CN109307771A - 亲和层析定量检测重组人α干扰素工艺中间体含量的方法 - Google Patents

亲和层析定量检测重组人α干扰素工艺中间体含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及亲和层析定量检测重组人α干扰素生产工艺中间体含量的方法，包括：1)表达重组人α干扰素的工程菌构建；2)发酵工程菌并分离纯化以可溶性蛋白或包涵体形式表达的目的蛋白。其中蛋白纯化包括粗纯和精纯，利用硫酸铵盐析沉淀获得蛋白粗品，粗品经DEAE阴离子交换柱层析纯化得到中间体，用单抗亲和层析柱定量检测中间体中重组人α干扰素的含量。本方法适于重组人α干扰素和重组集成干扰素生产工艺中间体的定量检测，优点是操作简单、快速、准确，根据得到的干扰素浓度数据可以改进人们对生产过程的认知程度和控制程度，使得可靠、快速、直接、容易地评估干扰素生产关键环节成为可能，以实现精确质量控制的目的。

Description

亲和层析定量检测重组人α干扰素工艺中间体含量的方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及亲和层析定量检测重组人α干扰素工艺中间体含量的方法。
背景技术
质量可控是药品研发、生产的重要环节，是保证药品安全、有效的前提，也是新药研究的主要课题之一。蛋白质含量测定法，是生物制品质量控制中最基本的分析方法之一。目前，药品含量质量控制的重点主要集中在原液和制剂成品上，而忽略了对生产过程及其中间体的质量控制。且又由于药品尤其是生物药物制品工艺的复杂性，在每一次纯化分离中均会有不同程度的主成分蛋白损失和相关蛋白干扰影响，因此对于含量复杂的中间体而言，建立一种特异性高，灵敏度强的中间品蛋白含量检测方法，对于生物制品的工艺过程控制具有十分重要的作用。
亲和层析属于液相色谱，它是以共价偶联了亲和配体的介质为固定相来吸附或研究与其发生相互作用的分子。亲和配体可以是蛋白分子、酶、抗体、抗原，也可以是一段DNA或RNA序列、仿生染料、酶的底物或抑制剂、小分子化合物(如药物或激素)等。很多亲和配体具有很高的选择性，将偶联了配体的介质装在柱子中，可以很好的用于分离、检测或研究复杂样品中的目标分子。
亲和层析介质主要由三部分组成：配体、间隔臂、基质。配体是决定亲和层析成功与否的一个重要因素。根据配体的类型，可以将亲和层析进行分类，如凝集素亲和层析、硼酸盐亲和层析、免疫亲和层析、金属螯合亲和层析等。在设计和使用亲和层析柱时，偶联配体所使用的基质的类型也很重要。以琼脂糖或纤维素等多糖类物质为基质的亲和层析介质常用于样品预处理或者靶分子的分离纯化。这种基质易于修饰和活化，有利于基质和配体的偶联，并且具有较好的物理化学稳定性，非特异性吸附少。
首先，要选择合适的样品处理缓冲液以利于目标分子与配体的结合。将处理好的样品上到亲和层析柱上，与配体无相互作用或作用弱的分子从柱子上穿出；然后通过更改流动相的pH或添加竞争剂，使目标分子与配体解离从而被洗脱下来。根据目标分子的性质，可以通过紫外吸收、荧光、质谱等方法对其进行检测。亲和层析的分离过程简单、快速，具有较高的选择性。
免疫亲和层析是利用生物体内存在的抗原、抗体之间高度特异性的亲和力进行分离的方法。多糖琼脂糖凝胶载体通过CNRr活化后与具有免疫亲和性的蛋白结合，产生的物质和N一羟基丁二酞亚胺作用，在具有抗体的溶液中反应，最后就能得到亲和载体，可用来分离抗体和抗原。以抗体为配体，免疫亲和层析可以用于分离纯化激素、酶、多肽、病毒等。以抗原或蛋白A/G为配体，可以对抗体进行纯化。免疫亲和层析广泛用于生物医学和药物分析中样品的分离和预处理。另外，除了可以利用亲和层析的吸附作用来富集目标分子外，同样也可以利用亲和层析来去除样品中影响分析的分子。如在蛋白组学的研究中，可以用亲和层析柱先去除白蛋白、IgG等高丰度蛋白，再研究低丰度蛋白。
目前尚未见用免疫亲和层析对蛋白中间体进行定量分析的相关报道，一方面，用于特异蛋白吸附的配基抗体不易大量获得，另一方面，得到的抗体纯度必须高以保证特异性。干扰素是细胞免疫的重要成分，目前广泛应用于病毒性肝炎、肿瘤和一些其他病毒感染的治疗中。干扰素的检测和重组人干扰素的纯化工艺均需要高质量的单克隆抗体，特别是在生产重组人干扰素工艺中，单克隆抗体亲和层析是干扰素生产工艺中最重要的步骤，制备大剂量干扰素，需要高效单抗亲和层析柱。特别是对于中间体含量复杂的重组人干扰素生产工艺来说，对其进行准确快速的浓度测定有难度，因此急需建立一套对生物药物制品中间体含量质量控制的有效方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于免疫亲和层析定量检测重组人α干扰素生产工艺中间体含量的方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的亲和层析定量检测重组人α干扰素生产工艺中间体含量的方法，包括以下步骤：
1)表达重组人α干扰素的工程菌构建；
2)发酵工程菌并分离纯化以可溶性蛋白或包涵体形式表达的目的蛋白；
其中，步骤2)蛋白纯化包括粗纯和精纯，利用硫酸铵盐析沉淀获得蛋白粗品，粗品经DEAE阴离子交换柱层析纯化得到中间体，用单抗亲和层析柱定量检测中间体中重组人α干扰素的含量。
本发明利用固定化干扰素抗体纯化相应的干扰素，主要包括3个步骤，首先用中性的缓冲溶液平衡亲和柱，让含有相应干扰素的溶液通过亲和柱。其次是洗去非特异性吸附蛋白，在标准操作中，应该用同样的缓冲液洗去非特异性结合的蛋白，但如果要达到更好的效果，可以用偏酸(pH值5.5)、偏碱(pH值8.5)或带有表面活性剂的缓冲溶液洗柱子。最后是目的蛋白的洗脱，通常用pH值为2.0-2.5的缓冲溶液洗脱，为了保持抗体的天然构象，缓冲液的pH值也可以用1mol/L磷酸盐缓冲液(pH值7.0)调整。对蛋白溶液，通常可以应用210-215nm或者是280nm处的紫外吸收法来检测。这种方法得到的色谱图一般包括两个峰，第一个峰代表非特异性吸附的物质，第二个峰代表了被分析的物质，而且第二个峰的保留时间可以通过控制加入洗脱剂的时间而改变。对供试品色谱图第二个峰进行积分，得到峰面积与标准品峰面积进行比对，即可得到供试品浓度。
前述的方法，步骤2)用单抗亲和层析柱定量检测中间体中重组人α干扰素的含量，具体方法为：
①用pH6.0-8.0的PBS液配制系列浓度的重组人α干扰素标准品溶液；
②将标准品溶液加至平衡好的单抗亲和层析柱中，依次用流动相A和流动相B进行洗脱，收集重组人α干扰素洗脱峰(用NaOH调pH至中性)，以标准品浓度对峰面积作图，绘制标准曲线；
③用pH6.0-8.0的PBS液配制中间体的供试品溶液至浓度0.5-30mg/mL(优选1mg/mL)，将供试品溶液加至平衡好的单抗亲和层析柱中，按照与步骤②相同的操作，并对供试品溶液洗脱峰的峰面积进行分析，代入上述标准曲线，即得供试品溶液中重组人α干扰素的含量水平；
其中，步骤②、③中所述流动相A为15-100mM，pH6.0-8.0的PBS缓冲液；所述流动相B为含有0.05-0.2M Gly和0.1-0.3M NaCl的水溶液，pH2-3。优选地，所述流动相A为25mM，pH7.0的PBS缓冲液；所述流动相B为含有0.1M Gly和0.2M NaCl的水溶液，pH2.5。
步骤②具体为：用流动相A平衡所述单抗亲和层析柱，然后将标准品溶液加至平衡好的单抗亲和层析柱中，依次用不少于2个柱体积流动相A、不少于5个柱体积流动相B及不少于5个柱体积流动相A进行洗脱；流动相线速度为0.5-3cm/min(优选1.274cm/min)；检测波长为280nm。优选地，依次用3个柱体积流动相A、6个柱体积流动相B及5个柱体积流动相A进行洗脱。
步骤2)所述单抗亲和层析柱中的填料是由抗重组人α干扰素单克隆抗体与CNBr-Act-Sepharose 4B偶联制备而成。
其中，所述抗重组人α干扰素单克隆抗体由杂交瘤细胞BTP-mAb4D9D1E7分泌产生。BTP-mAb4D9D1E7是分泌抗重组人α干扰素和重组集成干扰素的单克隆抗体细胞系。该细胞系由国家实验细胞资源共享平台北京协和细胞资源中心提供。所述单克隆抗体可以中和重组人干扰素α1b、α2b、α2a和重组集成干扰素四种抗原。
步骤2)所述单抗亲和层析柱中填料的制备方法如下：
将10-15mL 1mM HCl加入1-5g的CNBr-Act-Sepharose 4B中浸泡凝胶，抽洗；然后，用偶联缓冲液洗涤凝胶；加入10-24mg/ml单克隆抗体进行偶联，单克隆抗体与凝胶的体积比为2-20:1，室温、4小时内不停地摇动；然后，用3-5个体积的偶联缓冲液漂洗，除去剩余的单克隆抗体；加入0.05-0.2M pH8.0甘氨酸静止封闭2h；然后，用偶联缓冲液洗柱，再依次用0.1-0.5M pH4.0醋酸盐，0.1-0.5mol/L NaCl洗柱，即得所述单抗亲和层析柱，于4℃备用；
其中，所述偶联缓冲液为含有0.1-0.5M pH8.3NaHCO3和0.1-0.5mol/L NaCl的水溶液。
优选地，单抗亲和层析柱中填料的制备方法如下：
将10mL 1mM HCl加入1g的CNBr-Act-Sepharose 4B中浸泡凝胶，抽洗；然后，用偶联缓冲液洗涤凝胶；加入24mg/ml单克隆抗体进行偶联，单克隆抗体与凝胶的体积比为2:1，室温、4小时内不停地摇动；然后，用5个体积的偶联缓冲液漂洗，除去剩余的单克隆抗体；加入0.1M pH8.0甘氨酸静止封闭2h；然后，用偶联缓冲液洗柱，再依次用0.1M pH4.0醋酸盐，0.5mol/L NaCl洗柱，即得所述单抗亲和层析柱，于4℃备用。
本发明中，1mL CNBr-Act-Sepharose 4B凝胶可结合约10-40mg单抗，将制备的亲和层析柱用于提纯重组人α干扰素，每mL亲和层析介质可洗脱约0.5-3mg干扰素，获得的干扰素纯度95％以上。本方法适于重组人α干扰素和重组集成干扰素生产工艺中间体的定量检测，特别适合于大批量干扰素制备工艺，使大批量干扰素制品热原质试验达到中国药典标准。
在本发明的一个具体实施方式中，将所述重组人α干扰素的编码基因插入表达载体pET-23b中得到重组质粒，然后用所述重组质粒转化大肠杆菌BL21，即得重组工程菌；对重组工程菌进行发酵培养，诱导表达。
相应地，蛋白纯化依次包括发酵液离心收集菌体，菌体裂解，离心，复性，硫酸铵盐析沉淀，透析获得蛋白粗品，粗品经DEAE阴离子交换柱层析纯化得到中间体，用单抗亲和层析柱定量检测中间体中重组人α干扰素的含量。
其中，粗纯的具体方法如下：将发酵收集的菌体以TE溶解，超声破菌后离心收集包涵体，然后用6-8M的盐酸胍溶解，室温搅拌2-6h，再用浓度为0.1-0.2M、pH9-10的硼酸复性，复性液置于4℃过夜；4℃离心取上清，即得蛋白粗品。
利用DEAE阴离子交换柱层析纯化蛋白粗品的具体方法如下：将粗纯所得上清于15-50mM pH7.0-9.0的Tris-HCl中4℃过夜透析；1℃离心取上清；再上样至用15-50mMpH7.0-9.0Tris-HCl液平衡好的DEAE SepharoseTM FF层析柱，上样后用3-5个柱体积的平衡液冲洗，用含有0.1-0.7M NaCl的15-50mM pH7.0-9.0Tris-HCl溶液洗脱，收集洗脱峰组分。
所述重组人α干扰素包括重组人干扰素α1b、α2b、α2a和重组集成干扰素。优选重组人干扰素α1b。
上述方法对重组人α干扰素α1b的定量检测范围为0.5-30mg/mL。
上述方法对重组人α干扰素检测下限为0.1mg/mL。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明基于免疫亲和层析定量检测法，将干扰素工艺中间品吸附于带固定化抗体的亲和柱上，洗脱流出液直接进入检测器，对供试品洗脱峰进行积分，得到峰面积与标准品峰面积进行比较，即可得到供试品浓度。本方法的优点是操作简单、快速、准确，根据得到的干扰素浓度数据可以改进人们对生产过程的认知程度和控制程度，使得可靠、快速、直接、容易地评估干扰素生产关键环节成为可能，以实现精确质量控制的目的。
附图说明
图1A-a、b为本发明实施例3中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体准确度验证实验上样干扰素标准品蛋白含量1mg实验图谱、积分图。
图1B-a、b为本发明实施例3中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体准确度验证实验上样干扰素标准品蛋白含量1.5mg实验图谱、积分图。
图1C-a、b为本发明实施例3中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体准确度验证实验上样干扰素标准品蛋白含量2mg实验图谱、积分图。
图1D-a、b为本发明实施例3中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体准确度验证实验上样干扰素标准品蛋白含量5mg实验图谱、积分图。
图2A-a、b为本发明实施例4中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体精密度验证实验第一天第一次进样实验图谱、积分图。
图2B-a、b为本发明实施例4中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体精密度验证实验第一天第二次进样实验图谱、积分图。
图2C-a、b为本发明实施例4中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体精密度验证实验第一天第三次进样实验图谱、积分图。
图2D-a、b为本发明实施例4中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体精密度验证实验第四天第一次进样实验图谱、积分图。
图2E-a、b为本发明实施例4中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体精密度验证实验第四天第二次进样实验图谱、积分图。
图2F-a、b为本发明实施例5中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体精密度验证实验第四天第三次进样实验图谱、积分图。
图3A-a、b为本发明实施例5中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体线性验证实验上样干扰素标准品蛋白含量1mg实验图谱、积分图。
图3B-a、b为本发明实施例5中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体线性验证实验上样干扰素标准品蛋白含量2mg实验图谱、积分图。
图3C-a、b为本发明实施例5中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体线性验证实验上样干扰素标准品蛋白含量5mg实验图谱、积分图。
图3D-a、b为本发明实施例5中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体线性验证实验上样干扰素标准品蛋白含量7.5mg实验图谱、积分图。
图3E-a、b为本发明实施例5中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体线性验证实验上样干扰素标准品蛋白含量8.75mg实验图谱、积分图。
图3F为本发明实施例5中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体线性验证实验上样干扰素标准品蛋白含量对峰面积线性图。
图4A-a、b为本发明实施例6中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体加样回收率验证实验上样干扰素标准品0.4ml实验图谱、积分图。
图4B-a、b为本发明实施例6中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体加样回收率验证实验上样干扰素工艺中间品1.55ml实验图谱、积分图。
图4C-a、b为本发明实施例6中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体加样回收率验证实验上样供试品1 1.95ml实验图谱、积分图。
图4D-a、b为本发明实施例6中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体加样回收率验证实验上样干扰素标准品0.3ml实验图谱、积分图。
图4E-a、b为本发明实施例6中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体加样回收率验证实验上样干扰素工艺中间品1.65ml实验图谱、积分图。
图4F-a、b为本发明实施例6中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体加样回收率验证实验上样供试品2 1.95ml实验图谱、积分图。
图4G-a、b为本发明实施例6中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体加样回收率验证实验上样干扰素标准品0.2ml实验图谱、积分图。
图4H-a、b为本发明实施例6中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体加样回收率验证实验上样干扰素工艺中间品1.75ml实验图谱、积分图。
图4I-a、b为本发明实施例6中免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体加样回收率验证实验上样供试品3 1.95ml实验图谱、积分图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1抗重组人α干扰素单克隆抗体的获得及亲和力分析
本发明采用的免疫抗原为纯化重组人干扰素α，免疫动物为6周龄雄性BALB/C小鼠。从中获得40株抗重组人α干扰素的单克隆抗体阳性细胞株。其中BTP-mAb4D9D1E7是分泌抗重组人α干扰素和重组集成干扰素的单克隆抗体细胞系。BTP-mAb4D9D1E7腹水单克隆抗体效价为1:10000-30000。体外连续传代6个月，分泌抗体能力稳定，特异性专一；单克隆抗体亚类为IgG1。
单克隆抗体对重组人α干扰素和重组集成干扰素的特异性及亲和力分析如下：
将1-10μg/ml的重组人α干扰素和重组集成干扰素进行固相载体包被，使用牛血清白蛋白溶液进行封闭过夜；1-10μg/ml的腹水单克隆抗体加样孵育1-2小时；使用抗体洗液洗去多余的抗体；1：6000-8000稀释后的商业化辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(H+L)抗体加样孵育1-2小时；使用抗体洗液洗去多余的抗体；加入TMB底物显色液进行显色。在化学发光酶标仪中在450nm处读数检测。计算各抗原与抗体结合的效价值。
以1-5μg/ml进行浓度倍比稀释分别包被到96孔酶标板上，使用牛血清白蛋白溶液进行封闭过夜；1：100-1：32000倍比梯度稀释的腹水单克隆抗体加样孵育1-2小时；使用抗体洗液洗去多余的抗体；100μl/孔，4℃过夜；1：6000-8000稀释后的商业化辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(H+L)抗体加样孵育1-2小时；使用抗体洗液洗去多余的抗体；加入TMB底物显色液进行显色。在化学发光酶标仪中在450nm处读数检测。
以抗体浓度作为横坐标，相应OD450值为纵坐标。分别绘制三个抗原浓度所对应的ELISA曲线，计算各抗原的亲和常数Kaff值。结果显示，重组人α干扰素和重组集成干扰素与腹水单克隆抗体的结合效价均大于1：10000；亲和常数Kaff值均大于1.0×1010L/mol。
实施例2亲和层析定量检测重组人α干扰素α1b生产工艺中间体含量的方法
1、表达重组人α干扰素α1b的工程菌构建
将所述重组人α干扰素α1b的编码基因插入表达载体pET-23b中得到重组质粒，然后用所述重组质粒转化大肠杆菌BL21，即得重组工程菌。对重组工程菌进行发酵培养，诱导表达。具体可参见CN201010189352.8。
2、发酵工程菌并分离纯化以可溶性蛋白或包涵体形式表达的目的蛋白
蛋白纯化包括粗纯和精纯，利用硫酸铵盐析沉淀获得蛋白粗品，粗品经DEAE阴离子交换柱层析纯化得到中间体，用单抗亲和层析柱定量检测中间体中重组人α干扰素的含量。
2.1粗纯：依次包括发酵液离心收集菌体，菌体裂解，离心，复性，硫酸铵盐析沉淀，透析获得蛋白粗品。
具体方法如下：将发酵收集的菌体以TE溶解，超声破菌后离心收集包涵体，然后用7M的盐酸胍溶解，室温搅拌2-3h，再用浓度为0.15M、pH9.5的硼酸复性，复性液置于4℃过夜；4℃离心取上清，即得蛋白粗品。
2.2精纯
2.2.1利用DEAE阴离子交换柱层析纯化蛋白粗品的具体方法如下：将粗纯所得上清于25mM pH8.0的Tris-HCl中4℃过夜透析；4℃离心取上清；再上样至用25mM pH7.5Tris-HCl液平衡好的DEAE SepharoseTM FF层析柱，上样后用3-5个柱体积的平衡液冲洗，用含有0.2M NaCl的25mM pH7.5Tris-HCl溶液洗脱，收集洗脱峰组分。
2.2.2用单抗亲和层析柱定量检测中间体中重组人α干扰素的含量，具体方法为：
①用pH7.0的PBS液配制系列浓度的重组人α干扰素α1b标准品溶液；
②将标准品溶液加至平衡好的单抗亲和层析柱中，依次用流动相A和流动相B进行洗脱，收集重组人α干扰素洗脱峰(用NaOH调pH至中性)，以标准品浓度对峰面积作图，绘制标准曲线，得到峰面积与上样蛋白含量的关系曲线：y＝220.19x+22.13，式中y为峰面积，x为上样蛋白含量(单位：mg)；
③用pH7.0的PBS液将2.2.1中收集的洗脱峰组分稀释至浓度1mg/mL，将供试品溶液加至平衡好的单抗亲和层析柱中，按照与步骤②相同的操作，并对供试品溶液洗脱峰的峰面积进行分析，代入上述标准曲线，即得供试品溶液中重组人α干扰素的含量水平。
其中，步骤②、③中所述流动相A为25mM，pH7.0的PBS缓冲液；所述流动相B为含有0.1M Gly和0.2M NaCl的水溶液，pH2.5。
步骤②具体为：用流动相A平衡所述单抗亲和层析柱(洗脱柱子至基线)，然后将标准品溶液加至平衡好的单抗亲和层析柱中，依次用3个柱体积流动相A、6个柱体积流动相B及5个柱体积流动相A进行洗脱；流动相流速为1.274cm/min；检测波长为280nm；所述单抗亲和层析柱的内径为1cm，长度为6cm。
其中，所述单抗亲和层析柱中的填料是由抗重组人α干扰素单克隆抗体与CNBr-Act-Sepharose 4B偶联制备而成。填料的制备方法如下：将10mL 1mM HCl加入1g的CNBr-Act-Sepharose 4B中浸泡凝胶，抽洗；然后，用偶联缓冲液洗涤凝胶；加入24mg/ml单克隆抗体进行偶联，单克隆抗体与凝胶的体积比为2:1，室温、4小时内不停地摇动；然后，用5个体积的偶联缓冲液漂洗，除去剩余的单克隆抗体；加入0.1M pH8.0甘氨酸静止封闭2h；然后，用偶联缓冲液洗柱，再依次用0.1M pH4.0醋酸盐，0.5mol/L NaCl洗柱，即得所述单抗亲和层析柱，于4℃备用。
其中，所述偶联缓冲液为含有0.1M pH8.3NaHCO3和0.5mol/L NaCl的水溶液。
重组人α干扰素α1b的定量检测范围为0.5-30mg/mL，检测下限(检测灵敏度)为0.1mg/mL。
实施例3免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体准确度验证
实验材料：仪器：AKTA purifier、色谱柱：实施例1的单抗亲和层析柱、流动相A：25mM PBS，pH 7.0、流动相B：0.1M Gly-0.2M NaCl，用HCl调pH至2.5、上样样品：重组人α干扰素α1b标准品，浓度为5mg/ml。
实验方案：流速：1.274cm/min，检测波长：280nm，检测时间：65min，洗脱条件：100％A(3CV)-100％B(6CV)-100％A(5CV)。
实验步骤：用流动相A平衡好柱子后依次上样干扰素标准品0.2ml、0.3ml、0.4ml、1ml，完全收集目的蛋白洗脱峰，用NaOH调pH至中性，用微量lowry法检测浓度。
实验结果：以上样蛋白含量对收集的洗脱峰蛋白含量计算回收率，经计算证明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体准确度能达到90％-110％。
表1免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体准确度验证实验
上样蛋白含量(mg) 洗脱峰蛋白含量(mg) 回收率
1 1.01 101％
1.5 1.59 106％
2 1.99 99％
5 5.34 107％
图1A-a、b为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体准确度验证实验上样干扰素标准品蛋白含量1mg实验图谱、积分图。
图1B-a、b为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体准确度验证实验上样干扰素标准品蛋白含量1.5mg实验图谱、积分图。
图1C-a、b为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体准确度验证实验上样干扰素标准品蛋白含量2mg实验图谱、积分图。
图1D-a、b为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体准确度验证实验上样干扰素标准品蛋白含量5mg实验图谱、积分图。
实施例4免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体精密度验证
实验材料：仪器：AKTA purifier、色谱柱：实施例1的单抗亲和层析柱、流动相A：25mM PBS，pH 7.0、流动相B：0.1M Gly-0.2M NaCl，用HCl调pH至2.5、上样样品：重组人α干扰素α1b生产工艺中间品。
实验方案：流速：1.274cm/min，检测波长：280nm，检测时间：65min，洗脱条件：100％A(3CV)-100％B(6CV)-100％A(5CV)。
实验步骤：用流动相A平衡好柱子后第一天上样干扰素工艺中间品1ml，第四天上样同一批干扰素工艺中间品1ml，对目的蛋白洗脱峰峰面积进行积分。
实验结果：将上述6次实验得到的蛋白洗脱峰峰面积求平均值，计算其RSD为7％，证明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体精密度良好。
表2免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体精密度验证实验
峰面积
第一天第一针 1074.10
第一天第二针 887.89
第一天第三针 963.25
第四天第一针 1086.38
第四天第二针 1018.24
第四天第三针 998.40
均值 1004.71
STDEV 73.58
RSD 7％
图2A-a、b为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体精密度验证实验第一天第一次进样实验图谱、积分图。
图2B-a、b为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体精密度验证实验第一天第二次进样实验图谱、积分图。
图2C-a、b为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体精密度验证实验第一天第三次进样实验图谱、积分图。
图2D-a、b为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体精密度验证实验第四天第一次进样实验图谱、积分图。
图2E-a、b为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体精密度验证实验第四天第二次进样实验图谱、积分图。
图2F-a、b为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体精密度验证实验第四天第三次进样实验图谱、积分图。
实施例5免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体线性验证
实验材料：仪器：AKTA purifier、色谱柱：实施例1的单抗亲和层析柱、流动相A：25mM PBS，pH 7.0、流动相B：0.1M Gly-0.2M NaCl，用HCl调pH至2.5、上样样品：重组人α干扰素α1b标准品，浓度为5mg/ml。
实验方案：流速：1.274cm/min，检测波长：280nm，检测时间：65min，洗脱条件：100％A(3CV)-100％B(6CV)-100％A(5CV)。
实验步骤：用流动相A平衡好柱子后依次上样干扰素标准品0.2ml、0.4ml、1ml、1.5ml、1.75ml，对目的蛋白洗脱峰峰面积进行积分。
实验结果：以上样蛋白含量对峰面积作图，得到的线性曲线y＝220.19x+22.13，R2为0.9989，证明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体线性良好。
表3免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体线性验证实验
上样蛋白含量(mg) 峰面积
1 266.1
2 426.2
5 1134.4
7.5 1688.3
8.75 1935.3
图3A-a、b为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体线性验证实验上样干扰素标准品蛋白含量1mg实验图谱、积分图。
图3B-a、b为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体线性验证实验上样干扰素标准品蛋白含量2mg实验图谱、积分图。
图3C-a、b为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体线性验证实验上样干扰素标准品蛋白含量5mg实验图谱、积分图。
图3D-a、b为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体线性验证实验上样干扰素标准品蛋白含量7.5mg实验图谱、积分图。
图3E-a、b为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体线性验证实验上样干扰素标准品蛋白含量8.75mg实验图谱、积分图。
图3F为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体线性验证实验上样干扰素标准品蛋白含量对峰面积线性图。
实施例6免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体影响因素实验加样回收率验证
实验材料：仪器：AKTA purifier、色谱柱：实施例1的单抗亲和层析柱、流动相A：25mM PBS，pH 7.0、流动相B：0.1M Gly-0.2M NaCl，用HCl调pH至2.5、上样样品：重组人α干扰素α1b标准品、重组人α干扰素α1b生产工艺中间品。
实验方案：流速：1.274cm/min，检测波长：280nm，检测时间：65min，洗脱条件：100％A(3CV)-100％B(6CV)-100％A(5CV)。
上样样品预处理：供试品1：取干扰素标准品0.4ml加干扰素工艺中间品1.55ml制成供试品1 1.95ml；供试品2：取干扰素标准品0.3ml加干扰素工艺中间品1.65ml制成供试品2 1.95ml；供试品3：取干扰素标准品0.2ml加干扰素工艺中间品1.75ml制成供试品31.95ml。
实验步骤：用流动相A平衡好柱子后依次上样干扰素标准品0.4ml、干扰素工艺中间品1.55ml、供试品1 1.95ml；干扰素标准品0.3ml、干扰素工艺中间品1.65ml、供试品21.95ml；上样干扰素标准品0.2ml、干扰素工艺中间品1.75ml、供试品31.95ml，对目的蛋白洗脱峰峰面积进行积分。
实验结果：以上样干扰素标准品、干扰素工艺中间品及两者混和的供试品峰面积计算，得到回收率为95％-105％，证明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体加样回收率良好。
表4免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体加样回收率验证实验
图4A-a、b为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体加样回收率验证实验上样干扰素标准品0.4ml实验图谱、积分图。
图4B-a、b为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体加样回收率验证实验上样干扰素工艺中间品1.55ml实验图谱、积分图。
图4C-a、b为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体加样回收率验证实验上样供试品1 1.95ml实验图谱、积分图。
图4D-a、b为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体加样回收率验证实验上样干扰素标准品0.3ml实验图谱、积分图。
图4E-a、b为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体加样回收率验证实验上样干扰素工艺中间品1.65ml实验图谱、积分图。
图4F-a、b为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体加样回收率验证实验上样供试品2 1.95ml实验图谱、积分图。
图4G-a、b为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体加样回收率验证实验上样干扰素标准品0.2ml实验图谱、积分图。
图4H-a、b为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体加样回收率验证实验上样干扰素工艺中间品1.75ml实验图谱、积分图。
图4I-a、b为本发明免疫亲和层析法定量检测干扰素工艺中间体加样回收率验证实验上样供试品3 1.95ml实验图谱、积分图。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.亲和层析定量检测重组人α干扰素生产工艺中间体含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)表达重组人α干扰素的工程菌构建；
2)发酵工程菌并分离纯化以可溶性蛋白或包涵体形式表达的目的蛋白；
其中，步骤2)蛋白纯化包括粗纯和精纯，利用硫酸铵盐析沉淀获得蛋白粗品，粗品经DEAE阴离子交换柱层析纯化得到中间体，用单抗亲和层析柱定量检测中间体中重组人α干扰素的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)用单抗亲和层析柱定量检测中间体中重组人α干扰素的含量，具体方法为：
①用pH6.0-8.0的PBS液配制系列浓度的重组人α干扰素标准品溶液；
②将标准品溶液加至平衡好的单抗亲和层析柱中，依次用流动相A和流动相B进行洗脱，收集重组人α干扰素洗脱峰，以标准品浓度对峰面积作图，绘制标准曲线；
③用pH6.0-8.0的PBS液配制中间体的供试品溶液至浓度0.5-30mg/mL，将供试品溶液加至平衡好的单抗亲和层析柱中，按照与步骤②相同的操作，并对供试品溶液洗脱峰的峰面积进行分析，代入上述标准曲线，即得供试品溶液中重组人α干扰素的含量水平；
其中，步骤②、③中所述流动相A为15-100mM，pH6.0-8.0的PBS缓冲液；所述流动相B为含有0.05-0.2M Gly和0.1-0.3M NaCl的水溶液，pH2-3。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤②具体为：用流动相A平衡所述单抗亲和层析柱，然后将标准品溶液加至平衡好的单抗亲和层析柱中，依次用不少于2个柱体积流动相A、不少于5个柱体积流动相B及不少于5个柱体积流动相A进行洗脱；流动相线速度为0.5-3cm/min；检测波长为280nm。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述单抗亲和层析柱中的填料是由抗重组人α干扰素单克隆抗体与CNBr-Act-Sepharose 4B偶联制备而成；
其中，所述抗重组人α干扰素单克隆抗体由杂交瘤细胞BTP-mAb4D9D1E7分泌产生。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)所述单抗亲和层析柱中填料的制备方法如下：将10-15mL 1mM HCl加入1-5g的CNBr-Act-Sepharose 4B中浸泡凝胶，抽洗；然后，用偶联缓冲液洗涤凝胶；加入10-24mg/ml单克隆抗体进行偶联，单克隆抗体与凝胶的体积比为2-20:1，室温、4小时内不停地摇动；然后，用3-5个体积的偶联缓冲液漂洗，除去剩余的单克隆抗体；加入0.05-0.2M pH8.0甘氨酸静止封闭2h；然后，用偶联缓冲液洗柱，再依次用0.1-0.5M pH4.0醋酸盐，0.1-0.5mol/L NaCl洗柱，即得所述单抗亲和层析柱，于4℃备用；其中，所述偶联缓冲液为含有0.1-0.5M pH8.3 NaHCO3和0.1-0.5mol/L NaCl的水溶液。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)将所述重组人α干扰素的编码基因插入表达载体pET-23b中得到重组质粒，然后用所述重组质粒转化大肠杆菌BL21，即得重组工程菌；对重组工程菌进行发酵培养，诱导表达。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)蛋白纯化依次包括发酵液离心收集菌体，菌体裂解，离心，复性，硫酸铵盐析沉淀，透析获得蛋白粗品，粗品经DEAE阴离子交换柱层析纯化得到中间体，用单抗亲和层析柱定量检测中间体中重组人α干扰素的含量；
其中，粗纯的具体方法如下：将发酵收集的菌体以TE溶解，超声破菌后离心收集包涵体，然后用6-8M的盐酸胍溶解，室温搅拌2-6h，再用浓度为0.1-0.2M、pH9-10的磷酸盐缓冲液复性，复性液置于4℃过夜；4℃离心取上清，即得蛋白粗品。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)利用DEAE阴离子交换柱层析纯化蛋白粗品的具体方法如下：将粗纯所得上清于15-50mM pH7.0-9.0的Tris-HCl中4℃过夜透析；4℃离心取上清；再上样至用15-50mM pH7.0-9.0 Tris-HCl液平衡好的DEAESepharoseTM FF层析柱，上样后用3-5个柱体积的平衡液冲洗，用含有0.1-0.7M NaCl的15-50mM mM pH7.0-9.0 Tris-HCl溶液洗脱，收集洗脱峰组分。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述重组人α干扰素包括重组人干扰素α1b、α2b、α2a和重组集成干扰素。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，重组人α干扰素α1b的定量检测范围为0.5-30mg/mL。
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