 혈장으로 신속하게 유출시킨다는 것을 관찰하였다. 이 결과, 가용성 Aβ의 제거가 변경되고, 플라크 형성이 저해되며, 가장 놀랍게도 반드시 Aβ 아밀로이드 플라크 적재를 감소시키거나, 혈뇌장벽을 임의의 유의한 정도로 통과하거나, 플라크를 처리 (decoration)하거나, 세포의 메카니즘을 활성화하거나, 높은 친화성으로 응집된 Aβ에 결합하지 않고도 인식력을 개선시킨다.

본 발명의 개시

본 발명은 Aβ가 관여할 수 있는 질환 및 상태, 예를 들어 임상적 또는 전임상적 알쯔하이머병, 다운증후군 및 임상적 또는 전임상적 대뇌의 아밀로이드 혈관병증에서 인식력에 긍정적인 영향을 미치는 인간화 항체 또는 이의 단편을 제공한다. 항체 또는 이의 단편들은 혈뇌장벽을 통과하거나, 아밀로이드 플라크를 처리하거나, 세포의 반응을 활성화하거나, 반드시 아밀로이드 플라크 적재를 감소시킬 필요조차 없다. 다른 측면에서, 본 발명은 Aβ 펩티드를 Aβ펩티드가 결합한 혈액내 순환 형태로부터 격리시키며, 중추신경계 및 혈장에서 Aβ의 가용성 형태 및 결합 형태의 제거를 변경시키는 인간화 항체 및 이의 단편을 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 Aβ 분자의 아미노산 13과 28 사이의 에피토프에 특이적으로 결합하는 인간화 항체 및 이의 단편을 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 CDR이 마우스 모노클로날 항체 266으로부터 유래하고, 마우스 항체와 유사한 결합 성질을 보유하며, 마우스 항체의 시험관내 및 생체내 성질과 기능적으로 동등한 성질을 보유하는 인간화 항체 및 이의 단편 (서열 1 내지 서열 6의 서열)을 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 가변 영역의 서열이 마우스 항체 266으로부터의 CDR의 서열 및 특이적인 인간 프레임워크 서열을 포함하고, 마우스 항체와 유사한 결합 성질을 보유하며, 마우스 항체 266의 시험관내 및 생체내 성질과 기능적으로 동등한 성질을 보유하는 인간화 항체 및 이의 단편 (서열 7 내지 서열 10의 서열)을 제공한다. 다른 측면에서, 본 발명은 경쇄 서열이 서열 11이고 중쇄 서열이 서열 12인 인간화 항체 및 이의 단편을 제공한다.

또한, 본 발명의 일부는 상기 개시한 인간화 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 상기 인간화 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터, 상기 벡터로 형질전환시키거나 상기 인간화 항체 또는 이의 단편을 발현하는 폴리뉴클레오티드를 혼입시킨 숙주 세포, 본원에 개시된 인간화 항체 및 이의 단편의 제약상 제제 및 이의 제조 및 사용 방법이다.

이러한 인간화 항체 및 이의 단편은 뇌에서의 Aβ 플라크 또는 Aβ 독성을 특징으로 하는 질환 및 상태, 예를 들어 알쯔하이머병, 다운증후군 및 인간에서 대뇌의 아밀로이드 혈관병증의 치료 및 예방, 인간에서 이들 질환의 진단 및 인간 피험체가 Aβ에 대한 인간 항체를 사용한 치료법에 반응할 것인지 여부의 결정 등의 목적으로 인간에서의 Aβ 격리에 유용하다.

생물학적 유체 중에서 순환하는 Aβ 펩티드를 생체내 격리시키기 위해서는, 적당한 인간화 항체를 투여하는 것이 뇌에서의 Aβ-함유 범발 (diffuse) 신경염성 및 뇌혈관성 플라크의 형성과 연관된 상태의 예방적 및 치유적 치료에 유용하다. 인간화 항체 및 면역학적으로 반응성인 이의 단편은 통상적으로 체액 중에서 Aβ 펩티드를 플라크가 형성될 수 있는 부위 또는 독성일 수 있는 부위로 수송하는 것과 관련된 거대분자 복합체로부터 Aβ 펩티드를 제거한다. 또한, 상기 항체 또는 이의 단편을 사용한 혈장 Aβ 펩티드의 격리는 혈장 구획 내 가용성 Aβ 펩티드를 효과적으로 격리시키고 Aβ가 중추신경계 (CNS)에 있는 위치로부터 혈장으로 들어가도록 하는 "싱크 (sink)"로서 거동한다. 혈액내 Aβ를 격리시킴으로써, 뇌로부터의 순 (net) 유출이 강화되고 가용성 Aβ의 불용성 플라크 내 침착 및 뇌에서의 독성 가용성 종의 형성이 저해된다. 또한, 가용성 Aβ와 평형상태인 플라크 중의 불용성 Aβ는 혈액내 격리 효과를 통해 뇌로부터 제거될 수 있다. 또한, 항체와 결합한 Aβ 펩티드의 격리는 Aβ 펩티드의 신체로부터의 제거를 강화하고 뇌에서의 가용성 Aβ의 독성 효과를 억제하고 플라크 내 아밀로이드로서의 불용성 Aβ의 축적 및 진행을 억제한다. 본 발명에 유용한 항체는 혈뇌장벽을 대량으로 통과하지 못한다 ( ≤0.1％ 혈장 수준). 또한, 본 발명에 사용되는 인간화 항체를 말초에 투여하는 경우에는, 뇌에서 세포의 면역 반응을 촉발할 필요 없이 Aβ 펩티드에 결합하거나 자유롭게 순환하여 유익한 효과를 발휘한다. 또한, 이들을 말초에 투여한 경우에는 뇌에서 응집된 Aβ 펩티드에 유의하게 결합할 필요 없이 유익한 효과를 발휘한다.

그러므로, 한 측면에서, 본 발명은 Aβ 펩티드의 중간-영역에 특이적으로 결합하는 인간화 모노클로날 항체 또는 면역학적으로 반응성인 이의 단편을 베타-아밀로이드 단백질을 함유하는 플라크의 형성을 특징으로 하는 상태를 치료할 필요가 있는 인간에게 치유적 또는 예방적 유효량으로 바람직하게는 말초에 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 베타-아밀로이드 단백질을 함유하는 플라크의 형성을 특징으로 하는 상태의 치료 및 예방 방법에 관한 것이다. 다른 측면에서, 본 발명은 Aβ 펩티드를 혈액내 순환 형태로부터 격리하여 뇌 밖으로의 유출을 유도할 뿐 아니라 혈장 및 뇌에서 Aβ 제거를 변경시키는 인간화 항체를 아밀로이드 플라크 형성을 억제하고 아밀로이드 플라크를 제거할 필요가 있는 인간에게 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 아밀로이드 플라크 형성의 억제 방법 및 아밀로이드 플라크 제거 방법에 관한 것이다. 추가의 측면에서, 본 발명은 상기와 같은 인간화 항체 및 면역학적으로 효과적인 이의 일부 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 임상적 또는 전임상적 알쯔하이머병, 다운증후군 또는 임상적 또는 전임상적 대뇌의 아밀로이드 혈관병증이 있는 것으로 진단된 피험체에게 본 발명의 인간화 항체를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 상기 피험체에서 인식 감퇴를 전환시키고, 인식력을 개선시키고, 인식 감퇴를 치료하며, 인식 감퇴를 예방하는 방법을 포함한다.

또한, 본 발명은 인간 조직에서 상기 항체 또는 항체 단편의 재조합 서열의 발현 연장을 포함하는, 알쯔하이머병, 다운증후군 또는 대뇌의 아밀로이드 혈관병증의 치료, 예방 또는 전환; 임상적 또는 전임상적 알쯔하이머병, 다운증후군 또는 임상적 또는 전임상적 대뇌의 아밀로이드 혈관병증에서 인식 감퇴의 치료, 예방 또는 전환; 또는 인간에서 아밀로이드 플라크 형성 또는 가용성 Aβ 종의 독성 효과 억제 등을 위한 의약 제조에 있어서 본 발명의 인간화 항체의 용도를 포함한다.

본 발명은 본 발명의 항체를 투여한지 단시간 이내에 중추신경계로부터 혈액 으로 비교적 다량의 Aβ가 유출된다는 놀라운 관찰에 관한 것이다. 그러므로, 본 발명은

a) Aβ 또는 이의 단편에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 피험체에게 투여하는 단계; 및

b) 상기 피험체의 혈액에서 Aβ의 농도를 측정하는 단계

를 포함하는, Aβ 또는 이의 단편에 결합하는 항체를 처치한 인간 피험체의 반응을 평가하는 방법을 포함한다.

또한, 본 발명은

a) Aβ 또는 이의 단편에 결합하는 항체 또는 이의 단편의 제1 투여량을 피험체에게 투여하는 단계;

b) 상기 제1 투여량을 투여한지 3시간 내지 2주 이내에, 상기 피험체의 혈액에서 Aβ의 농도를 측정하는 단계;

c) 필요에 따라, 단계 b)의 결과를 기초로 상기 항체 또는 이의 단편의 제2 투여량 (상기 제1 투여량과 동일하거나 이와 상이함)을 계산하는 단계; 및

d) 상기 항체 또는 이의 단편의 제2 투여량을 투여하는 단계

를 포함하는, Aβ 또는 이의 단편에 결합하는 항체를 사용하여 인간 피험체를 치료하는 방법을 포함한다.

또한, 본 발명은

a) 피험체의 혈장 또는 CSF의 제1 샘플을 수득하는 단계;

b) 상기 제1 샘플에서 Aβ의 기준 농도를 측정하는 단계;

c) Aβ 또는 이의 단편에 결합하는 항체 또는 이의 단편을 상기 피험체에게 투여하는 단계;

d) 상기 항체 또는 이의 단편을 투여한지 3시간 내지 2주 이내에, 피험체의 혈장 또는 CSF의 제2 샘플을 수득하는 단계; 및

e) 상기 제2 샘플에서 Aβ의 농도를 측정하는 단계

를 포함하는, 인간 피험체에서 Aβ 또는 이의 단편에 결합하는 항체의 Aβ 아밀로이드 플라크 형성의 억제 또는 예방, Aβ아밀로이드 플라크의 감소, 가용성 Aβ 종의 독성 효과 감소 또는 Aβ 플라크와 연관된 상태 또는 질환의 치료에 대한 효능을 평가하는 방법을 포함하며, 상기 효능은 혈액내 항체에 결합하는 Aβ의 양 및 CSF 중 Aβ의 농도와 관련이 있다.

도 1은 Mab 266에 의해 투석막을 통해 인간 뇌척수액으로부터 격리된 Aβ 펩티드의 비율(％)을 상기 투석막의 분자량 컷오프 (cutoff)의 함수로서 나타낸다. .

도 2는 Mab 266 200 ㎍ 또는 600 ㎍을 주사한 후에 APP^V717F 트랜스제닉 마우스의 혈장에서 관측된 Aβ의 총 농도 (Aβ_Total)를 시간의 함수로서 나타낸다.

도 3A는 염수, 마우스 IgG 또는 Mab 266을 처치한 APP^V7l7F 트랜스제닉 마우스의 피질에서 Aβ 펩티드의 침착량을 나타낸다. 도 3B는 이러한 결과와 모(母) 기관과의 상관관계를 나타낸다.

도 4는 플라스미드 pVk-Hu266으로부터 인간화 266 경쇄를 발현하기 위한 폴 리뉴클레오티드 서열 및 발현된 인간화 266 경쇄를 위한 단일 아미노산 코드 (성숙한 경우, 서열 11에 상응함)를 나타낸다.

도 5는 플라스미드 pVg1-Hu266으로부터 인간화 266 중쇄를 발현하기 위한 폴리뉴클레오티드 서열 및 발현된 인간화 266 중쇄를 위한 단일 아미노산 코드 (성숙한 경우, 서열 12에 상응함)를 나타낸다.

도 6은 pVk-Hu266의 플라스미드 맵이다.

도 7은 pVg1-Hu266의 플라스미드 맵이다.

본 발명의 수행 방법

인간의 생물학적 유체 중에서 순환하는 Aβ 펩티드는 염색체 21 상에서 코딩되는 전구체 단백질의 카르복시 말단 영역이다. Aβ 펩티드는 자신의 보다 긴 전구체를 세포의 지질막에 앵커링하는 영역의 일부인 소수성 아미노산들의 스트레치를 함유하기 때문에 생리 용액 중에서 가용성이 불량하다는 시험관내 실험 결과가 보고된 바 있다. 그러므로, 통상적으로, 순환하는 Aβ 펩티드가 응집을 저해하는 다른 부분들과 복합체를 형성한다는 것은 놀라운 일이 아니다. 이 때문에, 생물학적 유체 중에서 순환하는 Aβ 펩티드 검출이 어려웠다.

앞서 언급한 특허 문헌 [미국 특허 제5,766,846호, 동 제5,837,672호 및 동 제5,593,846호]에는 Aβ 펩티드의 아미노산 13 내지 28을 포함하는 펩티드에 대해 생성된 항체 및 클론 266이라 지칭되는 모노클로날 항체를 포함하는 항체의 제조법이 기재되어 있으며, 이것들은 Aβ 펩티드의 아미노산 13 내지 28을 포함하는 펩티드에 특이적으로 결합하는 것으로 나타났다. 본 출원인들은 이 영역 내에 결합하 는 항체가 Aβ의 아미노산 서열 중 그외의 영역에 결합하는 항체들과는 반대로 가용성 Aβ 펩티드를 거대분자 복합체들로부터 매우 효과적으로 격리시킬 수 있다는 것을 밝혀냈다. 이러한 격리는 CNS로부터 Aβ 펩티드의 순 유출에 영향을 미치고, CNS 및 혈장에서 이를 제거하며, 플라크 형성시의 이의 이용가능성을 감소시킬 것이다. 그러므로, 인간화 형태로 전환시켜 면역원성이 감소되도록 변형시킨 이러한 특이성이 있는 항체들은 베타-아밀로이드 플라크의 형성과 연관된 상태를 예방적으로 및 치유적으로 치료할 기회를 제공한다. 상기 기재한 바와 같이, 이들 상태로는 전임상적 및 임상적 알쯔하이머병, 다운증후군 및 전임상적 및 임상적 대뇌의 아밀로이드 혈관병증 등이 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "치료"라는 용어는 치료할 상태가 이미 존재한다고 알려진 경우의 치유적 치료 및 예방 (즉, 이후에 가능한 상기 상태의 발병을 방지하거나 경감시킴)을 포함한다.

"Aβ 펩티드의 중간-영역에 결합하는 모노클로날 항체"란, Aβ의 위치 13 내지 28 사이에 함유된 에피토프를 제시하는 아미노산 서열에 결합하는 모노클로날 항체(들) (Mab(들))을 의미한다. 상기 영역 전체를 표적화할 필요는 없다. 이러한 영역 내에 있는 1개 이상의 에피토프 (특히, α-세크라타제 부위 16 내지 17 또는 항체 266이 결합하는 부위 등)에 결합하는 한, 이러한 항체는 본 발명의 방법에 효과적이다.

"항체"란, 모노클로날 항체 그 자체 또는 면역학적으로 효과적인 이의 단편, 예를 들어 이의 F_ab, F_ab' 또는 F_(ab')2 단편을 의미한다. 본원의 몇몇 맥락에서, 단편들을 특히 강조하여 언급할 것이지만, 단편들이 구체화되었는지의 여부와 관계없이, "항체"라는 용어는 상기와 같은 단편 뿐 아니라 단쇄 형태 역시 포함된다는 것을 이해할 것이다. 상기 단백질이 이의 의도된 표적에 대한 특이적인 결합력을 보유하고 혈액내 이의 운반 단백질로부터 Aβ 펩티드를 격리하는 한, 용어 "항체"에 속한다. 또한, "항체"의 정의에 속하는 예로는 이러한 특이성을 보유하는 항체의 단쇄 형태 (통상적으로 F_v 영역이라 지칭됨) 등이 있다. 본 발명에 유용한 항체는 재조합적으로 생성하는 것이 바람직하지만, 적당한 특이성을 보유하는, 전형적으로 쥐과 또는 다른 비인간 항체를 인간화 형태로 전환시키기 위한 조작이 요구되므로, 반드시 재조합적으로 생성할 필요는 없다. 항체들은 글리코실화될 수도 있고 글리코실화되지 않을 수도 있지만, 글리코실화된 항체인 것이 바람직하다. 공지된 바와 같이, 항체들은 이황 결합을 통해 적절하게 가교결합된다.

항체의 기본적인 구조 단위는 4량체를 포함하는 것으로 공지되어 있다. 각각의 4량체는 2쌍의 동일한 폴리펩티드 쇄로 구성되며, 각각의 쌍은 1개의 "경쇄" (약 25 kDa) 및 1개의 "중쇄" (약 50 내지 70 kDa)를 갖는다. 각 쇄의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100개 내지 110개 이상의 아미노산으로 이루어진 가변 영역을 포함한다. 각 쇄의 카르복시-말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 규정한다.

경쇄는 감마, 뮤, 알파 및 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되며, 항체의 이소타입을 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로서 규정한다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역들은 약 12개 이상의 아미노산으로 이루어진 "J" 영역에 의해 연결되며, 중쇄는 약 10개 이상의 아미노산으로 이루어진 "D" 영역도 포함한다.

각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역들이 항체 결합 부위를 형성한다. 그러므로, 무손상 항체는 2개의 결합 부위를 갖는다. 상기 쇄들 모두가 상보성 결정 영역 또는 CDR이라고도 불리우는 3개의 과가변 영역에 의해 연결된 비교적 보존된 프레임워크 영역 (FR)의 일반적 구조가 동일하다. 각 쌍에 있는 2개 쇄들의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 정렬되어 특이적인 에피토프에 결합할 수 있다. 경쇄 및 중쇄 모두 N-말단에서 C-말단으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에 대한 아미노산 번호는 공지된 협약에 따른다 [Kabat "Sequences of Proteins of Immunological Interest" National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 및 1991; Chothia, et al., J. Mol. Biol.196:901-917 (1987); Chothia, et al., Nature 342:878-883 (1989)].

당업계에서 이해되고 있는 바와 같이, 모노클로날 항체는 포유동물을 면역화하고, 상기 포유동물의 항체 생성 세포로부터의 하이브리도마를 형성하거나 상기 항체 생성 세포를 불멸화시키고, 상기 하이브리도마 또는 불멸화된 세포를 배양하면서 적절한 특이성에 대해 평가하는 표준 기술을 통해 적당한 특이성을 갖도록 쉽게 제조될 수 있다. 이러한 경우, 상기 항체는 Aβ 펩티드의 13 내지 28 영역 또는 이의 적절한 서브영역을 포함하는 에피토프를 제시하는 펩티드 등으로 인간, 토 끼, 래트 또는 마우스를 면역화하여 생성될 수 있다. 재조합 조작을 위한 물질들은 원하는 항체를 생성하는 하이브리도마 또는 다른 세포로부터 상기 원하는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 회수하여 수득될 수 있다. 이어서, 이들 뉴클레오티드 서열을 조작하여 이들을 인간화 형태로 제공할 수 있다.

"인간화 항체"란, 비인간 상보성 결정 영역 (CDR)을 보유하는 항체의 서열을 변경시킴으로써 일부 또는 전체가 인간 항체 배선 (germline)으로부터 유도된 아미노산 서열로 구성된 항체를 의미한다. 이러한 변경법으로 가장 간단한 것은 단순히 쥐과 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환하는 것으로 구성될 수 있는 것이어서, 이것으로 제약상 용도에 허용가능할 만큼 면역원성이 충분히 낮을 수 있는 인간/쥐과 키메라가 생성된다. 그러나, 항체의 가변 영역 및 심지어는 CDR도 현재 당업계에 공지된 기술을 사용하여 인간화하는 것이 바람직하다. 비인간 CDR을 실질적으로 무손상으로 유지하거나 CDR을 인간 게놈에서 유도된 서열로 대체하면서, 가변 영역의 프레임워크 영역을 상응하는 인간 프레임워크 영역로 치환한다. 완전한 인간 항체는 면역 시스템이 인간 면역 시스템에 상응하도록 변경된 유전적으로 변형된 마우스에서 생성된다. 상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 방법에 사용하기 위해서는 단쇄 형태를 대표하는 단편을 포함하는, 항체의 면역학적으로 특이적인 단편을 사용하는 것으로 충분하다.

다시, 인간화 항체란, 인간 프레임워크, 비인간 항체로부터의 CDR 1개 이상을 포함하고 존재하는 임의의 불변 영역이 인간 면역글로불린의 불변 영역과 실질적으로 동일한, 즉, 약 85 내지 90％ 이상, 바람직하게는 95％ 이상 동일한 항체를 지칭한다. 따라서, 가능하게는 CDR을 제외한 인간화 항체의 모든 부분들이 1개 이상의 천연 인간 면역글로불린 서열의 상응하는 부분에 실질적으로 동일하다. 예를 들면, 인간화 면역글로불린은 전형적으로 키메라 마우스 가변 영역/인간 불변 영역 항체를 포함하지 않는다.

인간 요법에 사용하는 데 있어서, 인간화 항체는 비인간 및 키메라 항체에 비해 다음과 같은 3가지 이상의 잠재적 잇점을 갖는다:

1) 이펙터 부분이 인간의 것이기 때문에, 이는 인간 면역 시스템의 다른 부분들과 더욱 잘 상호작용 할 수 있다 (예를 들어, 보체-의존성 세포독성 (CDC) 또는 항체-의존성 세포의 세포독성 (ADCC)에 의해 더욱 효율적으로 표적 세포를 파괴함).

2) 인간 면역 시스템은 인간화 항체의 프레임워크 또는 C 영역을 외래의 것으로 인식해서는 안되므로, 상기한 바와 같은 주사된 항체에 대한 항체 반응은 전체적 외래 비인간 항체 또는 부분적 외래 키메라 항체에 대한 것보다 덜 해야 한다.

3) 주사된 비인간 항체의 인간 순환계 중에서의 반감기는 인간 항체의 반감기 보다 훨씬 더 짧은 것으로 보고된 바 있다. 주사된 인간화 항체의 반감기는 자연 발생 인간 항체의 반감기와 본질적으로 동일하여, 투여량이 더 적고 덜 빈번할 수 있다.

인간화 면역글로불린은 다음과 같이 고안될 수 있다. 아미노산이 하기의 카테고리에 속하는 경우, 사용될 인간 면역글로불린 (수용체 면역글로불린)의 프레임 워크 아미노산은 CDR을 제공하는 비인간 면역글로불린 (공여체 면역글로불린)의 프레임워크 아미노산으로 대체된다: (a) 수용체 면역글로불린의 인간 프레임워크 영역에 있는 아미노산이 인간 면역글로불린의 상기 프레임워크 영역의 아미노산에 대해서는 드문 것이지만, 공여체 면역글로불린에 있는 상응하는 아미노산은 인간 면역글로불린의 상기 위치에 있는 아미노산에 대해 전형적이거나, (b) 아미노산의 위치가 CDR들 중 하나에 바로 인접해 있거나, (c) 프레임워크 아미노산의 임의의 측쇄 원자가 3차원적 면역글로불린 모델에 있는 CDR 아미노산 임의의 원자의 약 5 내지 6 Å (중심에서 중심까지) 이내에 있다 (문헌 [Queen, et al., op. cit.] 및 [Co, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2869 (1991)]). 수용체 면역글로불린의 인간 프레임워크 영역에 있는 아미노산 및 공여체 면역글로불린에 있는 상응하는 아미노산 각각이 인간 면역글로불린의 상기 위치에 있는 아미노산에 대해 드문 것인 경우, 그러한 아미노산은 상기 위치에서 인간 면역글로불린에 대해 전형적인 아미노산으로 대체된다.

바람직한 인간화 항체는 마우스 항체 266의 인간화 형태이다. 인간화 266의 CDR의 아미노산 서열은 하기와 같다:

경쇄 CDR1:

경쇄 CDR2:

경쇄 CDR3:

중쇄 CDR1:

중쇄 CDR2:

및

중쇄 CDR3:

.

본 발명의 인간화 항체의 바람직한 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 하기와 같으며, 여기서 프레임워크는 인간 배선 Vk 절편 DPK18 및 J 절편 Jk1로부터 유래한 것이고, 동일한 인간 V 아군 (subgroup)의 컨센서스 아미노산에서 여러 아미 노산을 치환하여 잠재적 면역원성을 감소시킨 것이다:

상기 서열에서,

위치 2의 Xaa는 Val 또는 Ile이고,

위치 7의 Xaa는 Ser 또는 Thr이고,

위치 14의 Xaa는 Thr 또는 Ser이고,

위치 15의 Xaa는 Leu 또는 Pro이고,

위치 30의 Xaa는 Ile 또는 Val이고,

위치 50의 Xaa는 Arg, Gln 또는 Lys이고,

위치 88의 Xaa는 Val 또는 Leu이고,

위치 105의 Xaa는 Gln 또는 Gly이고,

위치 108의 Xaa는 Lys 또는 Arg이며,

위치 109의 Xaa는 Val 또는 Leu이다.

본 발명의 인간화 항체의 바람직한 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 하기와 같으며, 여기서 프레임워크는 인간 배선 VH 절편 DP53 및 J 절편 JH4로부터 유래한 것이고, 동일한 인간 아군의 컨센서스 아미노산에서 여러 아미노산을 치환하여 잠재적 면역원성을 감소시킨 것이다:

상기 서열에서,

위치 1의 Xaa는 Glu 또는 Gln이고,

위치 7의 Xaa는 Ser 또는 Leu이고,

위치 46의 Xaa는 Glu, Val, Asp 또는 Ser이고,

위치 63의 Xaa는 Thr 또는 Ser이고,

위치 75의 Xaa는 Ala, Ser, Val 또는 Thr이고,

위치 76의 Xaa는 Lys 또는 Arg이고,

위치 89의 Xaa는 Glu 또는 Asp이며,

위치 107의 Xaa는 Leu 또는 Thr이다.

본 발명의 인간화 항체의 특히 바람직한 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 하기와 같으며, 여기서 프레임워크는 인간 배선 Vk 절편 DPK18 및 J 절편 Jk1로부터 유래한 것이고, 동일한 인간 V 아군의 컨센서스 아미노산에서 여러 아미노산을 치환하여 잠재적 면역원성을 감소시킨 것이다:

본 발명의 인간화 항체의 특히 바람직한 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 하기와 같으며, 여기서 프레임워크는 인간 배선 VH 절편 DP53 및 J 절편 JH4로부터 유래한 것이다:

본 발명의 인간화 항체에 바람직한 경쇄 아미노산 서열은 하기와 같다:

본 발명의 인간화 항체에 바람직한 중쇄 아미노산 서열은 하기와 같다:

다른 서열들이 본 발명의 인간화 항체 및 인간화 266의 경쇄 및 중쇄에 가능하다. 면역글로불린은 2쌍의 경쇄/중쇄 복합체를 가질 수 있으며, 이 중 적어도 하나의 쇄가 인간 프레임워크 영역 절편에 기능적으로 연결된 1개 이상의 마우스 상보성 결정 영역을 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 발현되었을 때, 본 발명의 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 CDR들을 포함하는 항체를 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 인간 프레임워크 영역으로서는 CDR을 제공하는 비인간 면역글로불린의 프레임워크 또는 가변 영역 아미노산 서열을 인간 면역글로불린 가변 영역 서열 집합에서의 상응하는 서열과 비교하고, 동일한 아미노산을 높은 비율(％)로 보유하는 서열을 선택한다. 모노클로날 항체 266의 중쇄 및 경쇄 CDR을 포함하는 폴리펩티드 쇄에 대한 발현 코드 상에 있는 폴리뉴클레오티드의 예를 도 4 및 도 5에 나타냈다. 코돈 동의성 및 중요하지 않은 아미노산 치환 때문에, 이러한 서열들은 다른 폴리뉴클레오티드 서열들로 쉽게 치환될 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 폴리뉴클레오티드는 발현되었을 때 서열 1 내지 서열 6의 CDR 또는 서열 7 내지 서열 10의 임의의 가변 영역 또는 서열 11 및 서열 12의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 항체를 코딩한다.

전형적으로, 폴리뉴클레오티드는 자연적으로 관련되거나 이종인 프로모터 영역을 포함하는 인간화 면역글로불린 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 것이다. 바람직하게는, 상기 발현 조절 서열은 진핵 숙주 세포를 형질전환시키거나 형질감염시킬 수 있는 벡터 내의 진핵 프로모터 시스템일 것이지만, 원핵 숙주의 조절 서열 역시 사용될 수 있다. 일단 벡터가 적당한 숙주 세포주로 혼입되면, 숙주 세포를 상기 뉴클레오티드 서열을 높은 수준으로 발현하기에 적합한 조건하에 증식시키고, 원한다면 이어서 경쇄, 중쇄, 경쇄/중쇄 2량체 또는 무손상 항체, 결합 단편 또는 다른 면역글로불린 형태를 수집 및 정제할 수 있다.

원하는 인간화 항체를 매우 높은 수준으로 발현할 수 있는 본 발명의 뉴클레오티드 서열을 다양한 상이한 폴리뉴클레오티드 (게놈 또는 cDNA, RNA, 합성 올리고뉴클레오티드 등) 및 성분 (예를 들어, V, J, D 및 C 영역)으로부터 다양한 상이 한 기술을 통해 형성할 수 있다. 적당한 게놈 및 합성 서열을 연결하는 것이 통상적인 제조 방법이지만, cDNA 서열을 이용할 수도 있다.

인간 불변 영역 DNA 서열을 공지된 절차에 따라 다양한 인간 세포, 바람직하게는 불멸화된 B-세포로부터 단리할 수 있다. 본 발명의 면역글로불린을 생성하는 CDR들은 Aβ 펩티드의 아미노산 13과 28 사이에 있는 에피토프에 결합할 수 있는 비인간 모노클로날 항체로부터 유사하게 유도될 것이며, 이때, 상기 기재한 바와 같이 공지된 방법을 통해 상기 모노클로날 항체들이 임의의 편리한 포유동물 공급원, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 항체들을 생성할 수 있는 다른 척추동물에서 생성된다. 폴리뉴클레오티드 서열의 적합한 공급원 세포 및 면역글로불린 발현 및 분비를 위한 적합한 숙주 세포는 당업계에 공지된 수많은 공급원으로부터 얻을 수 있다.

또한, 본원에 구체적으로 기재한 인간화 면역글로불린으로서는 당업자에게 공지된 다양한 재조합 DNA 기술을 통해 기타의 "실질적 상동성"이도록 변형된 면역글로불린을 쉽게 고안하고 제조할 수 있다. 예를 들면, 프레임워크 영역은 여러 아미노산 치환, 말단 및 중간에서의 첨가 및 결실 등에 의해 1차 구조 수준에서의 천연 서열이 달라질 수 있다. 또한, 각종 상이한 인간 프레임워크 영역을 단독으로 또는 본 발명의 인간화 면역글로불린을 기초로 조합하여 사용할 수 있다. 일반적으로, 유전자 변형은 부위-지정 돌연변이유발법 등과 같은 다양한 공지된 기술에 의해 쉽게 달성될 수 있다.

별법으로, 1종 이상의 면역글로불린 활성 (예를 들어, 보체 고정 활성)을 보 유하고 1차 항체 구조의 일부만을 포함하는 폴리펩티드 단편을 생성할 수 있다. 이들 폴리펩티드 단편은 당업계에 공지된 방법을 통한 무손상 항체의 단백질분해성 절단에 의해 생성하거나, 부위-지정 돌연변이유발법을 통해 벡터 내 원하는 위치에 중지 코돈을 삽입함으로써 생성할 수 있으며, 예를 들어 CH1 이후에 삽입하여 F_ab 단편을 생성하거나 힌지 영역 다음에 삽입하여 F_(ab')2 단편을 생성할 수 있다. 단쇄 항체는 VL과 VH를 DNA 링커로 연결하여 생성할 수 있다.

상술한 바와 같이, 코딩 뉴클레오티드 서열은 상기 서열이 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 (즉, 발현 조절 서열의 기능 수행을 보장하도록 연결된) 후에 숙주에서 발현될 것이다. 이들 발현 벡터는 전형적으로 숙주 유기체 내부에서 에피솜으로서 또는 숙주 염색체 DNA의 통합된 일부로서 복제될 수 있다. 통상적으로, 발현 벡터는 테트라사이클린 또는 네오마이신 등에 대한 선택 마커를 함유하여 원하는 DNA 서열로 형질전환된 세포를 검출할 수 있다.

대장균은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 클로닝에 특히 유용한 원핵 숙주이다. 이용에 적합한 다른 미생물 숙주로는 바실러스, 예를 들어 고초균 (Bacillus subtilus) 및 기타의 장내세균, 예를 들어 살모넬라 (Salmonella), 세라티아 (Serratia) 및 각종 슈도모나스 (Pseudomonas) 종 등이 있다. 이들 원핵 숙주에서, 전형적으로 숙주 세포와 상용가능한 발현 조절 서열 (예를 들어, 복제 기점)을 함유하는 발현 벡터를 제작할 수도 있다. 또한, 임의의 수많은 공지된 프로모터가 있을 수 있으며, 예를 들어 락토스 프로모터 시스템, 트립토판 (trp) 프로모터 시 스템, 베타-락타마제 프로모터 시스템 또는 파지 람다로부터의 프로모터 시스템 등이 있다. 전형적으로, 상기 프로모터들은 경우에 따라 오퍼레이터 서열을 이용하여 발현을 조절할 것이며, 전사 및 번역의 개시 및 종결을 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 보유할 것이다.

또한, 발현을 위해 효모 등의 다른 미생물을 사용할 수도 있다. 바람직한 숙주는 사카로마이세스 (Saccharomyces)이며, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소 등과 관련한 프로모터 등의 발현 조절 서열 및 원한다면 복제 기점, 종료 서열 등을 보유하는 적합한 벡터를 사용한다.

또한, 미생물로서는 포유동물 조직 세포 배양물을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 발현하고 생성할 수 있다. CHO 세포주, 각종 COS 세포주, 시리안 햄스터 난소 세포주, HeLa 세포 등과 같이 무손상 면역글로불린을 분비할 수 있는 수많은 적합한 숙주 세포주가 당업계에 개발되어 있기 때문에 진핵 세포가 실제로 바람직하며, 이 중 바람직한 것은 골수종 세포주, 형질전환된 B-세포, 인간 배 신장 세포주 또는 하이브리도마이다. 이들 세포를 위한 발현 벡터로는 발현 조절 서열, 예를 들어 복제 기점, 프로모터, 인핸서 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예를 들어 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이싱 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 터미네이터 서열 등이 있을 수 있다. 바람직한 발현 조절 서열은 면역글로불린 유전자, SV40, 아데노바이러스, 소유두종 바이러스, 시토메갈로바이러스 등에서 유도한 프로모터이다.

관심 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 중쇄 및 경쇄 코딩 서열 및 발현 조절 서열)을 함유하는 벡터를 공지된 방법을 통해 숙주 세포로 이동시킬 수 있으며, 이때의 방법은 숙주 세포의 유형에 따라 달라진다. 예를 들면, 원핵 세포에 대해서는 통상적으로 염화칼슘 형질감염법을 사용하지만, 다른 세포의 숙주에 대해서는 인산칼슘 처리법 또는 전기천공법을 사용할 수 있다.

일단 발현되면, 온전한 항체, 이들의 2량체, 개별적 경쇄 및 중쇄 또는 본 발명의 다른 면역글로불린 형태는 황산암모늄 침전법, 이온 교환, 친화성, 역상, 소수성 상호작용 컬럼 크로마토그래피법, 겔 전기영동법 등을 포함하는 당업계의 표준 절차에 따라 정제할 수 있다. 제약상 사용하기 위해서는, 약 90 내지 95％ 이상 균질한 질적으로 순수한 면역글로불린이 바람직하고, 98 내지 99％ 이상 균질한 실질적으로 순수한 면역글로불린이 가장 바람직하다. 일단 부분적으로 또는 원하는 균질성이 얻어질 때까지 정제되면, 본원에서 지시한 바와 같이 상기 폴리펩티드를 치유적 또는 예방적으로 사용할 수 있다.

상기 항체 (면역학적으로 반응성인 단편을 포함함)는 Aβ-관련 증상 또는 병리, 예를 들어 임상적 또는 전임상적 알쯔하이머병, 다운증후군 또는 임상적 또는 전임상적 아밀로이드 혈관병증의 위험이 있거나 이를 나타내는 피험체에게 표준 투여 기술을 사용하여, 정맥내, 복강내, 피하, 폐, 경피, 근육내, 비내, 협측(頰側), 설하(舌下) 또는 좌제 투여에 의해 바람직하게는 말초에 (즉, 중추신경계에 투여하지 않음) 투여한다. 항체를 심실계, 척수액 또는 뇌 실질에 직접 투여할 수 있고 이들 위치로 지시하기 위한 기술이 당업계에 공지되어 있지만, 이러한 보다 복잡한 절차를 이용할 필요가 없다. 본 발명의 항체는 말초 순환계에 의존하는 보다 간단 한 기술로 투여되는 경우에 효과적이다. 본 발명의 잇점은 중추신경계 자체에 직접 제공되지 않는다 해도 그의 유익한 효과를 발휘할 수 있는 능력을 포함한다. 사실, 본원에서는 혈뇌장벽을 통과하는 항체의 양은 혈장 수준의 0.1％ 미만이며 본 발명의 항체가 말초 순환 중에 있는 Aβ를 격리시킬 뿐 아니라 CNS 및 혈장의 가용성 Aβ를 제거할 수 있는 능력을 발휘할 수 있음을 입증하였다.

투여용 제약 조성물은 선택된 투여 방식에 적당하게 고안되고, 적당하다면, 제약상 허용가능한 부형제, 예를 들어 분산제, 완충액, 계면활성제, 방부제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등이 사용된다. 본원에 참고로 도입되는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA, latest edition]은 의사들에게 통상적으로 공지된 바와 같은 제제 기술들의 요약서를 제공한다. 본 발명의 항체의 가용성 특징을 변경시켜, 예를 들어 본 발명의 항체들을 리포좀 내에 캡슐화하거나 극성기를 블록킹함으로써 이들을 더욱 친지성으로 만드는 것이 특히 유용할 수 있다.

정맥내 또는 복강내 또는 피하 주사에 의한 전신적 말초 전달이 바람직하다. 상기 주사에 적합한 비히클은 간단하다. 그러나, 투여는 또한 비내 에어로졸제 또는 좌제에 의해 점막을 통해 효과를 발휘할 수 있다. 상기 투여 방식에 적합한 제제는 공지되어 있고, 전형적으로 막을 통과한 이동을 용이하게 하는 계면활성제를 포함한다. 이러한 계면활성제는 종종 스테로이드에서 유도된 것이거나 양이온성 지질, 예를 들어 N-[1-(2,3-디올레오일)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드 (DOTMA) 또는 각종 화합물, 예를 들어 콜레스테롤 헤미숙시네이트, 포스파티딜 글 리세롤 등이다.

제제 중 인간화 항체의 농도는 약 0.1 중량％ 내지 15 또는 20 중량％이고, 이는 우선적으로 선택된 특정 투여 방식에 맞춰 유액 부피, 점도 등을 토대로 선택될 것이다. 그러므로, 전형적인 주사용 제약 조성물은 인산염 완충 염수의 멸균 완충수 1 ㎖ 및 본 발명의 인간화 항체 1 내지 100 mg을 함유하도록 구성될 수 있다. 상기 제제는 제제를 제조한 후에 멸균 여과하거나 미생물학적으로 허용가능하게 만든다. 정맥내 주입용으로 전형적인 조성물의 부피는 유액, 예를 들어 멸균 링거 용액 250 ㎖일 수 있고, 1 ㎖ 당 항체 농도가 1 내지 100 mg 이상일 수 있다. 본 발명의 치료제는 냉동시키거나 동결건조시킨 상태로 저장해 두었다가 사용전에 적합한 멸균 담체 중에서 재구성할 수 있다. 동결건조 및 재구성은 다양한 정도의 항체 활성 손실을 초래할 수 있다 (예를 들면, 통상적인 면역 글로불린을 사용할 경우, IgM 항체가 IgG 항체 보다 활성 손실이 더 큰 경향이 있음). 투여량을 조정하여 보충해야 한다. 제제의 pH는 항체 안정성 (화학적 및 물리적 안정성)의 균형을 맞추고 투여되는 환자에게 적절하도록 선택될 것이다. 일반적으로, pH 4 와 pH 8 사이가 허용된다.

전술한 방법들이 단백질, 예를 들어 인간화 항체의 투여에 가장 편리하고 가장 적당한 것으로 여겨지지만, 경피 투여 및 경구 투여 등의 투여를 위한 다른 기술들을 적절하게 변형시켜 이용하여, 적당한 제제를 고안할 수 있다.

또한, 덱스트란 비드, 알긴산염 또는 콜라겐 기재의 생분해성 필름 및 매트릭스 또는 삼투성 미니-펌프 또는 전달 시스템을 사용한 제어 방출 제제를 이용하 는 것이 바람직할 수 있다.

요약하면, 본 발명의 항체를 투여하기 위한 제제가 시판되고 있고, 상기 제제는 당업자에게 공지되어 있어서 선택할 수 있는 범위가 넓다.

전형적인 투여량 수준은 표준 임상적 기술을 사용하여 최적화될 수 있으며, 투여 방식 및 환자의 상태에 따라 달라질 것이다.

하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위함이며, 본 발명을 제한하지 않는다.

하기의 실시예는 무엇보다도 본래 인간 Aβ 펩티드의 잔기 13 내지 28로 구성된, "266"이라 지칭되는 펩티드를 사용한 면역화를 통해 제조한 쥐과 모노클로날 항체를 이용했다. 상기 항체는 이 펩티드와 면역반응을 하는 것으로 확인되었지만, 기존에는 인간 Aβ 펩티드의 잔기 17 내지 28만을 함유하거나, Aβ 펩티드 내의 임의의 다른 에피토프를 함유하는 펩티드와는 반응하지 않는 것으로 보고된 바 있다. 이러한 항체의 제조법은 미국 특허 제5,766,846호에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본원에 참고로 도입된다. 본원의 실시예는 쥐과 시스템에서 수행한 실험들을 기재한 것이기 때문에, 쥐과 모노클로날 항체를 사용하는 것이 만족스럽다. 그러나, 본 발명을 인간에 사용하는 치료 방법에서, 항체 266의 면역특이성에 상응하는 면역특이성을 나타내는 항체의 인간화 형태가 바람직하다.

실시예 1: 첨가된 Aβ 펩티드의 인간 유액 내 격리

인간 뇌척수액 (CSF) 샘플 (50 ㎕) 및 인간 혈장 (50 ㎕)을 다음과 같이 실온에서 인큐베이션했다:

1. 단독 인큐베이션;

2. Aβ₄₀ 펩티드 5 ng와 함께 인큐베이션; 또는

3. Aβ₄₀ 펩티드 5 ng + 모노클로날 항체 266 1 mg (예를 들어, 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제5,766,846호에 기재되어 있음).

이어서, 상기 샘플을 4 내지 25％ 비변성 구배 겔 상에서 전기영동, 즉, 비변성 구배 전기영동 (NDGGE)시키고 니트로셀룰로스로 이동시켰다. 이어서, 상기 블롯들을 폰슈-에스 (Ponceau-S)로 염색하거나, 웨스턴 블롯을 위해 Aβ 펩티드의 처음 5개 아미노산에 대해 지시된 비오틴-표지된 모노클로날 항체 (3D6)로 프로빙하고, 스트렙타비딘-호스 래디쉬 퍼옥시다제로 현상 (development)시키고 고감도 화학발광기 (enhanced chemiluminescence (ECL))로 검출했다. 블롯에 있는 밴드 내에 함유된 물질의 수화된 직경을 파르마샤 (Pharmacia)의 분자량 마커를 사용하여 추정했다. 그러므로, Aβ 펩티드가 다른 분자에 결합하는 경우, 생성된 복합체의 크기로 이동할 것이다.

Aβ 펩티드 5 ng을 사용하거나 Aβ 펩티드를 사용하지 않은 CSF의 웨스턴 블롯은 Aβ 펩티드가 항체 3D6으로 매개된 검출에 반응한다는 증거를 나타내지 않았다. Aβ 펩티드는 SDS-PAGE을 수행한 후에 동일한 기술을 사용하고 동일한 CSF 샘플에 대해 수행한 웨스턴 블롯팅을 통해 검출될 수 있다는 사실에도 불구하고, 인간 혈장에서도 유사한 결과가 얻어졌다. Aβ 펩티드의 검출은 이 펩티드와 시험된 유액 내 다른 인자들과의 상호작용에 의해 저해된 것으로 추측된다. 그러나, Mab 266을 상기 인큐베이션물에 첨가하는 경우에는 항체와 복합체를 형성한 격리된 Aβ 펩티드를 나타내는 특징적인 밴드가 혈장 및 CSF 모두에 존재했다. 항체 단량체에 상응하는 주 밴드는 수화된 직경이 대략 11 nm이며, 항체 2량체에 상응하는 또하나의 더 소량의 밴드는 13 nm였다.

실시예 2: 격리 항체의 특이성

인간 CSF 50㎕ 또는 APP^V717F CSF 10 ㎕를 함유하는 샘플을 사용했다. APP^V717F 는 유전적인 알쯔하이머병 돌연변이가 있는 인간 아밀로이드 전구체 단백질 트랜스진이 발현되어 중추신경계 내에 인간 Aβ 펩티드를 생성하는 알쯔하이머병의 마우스 모델을 대표하는 트랜스제닉 마우스이다.

실시예 1에 기재한 바와 같이, 상기 샘플들을 각종 Mab (1 ㎍)와 함께 또는 이러한 Mab 없이 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시킨 후에, 4 내지 25％ NDGGE상에서 전기영동하고 니트로셀룰로스로 블롯팅했다. 상기 항체들은 다음과 같다:

Mab 266 (위치 13 내지 28에 결합하는 항체),

Mab 4G8 (위치 17 내지 24에 결합하는 항체),

QCBpan (위치 1 내지 40에 대한 토끼 폴리클로날 항체),

마우스 IgG (비특이적 항체),

Mab 3D6 (위치 1 내지 5에 결합하는 항체),

Mab 21F12 (위치 33 내지 42에 결합하는 항체),

Mab 6E10 (위치 1 내지 17에 결합하는 항체) 및

QCB₄₀, ₄₂ (Aβ₄₀ 및 Aβ₄₂에 대한 토끼 폴리클로날 항체).

실시예 1에 기재한 바와 같이, 비오틴 표지된 3D6 (Aβ 펩티드 N-말단에 대한 것임)으로 Aβ 펩티드 항체 복합체를 검출한 후에, 스트렙타비딘-HRP 및 ECL을 수행했다. 몇몇 예에서는 3D6를 Aβ 펩티드의 카르복실 말단에 결합하는 QCB₄₀, ₄₂로 대체하여 Mab 266과 함께 인간 CSF에서 인큐베이션시켜 유사하게 검출했다.

이 결과, 시험된 항체 중 오직 Mab 4G8 및 Mab 266만이 Aβ 펩티드의 검출을 허용하는 것으로 나타났다.

이러한 결과는 인간 CSF에서는 오직 Mab 266 및 Mab 4G8만이 항체 Aβ 복합체를 검출가능한 양으로 격리시킬 수 있음을 나타낸다 (다시, 임의의 항체가 없다면, Aβ가 검출되지 않음). 또한, Mab 266은 APP^V717F 트랜스제닉 마우스로부터의 CSF를 사용한 경우에도 인간 CSF를 사용하여 얻은 것과 유사한 결과를 낼 수 있다. 웨스턴 블롯의 현상에 3D6 또는 QCB_{40, 42} 항체를 사용했는지의 여부과 관계없이, Mab 266을 사용하면 인간 CSF에서 Aβ 펩티드를 격리시킬 수 있다.

실시예 3: 2차원적 전기영동에 의한, Aβ 펩티드-266 복합체의 입증

Aβ₄₀ 펩티드 50 ng을 함유하는 샘플을 Mab 266 2 ㎍과 함께 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션했다. Mab 266을 단독으로 사용한 상응하는 인큐베이션물을 대조군으로 사용했다.

이어서, 샘플들을 2-차원적 겔 전기영동시켰다.

제1차원 겔 전기영동에서, 실시예 1에 기재한 바와 같이 인큐베이션된 샘플들을 NDGGE시켰다. 이어서, 폴리아크릴아미드 겔을 제1차원의 진행 방향에 수직인 개개의 레인별로 절단하고, SDS-PAGE (트리신 우레아 겔)에 의한 변성/환원 조건하에 제2차원에서 겔을 분리했다. 폰슈-에스 염색법 (임의의 단백질) 또는 HRP-기재의 검출 시스템에서 6E10 Mab (세네테크, 인크. (Senetek, Inc.) 제품) 및 비오티닐화된 항-마우스 Aβ를 사용한 특이적인 현상법에 의해 밴드의 존재를 검출했다.

니트로셀룰로스로 이동시킨 블롯을 폰슈-에스 염색하여 Mab 266만의 중쇄 및 경쇄를 가시화했다. Aβ 펩티드는 제1차원의 NDGGE 후에 나타난 전장 Mab 266의 크기에 맞춰 정렬된 Mab 266과의 복합체에서 4 kD의 밴드로 관찰되었다.

실시예 4: 결합 및 격리의 비등가성 증명

Aβ 펩티드는 혈장 및 CSF 내에서 순환하기 때문에 아포지단백질 E (apolipoprotein E)를 포함하는 단백질과의 복합체에 함유된 것으로 여겨진다. 본 실시예는 apoE에 대한 항체가 상기 복합체에 결합할 수는 있지만, apoE를 상기 복합체의 나머지 부분으로부터 격리시키지 못한다는 것을 입증한다.

apoE 복합체 (500 ng)를 apoE에 대한 Mab 또는 폴리클로날 항체 (2 ㎍)와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 이어서, 상기 실시예 1에 기재한 기술을 사용하여 인큐베이션된 샘플을 NDGGE시켰다. NDGGE 이후에, 친화성 정제된 염소 항-apoE 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하고 ECL로 검출했다. 항체가 존재하지 않을 경우, apoE는 이의 지단백질 입자들의 존재와 일치하는 8 내지 13 nm로 검출될 수 있다. apoE에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 존재로 인해, 더 대형인 분자 종으로 apoE가 집단 쉬프트되었다 ("수퍼 쉬프트 (shift)"). 이는 apoE에 대한 상기 항체가 apoE를 격리, 즉, 지단백질 입자로부터 apoE를 제거하지 못하고, 지단백질 상에서 apoE에 결합하여 더 대형인 분자 종을 생성한다는 것을 입증하는 것이다.

실시예 5: 항-apoE 항체에 의해 교란되지 않는, Aβ의 격리

인간 CSF의 샘플 100 ㎕을 Mab 266과 함께 또는 폴리클로날 항-apoE과 함께 또는 상기 2종의 항체 모두와 함께 60분 동안 37℃에서 인큐베이션했다. 이어서, 실시예 1에 기재한 바와 같이 상기 샘플들을 NDGGE로 분석하고, 실시예 1에 기재한 바와 같이 밴드를 검출했다.

이 결과, Mab 266을 상기 샘플에 첨가한 경우에는 격리된 266-Aβ 펩티드 복합체에 특징적인 대략 11 nm 직경의 밴드가 가시화 되는 것으로 나타났다. 이는 항-apoE가 존재하거나 존재하지 않는 경우의 결과이다. 격리된 Aβ를 입증하는 이 밴드들은 Aβ 펩티드 50 ng를 Mab 266이 존재하는 상기 인큐베이션 혼합물에 첨가한 경우에도 나타났다. 그러므로, 항-apoE 항체의 존재에 의한 apoE의 분자량 변경은 Mab 266에 의한 Aβ 펩티드의 격리를 방해하지 않는다.

실시예 6: Aβ펩티드의 생체내 격리

A. PDAPP 마우스라고도 지칭되는 트랜스제닉 APP^V717F 마우스는 인간 APP 단백질의 돌연변이체 형태를 과다발현한다. 이들 마우스는 CNS에서 인간 Aβ를 생성하고 CSF 및 혈장 중에서 순환하는 인간 Aβ 펩티드의 수준이 증가된다. 8개월 된 마우스에 염수 또는 Mab 266 100 ㎍을 정맥내 주사했다. 이들 마우스에게 처음 주사한지 10분 후에 먹이를 주었고, 처음 주사한지 20시간 후에 다시 먹이를 주었다.

실시예 1에 기재한 바와 같이, 각 동물의 혈장 20 ㎕를 함유하는 샘플을 NDGGE로 분석하였고, 항체 3D6을 사용하여 웨스턴 블롯팅했다. 염수를 주사한 동물들에서는 10분 또는 20시간 후에 격리된 Aβ 펩티드에 특징적인 11 nm의 밴드가 존재하지 않았다. 그러나, Mab 266을 주사한 2마리 동물들은 20시간 후에 이 밴드가 나타나지 않았다.

B. 2개월 된 APP^V717F 마우스를 이 연구에 사용했다. 제0일에, 마우스에게 Mab 266을 주사하지 않거나 Mab 266 1 mg를 주사하거나 이 항체 100 ㎍을 주사했다. 항체를 투여하기 2일 전, 항체를 투여한 제1일, 제3일, 제5일 및 제7일에 혈장 샘플을 취했다. 실시예 1에 기재한 바와 같이, 상기 혈장 샘플들로 NDGGE를 수행한 후에 웨스턴 블롯팅을 수행하여 3D6를 검출했다. 혈장 샘플에 면역글로불린과 결합하여 Mab 266을 효과적으로 제거하는 단백질 G를 처치하지 않은 경우에는, Mab 266을 투여한 후의 모든 시점에서 266/Aβ 복합체가 검출되었다. 제7일에 Mab 266 100 ㎍을 주사한 동물에서 약간의 드롭오프가 일어났다는 점을 제외하면, 복합체 수준은 시험 기간에 걸쳐 일관되었다; 일반적으로, 100 ㎍을 투여한 동물에서의 상기 수준은 이 항체 1 mg을 투여한 마우스에서 관측되는 것보다 일관되게 더 낮았다.

C. 2마리의 2개월 된 APP^V717F 마우스에 Mab 266 1 mg을 정맥내 투여하고 각각 으로부터 혈장 샘플 25 ㎕씩을 취하였다. 상기 혈장 샘플로 NDGGE를 수행한 후에, 비오티닐화된 3D6과 결합시킨 후에 스트렙타비딘 ¹²⁵I (아머샴 (Amersham) 제품)을 사용하여 검출하고 포스포르이미지 스크린에 노출시켰다는 점을 제외하고는 상기 기재한 바와 같이 웨스턴 블롯팅을 수행했다. 복합체의 수준은 Mab 266의 포화 수준과 복합체를 형성한 공지된 양의 Aβ₄₀를 사용한 표준 곡선과 비교하여 추정하고 유사하게 검출했다. Mab 266과 결합한 Aβ 펩티드의 양은 대략 100 ng/㎖로 추정되며, 이는 이들 마우스에 내인성 Aβ 펩티드를 처치하여 약 100 pg/㎖로 측정되었던 경우에 비해 대략 1,000배 증가한 것이었다. 또한, 이는 Aβ 침착 전의 APP^V717F 뇌에서의 Aβ 펩티드 수준 (50 내지 100 ng/g)과 유사했다. APP^V717F Tg 마우스에서 인간 APP 및 인간 Aβ는 거의 독점적으로 뇌에서 생성된다. 그러므로, 혈장 중 Mab 266의 존재는 CNS로부터 혈장으로의 Aβ 펩티드의 순 유출을 용이하게 하는 Aβ 펩티드 싱크로서 작용하는 것으로 여겨진다. 이러한 순 유출 증가는 CNS로부터 혈장으로의 Aβ 유출 증가 및 혈장 중의 Aβ가 뇌로 다시 들어가는 것을 저해하는 것 모두로부터 초래된 것이라 여겨진다.

Mab 266 1 mg을 주사한 APP^V7l7F 마우스에서 주사 24시간 후에 얻은 혈장 샘플 20 ㎕을 트리스-트리신 SDS-PAGE 겔에서 운행한 후에, 단백질 G와 결합한 비드를 사용한 단백질 G에의 노출 전 또는 후에 항-Aβ 항체 6E10을 사용한 웨스턴 블롯팅을 수행하여 격리된 Aβ 펩티드의 정확한 크기를 확인했다. 단백질 G에 의해 결핍 된 밴드는 4 내지 8 kD인 것으로 검출되었고, 이는 Aβ 펩티드 단량체 및 가능하게는 2량체의 존재와 일치하는 것이었다.

D. 2개월 된 APP^V717F 마우스에 PBS (n = 7) 또는 비오티닐화된 Mab 266 -즉, m266B (n = 9) 500 ㎍을 복강내 처치했다. 문헌 [Johnson-Wood, K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:1550-1555] 및 문헌 [Bales, K. R., et al., Nature Genet (1997) 17:263-264]의 ELISA 방법의 변형법을 사용하여 주사하기 전 및 주사한지 24시간 후 모두의 혈장에서 전체 Aβ 펩티드에 대해 분석했다. m266B에 결합된 전체 Aβ를 m3D6으로 코팅한 96-웰 옵티플레이트 (Optiplate) (패커드, 인크 (Packard, Inc.) 제품)를 사용하여 측정했다. 희석시킨 혈장 샘플 및 표준물 (Aβ₄₀ 및 m266B의 농도는 다양함)을 상기 코팅된 플레이트에서 밤새 인큐베이션하고, ¹²⁵I-스트렙타비딘을 사용하여 전체 Aβ/m266B 복합체의 양을 측정했다. 또한, 제24시간의 시점에서 상기 혈장 샘플에 먼저 단백질 G를 처치하고 ELISA를 통해 CSF 중 Mab 266에 결합하지 않은 Aβ 펩티드 및 Aβ_Total 및 Aβ₄₂를 정량했다. PBS를 주사한 동물에서, 혈장 Aβ 펩티드 수준은 주사 전 및 주사 후 모두의 경우에 140 pg/㎖였다. Mab 266을 주사한 마우스에서의 혈장 수준은 주사 전과 유사했으나, Mab 266와 결합하지 않은 Aβ 펩티드 수준은 주사한지 24시간 후에 검출가능하지 않았다.

또한, CSF 중의 수준을 측정하였다 (CSF는 CNS 내 세포외 구획을 대표하며, CSF 중 분자들의 농도는 뇌의 세포외 공간에 있는 물질들의 농도를 어느 정도 반영함). 대조(大槽) (cisterna magna) 구획으로부터 CSF를 단리했다. 펜토바르비탈을 사용하여 마우스를 마취하고, 두개의 기조부로부터 제1 척추골까지의 근조직을 제거했다. 해부 현미경하에서 미세 바늘을 사용하여 상기 조(槽) (cistern)를 덮은 거미막에 조심스럽게 구멍을 뚫어 CSF를 폴리프로필렌 마이크로피펫으로 빨아들여 CSF를 수집했다. 주사한지 24시간 후에, Mab 266을 주사한 마우스의 CSF에서 전체 Aβ 펩티드가 증가한다는 것이 밝혀졌으며, PBS를 주사한 마우스에 비해 CSF 중 Aβ₄₂가 대략 2배 증가했다. 변성 겔 전기영동을 수행한 후에 Aβ₄₂-특이적인 항체 21P12를 사용한 웨스턴 블롯팅을 통해 이를 확인했다.

추가의 실험에서, 3개월 된 APP^V717F Tg 마우스에 PBS 또는 Mab 266을 정맥내 주사하고, CSF 중 Aβ₄₀ 및 Aβ₄₂ 모두의 수준을 하기와 같이 평가했다:

Aβ₄₀를 측정하기 위해서, Aβ₄₀에 특이적인 모노클로날 항체 m2G3를 이용했다. 문헌 [Johnson-Wood, K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:1550-1555]에 기재된 ELISA법에서 스트렙타비딘-HRP 시약을 ¹²⁵I-스트렙타비딘으로 대체함으로써 상기 방법을 RIA로 변형시켰다. 혈장 및 CSF 샘플의 경우에는 상기 절차를 완충액 중에 구아니딘이 없는 비변성 조건하에서 수행했다. 뇌 균질화물에서 탄산염 가용성 Aβ 및 불용성 Aβ를 평가하기 위해서, 샘플들을 100 mM 탄산염, 40 mM NaCl, pH 11.5 (4℃)과 함께 균질화하고, 10,000 ×g로 15분 동안 회 전시키고, 문헌 [Johnson-Wood, K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:1550-1555] 및 상기에서 기재한 바와 같이, 상층액 (가용성) 및 펠렛 (불용성) 분획 중에서 Aβ를 평가했다. 변형된 RIA법을 사용하여 혈장 중 Aβ/Mab 266 복합체를 측정했다. 마우스에게 비오티닐화된 Mab 266 (Mab 266B)를 주사하고 여러 시점에서 혈장을 단리했다. Mab 266에 결합한 전체 Aβ를 m3D6으로 코팅한 96-웰 옵티플레이트 (패커드, 인크 제품)로 측정했다. 희석시킨 혈장 샘플 및 표준물 (Aβ₄₀ 및 Mab 266B의 농도는 다양함)을 상기 코팅된 플레이트에서 밤새 인큐베이션하고, ¹²⁵I-스트렙타비딘을 사용하여 전체 Aβ/Mab 266B 복합체의 양을 측정했다.

Mab 266을 정맥내 주사한지 3시간 후에, CSF 중 Aβ₄₀의 수준은 2배 증가했고, Aβ₄₂는 유의한 수준으로 증가하지 않았다. 그러나, 제24시간 및 제72시간 모두에서 CSF 중 Aβ₄₀ 및 Aβ₄₂ 모두가 2 내지 3배 증가했다. 풀링한 CSF를 사용하여 변성 겔 분석법을 수행한 후에 Aβ 웨스턴 블롯팅한 경우에도 유사한 결과가 얻어졌다. 뇌 간질액을 통한 Aβ의 유출 (CSF 수준을 통해 어느 정도 반영됨)이 CSF에서 관찰된 Aβ의 증가를 설명하는 것으로 여겨진다. .

주사 후 제24시간에 측정된 수준 (Mab 266의 0.1％ 혈장 수준 미만)은 이러한 변화를 설명하기에는 불충분하기 때문에, CSF Aβ 펩티드 수준의 변화가 Mab 266의 CSF로의 도입에 기인한 것일 수 없다고 생각된다. 이러한 결과들은 혈류 내 항체의 존재로 인해 Aβ 펩티드가 뇌 실질로부터 CSF로 회수되었음을 암시한다.

PBS 또는 탄산염 완충액에 가용성인 형태의 Aβ 펩티드를 Mab 266을 주사한 것과 동일한 마우스의 대뇌 피질에서 측정하였고, 이의 CSF를 상기 기재한 바와 같이 분석했다. 피질 균질화물에서 이들 가용성 형태들의 증가는 유사한 것으로 관찰되었다.

실시예 7: 시험관내 Aβ 펩티드 싱크로서 작용하는 Mab 266

Mab 266이 Aβ 펩티드에 대한 싱크로서 작용하는 능력을 시험하기 위한 시험관내 시스템으로서 투석 챔버를 구축했다. 폴리프로필렌 튜브로 이루어진 상부 챔버에 인간 CSF 1 ㎖을 넣었고, 하부 챔버는 PBS 75 ㎕를 함유하며 Mab 266 1 ㎍가 있거나 없으며, 상기 상부 챔버와 하부 챔버는 구체적인 컷오프가 10 내지 100 kD의 범위에 있는 투석막을 통해 서로 분리시켰다.

하부 챔버에 있는 물질을 산 우레아 겔에 적용한 후에 각종 시점에서 6E10를 사용하여 Aβ 펩티드에 대한 웨스턴 블롯팅을 수행함으로써 평형을 측정하여, 평형은 3시간 후에 도달되는 것으로 여겨졌다. 샘플들을 포름산 중에서 최종 농도 80％ (vol/vol)로 변성시키고 β-메르캅토에탄올 (1％)을 사용하여 환원시켰다. 샘플을 0.9 M 아세트산 운전 완충액 중에서 6 M 우레아, 5％ (vol/vol) 빙초산 및 2.5％ TEMED를 함유하는 4％ 내지 35％ 폴리아크릴아미드 구배 겔을 통해 전기영동 (애노드에서 캐소드로)시켰다. 겔의 산성 pH를 중화시킨 후에 니트로셀룰로스로 이동시켰다. 이어서, 표준 웨스턴 블롯팅 기술을 사용하여 Aβ를 확인했다. 검출된 밴드들은 4 kD에 상응했다.

이에 따라, 3시간 후에 상부 챔버로부터 제거된 Aβ의 양을 ELISA 분석법을 통해 상부 및 하부 챔버 모두에서 측정했다 (n=4). Mab 266의 존재 및 부재하에 각종 분자량 컷오프에 대한 결과를 도 1에 나타냈다. 나타난 바와 같이, 하부 챔버에 PBS가 있는 경우에는 최소량의 Aβ 펩티드만이 막을 통과했고, Mab 266이 존재하는 경우에는 분자량 컷오프가 25 kD일 때 하부 챔버에 있는 Aβ 펩티드의 50％가 격리되었다. 분자량 컷오프가 100 kD로 증가함에 따라 통과하는 양도 증가하여, 이 경우에는 거의 100％의 Aβ 펩티드가 막을 통과하였다.

또한, 실시예 1에 기재한 분석법에서는 Aβ 펩티드를 격리시키지 못했지만, 이 시스템에서는 항-N-말단 Aβ 항체 3D6 및 10D5가 막을 통해 Aβ 펩티드를 끌어당길 수 있는 것으로 관찰되었다. 이들 결과는 Aβ 펩티드에 대한 항체가 생리 용액 중에서 상기 펩티드를 다른 결합 단백질들로부터 격리시키는 조건 하에서는 충분한 친화성을 갖지만, 위치 13 내지 28의 에피토프와 면역반응성인 266 등과 같은 Mab는 실질적으로 더욱 효율적이어서 더 높은 친화성으로 결합한다는 것을 나타낸다.

유사한 분석법에서, 문헌 [DeMattos, R. B., et al., J. Biol. Chem. (1998) 273:4206-4212; Sun, Y., et al., J. Neurosci. (1998) 18:3261-3272]에 기재된 바와 같이 정제한 성상세포가 분비한 apoE4가 하부 챔버에 있는 Aβ 펩티드의 중량 증가에 통계적으로 유의한 효과를 다소 발휘함을 알아냈다. Mab 266 대신 폴리클로날 IgG 또는 BSA를 사용한 경우에는 뚜렷한 효과가 관찰되지 않았다.

실시예 8: CNS로부터 혈장으로의, Aβ펩티드의 이동

A. Aβ₄₀ 1 ㎍을 래트 CSF 1 ㎍ 중에 용해하여 이를 가용성으로 유지한 후에, 이를 PBS (n = 3) 또는 비오티닐화된 Mab 266 (n = 3) 200 ㎍을 미리 IV 주사해 둔 야생형 스위스 웹스터 (Swiss Webster) 마우스 대조(大槽)의 거미막하 공간으로 주사하였다. 처치 후의 상이한 시점에, 마우스 혈장 내의 Aβ_Total을 코팅 항체 및 비오티닐화된 266의 잉여량과 혼합한 Aβ의 표준으로서 3D6을 사용하는 Aβ ELISA를 사용하여 측정하였다. ELISA에서의 Aβ 검출을 위해 각 동물로부터 각 혈장 샘플을 취하여 비오티닐화된 266의 잉여량을 사용하여 스파이크 했다. PBS를 주사한 마우스에서는 30 내지 60분 후에 펩티드의 최고 값이 최소의 검출가능한 양인 0.15 ng/㎖의 수준으로 검출되었고, 이후에는 상기 수준이 본질적으로 0이었다. 그러나, Mab 266을 투여한 마우스에서는 60분 후 혈장 Aβ 펩티드의 수준이 PBS를 주사한 마우스에서 검출된 수준보다 330배 더 높은 수준 (대략 50 ng/㎖)에 이르렀으며, 180분 후에는 대략 90 ng/㎖의 값에 이르렀다.

B. 2개월 된 APP^V717F 마우스에 200 ㎍ (n = 3) 또는 600 ㎍ (n = 3)을 i.v. 주사하여 상기 절차를 반복했다. 3개월 된 APP^V7F+/+ 마우스에 Mab 266을 상기 투여량으로 i.v. 주사하였다. i.v. 주사 전 및 이후의 상이한 시점에서, Mab 266과 결합한 Aβ의 혈장 농도를 RIA로 측정했다. 하나의 예시적인 마우스로부터의 상세한 결과를 도 2에 나타냈다.

모노클로날 항체 Mab 266에 결합한 Aβ의 농도는 기준 수준인 150 pg/㎖에서 4일 후에는 100 ng/㎖을 넘는 수준으로 증가한다는 것이 밝혀졌다. 상기 곡선상에서 초기 시점을 분석하여, 포화 수준의 항체의 존재하에서 APP^V717F Tg 마우스의 혈장으로 Aβ_Total의 순 유입 속도는 42 pg/㎖/분인 것으로 측정되었다.

야생형 및 APP^V7l7F Tg 마우스 모두에서 혈장 Aβ 수준에 미치는 Mab 266의 효과 및 CSF에서의 Aβ 농도에 상기 항체가 미치는 효과는 순환하는 Mab 266의 존재가 CNS와 혈장 사이에서 Aβ의 이동 또는 수송의 평형에 변화를 초래한다는 것을 나타낸다.

실시예 9: 뇌에서 Mab 266이 Aβ에 미치는 효과

4개월 된 APP^V717F+/+ 마우스에 염수, Mab 266 (500 ㎍) 또는 대조군 마우스 IgG (100 ㎍, 파르미겐 (Pharmigen) 제품)를 5개월 동안 2 주마다 i.p. 주사하여 처치했다. 9개월된 상기 마우스들을 희생시켜 피질에서의 Aβ 침착량을 측정했다. 토끼 pan-Aβ 항체 (큐씨비, 인크 (QCB, Inc.) 제품)을 사용하여 확인한 바와 같이, Aβ-면역반응성을 나타내는 영역(％)을 문헌 [Holtzman, D. M., et al., Ann. Neurol. (2000) 97:2892-2897]에 기재된 바와 같이 후방 (dorsal) 해마 바로 위쪽의 피질에서 정량했다. 이 결과를 도 3A에 나타냈다. 이 연령에서, 각 군의 약 절반이 여전히 Aβ 침착이 시작되지 않았다. 그러나, 피질에서 Aβ가 50％ 미만으로 적재된 마우스의 비율(％)은 266을 처치한 군에서 유의하게 더 적었다 (P = 0.02, 카이 제곱 검정). APP^V717F 마우스는 9개월에 걸쳐 다량의 Aβ를 침착시킬 수 있지만, 약 50％는 전혀 침착되지 않는 것으로 나타나고 약 50％는 실질적인 침착을 나타내어 편차가 컸다. PBS 및 IgG를 처치한 동물에서, 6/14 및 5/13 마우스에서 피질의 50％ 초과가 Aβ 염색되었으나, Mab 266을 처치한 경우에는 14마리의 마우스 중 오직 1마리만이 이 수준으로 염색되었다. 모든 군의 동물들의 거의 50％가 9개월의 연령이 된 후에도 여전히 Aβ를 침착시키지 않았는데, 연구된 모든 마우스가 APP^V717F+/+인 것으로 확인되었지만, 교배시킨 마우스 8쌍 중 4쌍에서 태어난 마우스에서만 Aβ 침착이 높은 수준으로 관찰되었기 때문에 (리터 당 병리 수준이 높음), 이는 본 실험군 (cohort)의 각 마우스의 모 기관에 기인하는 것으로 여겨진다. 교배시킨 다른 4쌍의 마우스에서 태어난 마우스는 사실상 Aβ 침착이 없었다 (리터 당 병리 수준이 낮음). 모 기관을 공동 변량(開渠) (co-variate)으로 이용할 때, m266은 Aβ 침착의 감소에 강하고 유의한 효과를 발휘했다 (p = 0.0082, 도 3B).

실시예 10: APP ^V717F Tg 마우스에서 말초 주사된 Mab 266은 플라크에 결합하지 않음

i.p. 주사된 Mab 266이 5개월 후에 뇌에서 Aβ에 결합하였는지 여부를 결정하기 위해서, Aβ 침착물을 함유하며 Mab 266, 염수 또는 대조군 IgG를 처치한 9개월 된 APP^V717F+/+ Tg 마우스의 뇌 절편을 이용했다. 문헌 [Bales, K. R., et al., Nature Genet. (1997) 17:263-264]에 기재되어 있는 바와 같이, 조직 가공 및 면역염색을 수행했다. 모든 군의 동물들로부터의 조직을 플루오레신-표지된 항-마우스 IgG (벡터, 인크. (Vector, Inc.) 제품)와 함께 인큐베이션한 후에 형광 현미경하 에서 조사하였다. 어떠한 군에서도 Aβ 침착에 특이적인 염색은 관찰되지 않았다. 반대로, Mab 266을 상기 절편에 적용한 후에 이를 항-마우스 IgG와 함께 인큐베이션시킨 경우에는 Aβ 침착이 명백하게 검출되었다.

실시예 11: 24개월 된 트랜스제닉 반접합 PDAPP 마우스에서 항체 266의 투여가 인식력에 미치는 효과

16마리의 반접합 트랜스제닉 마우스 (APP^V717F)를 사용했다. 연구를 시작할 때, 마우스들은 대략 24개월 된 것들이었다. 모든 주사는 복강내 (i.p.) 주사로 행하였다. 마우스의 절반에는 매주 인산염 완충 염수 (PBS, "대조군")를 주사했고, 나머지 절반에는 PBS 중에 용해한 마우스 항체 266 500 ㎍을 주사했다. 총 6회의 주사를 7주 (42일)의 기간에 걸쳐 수행했다. 마지막으로 주사하고 3일 후에, 본질적으로 문헌 [J.-C. Dodart, et al., Behavioral Neuroscience, 113 (5) 982-990 (1999)]에 기재된 바와 같이 대상 인식 작업을 통해 동물들의 거동을 평가했다. 인식 지수 (T_B ×100)/(T_B-T_A)를 계산했다. 결과를 하기 표 1에 나타냈다.

인식 지수에 대한 상세한 통계치
		인식 지수 (분)
	N	평균	표준 편차	표준 오차
대조군 (PBS)	8	71.2**	8.80	3.11
항체 266	8	54.35	7.43	2.62
**p = 0.0010

24개월 된 반접합 트랜스제닉 마우스에 매주 항체 266 500 ㎍을 투여하는 것은 거동에서의 유의한 변화와 관련이 있었다. 항체를 처치한 트랜스제닉 마우스의 인식 지수는 야생형 대조군 동물과 유사했다 [J.-C. Dodart, et al]. 인식 지수의 차이는 통계적으로 0.001 확률 수준으로 유의했다. 이러한 인식 지수 증가는 아미노산 13 내지 28의 영역에서 베타-아밀로이드 펩티드에 결합하는 항체의 처치가 알쯔하이머병의 이러한 마우스 모델에서 입증된 거동 장애를 전환시킬 것임을 지시하는 것이다. 그러므로, 아미노산 13 내지 28의 영역에서 베타-아밀로이드 펩티드에 결합하는 항체의 투여가 알쯔하이머병 및 다운증후군과 같은 질환을 치료할 것이고, 전형적으로 질환 진행과 연관된 인식 감퇴를 정지시킬 것이다.

상기 기재한 바와 같이, 아밀로이드 적재율 (항-Aβ 항체 3D6 또는 21F12로 염색한 후에 면역반응성인 물질로 덮인 영역(％))을 7주 동안 마우스 항체 266로 처치한 24개월된 동물들의 뇌로부터 대상 피질 및 두정부 피질 영역을 포함하는 해마 바로 위쪽의 피질에서 정량했다. 이 결과를 하기 표에 나타냈다. 처치 군 사이의 차이는 통계적으로 유의하지 않았다.

마우스 266 항-Aβ 항체를 하기와 같이 처치한 APPV717F+/- 마우스에서 아밀로이드 플라크의 적재율
		플라크 적재율(％)
		3D6을 사용		21F12를 사용
	N	평균	표준 오차	평균	표준 오차
대조군 (PBS)	7	44.3	5.93	0.77	0.14
항체 266	8	38.0	2.96	0.93	0.11

이들 매우 나이든 동물의 경우에는 3D6 또는 21F12를 사용하여 측정했을 때 마우스 항체 266의 처치로 인한 아밀로이드 적재율이 PBS를 처치한 군과 비교하여 유의하게 상이하지 않았다. 또한, Aβ 적재율은 대상 인식 작업에서 새로운 대상 과 친근한 대상을 식별할 수 없는 더 어린 동물에서의 아밀로이드 적재율 (하기 참조)에 비해 실질적으로 더 높고 유의하게 증가되었다. 가장 놀랍게도, 이들 결과는 항-Aβ 항체기 아밀로이드 적재 자체를 감소시킬 필요 없이도 인식 결손을 전환시킬 수 있음을 입증한다.

m266을 처치한 군에서 처치 7주 후의 인식 지수는 24개월 된 마우스의 야생형 실험군의 경우에 예측되는 것보다 유의할 정도로 상이하지는 않았다. 이는 상기 트랜스제닉 동물에서의 인식 감퇴가 완전하게 전환되었음을 지시한다.

실시예 12: 어린 트랜스제닉 반접합 PDAPP 마우스에서 항체 266의 투여가 인식력에 미치는 효과

54마리의 동형접합 트랜스제닉 마우스 (APP^V717F)를 사용했다. 연구를 시작할 때, 23마리의 마우스가 대략 2개월 된 것이었다. 연구를 시작할 때, 나머지 마우스는 대략 4개월 된 것이었다. 처치 기간은 5개월이었다. 그러므로, 연구 종료시에, 상기 마우스들은 대략 7개월 된 것이거나 대략 9개월 된 것이었다.

모든 주사는 복강내 (i.p.) 주사로 행하였다. "PBS" 대조군의 마우스 각각에는 매주 인산염 완충 염수 (PBS; 200 ㎕)를 주사했다. "IgG" 대조군의 마우스 각각에는 매주 IgG1κ1 이소타입 대조군 (100 ㎍/마우스/주)을 주사했다. "고투여량" 군의 마우스 각각에는 PBS 중에 용해한 항체 266 500 ㎍를 매주 주사했다 ("HD"). "저투여량" 군의 마우스 각각에는 PBS 중에 용해한 항체 266 100 ㎍를 매주 주사했다 ("LD"). 상기 실시예 10에 기재한 바와 같이, 마지막으로 주사한지 3 일 후에 대상 인식 작업을 통해 동물들의 거동을 평가하고, 새로운 대상에 대해 지나간 시간과 친근한 대상에 대해 지나간 시간 사이의 차이로서 식별 지수를 계산했다. 결과를 하기 표 3에 나타냈다. 연구가 끝났을 때, 이들 데이타를 마우스 연령에 따라 분류했다.

식별 지수에 대한 상세한 통계치
		식별 지수 (분)
		평균	표준 편차	표준 오차
7개월된 마우스	N
PBS	7	2.12	4.22	1.59
IgG	8	0.81	3.64	1.29
HD	8	10.04*	6.52	2.30
9개월된 마우스
PBS	7	1.87	3.54	1.34
IgG	8	0.96	3.51	1.24
LD	8	10.75*	6.44	2.28
HD	8	12.06***	7.82	2.76
*p < 0.05
***p < 0.0001

이들 데이타를 합하면, Aβ의 중심 도메인에 대해 지시된 항체인 항체 266의 투여가 7 내지 9개월 된 APP^V717F 트랜스제닉 마우스에서 플라크 침착을 감쇠시킬 뿐 아니라 이미 특징지어진 거동 장애까지 전환시킨다는 결론이 지지된다. Aβ 펩티드의 중심 도메인에 대해 지시된 항체를 사용한 환자 치료법은 전형적으로 질환 진행과 연관된 인식 감퇴를 억제 또는 예방하고, 이를 전환시킬 것이다.

처치된 동물에 대한 식별 지수는 동일한 연령의 야생형 마우스에서 예측되는 것과 유의하게 상이했다. 그러므로, 연령이 더 많은 동물에서와 같이 (실시예 11), m266의 처치가 이들 더 어린 트랜스제닉 동물에서의 인식 감퇴를 완벽하게 전환시켰다.

실시예 13: 인간화 항체 266의 합성

세포 및 항체: 마우스 골수종 세포주 Sp2/0를 ATCC (미국 버지니아주 만나사스 소재)로부터 얻어 10％ FBS를 함유하는 DME 배지 (제품 번호; SH32661.03, 미국 유타주 로간에 소재하는 하이클론 (HyClone) 제품) 중에서 37℃ CO₂ 인큐베이터에 유지했다. 먼저, 마우스 266 하이브리도마 세포를 10％ FBS (하이클론 제품), 10 mM HEPES, 2 mM 글루타민, 0.1 mM 불필수 아미노산, 1 mM 피루브산 나트륨, 25 ㎍/㎖ 젠타마이신을 함유하는 RPMI-1640 배지 중에서 성장시킨 후에, 롤러병에 2.5 L 부피로 채운 2％ 저 (low) Ig FBS (제품 번호; 30151.03, 하이클론 제품)를 함유하는 무혈청 배지 (하이브리도마 SFM (Hybridoma SFM), 제품 번호; 12045-076, 미국 매릴랜드주에 소재하는 라이프 테크놀로지스 (Life Technologies) 제품) 중에서 증식시켰다. 마우스 모노클로날 항체 266 (Mu266)을 단백질-G 세파로스 컬럼을 사용한 친화성 크로마토그래피를 통해 상기 배양물 상층액으로부터 정제했다. EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC 비오틴 (제품 번호; 21338ZZ, 미국 일리노이주 록크포드에 소재하는 피어스 (Pierce) 제품)을 사용하여 비오티닐화된 Mu266을 제조했다.

가변 영역 cDNAs의 클로닝: 대략 10⁷개의 하이브리도마 세포로부터의 RNA 전체를 폴리ATract mRNA 단리 시스템 (미국 위스콘신주 매디슨에 소재하는 프로메가 (Promega) 제품)을 사용하여 제공업자의 프로토콜에 따라 TRIzol 시약 (라이프 테 크놀로지스 제품) 및 폴리 (A)⁺RNA를 사용하여 추출했다. SMART^TMRACE cDNA 증폭 키트 (미국 캘리포니아주 팔로 알토에 소재하는 클론테크 (Clontech) 제품)를 공급업자의 프로토콜에 따라 사용하여 이중 가닥 cDNA를 합성했다. 마우스 카파 및 감마 쇄 불변 영역 각각에 어닐링하는 3' 프라이머 및 SMART^TMRACE cDNA 증폭 키트에서 제공된 5' 유니버설 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 통해 경쇄 및 중쇄의 가변 영역 cDNA을 증폭시켰다. VL PCR을 위한 3'프라이머의 서열은

(잔기 17 내지 46이 마우스 Cκ 영역에 혼성화함)이었다. VH PCR을 위한 3'프라이머의 변성 서열은

(잔기 17 내지 50이 마우스 감마 쇄 CH1에 혼성화함)이었다. 서열 결정을 위해, VL 및 VH cDNA를 pCR4Blunt-TOPO 벡터 (미국 캘리포니아주 칼스배드에 소재하는 인비트로젠 (Invitrogen) 제품)에 서브클로닝했다. 형광 디데옥시 쇄 터미네이터 (미국 캘리포니아주 포스터 시티에 소재하는 어플라이드 바이오시스템스 (Applied Biosystems) 제품)를 제조업체의 지시에 따라 사용한 PCR 사이클 서열분석 반응을 통해 DNA 서열분석을 수행했다. 서열분석 반응물을 모델 377 DNA 서열분석기 (어플라이드 바이오시스템스 제품) 상에서 분석하였다.

인간화 266 (Hu266) 가변 영역의 구축: 문헌 [Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1988)]에 요약된 바와 같이 마우스 항체 V 영역의 인간화를 수행했다. 서열 상동성을 기초로, Mu266 CDR에 대한 수용체로서 사용될 인간 V 영역 프레임워크를 선택했다. 컴퓨터 프로그램 ABMOD 및 ENCAD [Levitt, M., J. Mol. Biol.168:595-620 (1983)]를 사용하여 가변 영역의 분자 모델을 구축했다. CDR과 접촉할 것이라 예상되는 인간화 V 영역의 아미노산을 Mu266의 상응하는 잔기로 치환했다. 이는 중쇄의 잔기 46, 47, 49 및 98 및 경쇄의 잔기 51에서 수행되었다. 동일한 V-영역 아군에서는 드문 것이라 밝혀진 인간화 V 영역의 아미노산을 컨센서스 아미노산으로 변화시켜 잠재적 면역원성을 제거했다. 이는 경쇄의 잔기 42 및 44에서 수행되었다.

대략 65 내지 80개의 염기 길이의 8개 오버랩 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 경쇄 및 중쇄 가변 영역 유전자를 구축하고 증폭시켰다 [He, X. Y., et al., J. Immunol.160:029-1035 (1998)]. 상기 올리고뉴클레오티드들을 쌍별 어닐링하고 DNA 중합효소 I의 클레나우 (Klenow) 단편으로 연장시켜 4종의 이중 가닥 단편을 수득했다. 생성된 단편들을 변성시키고 쌍별 어닐링하고 클레나우로 연장시켜 2종의 단편을 수득했다. 이들 단편들을 변성시키고, 쌍별 어닐링하고 다시 한번 연장시켜 전장 유전자를 수득했다. 생성된 생성물을 익스팬드 하이 피델러티 PCR 시스템 (Expand High Fidelity PCR System) (미국 인디애나주 인디아폴리스에 소재하는 로쉐 모레큘라 바이오케미칼스 (Roche Molecular Biochemicals) 제품)을 사용한 PCR로 증폭시켰다. PCR-증폭된 단편을 겔-정제하고 pCR4Blunt-TOPO 벡터에 클로닝했다. 서열 확인 후에, VL 및 VH 유전자를 MIuI 및 XbaI으로 소화시켜 겔- 정제하고, 경쇄 및 중쇄 발현을 위한 벡터에 각각 서브클로닝하여 pVk-Hu266 및 pVg1-Hu266을 제작했다 (각각 본원의 도 6 및 도 7 참조) [Co, M. S., et al., J. Immunol.148:1149-1154 (1992)]. 이들 플라스미드로부터 발현된 성숙한 인간화 266 항체는 서열 11의 경쇄 및 서열 12의 중쇄를 보유했다.

안정한 형질감염: 마우스 골수종 세포주 Sp2/0으로의 안정한 형질감염을 진 펄서 (Gene Pulser) 장치 (미국 캘리포니아주 헤르큘레스에 소재하는 바이로라드 (BioRad) 제품)를 문헌 [Co et al., 1992]에 기재된 바와 같이 360 V 및 25 μF에서 사용한 전기천공법을 통해 수행했다. 형질감염시키기 전에, FspI을 사용하여 pVk-Hu266 및 pVg1-Hu266 플라스미드 DNA를 선형화했다. 대략 10⁷ Sp2/0 세포를 pVk-Hu266 20 ㎍ 및 pVg1-Hu266 40 ㎍으로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포들을 10％ FBS를 함유하는 DME 배지 중에 현탁하고, 여러 96-웰 플레이트에 플레이팅했다. 48시간 후에, 선택 배지 (10％ FBS, HT 배지 보충물, 0.3 mg/㎖ 크산틴 및 1 ㎍/㎖ 마이코페놀산을 함유하는 DME 배지)를 적용했다. 상기 선택을 개시한지 대략 10일 후에, 배양물 상층액을 하기 나타낸 바와 같은 ELISA를 통해 항체 생성에 대해 분석했다. 고수율의 클론을 10％ FBS를 함유하는 DME 배지에서 증식시키고 항체 발현에 대해 추가로 분석했다. 이어서, 선택된 클론을 하이브리도마 SFM 중에서 성장시켰다.

ELISA에 의한 항체 발현 측정: 96-웰 ELISA 플레이트 (넌크-이뮤노 (Nunc-Immuno) 플레이트, 제품 번호; 439454, 미국 일리노이주 나퍼빌에 소재하는 날제넌 크 (NalgeNunc) 제품)의 웰들을 0.2 M 탄산 나트륨/중탄산 나트륨 완충액 (pH 9.4) 중 Fcγ단편 특이적인 폴리클로날 항체인 1 ㎍/㎖ 염소 항-인간 IgG (제품 번호; 109005-098, 미국 팬실바니아주 웨스트 그로브에 소재하는 잭슨 이뮤노리서치 (Jackson ImmunoResearch) 제품) 100 ㎕로 4℃에서 밤새 코팅했다. 세척 완충액 (0.1％ Tween 20을 함유하는 PBS)으로 세척한 후에, 웰들을 수퍼블록 블록킹 (Superblock Blocking) 완충액 (제품 번호; 37535, 피어스 제품) 400 ㎕로 30분 동안 블록킹한 후에, 세척 완충액으로 세척했다. Hu266을 함유하는 샘플을 ELISA 완충액 (1％ BSA 및 0.1％ Tween 20을 함유하는 PBS) 중에 적당하게 희석하고 ELISA 플레이트 (웰 당 100 ㎕)에 적용했다. 기준으로서, 인간화 항-CD33 IgG1 모노클로날 항체 HuM195를 사용했다 [Co, et al., 1992, 상기 문헌]. 상기 ELISA 플레이트를 2시간 동안 실온에서 인큐베이션시키고 웰들을 세척 완충액으로 세척했다. 이어서, ELISA 완충액 중 1/1,000배로 희석시킨 HRP-접합된 염소 항-인간 카파 폴리클로날 항체 (제품 번호; 1050-05, 미국 알라바마주 버밍엄에 소재하는 서던 바이오테크놀로지 (Southern Biotechnology) 제품) 100 ㎕을 각 웰에 적용했다. 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시키고 세척 완충액으로 세척한 후에, ABTS 기질 (제품 번호; 507602 및 506502, 미국 매릴랜드주 가이테스버그에 소재하는 키르케가드 앤드 페리 래버레이토리즈 (Kirkegaard and Perry Laboratories) 제품) 100 ㎕를 각 웰에 첨가했다. 웰 당 2％ 옥살산 100 ㎕을 첨가하여 발색을 중단시켰다. OPTImax 마이크로플레이트 판독기 (미국 캘리포니아주 멘로 파크에 소재하는 모레큘라 디바이시스 (Molecular Devices) 제품)를 사용하여 415 nm에서의 흡광도를 판 독했다.

Hu266의 정제: Hu266을 고발현하는 Sp2/0 안정한 형질감염체 (클론 1D9) 중 하나를 택해 하이브리도마 SFM 중에서 성장시키고 롤러병 중 2 L에서 증식시켰다. 세포 생존력이 10％ 이하에 도달했을 때, 사용된 배양물 상층액을 수거하고 단백질-A 세파로스 컬럼에 로딩했다. 상기 컬럼을 PBS로 세척한 후에 항체를 0.1 M 글리신-HCl (pH 2.5), 0.1 M NaCl로 용출시켰다. PBS를 2 L씩 3회 교환해가며 용출된 단백질을 투석하고 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과한 후에 4℃에 저장했다. 280 nm에서의 흡광도를 측정하여 항체 농도를 측정했다 (1 mg/㎖ = 1.4 A₂₈₀). 표준 절차에 따라, 트리스-글리신 완충액 중 SDS-PAGE를 4 내지 20％ 구배의 겔 (제품 번호; EC6025, 미국 캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 노벡스 (Novex) 제품) 상에서 수행했다. 정제된 인간화 266 항체를 환원시키고 SDS PAGE 겔상에서 이동시켰다. 온전한 항체는 대략적인 분자량이 25 kDa 및 50 kDa인 2개의 밴드를 나타냈다. 이들 결과는 경쇄 및 중쇄 또는 중쇄 단편의 아미노산 조성으로부터 계산한 이들의 분자량과 일치하는 것이었다.

실시예 14: 인간화 266 항체의 시험관내 결합 성질

상기 기재한 바와 같이 합성하여 정제한 인간화 266 항체의 결합 효능을 비오티닐화된 마우스 266 항체를 사용한 마우스 266 항체와 비교용 ELISA에서 비교했다. 96-웰 ELISA 플레이트 (넌크-이뮤노 플레이트, 제품 번호; 439454, 날제넌크 제품)의 웰들을 0.2 M 탄산 나트륨/중탄산 나트륨 완충액 (pH 9.4) (10 ㎍/㎖) 중 에서 BSA와 접합된 β-아밀로이드 펩티드 (1-42) 100 ㎕으로 밤새 4℃에서 코팅했다. Aβ_1-42-Cys₄₃ (C-말단 시스테인 Aβ_1-42, 아나스펙 (AnaSpec) 제품) 7.5 mg을 디메틸술폭시드 500 ㎕ 중에 용해한 직후에 증류수 1,500 ㎕를 첨가하여 Aβ_1-42-BSA 접합체를 제조했다. 말레이미드로 활성화된 소 혈청 알부민 (피어스 제품) 2 mg을 증류수 200 ㎕ 중에 용해시켰다. 상기 2가지 용액들을 합하여 철저하게 혼합하고 2시간 동안 실온에 방치했다. 겔 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 Aβ_1-42-Cys-BSA 접합체로부터 미반응된 펩티드를 분리했다.

ELISA 플레이트 세척기를 사용하여 0.1％ Tween 20을 함유하는 인산염 완충 염수 (PBS) (세척 완충액)로 웰들을 세척한 후에, 상기 웰들에 웰 당 수퍼블록 시약 (피어스 제품) 300 ㎕씩을 첨가하여 블록킹했다. 블록킹시키고 30분 후에, 웰들을 세척 완충액으로 세척하고 잉여량의 지질을 제거했다.

ELISA 완충액 중 비오티닐화된 Mu266 (최종 농도 0.3 ㎍/㎖) 및 경쟁자 항체 (Mu266 또는 Hu266; 시작시의 최종 농도 750 ㎍/㎖ 및 3배 계열 희석)의 혼합물을 웰 당 최종 부피 100 ㎕씩 3벌로 첨가했다. 경쟁자가 없는 대조군으로서, 0.3 ㎍/㎖ 비오티닐화된 Mu266 100 ㎕을 첨가했다. 백그라운드 대조군으로서, ELISA 완충액 100 ㎕을 첨가했다. ELISA 플레이트를 실온에서 90분 동안 인큐베이션했다. 세척 완충액으로 웰들을 세척한 후에, 1 ㎍/㎖ HRP-접합된 스트렙타비딘 (제품 번호; 21124, 피어스 제품) 100 ㎕을 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고 세척 완충액으로 세척했다. 발색시키기 위해서, ABTS 퍼옥시 다제 기질 (키르케가드 앤드 페리 래버레이토리즈 제품)을 100 ㎕/웰로 첨가했다. 웰 당 2％ 옥살산 100 ㎕을 첨가하여 발색을 중단시켰다. 415 nm에서의 흡광도를 판독했다. 흡광도를 로그값의 경쟁자 농도에 대해 플롯팅하여 데이타 점 (프리즘 사용)에 맞춰 곡선을 만들고, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 각 항체에 대한 IC50을 측정했다.

마우스 266에 대한 평균 IC50은 4.7 ㎍/㎖ (3회의 별도 실험, 표준 편차 = 1.3 ㎍/㎖)이었고, 인간화 266에 대한 평균 IC50은 7.5 ㎍/㎖ (3회의 별도 실험, 표준 편차 = 1.1 ㎍/㎖)이었다. 3회 실험의 제2 세트를 본질적으로 상기 기재한 바와 같이 수행하여 마우스 266에 대한 평균 IC50은 3.87 ㎍/㎖ (SD = 0.12 ㎍/㎖이며 인간 266에 대한 평균 IC50은 4.0 ㎍/㎖ (SD = 0.5 ㎍/㎖)인 것으로 측정되었다. 이러한 결과를 바탕으로, 본 출원인들은 인간화 266의 결합 성질이 마우스 항체 266의 결합 성질과 매우 유사하다는 결론에 이르렀다. 그러므로, 본 출원인들은 인간화 266의 시험관내 및 생체내 활성이 마우스 266과 매우 유사하고, 인간화 266이 인간에서 사용하면, 마우스에서 마우스 266을 사용하여 입증된 것과 동일한 효과를 나타낼 것이라 예측한다.

실시예 15: 마우스 항체 266 및 4G8의 시험관내 결합 성질

BIAcore 바이오센서 2000 및 BIAevaluation (v.3.1) 소프트웨어로 분석한 데이타를 사용하여 항체 친화성 (KD = Kd/Ka)을 측정했다. N-에틸l-N-디메틸아미노프로필 카르보디이미드 및 N-히드록시숙신이미드 (EDC/NHS)를 사용하여, 포획 항체 (토끼의 항-마우스 항체)를 유리 아민기를 통해 바이오센서 칩 (CM5)의 유동 세포 2의 카르복실기에 커플링했다. 백그라운드 대조군으로서 비특이적 토끼 IgG를 유동 세포 1에 커플링했다. 모노클로날 항체를 포획하여 300 공명 단위 (Resonance Units, RU)를 수득했다. 이어서, 아밀로이드-베타 1-40 또는 1-42 (바이오소스 인터내셔널, 인크. (Biosource International, Inc.) 제품)를 감소시킨 농도 (1000에서 0.1 ×KD)에서 칩 상에서 유동시켰다. 칩을 재생시키기 위해서, 글리신-HCl (pH 2)로 세척함으로써 칩으로부터 결합된 항-Aβ 항체를 용출시켰다. 아밀로이드-베타를 함유하지 않는 대조군 주사는 기준선을 정하기 위한 대조군으로 기능했다. 결합 및 해리 단계를 증명하는 센서그램을 분석하여 Kd 및 Ka를 측정했다. 이러한 방법을 사용하여, Aβ_1-40 및 Aβ_1-42 모두에 대한 마우스 항체 266의 친화성은 4 pM인 것으로 밝혀졌다. 4G8의 Aβ_1-40에 대한 친화성은 23 nM였고, Aβ_1-42에 대한 친화성은 24 nM이었다. Aβ에 대한 친화성이 6000배 차이가 있음에도 불구하고, 266 및 4G8 모두는 Aβ의 아미노산 13과 28 사이에서 에피토프에 결합하여 Aβ를 인간 CSF로부터 효과적으로 격리시켰다. 그러므로, 항체가 Aβ를 격리하고 본 발명의 유익하고 놀라운 잇점을 제공하는 능력을 측정하는데 있어서, 에피토프의 위치가 결합 친화성 보다 더욱 중요하다.

실시예 16: BIAcore 방법을 사용한, 마우스 항체 266 및 가용성 펩티드의 에피토프 맵핑

BIAcore는 분자간 상호작용을 측정하기 위한 자동화된 바이오센서 시스템이다 [Karlsson R., et al. J. Immunol. Methods 145:229-240 (1991)]. 다른 결합 분석법에 비교되는 BIAcore의 잇점은 항원을 표지하거나 고정시킬 필요 없이 항원 결합을 측정할 수 있다는 점이다 (즉, 항원이 더욱 천연 형태를 유지함). 모든 희석이 Tween 20을 함유하는 HEPES 완충 염수를 사용하여 행해졌고, Aβ (바이오소스 인터내셔널 제품)의 다양한 단편들을 주사하였으며, 각각의 단편들을 단일 농도 (440 nM)로 주사했다는 점을 제외하고는 본질적으로 상기 실시예 12에 기재한 바와 같이 BIAcore 방법으로 각종 아밀로이드-베타 펩티드 단편의 마우스 항체 266에 대한 결합을 평가했다.

아밀로이드 베타 단편 1-28, 12-28, 17-28 및 16-25은 마우스 항체 266과 결합했으나, Aβ 단편 1-20, 10-20 및 22-35는 결합하지 않았다. 단편 1-20, 10-20 및 22-35는 Aβ의 상기 영역에 대한 공지된 에피토프 특이성을 보이며 다른 MAb들에 결합했다. 이러한 방법을 사용할 때, 마우스 항체 266에 대한 결합 에피토프는 Aβ의 아미노산 17과 25 사이에 있는 것으로 여겨진다. 존재하는 에피토프의 3개 이상의 잔기에서 결합이 일어나는 것이 보통이기 때문에, 당업자라면 이에 나아가 상기 에피토프가 잔기 19 내지 23 내에 보유되어 있음을 추측할 수 있다.

실시예 17: 인간화 항체 266의 시험관내 결합 성질

상기 기재한 바와 같이 합성하고 정제한 인간화 266 항체의 친화성 (KD = Kd/Ka)을 본질적으로 상기 실시예 15에서 기재한 바와 같이 측정했다. 이 방법을 사용하여 Aβ_1-42에 대한 인간화 266의 친화성은 4 pM인 것으로 밝혀졌다.

<110> ELI LILLY AND COMPANY and WASHINGTON UNIVERSITY <120> Humanized Antibodies that Sequester Amyloid Beta Peptide <130> 8792/293 <150> PCT/US01/06191 <151> 2001-02-26 <150> 60/184,601 <151> 2000-02-24 <150> 60/254,465 <151> 2000-12-08 <150> 60/254,498 <151> 2000-12-08 <160> 16 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 1 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ile Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 2 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 3 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 4 Arg Tyr Ser Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 5 Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 3 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 6 Gly Asp Tyr 1 <210> 7 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Humanized antibodies <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is Val or Ile <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa at position 14 is Thr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Xaa at position 15 is Leu or Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30)..(30) <223> Xaa at position 30 is Ile or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50) <223> Xaa at position 50 is Arg, Gln, or Lys <220> <221> MISC_FEATURE <222> (88)..(88) <223> Xaa at position 88 is Val or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (105)..(105) <223> Xaa at position 105 is Gln or Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (108)..(108) <223> Xaa at position 108 is Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (109)..(109) <223> Xaa at position 109 is Val or Leu <400> 7 Asp Xaa Val Met Thr Gln Xaa Pro Leu Ser Leu Pro Val Xaa Xaa Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Xaa Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Xaa Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Xaa Xaa Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Humanized antibodies <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa at position 1 is Glu or Gln <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa at position 7 is Ser or Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (46)..(46) <223> Xaa at position 46 is Glu, Val, Asp or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (63)..(63) <223> Xaa at position 63 is Thr or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (75)..(75) <223> Xaa at position 75 is Ala, Ser, Val or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (76)..(76) <223> Xaa at position 76 is Lys or Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (89)..(89) <223> Xaa at position 89 is Glu or Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (107)..(107) <223> Xaa at position 107 is Leu or Thr <400> 8 Xaa Val Gln Leu Val Glu Xaa Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Xaa Leu Val 35 40 45 Ala Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Xaa Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Xaa Xaa Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Xaa Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 9 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Humanized antibodies <400> 9 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ile Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Humanized antibodies <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 11 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Humanized antibodies <400> 11 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ile Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 12 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Humanized antibodies <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 Ala Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 115 120 125 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 130 135 140 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 145 150 155 160 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 180 185 190 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 195 200 205 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 225 230 235 240 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 245 250 255 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 260 265 270 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 275 280 285 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 290 295 300 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 305 310 315 320 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 340 345 350 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 13 <211> 46 <212> DNA <213> Synthetic nucleotides <400> 13 tatagagctc aagcttggat ggtgggaaga tggatacagt tggtgc 46 <210> 14 <211> 50 <212> DNA <213> Synthetic nucleotides <400> 14 tatagagctc aagcttccag tggatagach gatggggstg tygttttggc 50 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial seqence <400> 15 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 16 Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly

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69. a. 하기하는 <경쇄 CDR1> 내지 <경쇄 CDR3>의 아미노산 서열을 갖는 3개의 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및 인간화 면역글로불린 경쇄로부터의 경쇄 프레임워크 서열을 포함하는 경쇄, 및

    b. 하기하는 <중쇄 CDR1> 내지 <중쇄 CDR3>의 아미노산 서열을 갖는 3개의 중쇄 CDR 및 인간화 면역글로불린 중쇄로부터의 중쇄 프레임워크 서열을 포함하는 중쇄

    를 포함하는 인간화 항체.

    <경쇄 CDR1>

    

    <경쇄 CDR2>

    

    <경쇄 CDR3>

    

    <중쇄 CDR1>

    

    <중쇄 CDR2>

    

    <중쇄 CDR3>

    
70. 제69항에 있어서,

    경쇄 CDR1이

    

    이고,

    중쇄 CDR2가

    

    인 인간화 항체.
71. 제69항에 있어서,

    하기하는 서열

    

    (상기 서열에서, 위치 2의 Xaa는 Val 또는 Ile이고, 위치 7의 Xaa는 Ser 또는 Thr이고, 위치 14의 Xaa는 Thr 또는 Ser이고, 위치 15의 Xaa는 Leu 또는 Pro이고, 위치 30의 Xaa는 Ile 또는 Val이고, 위치 50의 Xaa는 Arg, Gln 또는 Lys이고, 위치 88의 Xaa는 Val 또는 Leu이고, 위치 105의 Xaa는 Gln 또는 Gly이고, 위치 108의 Xaa는 Lys 또는 Arg이며, 위치 109의 Xaa는 Val 또는 Leu임)을 포함하는 인간화 경쇄 가변 영역, 및

    하기하는 서열

    

    (상기 서열에서, 위치 1의 Xaa는 Glu 또는 Gln이고, 위치 7의 Xaa는 Ser 또는 Leu이고, 위치 46의 Xaa는 Glu, Val, Asp 또는 Ser이고, 위치 63의 Xaa는 Thr 또는 Ser이고, 위치 75의 Xaa는 Ala, Ser, Val 또는 Thr이고, 위치 76의 Xaa는 Lys 또는 Arg이고, 위치 89의 Xaa는 Glu 또는 Asp이며, 위치 107의 Xaa는 Leu 또는 Thr임)을 포함하는 중쇄 가변 영역

    을 포함하는 인간화 항체.
72. 제69항에 있어서, 경쇄 가변 영역의 서열이 서열 9이고 중쇄 가변 영역의 서열이 서열 10인 인간화 항체.
73. 제72항에 있어서, 경쇄 서열이 서열 11이고 중쇄 서열이 서열 12인 인간화 항체.
74. 제69항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ 펩티드에 결합할 수 있는 항체 단편인 항체.
75. 제69항에 있어서, 인간 피험체에서 Aβ를 격리시키거나, 아밀로이드 플라크의 형성을 억제하거나, 가용성 Aβ 종의 독성 효과를 억제하거나, 아밀로이드 플라크를 감소시키거나, 가용성 Aβ 종의 독성 효과를 감소시키거나, 인식 감퇴를 전환시키거나, 인식 감퇴를 예방하거나, 인식력을 개선시킬 수 있는 것인 인간화 항체.
76. 적합한 숙주 세포에서 발현될 경우, 제69항 내지 제73항 중 어느 한 항의 항체를 생산하는 폴리핵산.
77. 제69항 내지 제73항 중 어느 한 항의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 상기 항체를 발현하기 위한 발현 벡터.
78. 제77항의 발현 벡터로 형질감염된 세포.
79. 제69항 내지 제73항 중 어느 한 항의 유효량의 인간화 항체를 포함하는, 아밀로이드 플라크의 형성을 억제하거나, 가용성 Aβ 종의 독성 효과를 억제하거나, 아밀로이드 플라크를 감소시키거나, 가용성 Aβ 종의 독성 효과를 감소시키거나, 인식 감퇴를 전환시키거나, 인식 감퇴를 예방하거나, 인식력을 개선시키기 위한 제약 조성물.
80. 제74항의 유효량의 인간화 항체를 포함하는, 아밀로이드 플라크의 형성을 억제하거나, 가용성 Aβ 종의 독성 효과를 억제하거나, 아밀로이드 플라크를 감소시키거나, 가용성 Aβ 종의 독성 효과를 감소시키거나, 인식 감퇴를 전환시키거나, 인식 감퇴를 예방하거나, 인식력을 개선시키기 위한 제약 조성물.
81. 제69항 내지 제73항 중 어느 한 항의 유효량의 인간화 항체를 포함하는, 임상적 또는 전임상적 알쯔하이머병, 다운증후군 또는 임상적 또는 전임상적 대뇌의 아밀로이드 혈관병증이 있는 것으로 진단된 인간 피험체에서 임상적 또는 전임상적 알쯔하이머병, 다운증후군 또는 임상적 또는 전임상적 대뇌의 아밀로이드 혈관병증을 치료하기 위한 제약 조성물.
82. 제74항의 유효량의 인간화 항체를 포함하는, 임상적 또는 전임상적 알쯔하이머병, 다운증후군 또는 임상적 또는 전임상적 대뇌의 아밀로이드 혈관병증이 있는 것으로 진단된 인간 피험체에서 임상적 또는 전임상적 알쯔하이머병, 다운증후군 또는 임상적 또는 전임상적 대뇌의 아밀로이드 혈관병증을 치료하기 위한 제약 조성물.
83. 제81항에 있어서, 임상적 알쯔하이머병을 치료하기 위한 제약 조성물.
84. 제82항에 있어서, 임상적 알쯔하이머병을 치료하기 위한 제약 조성물.
85. 제81항에 있어서, 전임상적 알쯔하이머병을 치료하기 위한 제약 조성물.
86. 제82항에 있어서, 전임상적 알쯔하이머병을 치료하기 위한 제약 조성물.

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