CN104833797A - 检测双特异性抗体msbody的elisa方法及应用 - Google Patents

检测双特异性抗体msbody的elisa方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种检测双特异性抗体MSBODY的ELISA方法及应用，所述方法包括如下步骤：1)用抗人kappa轻链抗体包被微孔板；2)将MSBODY双特异性抗体和待测样品加入所述抗体包被的微孔板中孵育；3)再将酶标CD3抗原加入步骤2)中孵育后的微孔板中，所述CD3抗原用辣根过氧化物酶标记；4)再将加入酶标CD3抗原的微孔板洗涤后，加底物显色，测定OD值，确定有无MSBODY的抗体或制定MSBODY的抗体的标准曲线，通过标准曲线计算待测样品中MSBODY的抗体含量；本发明的方法和应用的检测灵敏度高、误差小、特异性高，能够准确、有效地检测和定量MSBODY抗体浓度。

Description

检测双特异性抗体MSBODY的ELISA方法及应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，涉及一种ELISA方法及应用，尤其涉及一种检测双特异性抗体MSBODY的ELISA方法及应用。
背景技术
双特异性抗体是一类可同时结合两种抗原的人工重组抗体，能在靶细胞(抗原)和效应细胞(抗原)之间架起桥梁，产生导向性的效应功能，双特异性抗体在生物医学中，特别是在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。
MSBODY是一类由武汉友芝友生物制药有限公司独立研发的双特异性抗体【PCT/CN2012/084982】，它是由两个单元组成：一个单元为针对肿瘤细胞或微生物有特异性的轻链-重链对，称为单价单元；另一个单元为融合肽，所述融合肽包含单链可变片段(scFv)和具有CH2结构域和CH3结构域的Fc片段，该所述融合肽针对免疫细胞具有特异性，称为单链单元。其中，单价单元的轻链恒定区(CL)与人IgG抗体轻链恒定区完全一致。单价单元特异性结合不同的肿瘤靶点抗原或微生物靶点抗原，如Her2，EGFR，EpCAM，CD19和CD20等；单链单元特异性结合免疫细胞的表面抗原，如CD3、CD16、CD19、CD28和CD64等。一般地，MSBODY结合的免疫细胞表面抗原为CD3抗原，属于T淋巴细胞的表面抗原。
在抗体的研发和生产中，经常需要对产品进行定性和定量的检测，检测方法通常采用酶联免疫吸附检测，简称ELISA。ELISA分为四大类：(1)直接ELISA；(2)间接ELISA；(3)夹心ELISA；(4)竞争抑制ELISA。其它的ELISA都隶属于这四类ELISA或由这四类ELISA组合衍生。ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗板的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量也就与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
MSBODY作为一种双特异性抗体，在生产过程中，通常会出现杂质抗体，主要为游离或聚合的单价单元抗体以及游离或聚合的单链单元抗体。使用传统的ELISA方法，例如双抗体夹心ELISA进行定量分析，因为使用的抗体针对目标抗体Fc段，杂质抗体也含有相同的Fc段，如果清洗步骤不彻底，该方法就无法排除杂质抗体的干扰。为排除杂质抗体的干扰，获得准确的MSBODY含量，需要使用双抗原夹心ELISA进行分析。但在具体实施时，有些抗原，比如细胞膜表面蛋白，很难提取和制备或者价格非常昂贵，无法做到长期大量使用。
鉴于面临的上述困难，有必要开发一种新的ELISA方法，保证双特异性抗体MSBODY检测的灵敏度，准确性和特异性。
发明内容
本发明的目的是针对目前双特异性抗体MSBODY检测灵敏度低，准确性和特异性差的问题，提供一种检测双特异性抗体MSBODY的ELISA方法及应用，从而能够准确地检测双特异性抗体MSBODY，并且检测灵敏度高，特异性强。
除非特别指明，本文中的“HRP”均指“辣根过氧化物酶”。
除非特别指明，本文中的“MSBODY标准品”指“MSBODY-1抗体和MSBODY-2抗体”。
一方面，本发明提供一种检测双特异性抗体MSBODY的ELISA方法，所述方法包括如下步骤：
1)用抗人kappa轻链抗体包被微孔板，得到包被后的微孔板；
2)将MSBODY双特异性抗体和待测样品加入所述抗体包被的微孔板中孵育，得到孵育后的微孔板；
3)再将酶标CD3抗原加入步骤2)中孵育后的微孔板中，所述CD3抗原用辣根过氧化物酶标记；
4)再将加入酶标CD3抗原的微孔板系洗涤后，加底物显色，测定OD值，确定有无MSBODY的抗体或制定MSBODY的抗体的标准曲线，通过标准曲线计算待测样品中MSBODY的抗体含量。
优选地，当样品中有抗体MSBODY时，OD值大于阴性值2.1倍以上。
优选地，在步骤1)中，所述抗人kappa轻链抗体为GAHK抗体，所述GAHK抗体的浓度为1～5μg/mL，由于GAHK抗体能够特异性结合人抗体kappa轻链的恒定区，不与其他物种的抗体轻链发生交叉反应。
优选地，所述GAHK抗体的浓度为2μg/mL，可检测的MSBODY浓度有效范围最大，从10ng/mL～1000ng/mL之间均可作为有效检测。
优选地，在步骤3)中，所述酶标CD3抗原的浓度为1:2000～1:10000，所述酶标CD3抗原是采用过碘酸钠法使所述CD3抗原与辣根过氧化物酶结合，所得酶标抗原的克分子比值为1.0～2.0。
优选地，所述CD3抗原为异二聚体蛋白，所述CD3抗原包括：Fc片段、CD3的ε亚基CD3E的胞外结构域CD3E ECD，以及CD3的δ亚基CD3D的胞外结构域CD3D ECD或CD3的γ亚基CD3G的胞外结构域CD3G ECD(具体参见申请号CN201310399169中记载的CD3抗原)，与天然CD3结构非常接近，可特异性结合抗CD3治疗性单抗OKT3，UCHT1和L2K，MSBODY的单链单元即采用的上述单抗中的其中一种构建；因此该ELISA法鉴定为阳性的样品，可以确定是具有MSBODY分子。
优选地，在步骤3)中，所述酶标CD3抗原的浓度为1:5000。
优选地，所述酶标CD3抗原是通过包括以下步骤的方法制得的：将所述CD3抗原和辣根过氧化物酶按照一定比例混合反应，用NaBH4水溶液中止反应；加入饱和硫酸铵沉淀并离心，再用PBS溶解，于403nm和280nm检测吸光值，计算标记抗原的浓度。
具体地，所述酶标CD3抗原是通过包括以下步骤的方法制得的：HRP使用超纯水配制成的HRP水溶液；新鲜配制的NaIO4充分混匀后按照等体积(0.2ml)加入到HRP水溶液中，4℃反应20min；加入乙二醇水溶液0.1ml终止反应，4℃静置30min以上；将抗原超滤浓缩，分别将抗原和处理后的HRP等体积加入到3.5KDa透析袋中，置于包被液中4℃透析；取出透析完毕的抗原和HRP，按照抗原与HRP等体积比例混合(避光)4℃反应过夜；反应完毕，加入NaBH4水溶液(新鲜配制)还原抗原与HRP的反应(避光，每半小时混匀一次)4℃反应3h；向反应体系中加入等体积的饱和硫酸铵混匀，4℃静置15-30min，4℃低温10000rpm离心30min，去上清，沉淀物再次用饱和硫酸铵洗板；4℃低温10000rpm离心30min，沉淀用PBS溶解，并于PBS中透析过夜(换液3次)；将抗原与HRP连接物于403nm和280nm检测吸光值，计算酶标抗原浓度。
优选地，在步骤1)中，所述微孔板被抗体包被后，还包括将封闭液加入微孔板，然后于37℃封闭1.5-2.0小时的步骤。
优选地，所述封闭液为5质量百分比％脱脂奶粉、3体积百分比％牛血清白蛋白或5体积百分比％胎牛血清。
优选地，所述封闭液为3体积百分比％牛血清白蛋白。
优选地，所述步骤1)包括以下步骤：用包被液将抗人轻链抗体稀释加入酶标板孔中，4℃过夜或者37℃孵育，PBST洗板。
优选地，包被液为pH＝9.6，0.05mol/L碳酸钠缓冲液，抗人轻链抗体使用Sigma公司的羊抗人kappa轻链抗体(Goat anti human kappa lightchain antibody，简写为GAHK抗体)，抗体被包被液稀释至2mg/L。
优选地，在步骤4)中，加底物显色后，测定OD值前，还包括加入终止液终止的步骤。
优选地，所述终止液为2M盐酸。
优选地，在步骤4)中，所述显色液为TMB底物溶液；显色时间为3分钟。
另一方面，本发明还提供一种检测双特异性抗体MSBODY的试剂盒，包括微孔板和酶标抗原，所述微孔板上包被有抗人kappa轻链抗体，所述酶标抗原为酶标CD3抗原，所述酶标抗原的标记物为辣根过氧化物酶。
优选地，所述GAHK抗体的浓度为1～5μg/mL，所述酶标CD3抗原的浓度为1:2000～1:10000，所述酶标CD3抗原是采用过碘酸钠法使所述CD3抗原与辣根过氧化物酶结合，所得酶标抗原的克分子比值为1.0～2.0。
优选地，所述CD3抗原为异二聚体蛋白，所述CD3抗原包括：Fc片段、CD3的ε亚基CD3E的胞外结构域CD3E ECD，以及CD3的δ亚基CD3D的胞外结构域CD3D ECD或CD3的γ亚基CD3G的胞外结构域CD3G ECD(具体参见申请号CN201310399169中记载的CD3抗原)。
再一方面，本发明还提供一种本发明所述的方法或本发明所述的试剂盒在用于检测双特异性抗体MSBODY中的应用。
本发明的检测双特异性抗体MSBODY的ELISA方法及试剂盒，通过采用抗体抗原夹心ELSIA方法检测MSBODY抗体，其检测方法的通用性高，灵敏度高，准确性和特异性高，并且通过与现有技术中通用的一些的ELISA方法比较，发现本发明的方法的检测有效性，准确性、灵敏度高，误差小，适用性强；
由于MSBODY的结构特点包含两个单元：单价单元具有轻链恒定区，单链单元具有T淋巴细胞表面抗原CD3分子结合特性，一般的标记方法无法对不同的MSBODY分子进行定性或定量检测，通用性差；而本发明通过使用同一种HRP标记抗原(CD3)和同一种抗体(GAHK)，以及夹心ELISA法，可以对不同的MSBODY分子进行定性或定量检测；避免需要制备不同的肿瘤表面抗原，通用性高；
本发明的方法能够检测的抗体浓度最低为5ng/mL，而现有的哺乳动物细胞重组蛋白表达系统，表达量都在10ng/mL以上，其灵敏度提高了1倍，具有显著的效果，从而可以有效地检测细胞表达上清中的MSBODY含量，灵敏度高；
该方法使用的GAHK抗体只与MSBODY的单价单元结合，不与单链单元结合；CD3抗原只与MSBODY的单链单元结合，不与单价单元结合；因此使用该抗体抗原夹心ELISA方法得到的样品含量，完全为MSBODY的含量，而排除了杂质抗体，特异性高；
此外，通过该ELISA方法测得的MSBODY含量，与标准定量方法得到的结果一致，从而能够有效地检测双特异性抗体MSBODY。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明所述的检测双特异性抗体MSBODY的ELISA方法的流程图；
图2A本发明的实施例2中1μg/mL的GAHK抗体包被酶标板绘制的ELISA标准曲线；
图2B本发明的实施例2中2μg/mL的GAHK抗体包被酶标板绘制的ELISA标准曲线；
图2C本发明的实施例2中5μg/mL的GAHK抗体包被酶标板绘制的ELISA标准曲线；
图3A为本发明的实施例3中的MSBODY-1抗体的标准曲线；
图3B为本发明的实施例3中的MSBODY-2抗体的标准曲线；
图4为本发明的对比例1中应用现有技术中抗体抗原夹心ELISA法的标准曲线；
图5为本发明的对比例2中应用现有技术中双抗体夹心ELISA法的标准曲线；
图6为本发明的对比例3中应用现有技术中双抗原夹心ELISA法的标准曲线；
图7为本发明的对比例4中不同方法检测上清中MSBODY-1的含量的结果。
具体实施方式
除非特别指明，以下实施例中的设备和方法为本技术领域常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
主要试剂
1.CD3抗原(CD3E/CD3D-Fc，武汉友芝友生物制药有限公司自制)；
2.MSBODY-1抗体(抗Her2和抗CD3的MSBODY，武汉友芝友生物制药有限公司自制)；
3.MSBODY-2抗体(抗EpCAM和抗CD3的MSBODY，武汉友芝友生物制药有限公司自制)；
4.羊抗人kappa轻链抗体(GAHK)购自Sigma公司，货号K3502；
5.HRP(Hydrogen peroxide oxidoreductase),购自Sigma公司，货号P6782
6.NaIO4购自Sigma公司，货号311448
7.NaBH4购自Sigma公司，货号452882
8.C2H6O2购自Sigma公司，货号324558
9.包被液(pH9.6，0.05mol/L碳酸钠缓冲液)：NaHCO30.586g，Na2CO30.318g，灭菌水200mL，pH9.6；
10.磷酸盐缓冲液(PBS)：NaCl 8.5g，NaH2PO4·12H2O 2.894g，KCl0.26g，K2HPO40.261g，灭菌水1L，pH7.2；
11.封闭液：100mL PBS中含3g牛血清白蛋白(BSA)；
12.PBST：1000mLPBS中加入0.5mL的Tween-20；
13.四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(天根生化科技有限公司)，其他试剂为国产分析纯；
14.终止液(2mol/L盐酸)：浓盐酸16.95mL，蒸馏水定容至100mL。仪器设备及耗材
小型离心机(Thermo、)酶标仪(Molecular Devices、)移液器(Thermo)、96孔酶标板(Corning)、恒温培养箱(Thermo)。
实施例1：HRP标记CD3抗原方法的建立
1.HRP使用超纯水配制成10mg/ml的HRP水溶液；新鲜配制的0.08mol/L的NaIO4充分混匀后按照等体积(0.2ml)加入到HRP水溶液中，4℃反应20min；加入0.4mol/L乙二醇水溶液0.1ml终止反应，4℃静置30min以上；
2.将CD3抗原超滤浓缩至1.5mg/mL，分别将抗原和处理后的HRP等体积(0.5ml)加入到3.5KDa透析袋中，置于1L包被液中4℃透析3次，每次4h；
3.取出透析完毕的抗原和HRP，按照抗原与HRP等体积比例混合(避光)4℃反应过夜；反应完毕，加入5mg/ml NaBH4水溶液(新鲜配制)20μL还原抗原与HRP的反应(避光，每半小时混匀一次)4℃反应3h；
4.向反应体系中加入等体积的饱和硫酸铵混匀，4℃静置15-30min，4℃低温10000rpm离心30min，去上清，沉淀物再次用饱和硫酸铵洗涤；4℃低温10000rpm离心30min，沉淀用1ml PBS溶解，并于PBS中透析过夜(换液3次)；
5.将抗原与HRP连接物于403nm和280nm检测吸光值，计算酶标抗原浓度。计算公式如下：
酶量(mg/ml)＝OD403nm×0.4
CD3量(mg/ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62
结果见表1：
克分子比值的范围在1.0～2.0之间为正常，本实施例的值为1.85，属于正常。
实施例2：双特异性抗体MSBODY的ELISA方法(抗体抗原夹心ELISA 方法)包被GAHK抗体最优浓度的测定
1.包被抗体：用包被液将GAHK抗体稀释到1μg/mL，2μg/mL，5μg/mL三种浓度，分别加入酶标板孔中，100ul每孔，4℃过夜或者37℃孵育2小时。PBST洗板一次，100μL/孔；
2.封闭：加入封闭液，100μL/孔，37℃孵育1小时；PBST洗板一次，100μL/孔；
3.加样：分别加入MSBODY的标准品100μL/孔，浓度从1000ng/mL开始，用PBS以3倍梯度稀释，连续稀释7个梯度，最低浓度为0.46ng/mL，设阴性对照孔，只加PBS；每个浓度做3个复孔；37℃孵育1小时；PBST洗板3次，100μL/孔；
4.加入酶标抗原：再加入HRP标记CD3抗原(用PBS 1:5000稀释)，100μL/孔，37℃孵育30分钟；PBST洗板5次，100μL/孔；
5.显色：加入显色液，100μL/孔，37℃避光显色3分钟；
6.终止：每孔加入100μl终止液终止显色反应，在酶标仪上读取各孔反应液OD450nm的值。记录结果。
利用graphpad prism5软件进行数据分析，采用log(agonist)vs.response--Variable slope绘制标准曲线。从图2A可以看出，MSBODY检测有效浓度范围在10-500ng/mL之间；从图2B可以看出，MSBODY检测有效浓度范围在10-1000ng/mL之间；从图2C可以看出，MSBODY检测有效浓度范围在20-400ng/mL之间。具体为下述表2所示：
表2不同浓度GAHK抗体包被及检测MSBODY有效浓度范围：
根据表2结果可知，当包被GAHK抗体浓度在2mg/L时，意外地获得其检测的MSBODY浓度有效范围最大，有效检测范围为10ng/mL～1000ng/mL。
实施例3：双特异性抗体MSBODY的ELISA方法(抗体抗原夹心ELISA 方法)检测样品MSBODY含量：
1.上清的处理：利用重组CHO细胞表达了两种MSBODY抗体(具体表达方法参见【PCT/CN2012/084982】)：MSBODY-1(抗Her2和CD3)和MSBODY-2(抗EpCAM和CD3)，作为MSBODY标准品；将14天连续发酵表达MSBODY-1或2的细胞上清10000rpm离心10min后，用0.22μm的滤膜过滤，作为供试品；
2.包被抗体：用包被液将GAHK抗体稀释到2μg/mL加入酶标板孔中，100ul每孔，4℃过夜或者37℃孵育2小时。PBST洗板一次，100μL/孔；
3.封闭：加入封闭液，100μL/孔，37℃孵育1小时；PBST洗板一次，100μL/孔；
4.标准曲线：分别加入MSBODY标准品100μL/孔，每个浓度做3个复孔；37℃孵育1小时；PBST洗板3次，100μL/孔；
5.加样：用PBS以1:500，1:1500，1:4500和1:13500四种方式稀释，并分别加入至步骤2的孔中，100μl/孔；每个浓度做3个复孔；在37℃孵育1小时；PBST洗板3次，100μL/孔；
6.加入酶标抗原：再加入酶标记抗原(用PBS 1:5000稀释)，100μL/孔，37℃孵育30分钟；PBST洗板5次，100μL/孔；
7.显色：加入显色液，100μL/孔，37℃避光显色1-10分钟；
8.终止：每孔加入100μl终止液终止显色反应，在酶标仪上读取各孔反应液OD450nm的值。记录结果。
同时，MSBODY-1或2的细胞上清上清的总抗体浓度用常规HPLC-proteinA检测，MSBODY-1或2的细胞上清抗体中MSBODY的含量先用proteinA亲和层析纯化后再用HPLC-SEC检测，结果如表3所示。
其中，所述上清的总抗体浓度用常规HPLC-proteinA检测步骤如下：
1.色谱条件
高效液相(Agilent 1260 Infinity)；
色谱柱：POROSnt 1260 Infin；
流动相A：0.05M PB+0.15M NaCl pH7.0；
流动相B：0.012M盐酸溶液pH1.9；
流动相C：0.3M MgCl2+2％乙酸；
流动相D：0.1M PB+1M NaCl；
梯度：0～0.5min 100％流动相A，0.5～1.5min 100％流动相B，1.5～3.0min 100％流动相A。
流速：3.0ml/min；温度：20度；；检测波长：280nm；
进样量：20μl
处理方法：积分从1.0分钟开始至1.4分钟。其他时间禁止积分。
2.对照品制备：取MSBODY标准品适量加流动相A配制成1.0mg/ml，0.5mg/ml，0.25mg/ml，0.1mg/m，0.05mg/ml的标准品溶液。
3.供试品处理：MSBODY-1或2的细胞上清用0.22μm滤头过滤，作为供试品溶液。
4.进样检测：用超纯水置换色谱柱中的保存溶剂后，需要用流动相A冲洗至少5个柱体积。待仪器稳定后，进空白样品2针，再按低浓度到高浓度的顺序进0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml的对照品溶液各两针，然后进质控样品2针，确定色谱柱状况良好后，对待测样品进行进样；每个样品溶液进两针，在进样过程中穿插标准品进样，以确定整个进样过程中色谱柱状况是否良好。
5.结果分析
系统适应性判断：双抗体主峰约在1.0min处出峰。
标准准曲线拟合：将标准品色谱结果以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标建立标准曲线
样品浓度计算：将样品峰面积带入到标准曲线中计算样品主峰的浓度。
其中，所述上清抗体中MSBODY的含量先用proteinA亲和层析纯化后再用HPLC-SEC检测步骤如下：
1.色谱条件
色谱柱：TOSOH TSK G3000 SWxl 7.8×300mm
保护柱：TSK guard column SWxl 6.0×40mm
流动相：50mM柠檬酸钠+100mM NaCl，pH 6.0
流速：0.5ml/min
温度：25℃
检测波长：280nm
进样量：50μl
2.对照品制备：取MSBODY标准品适量加流动相配制成1.0mg/ml
3.样品处理：将MSBODY-1或2的细胞样品用0.22DY针头滤膜过滤或离心后取上清，作为待检样品。
4.进样检测：用超纯水置换色谱柱中的保存溶剂，需要用超纯水冲洗至少1个柱体积(1个柱体积约15ml)，待仪器稳定后，MSBODY对照品进样，确定色谱柱状况良好后，对待测样品进行进样。
5.结果分析：Aglient 1260仪器系统下，M802主峰约在17.3min处出峰，单体应出现在18.9min左右，但如果单体形成二聚体，则会出现在16.6min左右。多聚体峰出现在15min之前。对样品色谱图进行积分和计算，以面积归一化法对各色谱峰进行百分比计算，确定MSBODY的纯度。
表3通用方法中上清中抗体浓度和纯度检测结果：
表4本发明所述的ELISA方法(抗体抗原夹心ELISA法)测定抗体浓度的结果：
由本实施例结果可知，在可检测有效浓度范围内，使用本发明的ELISA法，与经典定量方法HPLC相比较，检测得到的上清MSBODY含量的误差，保持在20％以内，因此说明本发明的方法可行，简单、有效。
对比例1：现有技术中的抗原抗体夹心ELISA法有效检测范围的确定：
使用的抗体为HRP标记的羊抗人F(ab)抗体(简写为HRP-GAHFab，购自Sigma，货号A0293)，抗原为前述的CD3抗原(未进行HRP标记)。
1.包被抗原：用包被液将CD3抗原稀释到1μg/mL加入酶标板孔中，100ul每孔，4℃过夜或者37℃孵育2小时。PBST洗板一次，100μL/孔；
2.封闭：加入封闭液，100μL/孔，37℃孵育1小时；PBST洗板一次，100μL/孔；
3.标准曲线：分别加入MSBODY标准品100μL/孔，浓度梯度同实施例2的步骤3，每个浓度做3个复孔；37℃孵育1小时；PBST洗板3次，100μL/孔；
4.加入酶标抗体：再加入HRP-GAHFab抗体(1：10000稀释)，100μL/孔，37℃孵育30分钟；PBST洗板5次，100μL/孔；
5.显色：加入显色液，100μL/孔，37℃避光显色1-10分钟；
6.终止：每孔加入100μl终止液终止显色反应，在酶标仪上读取各孔反应液OD450nm的值。记录结果，如图4所示，现有技术中抗体抗原夹心ELISA法不适用于MSBODY的定性定量检测。
对比例2：现有技术中双抗体夹心ELISA法有效检测范围的确定
使用的抗体之一为HRP标记的羊抗人F(ab)抗体(简写为HRP-GAHFab，购自Sigma，货号A0293)，抗体之二为兔抗人IGG抗体(简写为RAH，购自武汉三鹰)。
1.包被抗体：用包被液将RAH抗体稀释到1μg/mL加入酶标板孔中，100ul每孔，4℃过夜或者37℃孵育2小时。PBST洗板一次，100μL/孔；
2.封闭：加入封闭液，100μL/孔，37℃孵育1小时；PBST洗板一次，100μL/孔；
3.标准曲线：分别加入MSBODY标准品100μL/孔，浓度梯度同实施例2的步骤3，每个浓度做3个复孔；37℃孵育1小时；PBST洗板3次，100μL/孔；
4.加入酶标抗体：再加入HRP-GAHFab抗体(1：10000稀释)，100μL/孔，37℃孵育30分钟；PBST洗板5次，100μL/孔；
5.显色：加入显色液，100μL/孔，37℃避光显色1-10分钟；
6.终止：每孔加入100ul终止液终止显色反应，在酶标仪上读取各孔反应液OD450nm的值，结果如图5所示，双抗体夹心ELISA法检测MSBODY的有效浓度范围是2-300ng/mL，其有效检测浓度远远低于本发明的检测方法。
对比例3：现有技术中双抗原夹心ELISA法有效检测范围的确定
使用的抗原之一为HRP标记CD3抗原(同前)，抗原之二为Her2(实验室制备，浓度1mg/mL)。
1.包被抗原：用包被液将Her2稀释到1μg/mL加入酶标板孔中，100ul每孔，4℃过夜或者37℃孵育2小时。PBST洗板一次，100μL/孔；
2.封闭：加入封闭液，100μL/孔，37℃孵育1小时；PBST洗板一次，100μL/孔；
3.标准曲线：分别加入MSBODY-1标准品100μL/孔，浓度梯度同实施例2的步骤3，每个浓度做3个复孔；37℃孵育1小时；PBST洗板3次，100μL/孔；
4.加入酶标抗原：再加入HRP标记CD3抗原(PBS稀释到1μg/mL)，100μL/孔，37℃孵育30分钟；PBST洗板5次，100μL/孔；
5.显色：加入显色液，100μL/孔，37℃避光显色1-10分钟；
6.终止：每孔加入100ul终止液终止显色反应，在酶标仪上读取各孔反应液OD450nm的值。
记录结果，结果如图6所示，双抗原夹心ELISA法检测MSBODY的有效浓度范围是10-100ng/mL。低于本发明所述的ELISA方法(抗体抗原夹心ELISA法)检测MSBODY的有效浓度范围(10-1000ng/mL)。
对比例4：分别用双抗体和双抗原夹心ELISA法检测细胞上清中 MSBODY的含量：
1.上清的处理：上清为表达MSBODY-1的细胞上清，来源及处理同实施例3的步骤1；
2.包被：包被使用的抗原或抗体来源及浓度同对比例2和3中的步骤2，100ul每孔，4℃过夜或者37℃孵育2小时。PBST洗板一次，100μL/孔；
3.封闭：加入封闭液，100μL/孔，37℃孵育1小时；PBST洗板一次，100μL/孔；
4.标准曲线：分别加入MSBODY标准品100μL/孔，浓度梯度同实施例2的步骤3，每个浓度做3个复孔；37℃孵育1小时；PBST洗板3次，100μL/孔；
5.加样：用PBS以1:1500和1:4500两种方式稀释，并分别加入至步骤2的孔中，100μl/孔；每个浓度做3个复孔；在37℃孵育1小时；PBST洗板3次，100μL/孔；
6.加入酶标抗原或抗体：具体浓度和相应的酶标物同对比例2和3中的步骤6，100μL/孔，37℃孵育30分钟；PBST洗板5次，100μL/孔；
7.显色：加入显色液，100μL/孔，37℃避光显色1-10分钟；
8.终止：每孔加入100ul终止液终止显色反应，在酶标仪上读取各孔反应液OD450nm的值。记录结果，结果见表5。
表5使用双抗体夹心ELISA和双抗原夹心ELISA检测上清MSBODY-1的含量
图7可知，本发明的抗体抗原夹心ELISA方法检测MSBODY含量的误差要明显小于双抗体夹心ELISA方法，与双抗原夹心ELISA接近，并且抗体抗原夹心ELISA方法的检测的有限浓度范围大于双抗原夹心ELISA，进一步说明本发明的抗体抗原夹心ELISA检测方法，误差小，灵敏度高。

Claims (10)

1.一种检测双特异性抗体MSBODY的ELISA方法，所述方法包括如下步骤：
1)用抗人kappa轻链抗体包被微孔板，得到包被后的微孔板；
2)将MSBODY双特异性抗体和待测样品加入所述抗体包被的微孔板中孵育，得到孵育后的微孔板；
3)再将酶标CD3抗原加入步骤2)中孵育后的微孔板中，所述CD3抗原用辣根过氧化物酶标记；
4)再将加入酶标CD3抗原的微孔板洗涤后，加底物显色，测定OD值，确定有无抗体MSBODY或制定MSBODY的抗体的标准曲线，通过标准曲线计算待测样品中MSBODY的抗体含量。
2.根据权利要求1所述的检测双特异性抗体MSBODY的ELISA方法，其特征在于，在步骤1)中，所述抗人kappa轻链抗体为GAHK抗体，所述GAHK抗体的浓度为1～5μg/mL；优选地，所述GAHK抗体的浓度为2μg/mL。
3.根据权利要求1所述的检测双特异性抗体MSBODY的ELISA方法，其特征在于，在步骤3)中，所述酶标CD3抗原的浓度为1:2000～1:10000；优选地，所述酶标CD3抗原的浓度为1:5000；更优选地，所述酶标CD3抗原是采用过碘酸钠法使所述CD3抗原与辣根过氧化物酶结合，所得酶标抗原的克分子比值为1.0～2.0。
4.根据权利要求3所述的检测双特异性抗体MSBODY的ELISA方法，其特征在于，所述CD3抗原为异二聚体蛋白，所述CD3抗原包括：Fc片段、CD3的ε亚基CD3E的胞外结构域CD3E ECD，以及CD3的δ亚基CD3D的胞外结构域CD3D ECD或CD3的γ亚基CD3G的胞外结构域CD3G ECD。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的检测双特异性抗体MSBODY的ELISA方法，其特征在于，在步骤1)中，所述微孔板被抗体包被后，还包括将封闭液加入微孔板，然后于37℃封闭1.5-2.0小时的步骤。
6.根据权利要求5所述的检测双特异性抗体MSBODY的ELISA方法，其特征在于，所述封闭液为5质量百分比％脱脂奶粉、3体积百分比％牛血清白蛋白或5体积百分比％胎牛血清。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的检测双特异性抗体MSBODY的ELISA方法，其特征在于，当样品中有抗体MSBODY时，OD值大于阴性值2.1倍以上。
8.一种检测双特异性抗体MSBODY的试剂盒，包括微孔板和酶标抗原，所述微孔板上包被有抗人kappa轻链抗体，所述酶标抗原为酶标CD3抗原，所述酶标抗原的标记物为辣根过氧化物酶。
9.根据权利要求8所述的检测双特异性抗体MSBODY的试剂盒，其特征在于，所述GAHK抗体的浓度为1～5μg/mL，所述酶标CD3抗原的浓度为1:2000～1:10000，所述酶标CD3抗原是采用过碘酸钠法使所述CD3抗原与辣根过氧化物酶结合，所得酶标抗原的克分子比值为1.0～2.0；优选地，所述CD3抗原为异二聚体蛋白，所述CD3抗原包括：Fc片段、CD3的ε亚基CD3E的胞外结构域CD3E ECD，以及CD3的δ亚基CD3D的胞外结构域CD3D ECD或CD3的γ亚基CD3G的胞外结构域CD3G ECD。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的方法或权利要求8或9所述的试剂盒在用于检测双特异性抗体MSBODY中的应用。
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