JP6546178B2 - 細胞株中の宿主細胞タンパク質及び組換えポリペプチド産物を検出及び定量化するための組成物並びに方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2014年5月9日出願の米国仮特許出願第61/991228号及び2013年9月13日出願の同第61/877503号の優先権の利益を主張し、この何れの出願も、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、EFS−Webにより提出された配列表を含み、配列表の内容全体は参照により本明細書に援用される。前記ASCIIコピーは、2014年8月28日に作成され、P5701R1WO_PCTSequenceListing.txtと命名され、大きさは28965バイトである。
ハムスターホスホリパーゼB様2(phospholipase B−like2)に結合するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体が提供される。また、組換えポリペプチド調製物等におけるハムスターホスホリパーゼB様2を検出及び定量化するための方法、及び該方法を実施するためのキットが提供される。また、低レベルのハムスターホスホリパーゼB様2を発現する宿主細胞株又は組換えポリペプチド発現細胞株をスクリーニング又は選択する方法も提供される。
本明細書の説明のために以下の定義を適用し、単数形で用いられる用語は、適切な場合は常に、複数形を含み、その逆の場合も同じである。以下に記載の如何なる定義も、参照により本明細書に援用される任意の文書と矛盾する場合には、以下に記載する定義が優先するものとする。
100×分率X/Y
本明細書に提供されるのは、ハムスターPLBL2の検出及び定量化のためのイムノアッセイ法である。該方法が、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞等の宿主細胞中で産生された組換えポリペプチド調製物中のハムスターPLBL2の検出及び定量化のために使用されうる。幾つかの実施態態様では、該方法は、本明細書に記載の捕捉及び検出用抗PLBL2抗体を使用する。幾つかの実施態態様では、抗体は、サンドイッチアッセイ、酵素結合免疫吸着法(ELISA)、電気化学的アッセイ(ECL)、磁気イムノアッセイを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で知られている任意のイムノアッセイ法において使用される。特定の実施態様では、方法は、抗PLBL2抗体のハムスターPLBL2への結合を許容する条件下で、本明細書に記載の抗PLBL2抗体と組換えポリペプチド調製物の試料を接触させることと、抗PLBL2抗体とハムスターPLBL2との間に複合体が形成されているか否かを検出することとを含む。
例示的な抗ハムスターPLBL2抗体
本明細書に記載の任意のアッセイ法で使用するためのポリペプチドが提供される。一態様では、ハムスターPLBL2を結合する単離された抗体が提供される。幾つかの実施態様では、抗PLBL2抗体は、(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むCDRH1;(b)配列番号16のアミノ酸配列を含むCDRH2;(c)配列番号17のアミノ酸配列を含むCDRH3;(d)配列番号20のアミノ酸配列を含むCDRL1;(e)配列番号21のアミノ酸配列を含むCDRL2;及び(f)配列番号22のアミノ酸配列を含むCDRL3から選択される、少なくとも一、二、三、四、五又は六のCDRを含む。幾つかの実施態様において、抗PLBL2抗体は、配列番号14のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域を含む。幾つかの実施態様において、抗PLBL2抗体は、配列番号19のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む。幾つかの実施態様において、抗PLBL2抗体(「19C10」)は、配列番号13のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号18のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。別の実施態様において、抗体は、配列番号13及び配列番号18のCDR配列と95%以上同一であるCDR配列を含む。
組換えポリペプチド及びその調製物も提供されており、その試料は本明細書に記載の方法によりアッセイされうる。このような組換えポリペプチドの例は、限定されないが、免疫グロブリン、イムノアドヘシン、抗体、酵素、ホルモン、融合タンパク質、Fc含有タンパク質、イムノコンジュゲート、サイトカイン及びインターロイキン、哺乳類タンパク質(例えば、レニン);ホルモン;成長ホルモン(ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む);成長ホルモン放出因子;甲状腺傍ホルモン;甲状腺刺激ホルモン;リポタンパク質;アルファ−1−抗トリプシン;インシュリンA鎖;インシュリンB鎖;プロインシュリン;卵胞刺激ホルモン;カルシトニン;黄体ホルモン;グルカゴン;凝固因子(要子VIIIC、要子IX、組織因子及びフォン・ヴィレブランド因子等);抗凝固因子(プロテインC等);心房性ナトリウム利尿因子;肺界面活性剤;プラスミノゲン活性剤(ウロキナーゼ又はヒトの尿又は組織タイプ・プラスミノゲン活性剤(t−PA));ボンベシン;トロンビン;造血成長因子;腫瘍壊死因子−アルファ及び−ベータ;エンケファリナーゼ;RANTES;(regulated on activation normally T-cell expressed and secreted);ヒトのマクロファージ炎症タンパク質(MIP−1−アルファ);血清アルブミン(ヒト血清アルブミン等);Muellerian−阻害物質;リラキシンA鎖;リラキシンB鎖;プロリラキシン;マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド;酵素;微生物タンパク質(ベータ−ラクタマーゼ等);DNase;IgE;T−リンパ球関連抗原(CTLA)(CTLA−4等);インヒビン;アクチビン;血管内皮増殖因子(VEGF);ホルモン受容体又は増殖因子受容体;プロテインA又はD;リューマチ因子;神経栄養因子(骨由来の神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン−3、−4、−5、又は−6(NT−3、NT−4、NT−5、又はNT−6等)、或いは神経成長因子(NGF−b等);血小板由来増殖因子(PDGF);線維芽細胞増殖因子(aFGF及びbFGF等);上皮細胞増殖因子(EGF);形質転換増殖因子(TGF)(TGF−アルファ、及びTGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、TGF−β4又はTGF−β5を含むTGFベータ等);インスリン様増殖因子−I及び−II(IGF−I及びIGF−II);デス(1−3)−IGF−I(脳IGF−I)、インスリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP);サイトカイン;CDタンパク質(CD3、CD4、CD8、CD19及びCD20等);エリスロポエチン;骨誘導因子;免疫毒素;融合ポリペプチド、すなわち二以上の異種ポリペプチド又はその断片で構成され、組換え核酸によりコードされているポリペプチド;Fcg含有ポリペプチド、例えば、第二のポリペプチドに融合した、免疫グロブリンFc領域を含む融合タンパク質又はその断片;イムノコンジュゲート;骨形成タンパク質(BMP);インターフェロン(インターフェロン−アルファ、−ベータ及び−ガンマ等);コロニー刺激因子(CSF)(例えばM−CSF、GM−CSF及びG−CSF);インターロイキン(IL)、例えば、IL−1からIL−10;スーパーオキシド・ジスムターゼ;T細胞受容体;表面膜タンパク質;崩壊加速因子;ウイルスの抗原(例えば、AIDSエンべロープの一部);輸送タンパク質;ホーミング受容体;アドレシン;調節タンパク質;インテグリン(CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA−4及びVCAM等);腫瘍関連抗原(CA125(卵巣がん抗原)又はHER2、HER3若しくはHER4受容体等);イムノアドヘシン;並びに、タンパク質(例えば、上に列挙した任意のタンパク質を含む)を結合する抗体(抗体断片を含む)の他に、上に列挙した任意のタンパク質の断片及び/又は変異体を含む。
幾つかの実施態様では、抗体は、ポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原及びアジュバントの複数回にわたる皮下(sc)又は腹腔内(ip)注入により動物内で産生される。二官能性剤又は誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介したコンジュゲーション)、N−ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介した)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2、又はR1N=C=NR(式中、RとR1は異なるアルキル基である)を用いて、免疫化される種において免疫原性であるポリペプチド(例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又はダイズトリプシン阻害因子)に関連抗原をコンジュゲートすることは有益でありうる。
幾つかの実施態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち一般的に少量で存在しうる突然変異体等の、モノクローナル抗体の生成中に生じる突然変異体を除いて、集団を構成する個々の抗体が同一であり、及び/又は同じエピトープに結合する。したがって、修飾語「モノクローナル」は、別々の抗体の混合物(すなわちポリクローナル抗体)ではないという抗体の性質を示す。
幾つかの実施態様において、抗体は、抗体断片である。抗体断片を生産するために様々な技術が開発されてきている。伝統的には、こうした断片は、インタクトな抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan et al., Science 229:81 (1985)を参照)。しかし、こうした断片は、現在では組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は、上述の抗体ファージライブラリーから単離されうる。或いは、Fab’−SH断片を大腸菌から直接回収し、化学的に結合させてF(ab’)2断片を形成することができる(Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992))。他のアプローチ法では、F(ab’)2断片を組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体断片の生産のための他の技術は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Fv断片(scFv)である。国際公開第93/16185号、米国特許第5571894号及び米国特許第5587458号を参照のこと。抗体断片は、例えば、米国特許第5641870号に記載されるように「直鎖状抗体」であってもよい。このような直鎖状抗体断片は、単一特異性又は二重特異性であり得る。
本明細書に記載の抗体を含むポリペプチドのアミノ酸配列修飾は、本明細書に記載のポリペプチド調製物(例えば、抗体)をアッセイする方法において使用されうる。
「ポリペプチド変異体」とは、ポリペプチドの完全長天然配列、シグナルペプチドを欠くポリペプチド配列、(シグナルペプチドを伴うか又は伴わない)ポリペプチドの細胞外ドメイン)と、少なくともおよそ80%のアミノ酸配列同一性を有する、本明細書に定義されているポリペプチド、例えば活性ポリペプチドを意味する。このようなポリペプチド変異体は、例えば完全長天然アミノ酸配列のN末端又はC末端に、一又は複数のアミノ酸残基が付加されているか又は欠失しているポリペプチドを含む。通常、ポリペプチド変異体は、完全長天然配列ポリペプチド配列、シグナルペプチドを欠くポリペプチド配列、ポリペプチドの(シグナルペプチドを伴うか又は伴わない)細胞外ドメインに対して、少なくともおよそ80%のアミノ酸配列同一性、或いは少なくともおよそ85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の何れかのアミノ酸配列同一性を有するであろう。場合によっては、変異体ポリペプチドは、天然ポリペプチド配列と比較して一以下の保存的アミノ酸置換、或いは天然ポリペプチド配列と比較して約2、3、4、5、6、7、8、9、又は10の何れか以下の保存的アミノ酸置換を有する。
(1)非極性:Ala(A)、Val(V)、 Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)
(2)非荷電極性:Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)
(3)酸性:Asp(D)、Glu(E)
(4)塩基性:Lys(K)、Arg(R)、His(H)
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性の親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響する残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
本明細書に記載のポリペプチドは、他の異種ポリペプチド配列又はアミノ酸配列に融合したポリペプチドを含むキメラ分子を形成するように修飾されうる。幾つかの実施態様では、キメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとのポリペプチドの融合を含む。エピトープタグは一般的に、ポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシル末端に置かれる。ポリペプチドのこのようなエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を使用して検出されうる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他のタイプのアフィニティーマトリックスを使用する親和性精製により、ポリペプチドが容易に精製されるのを可能にする。
本明細書に記載のアッセイ法において使用されるポリペプチドは、組換え法を含む当該技術分野で周知の方法を用いて得ることができる。以下のセクションは、これらの方法に関するガイダンスを提供する。
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNA及びRNAを含む。
下記の説明は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによるポリペプチドの生成に主に関する。当然、当該技術分野でよく知られている代替的方法を用いてポリペプチドを調製することも考えられる。例えば、適切なアミノ酸配列又はその一部が、固相技術を用いて直接ペプチド合成により生成されうる(例えば、Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis W.H. Freeman Co., San Francisco, Calif. (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)を参照のこと)。インビトロタンパク質合成は、手動技術を用いるか、又は自動操作により実施されうる。自動化合成は、例えば、Applied Biosystems Peptide Synthesizer(Foster City,Calif.)を用いて、製造者の指示を用いて達成されうる。ポリペプチドの種々の部分を別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて所望するポリペプチドを生成させてもよい。
用語「ベクター」は、 発現ベクター及び形質転換ベクター及びシャトルベクターを含む。
宿主細胞は、例えば、細菌、酵母又は他の真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、又は哺乳動物細胞であってもよい。通常、宿主細胞は、ポリペプチドをコードする外因性核酸を含有しうるが、目的の組換えポリペプチド又は生産物をコードする外因性核酸は含有せず、ポリペプチドの発現は、例えば抗生物質耐性を付与するポリペプチドをコードする核酸といった特定の条件下で望ましい特性を細胞に付与する。
本明細書において生産物(例えば、抗体)とも称される目的の組換えポリペプチドは、例えば米国特許第4816567号に記載されているように、組換え法と組成物を使用して製造されうる。幾つかの実施態様では、抗体等の組換えポリペプチドをコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体(例えば、抗体の軽鎖及び/又は重鎖)のVLを含むアミノ酸配列及び/又はVHを含むアミノ酸配列をコードしうる。幾つかの実施態様では、このような核酸を含む一又は複数のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。幾つかの実施態様では、宿主細胞は、組換えポリペプチド発現細胞又は生産物細胞を生成するために、形質転換又は形質移入される。このような一実施態様において、組換えポリペプチド発現細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクター及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター第二のベクターを含む(例えば、これらで形質転換されている)。
本明細書に記載の方法において使用されるポリペプチドは、製造品内に含まれていてもよい。製造品はポリペプチドを収容する容器を含んでもよい。幾つかの実施態様では、製造品は、(a)容器内に、本明細書に記載のポリペプチドを含む組成物を含む容器、及び(b)アッセイ法においてポリペプチドを使用するための使用説明書を伴う添付文書を含む。
MAbフィードストック
すべての実施例のためのMAbのフィードストックは、ジェネンテック社(South San Francisco,CA,U.S.A.)での、産業用、試験的又は小規模の細胞培養バッチから選択された。細胞培養発酵期間の後、該細胞を分離し、特定の場合には清澄液(収集細胞培養液、HCCF)をプロテインAクロマトグラフィー、並びに下記の実施例に記載の一又複数の追加のクロマトグラフィー工程及び濾過工程により精製した。精製の様々な工程でのHCCF又はインプロセスプールを、実施例3及び5に記載のELISAアッセイの性能を調べるために使用した。実施例3のELISAアッセイの使用結果は実施例4に記載されており、実施例5のELISAアッセイの使用結果は実施例6に記載されている。
抗体の濃度は、UV可視分光光度計(8453モデルG1103A;Agilent Technologies;Santa Clara,CA,U.S.A.)又はNanoDrop 1000モデルND−1000(Thermo Fisher Scientific;Waltham,MA,U.S.A.)を用いて280と320nmの吸光度により測定した。抗体以外の種(すなわち、不純物)は濃度が低すぎて、UV吸光度に大した影響はなかった。必要に応じて、試料は、0.1から1.0吸光度単位の範囲内の適切な非干渉希釈剤で希釈した。試料調製及びUV測定は反復で実施し、平均値を記録した。mAbの吸光係数は、1.42から1.645/mg・ml・cmの範囲であった。
生産物濃度アッセイは、プロテインAに結合するポリペプチドの測定のためのアフィニティークロマトグラフィー法である。該方法は、アフィニティークロマトグラフィーを実施するための手段としてHPLCを用いてもよい。 このアッセイによって測定することができる生産物は、任意のFc含有ポリペプチドを含み、例えば、限定されないが、モノクローナル抗体、二重特異性又は多重特異性抗体、半抗体を含む抗体断片及びイムノアドヘシンを含む。固定化されたプロテインA(約1mg)を含有で容量約0.1mLのアフィニティークロマトグラフィーカラム(直径2.1mmx長さ30mm、粒径20μm)を、該方法において使用した。プロテインAアフィニティークロマトグラフィーカラムは、当該技術分野で既知の方法により作成することができ、また、例えばLife Technologiesから商業的に入手可能である。リン酸緩衝生理食塩水のローディングバッファー中、試料及び異なるIgG濃度の4つの標準物質をカラム(20μLの標準的な注入量)に適用した。典型的に、試料は収集細胞培養液(HCCF)であり、生産物は流速2mL/分で2%酢酸/100mMグリシン(pH2.5)でカラムから溶出された。分析産物(product analyte)の量を算出するために、溶出された物質のピーク面積を、適切な 生成物の吸光係数を用いて、4点IgG検量線のピーク面積と比較した。該アッセイの範囲は、典型的に0.025mg/mLから4.0mg/mLであった。生産物濃度を、次式に従って決定した:mg/mL IgG=HPLC値(mg/mL)x(標準物質の吸光係数/供試材の吸光係数)。
ELISAを、CHOPと呼ばれるトータル宿主細胞タンパク質のレベルを定量化するために使用した。生産物中のCHOタンパク質を検出するために用いたELISAは、サンドイッチELISAフォーマットに基づいていた。アフィニティー精製されたCHOPに対するポリクローナル抗体を、96ウェルマイクロタイタープレート上に被覆した。次いで、標準物質、コントロール及び試料を別々のウェルに2つ組で充填した。CHOPは、試料中に存在する場合には、被覆抗体(ポリクローナル抗CHOP)に結合する。インキュベーション工程の後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗CHOPポリクローナル抗体をプレートに添加した。最後の洗浄工程の後、KPL(Kirkegaard & Perry Laboratories,Inc.,Gaithersburg,MD,カタログ番号53−00−03)よりSUREBLUE RESERVETMとして入手可能でもある、テトラメチルベンジジン(TMB)の溶液(HRPによりこの溶液に作用すると、酵素が比色標識を発生させる)を添加することによって、CHOPを定量化した。450nmでの光学濃度(OD)を各ウェルにおいて測定した。5−パラメーターカーブフィッティングプログラム(SOFTMAX(登録商標)Pro,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)を使用して検量線を作成し、試料CHOPの濃度を検量線から算出した。トータルCHOP ELISAのアッセイ範囲は、5から320ng/mlであった。CHOP濃度(単位ng/mL)は、キャリブレーターとしてCHOP標準物質を使用する試料中のCHOPの量を指す。CHOP比率(単位ng/mg又はppm)は、生産物濃度に対するCHOP濃度の算出比率を指し、場合によっては、試験方法用の報告値であった。トータルCHOP ELISAは、試料中のトータルCHOPのレベルを定量化するために使用されうるが、個々のタンパク質の濃度は定量化しない。
本発明者らは、PLBL2を検出する目的のために市販されている二つのキットが、組換え抗体調製物中のPLBL2を検出することができるかどうか、また、もし検出できるのであれば、十分な定量化を提供するのか否かを試験した。最初に試験したキットは、USCN Life Science Inc.のヒトホスホリパーゼB(PLB)E92048Hu用のELISA Assay Kitであった。このキットは、ヒト組織ホモジネート及び他の生体液におけるPLBのインビトロ定量測定用のサンドイッチELISAとされている。このアッセイで試験した試料は、PLBL2不純物のレベルが質量分析アッセイ(更に後述する)を用いて約300ng/mgと決定されている、既知であり陽性の、ハムスターPLBL2の供給源(CHO細胞から精製した組換え抗体調製物)を含む。CHO細胞から精製し、検出可能なPLBL2を持たないことが知られている第二の組換え抗体調製物も試験された。0.3から20ng/ml(図1A)の範囲で本キットに含まれるヒトPLBL2標準物質の検出を示す検量線が作成されたが、試験試料の反応性は検出されなかった。抗体調製物は双方とも、10mg/mL(陽性試料中のPLBL2約3,000ng/mLに相当)で、10mg/mLから約1.3mg/mLまでの4回の2倍段階希釈液(陽性試料中のPLBL2 375ng/mLに相当)中で試験された。抗体調製物は双方とも、すべての希釈液で同じ結果、すなわち(例えばバックグラウンドの)ODがおよそ0.1AUがであった。ハムスターPLBL2を含有するとわかっている試料と、この不純物を含まないことがわかっている試料との間に差異はなかった。試料希釈の関数としての差異は存在せず、本発明者らの試料中のハムスターPLBL2を定量化する能力がないことを示した。本発明者らは、このキットの抗体が本発明者らの試料中のハムスターPLBL2不純物を認識しなかったと結論づけた。
抗体調製物中の不純物としてのPLBL2の識別は、遺伝子を合成し、次いで発現させ、ハムスターPLBL2を精製することに本発明者らを向かわせた。PLBL2に関する文献は、約66kDの分子量のリソソーム酵素としてPLBL2を説明している(F. Deuschl et al., FEBS Lett 580:5747-5752 (2006))。他のリソソーム酵素と同様に、このタンパク質は、マンノース−6−リン酸に対する複数の翻訳後修飾を含み、元々プレプロ酵素として合成される。プロセシングの間、リーダー配列が切り取られ、タンパク質切断が生じ、その結果タンパク質は、SDS−PAGEゲル上で3つのバンド、すなわち、インタクトなPLBL2(MW 66kD)、N末端ドメイン(28kD)及びC末端ドメイン(40kD)として現れる。切断は、酸性pHレベルで生じる。NドメインとCドメインはSDS−PAGE上で分離しているが、本発明者らは強力な溶媒(例えば、尿素、グアニジン又はエタノール)が断片を分離するために必要とされることを観察したことから、これらの断片はおそらく未変性条件下では分離しない。更に、結晶学的研究のためにPLBL2を精製している他の研究所もこの切断を観察しており、クロマトグラフ法で切断されたタンパク質からインタクトなタンパク質を分離することはできていない(F. Deuschl et al., FEBS Lett 580:5747-5752 (2006); A. Jensen et al., Biochem Journal 402, 449-458 (2007), F. Lakomek et al., BMC Structural Biology 9:56 (2009))。
組換えポリペプチド試料(例えば組換え抗体又はイムノアドヘシン調製物)中のCHOP不純物であるPLBL2を検出し定量化するためのELISAアッセイを開発した。手順は以下の通り。マウスモノクローナル抗体19C10を、炭酸バッファー(0.05Mの炭酸ナトリウム、pH9.6)中0.5μ/mLの濃度で、96ウェルマイクロタイタープレートの半分に一晩2〜8℃で被覆した。被覆後、タンパク質の非特異的な付着を防ぐために、Blocking Buffer(0.15MのNaCl、0.1Mリン酸ナトリウム、0.1%魚ゼラチン、0.05%ポリソルベート20、0.05%Proclin(登録商標)300[Sigma−Aldrich];Assay Diluentとも称される)を用いて該プレートをブロックした。標準物質、コントロール及び試料を、Assay Diluent(0.15M NaCl、0.1M リン酸ナトリウム、0.1%魚ゼラチン、0.05%ポリソルベート20、0.05%Proclin(登録商標)300 [Sigma−Aldrich])に希釈し、次いで別々のウェルに二つ組で充填し、室温(22〜27℃)で2時間インキュベートした。PLBL2は、試料中に存在する場合、被覆(本明細書では捕捉とも言われる)抗体に結合するであろう。上記のインキュベーション工程の後、Wash Buffer(0.05%ポリソルベート20/PBS[Corning cellgro カタログ番号99−717−CM])を用いて未結合材料を洗い流し、ビオチンコンジュゲート15G11抗PLBL2マウスモノクローナル抗体をAssay Diluentに濃度0.03125μ/mLまで希釈し、マイクロタイタープレートのウェルに添加した。
上の実施例3で述べたハムスターPLBL2 ELISAアッセイを使用して、本発明者らは、異なる条件下でPLBL2の混入量を定量化するために、CHO細胞中で産生された種々のモノクローナル抗体(mAb)調製物を評価した。本発明者らは、未精製の収集細胞培養液(HCCF)のみならず精製調製物の複数回の試験を評価した。場合によっては、比較のために、本発明者らはLC−MS/MSによりPLBL2ペプチドの量も定量化した。LC−MS/MS法は以下の通り実施された。
組換え抗体又はイムノアドヘシン調製物といった組換えポリペプチド試料中のCHOP不純物であるPLBL2を検出し定量化するためのELISAアッセイが開発された。手順は以下の通り。アフィニティー精製ウサギポリクローナル抗体を、炭酸バッファー(0.05Mの炭酸ナトリウム、pH9.6)中0.5/mLの濃度で、96ウェルマイクロタイタープレートの半分に一晩2〜8℃で被覆した。被覆後、タンパク質の非特異的な付着を防ぐために、Blocking Buffer(0.15M NaCl、0.1Mリン酸ナトリウム、0.1%魚ゼラチン、0.05%Polysorbate20、0.05%Proclin(登録商標)300[Sigma−Aldrich])を用いて該プレートをブロックした。標準物質、コントロール及び試料を、Assay Diluent(0.15MのNaCl、0.1Mのリン酸ナトリウム、0.1%魚ゼラチン、0.05%Polysorbate20、0.05%Proclin(登録商標)300[Sigma−Aldrich])中に希釈し、次いで別々のウェルに二つ組で充填し、室温(22〜27℃)で2時間インキュベートした。PLBL2が試料中に存在する場合、被覆抗体(本明細書では捕捉抗体とも称される)に結合させる。上記のインキュベーション工程の後、Wash Buffer(0.05%Polysorbate20/PBS[Corning Cellgro カタログ番号99−717−CM])を用いて未結合材料を洗い流し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートアフィニティー精製ウサギポリクローナル抗体をAssay Diluentに濃度40ng/mLまで希釈し、マイクロタイタープレートのウェルに添加した。
本発明者らは、実施例5に記載のポリローナルPLBL2 ELISAアッセイを使用し、mAb Gの最終的な限外濾過/ダイアフィルトレーション(UFDF)工程を伴う3カラムクロマトグラフィー精製プロセスによってPLBL2のクリアランスを評価した。結果を図7に示す。モノクローナルPLBL2 ELISAアッセイで見られたように、PLBL2レベルはHCCF中で最も高く、該精製プロセスは最終的なmAb G調製物からPLBL2を取り除くのに有効であった。ポリクローナルPLBL2 ELISAアッセイは、良好な感度及び特異性を実証し、未精製HCCF中のPLBL2レベルを精製の各段階で定量化するのに有効であった。本発明者らは、PLBL2 ELISAアッセイがトータルCHOPアッセイで見られた「抗原過剰」問題の対象ではないことを示す、様々な生産物希釈度での直線性を認めた。
まとめると、これらのデータは、本明細書に記載のモノクローナル及びポリクローナルPLBL2 ELISAアッセイの各々が強固で特異的且つ高感度であることを示している。各アッセイが、様々な精製条件下で広範囲のPLBL2レベルを有する多数の異なるMAb調製物に混入しているハムスターPLBL2 CHOPを正確に定量化できることを本発明者らは示した。本発明者らはまた、PLBL2 ELISAアッセイが、不純物クリアランスをモニターするために精製プロセスの各工程中に使用されうることも示した。したがって、本明細書に記載のモノクローナル及びポリクローナルPLBL2 ELISAアッセイの各々は、最終産物中のPLBL2レベルを定量化するためのみならず、精製プロセス進行中のクリアランスをモニターするための有効なツールである。
上記及び図4に示した通り、本発明者らは、異なるmAb産生細胞株間で、HCCF中のPLBL2レベルに大きな差異(幾つかの細胞株は他と比較して20倍のPLBL2レベルを有した)があることを認めた。このような大きな差異は、例えば下流の精製プロセスの負荷を削減するために、HCCF中に低レベルのPLBL2を生成する生産物細胞株、更に場合によっては宿主細胞株(すなわち、如何なる生産物も生成しない宿主細胞)を特定することが望まれることを示唆している。生産物細胞株に関して、大量の生産物と低量のPLBL2を同時に生成する株を特定することが望ましい。重要な問題は、大量の生産物と低量のPLBL2を生成するクローンを選択するために、生産物細胞株の異なるクローンをスクリーニングすることが可能であるどうかである。
Claims (59)
- 組換えポリペプチド調製物又は宿主細胞株から得られる試料中のハムスターホスホリパーゼB様2タンパク質(PLBL2)を検出するためのイムノアッセイ法であって、
(a)ハムスターPLBL2に結合する一次捕捉抗体を試料と接触させ、それにより試料−捕捉抗体結合材料を生成すること、
(b)ハムスターPLBL2に結合する二次検出抗体を試料−捕捉抗体結合材料と接触させること、及び
(c)試料−捕捉抗体結合材料に結合する二次抗体を検出すること
を含み、
一次捕捉抗体が、配列番号15のアミノ酸配列を含むCDRH1、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDRH2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むCDRH3を含む可変重鎖領域、並びに配列番号20のアミノ酸配列を含むCDRL1、配列番号21のアミノ酸配列を含むCDRL2、及び配列番号22のアミノ酸配列を含むCDRL3を含む可変軽鎖領域を含む可変領域を含む、及び/又は
二次検出抗体が、配列番号5のアミノ酸配列を含むCDRH1、配列番号6のアミノ酸配列を含むCDRH2、及び配列番号7のアミノ酸配列を含むCDRH3を含む可変重鎖領域、並びに配列番号10のアミノ酸配列を含むCDRL1、配列番号11のアミノ酸配列を含むCDRL2、及び配列番号12のアミノ酸配列を含むCDRL3を含む可変軽鎖領域を含む可変領域を含む
方法。 - 捕捉抗体が、結合に関して検出抗体と競合せず、検出抗体とは異なるエピトープに結合する、請求項1に記載の方法。
- 標準的な滴定曲線を使用して、結合した二次検出抗体のレベルを定量化することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 試料中に存在するハムスターPLBL2の量を、結合した二次検出抗体のレベルに基づいて算出することを更に含む、請求項3に記載の方法。
- イムノアッセイが電気化学発光(ECL)アッセイである、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- イムノアッセイがサンドイッチアッセイである、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- サンドイッチアッセイが、酵素結合免疫吸着法(ELISA)である、請求項6に記載の方法。
- 組換えポリペプチド調製物又は宿主細胞株が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株から得られる、請求項1に記載の方法。
- 試料が収集細胞培養液である、請求項8に記載の方法。
- 試料が組換えポリペプチド調製物から得られ、組換えポリペプチド調製物は一又は複数のクロマトグラフィー精製工程に供されている、請求項8に記載の方法。
- 組換えポリペプチド調製物が最終精製産物である、請求項10に記載の方法。
- 組換えポリペプチド調製物中に含まれる組換えポリペプチドが抗体又はイムノアドヘシンである、請求項1に記載の方法。
- 抗体が、多重特異性抗体、二重特異性抗体、半抗体又は抗体断片である、請求項12に記載の方法。
- 組換えポリペプチドがIgGである、請求項12に記載の方法。
- 組換えポリペプチドが、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4から選択される、請求項14に記載の方法。
- 組換えポリペプチドがIgG1である、請求項15に記載の方法。
- 組換えポリペプチドがIgG4である、請求項16に記載の方法。
- ハムスターホスホリパーゼB様2に結合するモノクローナル抗体であって、配列番号15のアミノ酸配列を含むCDRH1、配列番号16のアミノ酸配列を含むCDRH2、及び配列番号17のアミノ酸配列を含むCDRH3を含む可変重鎖領域、並びに配列番号20のアミノ酸配列を含むCDRL1、配列番号21のアミノ酸配列を含むCDRL2、及び配列番号22のアミノ酸配列を含むCDRL3を含む可変軽鎖領域を含む可変領域を含む抗体。
- 配列番号14のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域を含む、請求項18に記載の抗体。
- 配列番号19のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む、請求項18に記載の抗体。
- 配列番号14のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域、及び配列番号19のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む可変領域を含む、請求項18に記載の抗体。
- 配列番号13のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号18のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項21に記載の抗体。
- ハムスターホスホリパーゼB様2に結合するモノクローナル抗体であって、配列番号5のアミノ酸配列を含むCDRH1、配列番号6のアミノ酸配列を含むCDRH2、及び配列番号7のアミノ酸配列を含むCDRH3を含む可変重鎖領域、並びに配列番号10のアミノ酸配列を含むCDRL1、配列番号11のアミノ酸配列を含むCDRL2、及び配列番号12のアミノ酸配列を含むCDRL3を含む可変軽鎖領域を含む可変領域を含む抗体。
- 配列番号4のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域を含む、請求項23に記載の抗体。
- 配列番号9のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む、請求項23に記載の抗体。
- 配列番号4のアミノ酸配列を含む可変重鎖領域、及び配列番号9のアミノ酸配列を含む可変軽鎖領域を含む可変領域を含む、請求項23に記載の抗体。
- 配列番号3のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項26に記載の抗体。
- 捕捉抗体が、請求項18から22の何れか一項に記載の抗体を含む、請求項1から17の何れか一項に記載の方法。
- 検出抗体が、請求項23から27の何れか一項に記載の抗体を含む、請求項1から17の何れか一項に記載の方法。
- 捕捉抗体が請求項18から22の何れか一項に記載の抗体を含み、検出抗体が請求項23から27の何れか一項に記載の抗体を含む、請求項1から17の何れか一項に記載の方法。
- 検出抗体がビオチンにコンジュゲートしている、請求項1から17の何れか一項又は請求項28から30の何れか一項に記載の方法。
- 検出抗体がホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートしている、請求項1から17の何れか一項又は請求項28から30の何れか一項に記載の方法。
- 請求項18から22の何れか一項に記載の捕捉抗体、及び/又は請求項23から27の何れか一項に記載の検出抗体を含む、ハムスターホスホリパーゼB様2タンパク質の検出のためのイムノアッセイキット。
- 請求項18から22の何れか一項に記載の捕捉抗体、及び請求項23から27の何れか一項に記載の検出抗体を含む、請求項33に記載のイムノアッセイキット。
- イムノアッセイがECLイムノアッセイである、請求項33又は34に記載のイムノアッセイキット。
- イムノアッセイがELISAイムノアッセイである、請求項33又は請求項34に記載のイムノアッセイキット。
- 宿主細胞株から得られる試料中のPLBL2を検出することを含む、ハムスターPLBL2の発現のための宿主細胞株のスクリーニング方法。
- PLBL2を検出することが、請求項1又は2或いは8又は9の何れか一項に記載のイムノアッセイ法を含む、請求項37に記載の方法。
- 試料が全細胞培養液である、請求項38に記載の方法。
- 試料中のハムスターPLBL2の量を、請求項4から7の何れか一項に記載の方法に従って算出することを更に含む、請求項38に記載の方法。
- 低量のハムスターPLBL2を発現する最適な宿主細胞株を、二以上の宿主細胞株から成る群から選択する方法であって、
(i)二以上の宿主細胞株の各々から宿主細胞株試料を得ること、
(ii)試料中のハムスターホスホリパーゼB様2タンパク質(PLBL2)を検出するためのイムノアッセイ方法に従って各宿主細胞株試料中のPLBL2の量を算出することであって、該方法が
(a)ハムスターPLBL2に結合する一次捕捉抗体を試料と接触させ、それにより試料−捕捉抗体結合材料を生成すること;
(b)ハムスターPLBL2に結合する二次検出抗体を試料−捕捉抗体結合材料と接触させること;
(c)試料−捕捉抗体結合材料に結合する二次抗体を検出すること;
(d)標準的な滴定曲線を使用して、結合した二次検出抗体のレベルを定量化すること;
(e)試料中に存在するハムスターPLBL2の量を、結合した二次検出抗体のレベルに基づいて算出すること
を含み、
(iii)各宿主細胞株試料中のPLBL2の量を、その群の宿主細胞株試料の各々におけるPLBL2の量と比較すること、
(iv)その群の宿主細胞株試料の各々と比較して最低量のPLBL2を有する宿主細胞株試料を特定し、それにより、その群から特定された最低量のPLBL2を有する宿主細胞株を生成すること、及び
(v)最適な宿主細胞株として(iv)の特定された宿主細胞株を選択すること
を含む方法。 - 二以上の宿主細胞株の各々がCHO細胞株である、請求項41に記載の方法。
- 各宿主細胞株試料が収集細胞培養液である、請求項42に記載の方法。
- 各宿主細胞株試料が全細胞培養液である、請求項42に記載の方法。
- 生産物細胞株である組換えポリペプチド発現細胞株を、ハムスターPLBL2の発現についてスクリーニングする方法であって、生産物細胞株から得られる試料中のPLBL2を検出することを含む方法。
- PLBL2を検出することが、請求項1又は2或いは8から17の何れか一項に記載のイムノアッセイ法を含む、請求項45に記載の方法。
- 試料中のハムスターPLBL2の量を、請求項4から7の何れか一項に記載の方法に従って算出することを更に含む、請求項46に記載の方法。
- 試料中の生産物を検出して生産物の量を定量化することを含む、生産物の発現についてのスクリーニングを更に含む、請求項45から47の何れか一項に記載の方法。
- 生産物を検出することと、生産物の量を定量化することが、分光光度法又はアフィニティークロマトグラフィー法を含む、請求項48に記載の方法。
- 二以上の組換えポリペプチド発現細胞株から成る群より最適な組換えポリペプチド発現細胞株を選択する方法であって、二以上の組換えポリペプチド発現細胞株の各々は生産物細胞株であり、最適な組換えポリペプチド発現細胞株は最適な生産物細胞株であり、各生産物細胞株は同一の生産物を発現し、最適な生産物細胞株は低量のハムスターPLBL2及び大量の生産物を発現し、
(i)二以上の生産物細胞株の各々から生産物細胞株試料を得ること、
(ii)試料中のハムスターホスホリパーゼB様2タンパク質(PLBL2)を検出するためのイムノアッセイ方法に従って各宿主細胞株試料中のPLBL2の量を算出することであって、該方法が
(a)ハムスターPLBL2に結合する一次捕捉抗体を試料と接触させ、それにより試料−捕捉抗体結合材料を生成すること;
(b)ハムスターPLBL2に結合する二次検出抗体を試料−捕捉抗体結合材料と接触させること;
(c)試料−捕捉抗体結合材料に結合する二次抗体を検出すること;
(d)標準的な滴定曲線を使用して、結合した二次検出抗体のレベルを定量化すること;
(e)試料中に存在するハムスターPLBL2の量を、結合した二次検出抗体のレベルに基づいて算出すること
を含み、
(iii)生産物を検出し、各生産物細胞株試料中の生産物の量を定量化すること、
(iv)各生産物細胞株試料中のPLBL2の量を、その群の生産物細胞株試料の各々におけるPLBL2の量と比較すること、
(v)各生産物細胞株試料中の生産物の量を、その群の生産物細胞株試料の各々における生産物の量と比較すること、
(vi)その群の生産物細胞株試料の各々と比較して最低量のPLBL2且つ最高量の生産物を有する生産物細胞株試料を特定し、それにより、その群から特定された最低量のPLBL2且つ最高量の生産物を有する生産物細胞株を生成すること、及び
(vii)最適な生産物細胞株として(vi)の特定された生産物細胞株を選択すること
を含む方法。 - 二以上の組換えポリペプチド発現細胞株から成る群より最適な組換えポリペプチド発現細胞株を選択する方法であって、二以上の組換えポリペプチド発現細胞株の各々は生産物細胞株であり、最適な組換えポリペプチド発現細胞株は最適な生産物細胞株であり、各生産物細胞株は同一の生産物を発現し、最適な生産物細胞株は低量のハムスターPLBL2及び大量の生産物を発現し、
(i)二以上の生産物細胞株の各々から生産物細胞株試料を得ること、
(ii)試料中のハムスターホスホリパーゼB様2タンパク質(PLBL2)を検出するためのイムノアッセイ方法に従って各宿主細胞株試料中のPLBL2の量を算出することであって、該方法が
(a)ハムスターPLBL2に結合する一次捕捉抗体を試料と接触させ、それにより試料−捕捉抗体結合材料を生成すること;
(b)ハムスターPLBL2に結合する二次検出抗体を試料−捕捉抗体結合材料と接触させること;
(c)試料−捕捉抗体結合材料に結合する二次抗体を検出すること;
(d)標準的な滴定曲線を使用して、結合した二次検出抗体のレベルを定量化すること;
(e)試料中に存在するハムスターPLBL2の量を、結合した二次検出抗体のレベルに基づいて算出すること
を含み、
(iii)生産物を検出し、各生産物細胞株試料中の生産物の量を定量化すること、
(iv)各生産物細胞株試料について、生産物の量に対するPLBL2の量の比率を算出すること、
(v)各生産物細胞株試料について算出した該比率を、その群の生産物細胞株試料の各々と比較すること、
(vi)その群の最も低い該比率を有する生産物細胞株試料を特定し、それにより、その群から特定された、最低量のPLBL2且つ最高量の生産物を有する生産物細胞株を生成すること、及び
(vii)最適な生産物細胞株として(vi)の特定された生産物細胞株を選択すること
を含む方法。 - 二以上の各生産物細胞株がCHO細胞株である、請求項50又は51に記載の方法。
- 各生産物細胞株試料が収集細胞培養液である、請求項52に記載の方法。
- 生産物が抗体又はイムノアドヘシンである、請求項45、50又は51の何れか一項に記載の方法。
- 抗体が、多重特異性抗体、二重特異性抗体、半抗体又は抗体断片である、請求項54に記載の方法。
- 生産物がIgGである、請求項54に記載の方法。
- 生産物が、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4から選択される、請求項54に記載の方法。
- 生産物がIgG1である、請求項57に記載の方法。
- 生産物がIgG4である、請求項57に記載の方法。
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