CN107436350A - 一种利用酶标板和单克隆抗体进行混合物中各成分的分离方法 - Google Patents

一种利用酶标板和单克隆抗体进行混合物中各成分的分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用酶标板进行混合物中各成分的分离方法。所述分离方法操作如下：在酶标板上包被混合物中A成分的抗体，待测混合物中含A成分的物质结合后形成固定在板上的抗原‑抗体复合物，上清液中不含有A成分，从而分离出除A之外的其他成分。本发明提供更精确和特异的各成分分离方法，仅需同一种检测体系就可以将含同一成分的不同待测物分离和定量检测出来。所需待测样品体积大大减少，从毫升级减少到微升级；不需要复杂的设备投入，降低了检测成本，所需检测时间大大缩短，由3‑4天缩短至3‑4小时。检测精度大大提高，由微克级到纳克级。

Description

一种利用酶标板和单克隆抗体进行混合物中各成分的分离 方法
技术领域
本发明属于物质分离技术领域，尤其涉及一种利用酶标板和单克隆抗体进行混合物中各成分的分离方法。
背景技术
1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定(enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)用于IgG定量测定的文章，使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
ELISA主要包括双抗体夹心法、双位点一步法、间接法和竞争法。
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
⑴将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。
⑵加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。
⑶加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。
⑷加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。
根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。
在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。
间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
⑴将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
⑵加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。
⑶加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。
⑷加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。
本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。
竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：
⑴将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。
⑵待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。⑶加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。
结合疫苗是指采用化学方法将多糖共价结合在蛋白载体上做制备的多糖-蛋白结合疫苗，用于提高细菌疫苗多糖抗原的免疫原性，如b型流感嗜血杆菌结合疫苗、A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗。在结合疫苗研发和生产过程中，并不是所有多糖和蛋白都能够有效结合。游离成分的多少直接影响疫苗的有效性和安全性。因此，现行的2015版药典对结合疫苗的游离多糖和游离蛋白的含量做出了明确的规定。
定量检测的第一步是需要将游离成分或非游离成分进行有效的分离。目前分离多糖蛋白结合物中游离成分和非游离成分的常用方法有有机溶剂沉淀法，如乙醇、苯酚、脱氧胆酸钠等方法。这些方法均为通过不同分子大小的物质在不同有机溶剂浓度中沉淀和变性的程度不一致来进行多糖蛋白结合物中游离和非游离成分的分离。这种方法存在：1.特异性不足:对分子大小和性质相似的成分分离的效果不佳的不足。2.受实验条件影响大：溶液浓度、PH值等影响。3.所需待测样本体积大，为匹配后续的检测，样本体积少至几毫升，多则几十毫升。4.所需实验步骤、设备和实验时间相对较长。
定量检测的第二步将分离的成分进行检测，目前，对于多糖成分主要采用化学基团测定法：通过相似化学基团测定法利用理化的方法对多糖成分进行测定，如流脑A群通过磷的含量测定来确定A群流脑多糖的含量。这种化学基团检测法存在检测过程复杂，时间长，需要使用强酸等有机试剂，且易受含磷清洗液或其它干扰物质的的影响以及检测灵敏度较低的不足。而对于游离和非游离的蛋白成分一般采用蛋白含量测定法(Lowry法)、絮状单位方法、氮含量换算方法或火箭免疫电泳方法。这些方法中，Lowry法无法检测出抗原性，絮状单位测定法仅能检测出相对效价单位，而非质量单位。这些方法均存在：特异性不足、灵敏度不高的问题，对成分相似疫苗则无法区分不同的组份，且操作相对复杂、难以做到高通量。
总体说来，这些方法为疫苗的质量控制做出了积极的贡献，但这些方法操作比较繁琐，操作要求较高，样品体积需求较大，检测周期较长(约需1周)，需要2种或2种以上不同的实验体系才能完成分离和检测。对于结合物浓度或游离多糖含量较低的样品，可能因为多糖含量低于测定线而检测结果不准确的情况。而疏水层析和HPLC对设备要求较高，并且检测速度较慢。同时，无论是检测精度高的层析法还是快速的有机溶剂沉淀法对相似都高的成分都无法做到完全特异性的检测。同时，多糖本身是一个多分子的重复结构，对于化学基团数量不稳定或具有相同基团的不同成分的检测带来了困难。这个问题在多价的联合偶联疫苗中尤为突出。这给疫苗研发过程质量控制带来了不确定性。同时，Lowry法是一种常用的蛋白浓度检测法，仅能测定样品中总蛋白的含量，对于成分复杂的样品不能准确区分出蛋白并能准确反映蛋白的抗原性，且操作相对复杂，检测结果受实验操作的影响较大，对溶液配制等有较高的要求，还会受到多种离子的干扰，难以做到高通量，检测灵敏度一般为微克(μg)级。完成这种既有多糖又有蛋白类物质的检测，通常需要2种或2种以上不同的检测方法和体系，也给检测增加了复杂性。
在联合疫苗研究和生产过程中，均需要准确测定疫苗内各组分的蛋白或者是糖的含量，用于指导工艺开发和疫苗质量控制。在以化学偶联工艺制备的结合疫苗原液或成品中，通常含有如下3种组分：a.多糖-蛋白载体结合物，b.游离多糖，c.游离蛋白；其中仅多糖-蛋白载体结合物是疫苗有效成分。为了控制结合疫苗成品的质量，成品中有效结合的多糖-蛋白载体结合物浓度的测定十分重要。本发明开发了一种同一分离和检测体系下，能快速，高通量、高特异性、高敏感性的检测出游离成分非游离成分的含量。并且对其它分子大小相似、结构相似的混合物或含有相同成分的不同化合物均能进行快速、特异、高敏感性和高通量的检测方法。旨在为疫苗乃至偶联药物的质量控制提供更有效和快速的方法。
目前，现有技术只能通过elisa方法检测结合疫苗中总多糖或总蛋白载体的含量，不能分别直接定量检测结合疫苗中多糖-蛋白载体结合物、游离多糖和游离蛋白。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种利用酶标板进行混合物中各成分的分离方法。本发明利用单克隆抗体和酶标板对多组分样品中不同组分进行分离和检测，可以适用于偶联疫苗中不同成分含量的测定，特别是常规方法难以分离和准确测定的多组分样品。本发明的技术方案如下：一种利用酶标板进行混合物中各成分的分离方法。
所述分离方法操作如下：在酶标板上包被混合物中A成分的单克隆抗体，待测混合物中含A成分的物质结合后形成固定在板上的抗原-抗体复合物，上清液中不含有A成分，从而分离出除A之外的其他成分。
进一步地，所述混合物为含有相同成分的不同化合物的混合物。
进一步优选，所述混合物为多糖-蛋白结合疫苗、多糖-蛋白结合物原液，b型流感嗜血杆菌结合疫苗(原液)、流脑系列多糖结合疫苗、伤寒系列结合疫苗、蛋白-蛋白偶联物、化学大分子化合物。
所述结合疫苗中含有游离抗原、游离载体和抗原-载体结合物，分离游离载体时，通过在酶标板上包被抗原的单克隆抗体，待测物溶液含抗原成分的游离抗原和抗原-载体结合物与对应的单克隆抗体结合后形成固定在板上的抗原-抗体复合物，待测物中的游离抗原、抗原-载体结合物吸附在酶标板中，上清液中仅含有游离载体，分离出游离载体进行检测。
进一步地，分离游离载体时进行梯度稀释待测物，找到让酶标板上将含抗原的成分完全形成抗原-抗体复合物、上清中仅含有游离载体的稀释终点。
更进一步地，找到稀释终点后，取酶标板稀释终点的上清液按照竞争ELISA的方法或其它能进行含量检测的ELISA方法进行检测，建立标准曲线，通过标准曲线计算出上清液中游离载体的含量；同时，取待测物进行载体总含量的检测，通过标准曲线计算出待测物中游离载体的总含量。
进一步地，分离游离抗原时，通过在酶标板上包被载体的单克隆抗体，待测物溶液含载体成分的游离载体和抗原-载体结合物与对应的单克隆抗体结合后形成固定在板上的抗原-抗体复合物，待测物中的游离载体、抗原-载体结合物吸附在酶标板中，上清液中仅含有游离抗原，分离出抗原进行检测。
本发明的特点如下：本领域技术人员通常利用酶标板和抗体进行ELISA定性和定量检测，对于成分复杂，且含有相同成分的结合和非结合物则采用其它方法，如：有机溶剂沉淀法、有机溶剂螯合法进行成分的分离后再进行检测。ELISA定量检测时使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，从而定量检测被结合的抗原或抗体。由于ELISA操作时经常用到洗涤的操作，以及惯性思维的存在，本领域技术人员忽略了可以采用ELISA酶标板分离混合物中不同的成分。
以A群流脑结合疫苗为例，结合疫苗中含有游离A群多糖、游离载体TT和A群多糖-TT结合物，为了检测游离抗原或游离载体的量，通过在酶标板上包被A群流脑单抗(以下简称A单抗)，将待测物中含A多糖的物质结合后形成固定在板上的抗原-抗体复合物。具体为将待测物中的游离A、结合物A-TT吸附在酶标板中，让上清中仅含有游离TT。从而达到游离TT从待测物中的分离。然后通过竞争ELISA的方法或者其它能进行含量检测的ELISA方法检测游离TT的含量，游离A群多糖的检测同于游离TT的检测方法。本发明所述的分离方法不仅可以用于分离A-TT结合疫苗中的各组分，其它含有两种或多种抗原特性不同的组分的样品也可以通过该方法进行分离，进而进行检测。
本发明通过不同的单抗对偶联疫苗(结合疫苗)中的目标成分进行结合后分离，对分离后的不同成分应用单抗进行酶联免疫检测(ELISA)，可准确的检测出偶联疫苗中结合和未结合成分的含量、抗原性和比例，从而解决上述常规检测方法和应用中的不足。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供更精确和特异的各成分分离方法，仅需一种体系就可以将含同一成分的不同待测物定量检测出来。所需待测样品体积大大减少，从毫升级减少到微升级；不需要复杂的设备投入，降低了检测成本，所需检测时间大大缩短，由3-4天缩短至3-4小时。检测精度大大提高，由微克级到纳克级。
本发明能测定样品中总蛋白或总糖的含量到还可以测定成分的抗原性，特别是对于通过免疫系统产生效果的疫苗更为重要。不仅适用于含相同成分的不同偶联物的成分或混合物的含量测定，也适用于待测样品中含有多种成分相近或不同蛋白的偶联疫苗。
附图说明
图1为A群流脑多糖结合物溶液示意图；
图2为分离板(1#板)示意图；
图3为分离板(1#板)上清示意图；
图4为竞争ELISA中A群多糖标准品与游离A群多糖与A群单抗竞争结合；
图5为竞争ELISA中竞争后剩余单抗与包被的A群多糖标准品结合后通过酶标二抗显色；
图6为间接竞争ELISA酶联免疫吸附试验标准曲线；
图7为间接竞争ELISA酶联免疫吸附试验标准曲线；
图中标记：1-游离TT，2-游离A，3-结合物A-TT，4-TT单抗，5-酶标板，6-A群单抗，7-A群多糖标准品，8-酶标二抗。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。
1.A群流脑多糖结合物溶液(以下简称待测物)中含有游离A群流脑多糖(以下简称游离A)、游离的破伤风类毒素(以下简称游离TT)、A群流脑多糖结合物(以下简称结合物A-TT)，需要将游离A的含量、游离TT的含量以及结合物A-TT中A的含量以及TT的含量检测出来(见图1)。
实验操作：
1.1.1通过在酶标板上包被A群流脑单抗(以下简称A单抗)，将待测物中含A多糖的物质结合后形成固定在板上的抗原-抗体复合物。具体为将待测物中的游离A、结合物A-TT吸附在酶标板中(见图2)，让上清中仅含有游离TT(见图3)。从而达到游离TT从待测物中的分离。
1.1.2该步操作的关键在于通过梯度稀释待测物，找到让1#酶标板上将含A的成分完全形成抗原-抗体复合物，上清中仅含有游离TT成分的稀释点。该步的操作优势是所需检测物的体积仅为微升级。
1.1.3在2#酶标板上包被A群流脑标准品，将1#酶标板上清分成2份，其中一份上清按照设定的稀释梯度加入2#板中，按照竞争ELISA的方法或者其它能进行含量检测的ELISA方法，如间接ELISA进行检测，当某个稀释梯度值及以下稀释度的值变化不明显时，显示该稀释度为稀释终点，此时1#板中的该稀释度的上清中均为游离TT，见图4和图5。
1.1.4在3#酶标板上包被TT标准品，取1#酶标板稀释终点的上清进行，按照竞争ELISA的方法或其它能进行含量检测的ELISA方法进行检测。同时，建立标准曲线，通过标准曲线计算出上清中游离TT的含量。同时，取待测物进行TT总含量的检测。通过标准曲线计算出待测物中TT的总含量。
1.1.5更改包被的抗原或抗体的类型重复1.1.1-1.1.4步骤可得到上清中游离A的含量和待测物中A的总含量。
1.1.6计算：按照下述公式可将待测物中结合物A-TT中A的含量以及TT的含量计算出来。
结合物A-TT中A的含量＝A的总含量-游离A含量
结合物A-TT中TT的含量＝TT的总含量-游离TT含量
以下各实施例无特殊说明均为常规技术，各实施例中各种试剂、原料等均为市售产品。以下各实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的保护范围。
实施例1：A-TT结合疫苗中游离A含量的检测
1.1抗原的来源
A-TT结合物原液按照《中国药典2015版》中“A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗”制备。
1.2单克隆抗体的来源
A群脑膜炎球菌多糖单抗：由杂交瘤细胞株WV-A-01(CCTCC NO:C2015229,中国典型培养物保藏中心)按照小鼠单抗腹水制备法制备。
破伤风类毒素(TT)单抗：由杂交瘤细胞株WV-TT-05(CCTCC NO:C2014200，中国典型培养物保藏中心)按照小鼠单抗腹水制备法制备。
1.3使用TT单克隆抗体分离A-TT结合疫苗中的游离A群多糖
1.3.1将破伤风类毒素(TT)单抗按50ng/孔包被酶标板(1号酶标板)，37℃孵育1小时后洗板三次，每孔加入200μL的封闭缓冲液，置37℃孵育2小时，封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。
1.3.2如表1，对倍稀释待测样品(A群流脑多糖结合物原液)后，按50uL/孔加入1#酶标板中，每组3个重复，37℃孵育1小时后，取上清进行定量检测。
表1 1#酶标板待测样品加样情况
1.3.3竞争ELISA：
1#板上清分成2份按1#板的稀释度分别对应加入到TT标准品的ELISA酶标板(2#板)和包被A群多糖标准品(3#板)中。
1.3.3.1通过TT的竞争ELISA实验(按50ug/mL到0.0032ug/mL,对倍稀释TT标准品进行包被，37℃孵育1小时后洗板3次；5％脱脂奶粉，37℃封闭1小时后洗板3次，加入竞争抗原后加入TT单抗，37℃孵育1小时后加入二抗37℃孵育1小时加显色剂显色放入酶标仪中读数)确定待测样品中目标成分全部被吸附的稀释终点。2#板检测结果将在某一稀释度及之后出现吸光值的CV％≤20％时(参考根据药审中心发布的《生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则》精密度的要求为：一般情况下，酶法：小于20％)，表明分离板(1#板)中的上清中不再含有TT时，记为稀释终点。取终点下1-2个稀释度的上清进行游离成分定量检测。本实验中自1：8稀释度及之后，A450吸光值没有太大变化，选取3#板对应的1:16及其后稀释度进行A群多糖含量测定。
表2:2#板竞争ELISA结果
编号 1 2 3 4 5 6 7 8
稀释度 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128
A450均值(n＝3) 0.0051 0.0764 0.2 0.9009 0.8587 0.8288 0.8075 0.8051
1.3.3.2通过A群标准多糖的竞争ELISA(按1.3.3.1竞争ELISA步骤进行操作)实验定量检测待测结合物原液中游离多糖的含量。
1.3.3.2.1标准曲线的建立
根据前面试验优化的条件，按照竞争ELISA步骤操作，1.3.4竞争ELISA设置阳性对照和阴性对照：阳性对照-不加竞争抗原，加单抗，加二抗，显色。阴性对照-不加竞争抗原和单抗，加二抗，显色。
表3 竞争ELISA方法定量检测标准品结果
以A群脑膜炎球菌多糖标准品浓度对数为横坐标，以标准品及待测样品不同稀释度的平均A450值为纵坐标绘制标准曲线。图中看见标准品在3.2ng/mL～50μg/mL之间呈现良好的线性，r2＝0.9951。不仅检测浓度范围宽，而且检测的敏感度达到纳克级(见图6)。将1#板稀释度为1:8及其后的上清进行检测，待测样品A-TT稀释10倍一同进行检测，检测结果见表4。结果显示待测样品中A总含量为199.2993ug/mL，游离多糖含量为29.7868ug/mL，检测值与理论值无显著差别。
表4：游离A群多糖检测结果
实施例2：A-TT结合疫苗中游离TT含量的检测
1.1抗原的来源
A-TT结合物原液按照《中国药典2015版》中“A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗”制备。
1.2单克隆抗体的来源
A群脑膜炎球菌多糖单抗：由杂交瘤细胞株WV-A-01(CCTCC NO:C2015229,中国典型培养物保藏中心)按照小鼠单抗腹水制备法制备。
破伤风类毒素(TT)单抗：由杂交瘤细胞株WV-TT-05(CCTCC NO:C2014200，中国典型培养物保藏中心)按照小鼠单抗腹水制备法制备。
1.3使用A单克隆抗体分离A-TT结合疫苗中的游离TT
1.3.1将A群流脑单抗按50ng/孔包被酶标板(1#酶标板)，37℃孵育1小时后洗板三次，每孔加入200μL的封闭缓冲液，置37℃孵育2小时，封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。
1.3.2对倍稀释待测样品(A群流脑多糖结合物原液)后，按50uL/孔加入1#酶标板中，每组3个重复，37℃孵育1小时后，1#板上清分成2份按1#板的稀释度分别对应加入到2#板包被，然后按间接ELISA的方法进行稀释终点的判定。另一份上清加入包被TT标准品(3#板)中，按照竞争ELISA的方法进行定量检测。
表5:1#酶标板待测样品加样情况
1.3.3间接ELISA：1#板上清按稀释度对应加入酶标板中进行包被形成固相抗原，37℃孵育1小时后洗板3次；5％脱脂奶粉，37℃封闭1小时后洗板3次，每孔加入50uLA群流脑单抗后加入酶标二抗37℃孵育1小时加显色剂显色放入酶标仪中读数。阴性对照用PBS替代上清进行包被，，阳性对照用50uLA群流脑标准品包被，之后流程一致。检测结果显示在稀释度为1:4时显色值接近阴性，A450吸光值没有太大变化(见表6)。
表6 2#板间接ELISA结果
1.3.3通过TT标准品的竞争ELISA(按1.3.3竞争ELISA步骤进行操作)实验定量检测待测结合物原液中游离TT的含量。
1.3.3.2.1标准曲线的建立
按照竞争ELISA步骤操作，1.3.4竞争ELISA设置阳性对照和阴性对照：阳性对照-不加竞争抗原，加单抗，加二抗，显色。阴性对照-不加竞争抗原和单抗，加二抗，显色。见表7。
表7 竞争ELISA方法定量检测标准品结果
以破伤风类毒素标准品浓度对数为横坐标，以标准品及待测样品不同稀释度的平均A450值为纵坐标绘制标准曲线。图中看见标准品在3.2ng/mL～50μg/mL之间呈现良好的线性，r2＝0.9951。不仅检测浓度范围宽，而且检测的敏感度达到纳克级(见图7)。将1#板稀释度为1:8及其后的上清进行检测，待测样品A-TT稀释10倍一同进行检测，检测结果见表8。
表8 游离TT检测结果
结果显示待测样品中TT总含量为256.438ug/mL，游离TT含量为13.1226ug/mL，检测值与理论值无显著差别。

Claims (8)

1.一种利用酶标板和单克隆抗体进行混合物中各成分的分离方法。
2.如权利要求1所述的利用酶标板和单克隆抗体进行混合物中各成分的分离方法，其特征在于，所述分离方法操作如下：在酶标板上包被混合物中A成分的单克隆抗体，待测混合物中含A成分的物质结合后形成固定在板上的抗原-抗体复合物，上清液中不含有A成分，从而分离出除A之外的其他成分。
3.如权利要求1所述的利用酶标板和单克隆抗体进行混合物中各成分的分离方法，其特征在于，所述混合物为含有相同成分的不同化合物的混合物。
4.如权利要求3所述的利用酶标板和单克隆抗体进行混合物中各成分的分离方法，其特征在于，所述混合物为多糖-蛋白结合疫苗、多糖-蛋白结合物原液，b型流感嗜血杆菌结合疫苗、流脑系列多糖结合疫苗、伤寒系列结合疫苗、蛋白-蛋白偶联物、化学大分子化合物。
5.如权利要求4所述的利用酶标板和单克隆抗体进行混合物中各成分的分离方法，其特征在于，所述结合疫苗中含有游离抗原、游离载体和抗原-载体结合物，分离游离载体时，通过在酶标板上包被抗原的单克隆抗体，待测物溶液含抗原成分的游离抗原和抗原-载体结合物与对应的单克隆抗体结合后形成固定在板上的抗原-抗体复合物，待测物中的游离抗原、抗原-载体结合物吸附在酶标板中，上清液中仅含有游离载体，分离出游离载体进行检测。
6.如权利要求5所述的利用酶标板和单克隆抗体进行混合物中各成分的分离方法，其特征在于，分离游离载体时进行梯度稀释待测物，找到让酶标板上将含抗原的成分完全形成抗原-抗体复合物、上清中仅含有游离载体的稀释终点。
7.如权利要求6所述的利用酶标板和单克隆抗体进行混合物中各成分的分离方法，其特征在于，找到稀释终点后，再使用酶标板和单克隆抗体进行游离载体的检测，取酶标板稀释终点的上清液按照竞争ELISA的方法或其它能进行含量检测的ELISA方法进行检测；同时，用ELISA方法进行载体总含量的检测，通过标准曲线计算出待测物中游离载体的总含量。
8.如权利要求5所述的利用酶标板进行混合物中各成分的分离方法，其特征在于，分离游离抗原时，通过在酶标板上包被载体的单克隆抗体，待测物溶液含载体成分的游离载体和抗原-载体结合物与对应的单克隆抗体结合后形成固定在板上的抗原-抗体复合物，待测物中的游离载体、抗原-载体结合物吸附在酶标板中，上清液中仅含有游离抗原，分离出抗原进行检测。
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